CN115754028A - 一种分离检测氟伐替尼中苯胺类杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种LC‑MS法检测氟伐替尼中苯胺类基因毒性杂质的方法，所述杂质包括4‑氨基‑2‑氟苯酚、4‑（4‑氨基‑2‑氟苯氧基）‑7‑甲氧基喹啉‑6‑甲酰胺、4‑氨基‑3‑氯‑2‑氟苯酚和4‑（4‑氨基‑3‑氯‑2‑氟苯氧基）‑7‑甲氧基喹啉‑6‑甲酰胺。该LC‑MS法以十八烷基硅胶色谱柱为固定相，以甲酸水溶液‑乙腈为流动相，采用梯度洗脱、电喷雾质谱正模式测定各基因毒性杂质，采用外标法定量，可以准确测定氟伐替尼中苯胺类基因毒性杂质的含量，方法的专属性好、灵敏度高，可以良好地控制氟伐替尼的质量。
Description
技术领域
本发明属于药物分析化学领域，涉及一种分离检测氟伐替尼中苯胺类杂质的方法，具体涉及氟伐替尼中4种苯胺类基因毒性杂质的检测方法。
背景技术
氟伐替尼是一种处于研究阶段的小分子多靶点激酶抑制剂，可作用于血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR1/2/3）、纤维细胞生长因子受体（FGFR1/2/3/4）和转染期间重新排列（RET）等多个靶点，具有靶向治疗肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的潜力，是一种临床急需的药物。氟伐替尼的中间体（4-氨基-3-氯-2-氟苯酚和4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺）及合成过程中产生结构类似的副产物（4-氨基-2-氟苯酚和4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺）均为苯胺类化合物，含基因毒性警示结构，具有潜在基因毒性。其中，中间体4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺既是工艺杂质，又是降解杂质，为了保证氟伐替尼的安全性，在产品中必须严格控制其含量。因此，需开发相应的分析方法用于氟伐替尼原料药中这4种苯胺类基因毒性杂质含量的检测。
氟伐替尼 4-氨基-2-氟苯酚（I）
4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺（II） 4-氨基-3-氯-2-氟苯酚（III）
4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺（IV）。
发明内容
本发明的目的在于提供一种LC-MS法检测氟伐替尼中苯胺类基因毒性杂质的方法，所述杂质为4-氨基-2-氟苯酚（本文称杂质I）、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺（本文称杂质II）、4-氨基-3-氯-2-氟苯酚（本文称为杂质III）和/或4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺（本文称为杂质IV），该方法可以对这4种杂质进行有效的分离检测，从而实现氟伐替尼原料药的质量控制以及保证氟伐替尼制剂的质量。
为实现上述发明目的，本发明提供以下实施方案：
在一实施方案中，一种分离检测氟伐替尼中苯胺类杂质的方法，所述杂质选自杂质I 4-氨基-2-氟苯酚、杂质II 4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺、杂质III4-氨基-3-氯-2-氟苯酚和杂质IV 4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺中的一种或多种，该方法包括以下过程：
（1）制备氟伐替尼供试品溶液：将氟伐替尼供试品溶解于稀释剂中，得到供试品溶液；
（2）制备杂质对照品溶液：分别取杂质I、II、III和IV对照品各自溶解于稀释剂中，得到对照品溶液；
（3）采用LC-MS法检测供试品溶液和对照品溶液，使用外标法计算得到氟伐替尼中杂质的含量，
其特征在于：采用LC-MS法，其色谱条件为：以十八烷基硅胶键合柱为色谱柱，流动相为流动相A和流动相B，其中，流动相A为甲酸-水溶液，流动相B为甲醇、乙腈或它们的混合物，流速：0.4~0.6ml/min、柱温：25℃~40℃、进样量：5μl~100μl，采用梯度洗脱法。
上述本发明的方法，过程（1）和过程（2）中的稀释剂为乙腈-水溶液，其体积比为（20~80）:（80~20），优选的，所述稀释剂中乙腈-水的体积比为50:50；当杂质为 I、II、III时，所述供试品溶液中氟伐替尼的浓度为0.4~0.6mg/mL，当杂质为IV时，供试品溶液中氟伐替尼的浓度0.04~0.06mg/mL。
上述本发明的方法，过程（2），各对照品溶液中杂质的浓度为20~30ng/mL。
上述本发明的方法，所述色谱条件为：所述流动相A中甲酸-水的体积比为（0.05~0.2）:（99.95~99.8），所述流动相B为乙腈，所述流速为0.5mL/min，所述柱温为40℃，所述进样量为5μl，优选的，甲酸-水的体积比为0.1:99.9。
上述本发明的方法，杂质I、II、III的限度为50ppm，杂质IV的限度为500ppm。
上述本发明的方法，所述梯度洗脱法，其流动相梯度变化选自：
（1）梯度a（用于杂质I、II、III的检测）：
| Time（min） | 0 | 15 | 16 | 20 | 20.1 | 30 |
| 流动相A（%） | 85 | 55 | 20 | 20 | 85 | 85 |
| 流动相B（%） | 15 | 45 | 80 | 80 | 15 | 15 |
和
（2）梯度b（用于杂质IV的检测）：
| Time（min） | 0 | 15 | 16 | 20 | 20.1 | 30 |
| 流动相A（%） | 90 | 67 | 45 | 45 | 90 | 90 |
| 流动相B（%） | 10 | 33 | 55 | 55 | 10 | 10 |
上述本发明的方法，其特征在于，所述LC-MS法，其质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源（ESI源）；
扫描模式：正模式（Positive），单离子检测扫描（SIM）；
特征离子（m/z）：4-氨基-2-氟苯酚为128.0、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺为328.1、4-氨基-3-氯-2-氟苯酚为162.1、4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺为362.1。
在一具体实施方案中，本发明的一种分离检测氟伐替尼中苯胺类杂质的方法，包括以下过程：
（1）配制氟伐替尼供试品溶液：将氟伐替尼供试品溶解于稀释剂中，得到供试品溶液；
（2）配制杂质对照品溶液：将杂质对照品溶解于稀释剂中，得到对照品溶液，其中所述杂质包括杂质I、II、III和IV中的一种或多种；
（3）采用LC-MS法检测供试品溶液和对照品溶液，使用外标法计算得到氟伐替尼中杂质I、II、III和IV的含量。
在上述具体实施方案中，本发明的方法，过程（1）中所述配制供试品溶液：取氟伐替尼供试品适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含供试品0.5mg的溶液，作为供试品溶液1（用于杂质I、II和III的检测）；取氟伐替尼供试品适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含供试品0.05mg的溶液，作为供试品溶液2（用于杂质IV的检测）；过程（2）中所述配制对照品溶液：取杂质I、II、III和IV对照品适量，精密称定，分别用稀释剂稀释制成每1ml中约含4-氨基-2-氟苯酚、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺、4-氨基-3-氯-2-氟苯酚和4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品各25ng的溶液，作为对照品溶液；过程（3）中所述检测过程：得到供试品溶液和对照品溶液后，将供试品溶液和对照品溶液分别进行LC-MS检测，得到待测溶液谱图和对照品溶液谱图，根据谱图峰面积，使用外标法进行计算，得到氟伐替尼中杂质I、II、III和IV的含量。
在上述具体实施方案中，本发明的方法，LC-MS检测方法的液相色谱条件优选为：
色谱柱：十八烷基硅胶键合的色谱柱；
流动相：流动相A为甲酸-水溶液，流动相B为甲醇、乙腈中的一种或几种；
流速：0.4~0.6ml/min；
柱温：25℃~40℃；
进样量：5μl~100μl；
洗脱方式：梯度洗脱。
其中，所述流动相A中甲酸-水的体积比为（0.05~0.2）:（99.95~99.8）。
进一步优选的所述色谱条件为：
流动相A：甲酸-水的体积比为0.1:99.9
流动相B：为乙腈
流速：0.5mL/min
柱温：40℃
进样量：5μl。
所述梯度洗脱法，其流动相梯度变化选自如下的（1）和（2）：
（1）梯度a（用于杂质I、II、III的检测）：
| Time（min） | 0 | 15 | 16 | 20 | 20.1 | 30 |
| 流动相A（%） | 85 | 55 | 20 | 20 | 85 | 85 |
| 流动相B（%） | 15 | 45 | 80 | 80 | 15 | 15 |
（2）梯度b（用于杂质IV的检测）：
| Time（min） | 0 | 15 | 16 | 20 | 20.1 | 30 |
| 流动相A（%） | 90 | 67 | 45 | 45 | 90 | 90 |
| 流动相B（%） | 10 | 33 | 55 | 55 | 10 | 10 |
在本发明中，所述LC-MS检测方法的质谱条件优选为：离子源为电喷雾离子源（ESI源）；扫描模式为正模式（Positive），单离子检测扫描（SIM）；特征离子（m/z）如下：4-氨基-2-氟苯酚为128.0、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺为328.1、4-氨基-3-氯-2-氟苯酚为162.1、4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺为362.1。
本发明的方法的有益效果：本发明提供了一种LC-MS法检测氟伐替尼中苯胺类基因毒性杂质的方法，该方法有效解决了氟伐替尼中苯胺类基因毒性杂质的峰形裂分问题。可以实现氟伐替尼中苯胺类基因毒性杂质的有效分离，能够准确测定苯胺类基因毒性杂质的含量。该方法专属性好、灵敏度高、杂质峰形较佳，且方法的系统适用性、准确度、线性及灵敏度均符合验证要求，可以较好地控制氟伐替尼的质量。
附图说明
图1 对比例1的供试品溶液谱图；
图2 对比例2的供试品溶液谱图；
图3 实施例1中空白溶液（稀释剂）1谱图；
图4 实施例1中对照品溶液1（杂质I、II、III检测）谱图；
图5 实施例1中供试品溶液1谱图；
图6 实施例1中100%限度浓度加标（杂质I、II、III检测）的供试品溶液1谱图；
图7 实施例1中空白溶液（稀释剂）2谱图；
图8 实施例1中对照品溶液2（杂质IV检测）谱图；
图9 实施例1中供试品溶液2谱图；
图10 实施例1中100%限度浓度加标（杂质IV检测）的供试品溶液2谱图；
图11 实施例3中4-氨基-2-氟苯酚线性关系图；
图12 实施例3中4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺线性关系图；
图13 实施例3中4-氨基-3-氯-2-氟苯酚线性关系图；
图14 实施例3中4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺检测线性关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的方案进行详细的说明，但不以任何方式限制本发明的范围。
对比例1 4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺检测--梯度1
液相色谱条件：
色谱柱：Waters Symmetry C18，4.6×150mm，5μm；
流动相：流动相A为甲酸-水（0.1%-99.9%），流动相B为乙腈；
稀释剂：乙腈-水（50:50）
流速：0.5ml/min；
柱温：40℃；
进样量：5μl；
梯度：
| Time（min） | 0 | 10 | 11 | 15 | 15.1 | 25 |
| 流动相A（%） | 80 | 70 | 20 | 20 | 80 | 80 |
| 流动相B（%） | 20 | 30 | 80 | 80 | 20 | 20 |
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源（ESI源）；
扫描模式：正模式（Positive），单离子检测扫描（SIM）；
特征离子（m/z）：362.1。
实验步骤：
配制对照品储备液：取杂质4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品约5mg，精密称定，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液50μl，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
配制对照品溶液：精密量取对照品储备液100μl，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
取对照品溶液，按上述LC-MS条件进行检测，记录谱图；
结果见图1，实验结果显示，目标物4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺（杂质IV）峰形出现裂分，影响目标杂质的准确定量。
对比例2 4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺检测--梯度2
调整梯度如下：
| Time（min） | 0 | 10 | 11 | 15 | 15.1 | 25 |
| 流动相A（%） | 85 | 75 | 20 | 20 | 85 | 85 |
| 流动相B（%） | 15 | 25 | 80 | 80 | 15 | 15 |
其他液相色谱条件和质谱条件同对比例1。
实验步骤：
配制对照品储备液：同对比例1中对照品储备液；
配制对照品溶液：同对比例1中对照品溶液；
取对照品溶液，按上述LC-MS条件进行检测，记录谱图；
结果见图2，实验结果显示，目标物4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺峰形依旧不佳。
对比例1~2说明，未经优化的检测条件会使某些苯胺类基因毒性杂质的峰形出现裂分（如对比例1和对比例2），影响目标基因毒性杂质的准确定量。因此，为了保证氟伐替尼中苯胺类基因毒性杂质的准确定量，本发明人经探索和方法学研究建立了能有效定量检测氟伐替尼中苯胺类基因毒性杂质的方法。
实施例1 专属性及系统适用性实验
液相色谱条件：
色谱柱：ACE Excel 3 C18-PFP，4.6×150mm，3.0μm（用于杂质I、II、III的检测）；
Waters Symmetry C18，4.6×150mm，5μm（用于杂质IV的检测）；
流动相：流动相A为甲酸-水（0.1%-99.9%），流动相B为乙腈；
稀释剂：乙腈-水（50:50）
流速：0.5ml/min；
柱温：40℃；
进样量：5μl；
梯度：
（1）梯度a（用于杂质I、II、III的检测）：
| Time（min） | 0 | 15 | 16 | 20 | 20.1 | 30 |
| 流动相A（%） | 85 | 55 | 20 | 20 | 85 | 85 |
| 流动相B（%） | 15 | 45 | 80 | 80 | 15 | 15 |
（2）梯度b（用于杂质IV的检测）：
| Time（min） | 0 | 15 | 16 | 20 | 20.1 | 30 |
| 流动相A（%） | 90 | 67 | 45 | 45 | 90 | 90 |
| 流动相B（%） | 10 | 33 | 55 | 55 | 10 | 10 |
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源（ESI源）；
扫描模式：正模式（Positive），单离子检测扫描（SIM）；
特征离子（m/z）：4-氨基-2-氟苯酚为128.0、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺为328.1、4-氨基-3-氯-2-氟苯酚为162.1、4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺为362.1。
实验步骤：
（1）杂质I、II、III的检测：
配制对照品储备液1：分别取杂质4-胺基-2-氟苯酚、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺和4-氨基-3-氯-2-氟苯酚对照品各约5mg，精密称定，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液50μl，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
配制对照品溶液1：精密量取对照品储备液1 100μl，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
配制供试品溶液1：取氟伐替尼供试品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
配制100%限度浓度加标供试品溶液1：取氟伐替尼供试品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取对照品储备液1 100μl，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
（2）杂质IV的检测：
配制对照品储备液2：取杂质4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品约5mg，精密称定，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液50μl，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
配制对照品溶液2：精密量取对照品储备液2 100μl，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
配制供试品溶液2：取氟伐替尼供试品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1.0ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
配制100%限度浓度加标供试品溶液2：取氟伐替尼供试品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1.0ml、对照品储备液2 100μl，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
分别取空白溶液（稀释剂）1、对照品溶液1、供试品溶液1、100%限度浓度加标的供试品溶液1、空白溶液（稀释剂）2、对照品溶液2、供试品溶液2、100%限度浓度加标的供试品溶液2按上述条件进行LC-MS分析，记录谱图；结果见图3~图10。其中，
图3 表明，溶剂不干扰杂质4-胺基-2-氟苯酚、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺和4-氨基-3-氯-2-氟苯酚的测定。
图4 图中出峰顺序依次为4-胺基-2-氟苯酚、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺和4-氨基-3-氯-2-氟苯酚，各杂质响应较高，峰形较好。
图5 表明，氟伐替尼中的基因毒性杂质4-胺基-2-氟苯酚、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺、4-氨基-3-氯-2-氟苯酚检测结果分别为未检出、15ppm、未检出。
图6 表明，本发明的方法可以有效分离检测氟伐替尼中4-胺基-2-氟苯酚、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺和4-氨基-3-氯-2-氟苯酚这3种基因毒性杂质。
图7 表明，溶剂不干扰4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺测定。
图8 表明，杂质4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺响应较高，峰形较好。
图9 表明，氟伐替尼中的基因毒性杂质4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺检测结果为218ppm。
图10 表明，本发明的方法可以有效分离检测氟伐替尼中基因毒性杂质4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺。
实施例2 准确度实验
液相色谱条件和质谱条件同实施例1
实验步骤：
（1）杂质I、II、III的检测：
配制对照品储备液1：同实施例1中对照品储备液1；
配制对照品溶液1：同实施例1中对照品溶液1；
配制供试品溶液1：同实施例1中供试品溶液1；
配制30%限度浓度加标供试品溶液1：取氟伐替尼供试品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取对照品储备液1 30μl，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；（平行配制3份）
配制100%限度浓度加标供试品溶液1：取氟伐替尼供试品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取对照品储备液1 100μl，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；（平行配制3份）
配制200%限度浓度加标供试品溶液1：取氟伐替尼供试品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取对照品储备液1 200μl，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；（平行配制3份）
（2）杂质IV的检测：
配制对照品储备液2：同实施例1中对照品储备液2；
配制对照品溶液2：同实施例1中对照品溶液2；
配制供试品溶液2：同实施例1中供试品溶液2；
配制50%限度浓度加标供试品溶液2：取氟伐替尼供试品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1.0ml、对照品储备液2 50μl，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；（平行配制3份）
配制100%限度浓度加标供试品溶液2：取氟伐替尼供试品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1.0ml、对照品储备液2 100μl，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；（平行配制3份）
配制150%限度浓度加标供试品溶液2：取氟伐替尼供试品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1.0ml、对照品储备液2 150μl，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；（平行配制3份）
分别取空白溶液（稀释剂）1、对照品溶液1、供试品溶液1、3种限度浓度加标供试品溶液1、空白溶液（稀释剂）2、对照品溶液2、供试品溶液2、3种限度浓度加标供试品溶液2按上述条件进行LC-MS分析，记录谱图；准确度结果见下表1~表4。
表1 4-胺基-2-氟苯酚准确度实验结果汇总
表2 4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺准确度实验结果汇总
表3 4-氨基-3-氯-2-氟苯酚准确度实验结果汇总
表4 4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺准确度实验结果汇总
准确度实验结论：4-胺基-2-氟苯酚含量在3个浓度水平的回收率均在82.3%~89.6%范围内，9份溶液的回收率RSD为2.6%；4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺含量在3个浓度水平的回收率均在84.1%~89.5%范围内，9份溶液的回收率RSD为2.1%；4-氨基-3-氯-2-氟苯酚含量在3个浓度水平的回收率均在97.5%~105.2%范围内，9份溶液的回收率RSD为2.3%；4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺含量在3个浓度水平的回收率均在103.0%~107.8%范围内，9份溶液的回收率RSD为1.5%；故准确度均符合要求。
实施例3 线性实验
液相色谱条件和质谱条件同实施例1
实验步骤：
（1）杂质I、II、III的检测：
配制线性储备液1：分别取杂质4-胺基-2-氟苯酚、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺和4-氨基-3-氯-2-氟苯酚对照品各约5mg，精密称定，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液50μl，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液照下表5进行配制：
表5 线性溶液配制
取各线性溶液，各进样1针，记录谱图。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制线性关系图。4-胺基-2-氟苯酚在7.38ng/ml ~ 73.76ng/ml（相当于限度浓度的30%~300%）范围内线性方程为y= 4080.9827x–2541.1501，R2为0.9999，线性关系良好，线性关系图见图11；4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺在7.57ng/ml ~ 75.72ng/ml范围内线性方程为y= 11936.9905x–12239.9487，R2为0.9998，线性关系良好，线性关系图见图12；4-氨基-3-氯-2-氟苯酚在7.21ng/ml ~ 72.12ng/ml范围内线性方程为y=4789.3510x–7729.2675，R2为0.9995，线性关系良好，线性关系图见图13。
（2）杂质IV的检测：
配制线性储备液2：取杂质4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺对照品约5mg，精密称定，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液50μl，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液照下表6进行配制：
表6 线性溶液配制
取各线性溶液，各进样1针，记录谱图。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制线性关系图。4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺在2.49ng/ml ~99.50ng/ml（相当于限度浓度的10%~400%）范围内线性方程为y= 8464.3180x+8954.9645，R2为0.9997，线性关系良好，线性关系图见图14。
实施例4 灵敏度实验
液相色谱条件和质谱条件同实施例1
实验步骤：
（1）杂质I、II、III的检测：
配制对照品储备液1：同实施例1中对照品储备液1；
配制定量限溶液1：精密移取对照品储备液1 30μl，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
配制检测限溶液1：精密移取对照品储备液1 15μl，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
取定量限溶液连续进样6次，检测限溶液连续进样3次，记录谱图。
定量限结果见表7：4-胺基-2-氟苯酚浓度为7.38ng/ml（相当于限度浓度的30%），S/N均>10，峰面积RSD（n=6）为2.9%；4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺浓度为7.57ng/ml（相当于限度浓度的30%），S/N均>10，峰面积RSD（n=6）为1.7%；4-氨基-3-氯-2-氟苯酚浓度为7.21ng/ml（相当于限度浓度的30%），S/N均>10，峰面积RSD（n=6）为5.7%。
表7 定量限试验结果
检测限结果见表8：4-胺基-2-氟苯酚浓度为3.69ng/ml（相当于限度浓度的15%），S/N均>3；4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺浓度为3.79ng/ml（相当于限度浓度的15%），S/N均>3；4-氨基-3-氯-2-氟苯酚浓度为3.61ng/ml（相当于限度浓度的15%），S/N均>3。
表8 检测限试验结果
表7~表8的灵敏度实验结果表明本发明提供的方法用于4-胺基-2-氟苯酚、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺和4-氨基-3-氯-2-氟苯酚检测灵敏度良好。
（2）杂质IV的检测：
配制对照品储备液2：同实施例1中对照品储备液2；
配制定量限溶液2：精密移取对照品储备液2 10μl，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
配制检测限溶液2：精密移取对照品储备液2 5μl，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
取定量限溶液连续进样6次，检测限溶液连续进样3次，记录谱图。
定量限结果见表9：4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺浓度为2.49ng/ml（相当于限度浓度的10%），S/N均>10，峰面积RSD（n=6）为1.7%。
表9 定量限试验结果
检测限结果见表10：4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺浓度为1.24ng/ml（相当于限度浓度的5%），S/N均>3。
表10 检测限试验结果
表9~表10的灵敏度实验结果表明本发明提供的方法用于4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺检测灵敏度良好。
上述表1~表10的实验结果表明，本发明的技术方案能获得良好的分离测试效果，且系统适用性、准确度、线性及灵敏度均符合验证要求，能够很好的控制氟伐替尼中基因毒性杂质4-氨基-2-氟苯酚、4-（4-氨基-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺、4-氨基-3-氯-2-氟苯酚和4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺的含量，从而保证氟伐替尼的质量。
在不改变本发明的精神实质的条件下，对本发明作简单的替换或调整也属于本发明的范围。
Claims (10)
1.一种分离检测氟伐替尼中苯胺类杂质的方法，所述杂质选自杂质I 4-氨基-2-氟苯酚、杂质II 4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺、杂质III 4-氨基-3-氯-2-氟苯酚和杂质IV 4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺中的一种或多种，该方法包括以下过程：
（1）制备氟伐替尼供试品溶液：将氟伐替尼供试品溶解于稀释剂中，得到供试品溶液；
（2）制备杂质对照品溶液：分别取杂质I、II、III和IV对照品各自溶解于稀释剂中，得到对照品溶液；
（3）采用LC-MS法检测供试品溶液和对照品溶液，使用外标法计算得到氟伐替尼中杂质的含量；
其特征在于：采用LC-MS法，其色谱条件为：以十八烷基硅胶键合柱为色谱柱，流动相为流动相A和流动相B，其中，流动相A为甲酸-水溶液，流动相B为甲醇、乙腈或它们的混合物，流速：0.4~0.6ml/min、柱温：25℃~40℃、进样量：5μl~100μl，采用梯度洗脱法。
2.根据权利要求1所述的方法，过程（1）和过程（2）中的稀释剂为乙腈-水溶液，其体积比为（20~80）:（80~20）。
3.根据权利要求2所述的方法，所述稀释剂中乙腈-水的体积比为50:50。
4.根据权利要求1所述的方法，过程（1）中，当杂质为 I、II、III时，所述供试品溶液中氟伐替尼的浓度为0.4~0.6mg/mL，当杂质为IV时，供试品溶液中氟伐替尼的浓度为0.04~0.06mg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，过程（2）中，各对照品溶液中杂质的浓度为20~30ng/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，所述色谱条件为：流动相A中甲酸-水的体积比为（0.05~0.2）:（99.95~99.8），所述流动相B为乙腈，所述流速为0.5mL/min，所述柱温为40℃，所述进样量为5μl。
7.根据权利要求1所述的方法，杂质I、II、III的限度为50ppm，杂质IV的限度为500ppm。
8.根据权利要求6所述的方法，所述流动相A，甲酸-水的体积比为0.1:99.9。
9.根据权利要求1所述的方法，所述梯度洗脱法，其流动相梯度变化选自：
（1）梯度a（用于杂质I、II、III的检测）：
和
（2）梯度b（用于杂质IV的检测）：
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LC-MS法，其质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源（ESI源）；
扫描模式：正模式（Positive），单离子检测扫描（SIM）；
特征离子（m/z）：4-氨基-2-氟苯酚为128.0、4-（4-氨基-2氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺为328.1、4-氨基-3-氯-2-氟苯酚为162.1、4-（4-氨基-3-氯-2-氟苯氧基）-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺为362.1。
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