BE1020835A5 - Werkwijze voor het vervaardigen van een plantenextract, i.h.b. uit desmodium. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het vervaardigen van een plantenextract, i.h.b. uit Desmodium

Onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het vervaardigen van een plantenextract, in het bijzonder een extract uit Desmodium, meer in het bijzonder Desmodium adscendens, desgevallend van exotische oorsprong.

Sinds de oudheid worden planten gebruikt voor hun medicinale eigenschappen. Vele hedendaagse geneesmiddelen zijn actieve componenten van planten, zoals paclitaxel (Taxol) van Taxus brevifolia en morfine van Papaver somniferum, of zijn ervan afgeleid. Ook in de traditionele geneeskunde in Afrika worden vele planten gebruikt, waaronder Desmódium adscendens. Qua geografische verspreiding en gebruik is de plant immers inheems in vele tropische of subtropische landen van Afrika en ook Zuid-Amerika o.a., en groeit op open vlakten, weiden en langs de weg, zodat deze plant vrij toegankelijk is en deze zodoende aantrekkelijk maakt als geneesmiddel voor bevolkingen waar de medicijnen vaak moeilijk aan te schaffen zijn door hun kostprijs. Aldus wordt de plant in de traditionele geneeskunde aangewend bij o.a. astma, pijn, koorts, epilepsie, hepatitis en spierkrampen. Hiervoor wordt een decoct als warm waterig aftreksel van de bladeren, takken of de stam gebruikt.

Er zijn een aantal commerciële bereidingen van flavonoïd bevattende bladextracten van de plant in omloop, die verhandeld worden als voedingssupplementen met verscheidene eigenschappen die een goede gezondheid in de hand werken.

Ook voor de behandeling van leveraandoeningen worden al eeuwèn lang medicinale planten gebruikt. Aldus zijn Silybum marianum, Picrorrhiza kurroa, Curcuma longa, Glycyrrhiza glabra, Phyllantus amarus en Andrographis paniculata planten waarvan een hepatoprotectieve werking vermoed werd.

De lever is een zeer belangrijk orgaan in het menselijk lichaam dat zich rechts bovenaan in het abdomen bevindt en bij volwassenen 1,4 tot 1,6 kg kan wegen. Per minuut stroomt er via de leverslagader en de portale vene ongeveer 1,5 I bloed naar de lever wat overeenkomt met 28% van het hartdebiet. De afvoer gebeurt via de hepatische vene en galkanalen. De levercellen zelf zijn georganiseerd in onregelmatige eenheden, de lobben, met in het midden een centrale hepatische vene. Aan de uiteinden van de lobules bevinden zich de hepatische arteriën en portale vene. Deze laatste twee vormen een soort vertakkingen onder de vorm van sinusoïden, zodat ongeveer 70% van de oppervlakte van de hepatocyten met de bloedvaten in contact komt voor een maximale uitwisseling. Ongeveer 15% van de hepatocytmembranen staan in contact met de galkanalen welke ook op de hoekpunten van de lobules liggen. De door de lever geproduceerde gal wordt afgevoerd via galkanalen die uitmonden in de galblaas.

De lever staat in voor de metabole homeostase en speelt een cruciale rol in het koolhydraat- en lipidenmetabolisme. Daarnaast staat de lever in voor trans-, resp. de-aminering en synthese van proteïnen zoals o.a. transportproteïnen en stollingsfactoren en opslag van vitamine A, D en B12. Een goede galsecretie is belangrijk voor resorptie van vetoplosbare vitaminen.

Een andere belangrijke functie is detoxificatie en excretie van endogene afvalstoffen, zoals ammoniak, en exogene stoffen, zoals farmaca.

Daar de lever zodus vele belangrijke taken verzekert, hebben leveraandoeningen een jgrote invloed op het lichaam. Zo staat levercirrhose als één van de grote doodsoorzaken in de Westerse wereld. Verder is geelzucht een aandoening die ontstaat door een toename van niet-geconjugeerd of indirect bilirubine of van geconjugeerd of direct bilirubine, wat aanleiding geeft tot geelverkleuring van de huid en sclerae. Oorzaken van een toename van indirect bilirubine zijn verhoogde aanmaak van bilirubine zoals heriditaire sferocytose, verminderde opname in de lever (competitie met farmaca) en. gestoorde conjugatie (Crigler-Najjar syndroom). Oorzaken van toename van direct bilirubine zijn een verandering in expressie van membraantransporters van de canaliculi (Dubin-Johnson syndroom) en verminderde excretie van bilirubine glucuroniden (cholestase).

Cholestase is een aandoening waarbij geconjugeerd bilirubine verminderd wordt afgevoerd naar de galkanaaltjes en terugkeert naar het bloed. Oorzaken van intra-hepatische cholestase zijn hépatocellulaire dysfunctie -zoals beschadiging en zwelling- bij virale hepatitis, chronische hepatitis en levercirrhose. Ook medicatie zoals oestrogenen kunnen de oorzaak zijn van cholestase.

Cirrose is een gevolg van progressieve nécrosé met littekenvorming (fibrose), waarbij tussen de littekens nodulaire regeneratie ontstaan en de normale bouw verstoren. Gevolgen zijn stuwing, portale hypertensie, encefalopathie, ascites, e.a. 60 tot 70 % van gevallen van levercirrose worden veroorzaakt door alcohol misbruik. Andere oorzaken zijn virale hepatitis, biliaire aandoeningen en primaire hémochromatose.

Leverfalen is het eindstadium van massieve nécrosé >van de lever door virale hepatitis, geneesmiddelen en chemicaliën, chronische leverziekten en van hepatische dysfuncties zonder nécrosé, zoals het syndroom van Reye.

Ter situering van de mechanismen van leverschade en om een idee te krijgen van de celbeschadiging, worden bloedparameters gemeten, zoals de transaminasen alanineaminotransferase (ALT) en aspartaataminotransferase (AST). ALT komt enkel voor in het cytoplasma, terwijl AST ook in de mitochondriën voorkomt. De transaminasen stijgen snel omdat ze reeds vrijkomen bij celwandbeschadiging. AST stijgt later dan ALT en geeft aan dat het om een ernstigere nécrosé gaat. Membraanenzymen als gammaglutamyltransferase (yGT) en alkalische fosfaten (AF) komen voor in de celmembranen van bijna alle lichaamscellen. Gamma-GT is verhoogd bij hepatitis van virale of bacteriële oorsprong, of bij intoxicatie door geneesmiddelen of alcohol. Ook alkalische fosfatase wordt bepaald bij de diagnostiek en het opvolgen van leveraandoeningen. Deze parameters geven een beeld van de leverbeschadiging.

De hier bedoelde plant Desmodium adscendens bevat onder meer flavonoïden zoals vitexine, rutine en isovitexine, het tetrahydroisochinoline salsoline (3), sojasaponinen o.a. sojasaponine I (4), jB-fenylethylamines zoals tyramine (5) en hordenine hieronder weergegeven onder (1) tot (6) resp. en een indool-3-alkylamine.

Desmodium adscendens heeft meerdere farmacologische eigenschappen. Op neuro-farmacologisch gebied heeft een extract van de plant een onderdrukkende activiteit op het centraal zenuwstelsel. Het ethanolisch extract bezit analgetische en hypothermische activiteit en inhibeert de propagatie van tonisch-clonische toevallen.

Waterige en ethanolische extracten van deze plant reduceren gladde spiercontracties en verminderen de vrijgave van substanties, die gladde spiercellen activeren, in de longen. Verschillende fracties van het extract werden onderzocht. Een subtractie inhibeert de gladde spiercel contractie geïnduceerd door antigen, via inhibitie van fosfolipases welke tot stand komt door activatie van calcium geactiveerde kaliumreceptoren. In deze fractie waren saponines aanwezig. Verder inhibeert de fractie, welke een tetrahydroisochinoline analoog bevat, de cytochroom P450 NADPH- afhankelijke mono-oxygenase reactie, welke epoxy- en hydroxyeicosanoiden aanmaakt. De fractie verhoogt de cox-activiteit wat resulteert in een verhoogde prostaglandine aanmaak.

De Europese octrooipublicatie EP 0309342 beschrijft het gebruik van Desmodium in de behandeling van hepatitis, en geneesmiddelen hiervoor. Dit octrooi beschrijft het gebruik van

Desmodium adscendens in de behandeling van virale hepatitis van het type A of B en toxischet hepatitis, a priori niet tegen alle, i.h.b. voor verslaafde mensen of bij kankerbehandeling.

Tot nu toe waren leveraandoeningen zeer moeilijk te behandelen en vrijwel onmogelijk te voorkomen. Dit is dan ook het gestelde probleem, hoe de één of andere leveraandoening voorkomen.

Onderhavige uitvinding heeft tot doel aan voornoemd probleem een oplossing te brengen. M.a.w. het doel van deze uitvinding is in eerste instantie het onderzoek van de hepatoprotectieve eigenschappen van extracten van Desmodium adscendens, met name bladeren, takjes en/of andere bovengrondse doch ook ondergrondse delen hiervan, en de bereiding van een gekwantificeerd extract hieruit.

Bij het zoeken naar een passende substantie of geneesmiddel voor leveraandoeningen werd een substantie uit de groep der inositolen getoetst. Deze vormen een klasse van verbindingen die hexahydroxycyclohexaan derivaten, meer bepaald cyclische suikeralcoholen.

Zoals suikers vormen inositolen een deel van het gewone menselijke dieet, zonder toxisch te zijn. Verschillende studies, inclusief bij de mens, hebben uitgewezen dat D-pinitol een effect uitoefent dat analoog is met dat van insuline om de vereiste controle van de glycemie te verbeteren. Voornoemde studies suggereren inderdaad dat er een synergie blijkt te bestaan tussen D-pinitol en insuline bij submaximale concentraties, waarbij dit evenwel niet voor de hand ligt bij glucosetransport. Het is wel te verstaan dat hier beide isomeren bedoeld zijn, dus ook het niet-actieve L-pinitol.

D-pinitol is een cyclisch suikeralcohol met een laag moleculair gewicht. Het is een methylderivaat van D-chiro-inositol. Zowel D-pinitol als D-chiro-inositol zijn structureel verwant met fosfatidyl inositolen, die een schakel vormen in de door insuline geïnduceerde signaaltransductie. D-pinitol waarvan de structuur hieronder uitgebeeld is, komt voor in vele groenten, sojaproducten en dennenbomen -maar niet uitsluitend- en wordt in het lichaam gemetaboliseerd tot chiro-inositol.

D-pinitol verschilt van de andere inositolen door zijn specifieke activiteit.

Een verder verschil van D-pinitol tegenover de overige inositolen bestaat erin dat dit een methyl ethergroep bevat. Gelet op voornoemde samenstelling, bezit D-pinitol een natuurlijke invloed op het glucosemetabolisme, en vandaar op diabetes of suikerziekte. In vitro farmacologische eigenschappen wijzen inderdaad op werkzaamheid van D-pinitol waaronder hypoglycemische, antiatherogene activiteit en de invloed op het immuunsysteem. Wat de hypoglycemische activiteit betreft kan D-pinitol het glucosetransport en de insulinegevoeligheid verbeteren. D.i. t.w.a. het feit dat D-pinitol in de mens gedeeltelijk gemetaboliseerd wordt tot D-chiro-inositol, die eigenlijk de verantwoordelijke stof is voor de biologische activiteit : D-chiro-inositol heeft effect op suikerziekte die door gedeeltelijke metabolisatie uit D-pinitol wordt gevormd, de actieve verbinding voor de positieve effecten, met name bij type-2 suikerziekte. M.a.w. wordt insulinegevoeligheid of -resistentie verbeterd. Er wordt inderdaad aangetoond dat D-pinitol in de mens gemetaboliseerd is tot D-chiro-inositol, i.h.b. bij type-2 suikerziekte, en ook onveranderd wordt afgescheiden.

Met andere woorden kan op het eerste gezicht niet worden afgeleid dat D-pinitol a priori niet in aanmerking kan komen als nuttig, laat staan voornaam element om een significante bijdrage te verschaffen bij de preventie of behandeling van de hier bedoelde leveraandoeningen.

Hiertegenover is er de octrooipublicatie afgeleid van EP 04723853 maar niets beschrijft hierin het gebruik van een extract van een plant die D-pinitol bevat ter bescherming van de leverfunctie dat wijst op één of andere werkwijze voor het voorkomen, laat staan behandelen, van één of andere leveraandoening; en zeker niet een exotische plant met gebruik van D-pinitol, of eender extract dat deze component zou bevatten.

Aldus is volgens de uitvinding een werkwijze voorgesteld voor het vervaardigen van pinitol uit een plantenextract, waarbij vertrokken wordt van een plantenextract van een fractie van Desmodium adscendens, meer i.h.b. bladeren, takken en/of ondergrondse delen hiervan, desgevallend ook bloemen of zelfs vruchten, die vooraf gedroogd worden.

Dankzij de uitvinding is aldus een gestandaardiseerd extract voorgesteld afgeleid van een gekende plant, Desmodium adscendens, gequantifieerd op de molecule D-pinitol in haar werking tegen hepatitis. Het punt is dat de hier bedoelde afzondering van D-pinitol uit Desmodium adscendens geenszins gekend is, terwijl de betrokken plant Desmodium adscendens gebruikt wordt voor talrijke doeleinden. Het kader van de nagestreefde bescherming is echter terug te plaatsen in de bewuste en doelgerichte keuze van een bepaalde indicatie hiervan. Er bestaan weliswaar aanwijzingen in een naburig domein van een hele reeks producten waaronder flavonoïden, aminozuren e.d., doch waarbij geen melding· gemaakt wordt van D-pinitol, die net verantwoordelijk is voor de activiteit in Desmodium adscendens tegen leveraandoening.

Aldus is dankzij de uitvinding een analysemethode ontwikkeld om een op D-pinitol gequantifieerd preparaat te verkrijgen, waarbij een biologisch gestuurde isolatie voorgesteld wordt, waarbij het product telkens aangerijkt wordt en talrijke fracties geïsoleerd worden en waarbij het verkregen decoct bovendien een grote hoeveelheid D-pinitol bevat.

Tengevolge van de natuurlijke variatie jn de planten met betrekking tot de inhoudsstoffen is het noodzakelijk om de reproduceerbaarheid te garanderen en bijgevolg om de inhoudsstoffen te standardiseren.

Door middel van een geschikte analytische methode worden de hoofdcomponenten in Desmodium adscendens en de totale hoeveelheid van D-pinitol bepaald. Het extractieproces, de verkregen producten na extractie en de voorwaarden worden geëvalueerd en geoptimaliseerd.

Volgens een voorkeurdragende uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt voornoemde fractie Desmodium adscendens voorafgaand verfijnd, i.h.b. in poedervorm.

Volgens een meer voorkeurdragende uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt een waterig afkooksel van voornoemde bladeren en/of takken Desmodium vervolgens bereid tot een decoct door een bepaalde hoeveelheid gedroogde, desgevallend verpulverde, bladeren op te koken in een bepaalde hoeveelheid water, i.h.b. gedestilleerd water, gedurende een bepaalde tijdspanne, i.h.b. 5 x 200 g, 3 f, resp.1 uur.

Volgens een nog meer voorkeurdragende uitvoeringsvorm van dè uitvinding wordt voornoemd waterig afkooksel van bladeren of takken Desmodium vervolgens afgekoeld, meer bepaald waarna de verkregen porties samengevoegd en gefilterd werden, waarna het verkregen filtraat geconcentreerd wordt, i.h.b. onder vacuüm en daarna gelyofiliseerd of gesproeidroogd.

Volgens een bijzondere uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt uitgaandê van 1 kg gedroogde bladeren van 60 tot 70 g, i.h.b. ongeveer 65 g van droog decoct bekomen.

Volgens een steeds meer voorkeurdragende uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt vervolgens een bepaalde hoeveelheid, i.h.b. ca. 20 g, voornoemd decoct onderworpen aan kolomchromatografie, i.h.b. op Sephadex LH20 met methanol elutie, waarbij bepaalde fracties, i.h.b. van 100 ml, verzameld en geanalyseerd worden met dunne laag chromatografie, i.h.b. Silicagel, laagdikte 0,25 cm, Me0H/H20:5:1 als mobiele fase, en waarbij hun chromatografisch patroon bepaald wordt.

Volgens een verdere uitvoeringsvorm van de uitvinding worden voornoemde fracties gecombineerd in een aantal subfracties, i.h.b. 11, volgens hun chromatografisch patroon.

Volgens een nog verdere uitvoeringsvorm van de uitvinding worden een deel geselecteerde voornoemde subfracties 5-11 [i.h.b. 200 mg] samengevoegd, i.h.b. deze die een gekleurde vlek vertonen, waarbij deze fractie onderworpen wordt aan een verdere kolomchromatografie, i.h.b. op Sephadex LH-20 geëlueerd met MeOH, waarbij opnieuw bepaalde fracties, i.h.b. van 100 ml, verzameld worden en geanalyseerd.

Volgens een steeds verdere uitvoeringsvorm van de uitvinding worden voornoemde subfracties 4-5, i.h.b. 120 mg, van deze kolom gecombineerd, waarbij deze onderworpen worden aan een nog verdere kolomchromatografie onder dezelfde voorwaarden, waarna een zuiver product verkregen wordt, i.h.b. wit.

Volgens een bevoorrechte uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt voornoemd extract afgezonderd en wordt het geïsoleerd product geïdentificeerd als het gemethyleerde cyclitol 3-0-methyl-chiro-inositol, ook (+)-D-pinitol of D-pinitol genoemd.

Deze uitvinding heeft ook nog betrekking op een plantenextract verkregen volgens een werkwijze zoals hierboven bepaald voor gebruik bij het beschermen van de lever bij een zoogdier, i.h.b. voor preventie van een leveraandoening ervan.

Volgens een bijkomende uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt voornoemd plantenextract aangewend voor behandeling van een leveraandoening bij een zoogdier.

Volgens een particuliere uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt het D-pinitol bevattend plantenextract aan het zoogdier gegeven onder de vorm van een samenstelling die deze bevat, waarbij voornoemde samenstelling geselecteerd wordt uit de groep bestaande uit: een farmaceutische samenstelling, een voedingsamenstelling en/of een dranksamenstelling.

Verdere kenmerken en bijzonderheden van de werkwijze volgens de uitvinding zijn bepaald in de verdere onderconclusies.

Verdere details zijn opgenomen in de hiernavolgende beschrijving van enkele voorkeurdragende uitvoeringsvoorbeelden van de werkwijze volgens de uitvinding dewelke toegelicht is in het licht van bijliggende tekeningen.

Figuur 1 stelt een functioneel werkingsdiagramma voor van de werkwijze volgens de uitvinding onder de vorm van een vloeidiagramma.

Figuur 2 is een realistische weergave van een representatief staal van bladeren en bloemen van Desmodium adscendens.

Figuur 3 is een schematische weergave van Insuline signaaltransductie.

Figuur 4 is een grafische voorstelling van de ijklijn bekomen na derivatiseren met BSTFA.

Figuren 5 tot 7 zijn elk een grafische voorstelling van concentratie- en oppervlakteverhoudingen na 3 uur, resp. na 6 uur derivatiseren en na overnacht derivatiseren.

Figuren 8 en 9 zijn elk een grafische voorstelling van de concentratie- en oppervlakteverhoudingen na een uur derivatiseren in een warmteblok.

Figuren 10 en 11 zijn elk een grafische voorstelling van de oppervlakteverhouding D-pinitol/inwendige standaard per 100 mg staal voor extractie onder ultrasoon trilbad.

Figuren 12 en 13 zijn elk een grafische voorstelling van de oppervlakteverhouding D-pinitol/inwendige standaard per 100 mg staal voor extractie onder verwarmd trilbad, resp. extractie - reflux.

Figuur 14 is een grafische voorstelling van de gemiddelde oppervlakteverhoudingen voor de verschillende extractiemethoden.

Figuur 15 is een grafische voorstelling van een responsfunctie.

Figuur 16 is een grafische voorstelling met storingen die een overzicht weergeeft van residu's. Figuren 17 en 18 zijn elk een grafische voorstelling van individuele metingen en gemiddelden op verschillende dagen.

Figuren 19 en 20 zijn elk een grafische voorstelling van de teruggevonden waarden na toepassing van de zogenaamde standaardadditiemethode.

Figuren 21 en 22 zijn elk een gedeeltelijk chromatogram van de analyse zonder, resp. met inwendige standaard die de spanning in mV weergeeft i.f.v. minuten.

Figuren 23 en 24 zijn elk een volledig chromatogram van de analyse van de standaarden die de spanning in mV weergeeft i.f.v. minuten.

Figuren 25 tot 28 zijn elk een massaspectrum voor verschillende stoffen, resp standaarden xylitol die de relatieve overvloed weergeeft in % i.f.v. het meest intense signaal met het oog op de specificiteit.

Figuren 29 tot 31 tonen Serum AST waarden 48h na acetaminofen toediening; resp. Serum ALT waarden 48h en 72h na acetaminofen toediening.

Figuren 32 e.v. tonen verdere experimentele gegevens.

Deze uitvinding heeft algemeen betrekking op een methode waarvan de verschillende stappen schematisch beschreven zijn en die toegepast worden voor het vervaardigen van een exotische plantenextract, in het bijzonder Desmodium adscendens, waarvan dé boven- en/of ondergrondse delen dienst doen als startproduct bij dit productieproces.

Desmodium adscendens is een kruid dat behoort tot de familie van de Fabaceae en tot het genus Desmodium, waarvan een fragment voorgesteld is in Fig. 2. Het is een vaste plant die 0,5 tot 1 m hoog kan worden en heeft een ronde, behaarde, kruipende stam met groeven. De plant is driebladig. De steunblaadjes zijn behaard tot kaal aan de buitenkant en 0,5-1 mm lang en 1,5-3 mm breed. Ze zijn wintervast. De bladsteel is behaard en 1 tot 3 cm lang.

De blaadjes zijn elliptisch - omgekeerd eivormig, stomp en uitgerand aan de top en wigvormig -rond aan de basis. De bladeren zijn voornamelijk kaal aan de bovenzijde en dik behaard aan de onderzijde.

De bloeiwijze bestaat uit axiale en eindstandige trossen. De bladspil is gegroefd en overvloedig behaard tot fijn behaard. De eerste schutbladeren zijn ovaal-spits toelopend met een spitse top en 3,5 - 5 mm lang en 1,5-2 mm breed. De bloemsteeltjes hebben dezelfde beharing als de bladspil én zijn 0,4 - 1,7 cm lang. De kroonbladeren zijn meestal paars. De kelk heeft twee lippen en de kelkbuis is fijn behaard. De tanden van beide lobben zijn behaard en 2 - 3 mm lang. De kroonbloem is groter dan de kelk en is ovaal.

De vrucht heeft een verlengde bloemsteel van 0,5 - 2 mm lang en is 1-5 ledig, schuin langwerpig met een afmeting van 3,5 — 5,5 mm op 2,5 - 3 mm. Het zaad is dwars elliptisch en 2,5 - 5 mm lang en 1,5 mm breed.

In de experimentele fase werden eerst een aantal proeven uitgevoerd in vitro, en vervolgens nog in vivo. Het verloop van de hierna beschreven proef is schematisch weergegeven in het vloeidiagramma volgens figuur 1.

In een fytochemisch onderzoek van Desmodium adscendens leverde plantenmateriaal en extractie hiervan afkomstig van Ghana een waterig afkooksel van de bladeren dat bereid werd door 5 X 200 g gedroogde en verpulverde bladeren op te koken in 3 l gedistilleerd water gedurende 1 uur. Na afkoelen werden de porties samengevoegd en gefiltreerd. Het filtraat werd geconcentreerd onder vacuüm en daarna gelyofiliseerd. Uitgaande van 1 kg gedroogde bladeren werd typisch ongeveer 65 g droog decoct bekomen.

Vervolgens werd 20 g decoct onderworpen aan kolomchromatografie op Sephadex LH20 (120 X 4 cm) met methanol elutie. Fracties van 100 ml werden verzameld en geanalyseerd met dunne laag chromatografie (silicagel Merck, laagdikte 0,25 cm, Me0H/H20:5:1 als mobiele fase). Spots werden gedetecteerd onder UV licht, in het bijzonder onder een golflengte van 366 nm. Na sproeien met anijsaldehyde 1%/H2S04 in MeOH, werd de plaat verhit tot 120°C gedurende 10 min om gekleurde spots te verkrijgen. Fracties werden gecombineerd in 11 subfracties volgens hun chromatografisch patroon. Subfracties 5-11 (200mg) vertoonden een vlek met een groene kleur, en werden samengevoegd. Deze fractie werd onderworpen aan een verdere kolomchromatografie op Sephadex LH20 (60 X 3 cm) geëlueerd met MeOH, en opnieuw werden fracties van 100 ml verzameld en geanalyseerd zoals beschreven. Subfracties 4-5 (120 mg) van deze kolom werden gecombineerd, en na een nieuwe kolomchromatografie onder dezelfde voorwaarden werd een kristallijn product verkregen.

De fase van structuuropheldering middels spectroscopisch onderzoek met 1H, 13C NMR en massaspectroscopie, en meting van de specifieke optische rotatie, leidde tot de identificatie van het geïsoleerde product als het gemethyleerde cyclitol 3-O-methyl-chiro-inositol, ook (+)-pinitol of D-pinitol genoemd.

Behandeling van 3T3-L1 adipocyten met 0,5 en 1 mM D-pinitol verhoogt de mRNA expressie van glucose transporter (GLUT4), insuline receptor substraat (1RS), peroxisoom proliferator geactiveerde receptor Y(PPARy) en CCAAT/enhancer-binding proteïne (C/EBP). 1 mM D-pinitol verhoogt adiponectine mRNA expressie, een adipocytokine met anti-inflammatoire, antidiabetische en antiatherogene eigenschappen waarvan de expressie ook verhoogd wordt door insuline. De verhoogde expressie van een aantal factoren kan verklaard worden door de insuline mimetische eigenschappen die D-pinitol bezit.

In L6 rat spiercellen induceert D-pinitol de translocatie van GLUT4 naar het celmembraan zoals insuline en zorgt het voor opname van glucose (fig. 3).

Aangaande de antiatherogene activiteit kon worden vastgesteld dat D-pinitol de vorming van schuimcellen matig inhibeert door verminderde secretie en expressie van cytokines zoals TNF-a, monocyt chemoattractant proteine-1, IL-1beta, IL-8 en verminderde expressie van macrofaag scavenger receptor, CD36 en CD86. De insuline mimetische activiteit van D-pinitol is waarschijnlijk ook de verklaring hiervoor.

Rond de invloed op het immuunsysteem kon worden vastgesteld dat D-pinitol immunofarmacologische eigenschappen heeft en dat D-pinitol de expressie van MHC-I, MHC-II, en costimulatoren zoals CD80 en CD86 vermindert, zowel in vitro als in vivo, door onderdrukking van MAPKs activatie en translocatie van NF-kB en productie vermindert van grote hoeveelheden IL-12 en proinflammatoire cytokines in LPS-geïnduceerde dendritische beenmergcellen. Hieruit volgt de inhibitie van de maturatie van deze cellen. Behandeling van dendritische cellen met D-pinitol verhindert deze cellen een normaal cel gemedieerd immuun antwoord te induceren en wanneer LPS-gestimuleerde dendritische cellen met D-pinitol behandeld worden, wordt de proliferatie van T-cellen en de productie van INF-γ door CD4+cellen negatief beïnvloed. In neutrofielen inhibeert D-pinitol de TNF-alfa expressie. ' D-pinitol inhibeert constitutieve en geïnduceerde NF-kB activatie op een dosis- en tijdsafhankelijke manier. De inhibitie is niet cel specifiek en gebeurt door inhibitie van IKK activatie, IkBa degradatie en fosforylatie, nucleaire fosforylatie en translocatie van p65. D-pinitol vermindert ook NF-kB afhankelijke reporter gen expressie en onderdrukt NF-kB afhankelijke genproducten die betrokken zijn bij celproliferatie, antiapoptosis, invasie en angiogenese. Dit kan verklaren waardoor analogen van D-pinitol, zoals azoolnucleoside analogen, antitumorale eigenschappen bezitten. Andere derivaten van D-pinitol zoals aminocyclitolen inhiberen glycosidase.

In vivo farmacologische eigenschappen werden onderzocht in proefdieren. In de uitgevoerde in vivo proeven werd de lever beschadigd, waar onderzocht werd of het preventief en/of curatief werkt. Tot dan werd nog niet bewezen dat de betrokken molecule curatief werkt, waarbij het preventieve karakter hiervan echter wel bewezen werd. Naast activiteit bij diabetische muizen resp. ratten in streptozotocine geïnduceerde diabetische muizen -waarbij D-pinitol een acuut en chronisch antihyperglycemisch effect heeft-, verhoogt het de basale opname van 2-deoxyglucose in L6 spiercellen door tussenkomst in de insuline signaal transductie. In ernstig insuline resistente muizen is D-pinitol niet effectief. In streptozotocine geïnduceerde diabetische ratten zorgt D-pinitol voor een verlaging van bloedglucose hemoglobine en voor een verhoging van insuline waarbij D-pinitol ook aspartaat transaminase (AST)-, alanine transaminase (ALT)- en alkalische fosfatase leverwaarden normaliseert en heeft een lipiden verlagend effect. Het antioxydatief effect weerspiegelt zich in de vermindering van de lipide peroxidatie en hydroperoxidatie, een verhoging van de niet-enzymatische antioxidanten en een normalisatie van de enzymatische antioxidanten superoxide dismutase (SOD), glutathion peroxidase (GP), catalase en glutathion-S-transferase (GST).

Wat het hepatoprotectief effect betreft, normaliseert de stof de aspartaat .transaminase (AST)-, alanine transaminase (ALT)-leverwaarden en TNF-α waarden na inductie van leverschade met galastosamine. Daarnaast vermindert D-pinitol de. lipide peroxidatie en normaliseert het de glutathion, glutathionreductase en glutathionperoxidase waarden.

Er is ook een anti-inflammatoir effect, waarbij in ratproeven D-pinitol anti-inflammatoire eigenschappen heeft, zowel tegen acute (carrageenan geïnduceerd oedeem aan de poot) als subacute (cotton pellet granuloma) ontsteking' De stof werkt ook antihelmintisch.

Aangaande de invloed op het immuunsysteem aangetoond in. muizen met OVA-geïnduceerde astma, vermindert het D-pinitol het aantal ontstekingscellen in broncheoalveolaire lavagevloeistof en vermindert de infiltratie van deze cellen in péribronchiolaire en périvasculaire regio’s. De inflammatie in de longen wordt dus tegengegaan. De Th2 cytokines zoals IL-4, IL-5 en eotaxine dalen door inname van D-pinitol en de Th1 cytokines zoals INF-γ stijgen en eveneens de INF-y positieve CD4-cellen. De Th1/Th2 balans wordt verder nog gecorrigeerd door D-pinitol door toename van expressie van de Th1 transcriptiefactor T-bet en door afname van de transcriptiefactor GATA-3 die verhoogt is bij Th2 patologieën.. De gelatinolytische activiteit van MMP-9 in longweefsel, die belangrijk is in de migratie van de ontstekingscellen van bloed naar weefsel, wordt verminderd. D-pinitol reduceert dus de hyperreactiviteit en inflammatie die bij astma wordt gezien.

Proeven bij mensen

Bij patiënten met diabetes type 2, heeft D-pinitol een gunstige invloed op de nuchtere glucosewaarden, HbA1c waarden en insuline. Totale cholesterol, LDL/HDL ratio en systolische en diastolische bloeddruk verminderen na een 13 weken durende behandeling met tweemaal 60 mg per dag D-pinitol, terwijl de HDL cholesterol waarden stijgen. Bij patiënten met ongecontroleerde diabetes type 2 verlaagt een 12 weken lange therapie met 20 mg/kg/dag D-pinitol, bovenop de gewone therapie, de nuchtere en post-prandiale glucosewaarden evenals HbAc1 waarden, maar doet het gehalte adipónectine; leptine, C-reactief proteïne (CRP) en vrije vetzuren niet significant veranderen. Wanneer D-pinitol in een dosering van 20 mg/kg/dag wordt ingenomen over een kortere periode van 4 weken, heeft de stof geen effect op basale en insuline gemedieerd glucose of lipiden metabolisme bij insuline resistente patiënten. In niet diabetische oudere patiënten heeft D-pinitol inname gedurende 6 weken geen effect op insuline gemedieerde glucosemetabolisme.

De ontwikkeling van een analytische methode voor D-pinitol in Desmodium adscendens decoct is hiernavolgend weergegeven met de bijhorende validatie. Vooraleer uit plantenmateriaal een gestandaardiseerd preparaat geproduceerd kan worden, dient de concentratie van de actieve stof in de plant bekend te zijn. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een standaardmethode die herhaalbaar, accuraat, niet tijdsrovend is en ook , liefst economisch. Het doel van deze masterproef is het ontwikkelen van een analytische methode om het gehalte D-pinitol te bepalen in een decoct van Desmodium adscendens. Hiervoor werden verschillende parameters onderzocht zoals dë analysetechniek (GC, HPLC, TLC), de kolom, de detector en de eventuele opzuivering. Wanneer een mogelijke methode ontwikkeld is, zou deze ook gevalideerd worden via de ICH normen. Zo werd de lineariteit, de range, herhaalbaarheid, accuraatheid en specificiteit onderzocht.

Als materialen werd .vertrokken van methanol, HPLC grade met analytische kwaliteit, pyridine (99+%) BSTFA 1% TMCS, standaarden D-pinitol (95%), xylitol (99% minimum) en dulcitol (99+%), mannitol p.a. en sorbitol, helium, waterstofgas en lucht, natriumchloride (p.a.), D-(+)-galactosamine hydrochloride (99% minimum) en sylimarine.

Het decoct van Desmodium adscendens werd op de volgende manier bereid: aan 200 gram plantenmateriaal werd 3 liter gedistilleerd water toegevoegd. Het geheel werd gekookt gedurende 1 uur waarna het afgekoeld en afgefiltreerd werd. Volumereductie werd bekomen door evaporatie m.b.v. een rotavapor. Als laatste stap werd het decoct gelyofiliseerd.

Bij de techniek van dunne laag chromatografie bevindt de stationaire fase zich op een plastic of glazen drager. De stationaire fase kan silicagel of gemodifieerd silica zijn maar ook aluminiumoxide, cellulose of kieselgoer.

1-10 μΙ van de te analyseren oplossing werd op ongeveer 1,5 cm van de onderkant vap het plaatje gespot. Daarna werd de plaat in een ontwikkelingstank gebracht die een laag van ca. 1 cm mobiele fase bevatte. Door de capillaire krachten steeg de mobiele fase op en, afhankelijk van het karakter van de stoffen in de oplossing, elueerden de stoffen sneller of trager. Wanneer het vloeistoffront bijna de bovenkant van de plaat bereikte, werd deze uit de ontwikkelingstank gehaald en verdampte de mobiele fase. Nadien kon door middel van UV-licht of door behandeling met sproereagens een vlekkenpatroon zichtbaar gemaakt worden en de retentietijden berekend worden. Een kwalitatieve bepaling kan met behulp van een densitometer die de intensiteit van de vlekken meet en omzet in een densitogram.

Voor de experimenten werden silica gel F254 kieselgel TLC-platen, Lichrospher silica gel F254 HPTLC-platen en silica-gel 60 RP-18 F254 platen gebruikt.

Gaschromatografie GC is een analytische techniek waarbij d.m.v. verdeling tussen de stationaire vloeistoffase en een mobiele gasfase analieten gescheiden worden. Door de hoge temperatuur in het injectieblok verdampen tijdens het injecteren zowel het solvens als de analieten en condenseren ze op de koudere kolom. Door het verhogen van de kolomtemperatuur, komen ook de relatief minder vluchtige analieten in de gasfase en bereiken uiteindelijk de detector. Hoe apolairder en vluchtiger de analieten, hoe meer affiniteit voor de gasfase en hoe korter de retentietijd. Meer polaire of minder vluchtige analieten hebben meer affiniteit voor de polairdere stationaire fase en bereiken later de detector. Mogelijke detectoren zijn de vlamionisatiedetector, électron capture detector, stikstof-fosfor detector, katarometer, zwaveldetector en massaspectrometer.

Voor de experimenten werd een GC-FIQ gebruikt van het type Tracé GC Ultra met FID detector. Om de specificiteit na te gaan, werd een GC-MS gebruikt van het type Trace 2000 GC met een voyager El MS detector.

In deze experimenten werden een vlamionisatiedetector (FID) en een massaspectrometer (MS) gebruikt. De vlamionisatiedetector is een universele en gevoelige detector. Het eluaat werd vermengd met H2 en lucht, en verbrandt. Hierdoor ioniseren organische verbindingen en de ionen verhogen de stroomsterkte t.o.v. een collectorelectrode met constante spanning. De massaspectrometer werkt door ionisatie van moleculen, waarna de ionen gemeten worden.

Vloeistofchromatografie is een verdere analytische techniek waarbij de scheiding door een verschil in verdeling tussen de stationaire fase en de mobiele vloeistoffase gebeurt. Wanneer de stationaire fase polairder is dan de mobiele fase, wordt gesproken van “normale fase chromatografie”, terwijl wanneer de stationaire fase apolair is over “reversed phase chromatografie" wordt gesproken. De analieten werden geëlueerd met eluens waarvan de samenstelling, en dus ook de polariteit, kan gewijzigd worden om zo sneller of trager analieten te elueren. Mogelijke detectoren zijn UV-detectors, Rl-detectors, amperometrische detectoren, massaspectromeers en evaporatieve light scattering detectoren (ELSD).

Voor de experimenten werd een ELSD detector gebruikt, waarbij na verdampen van de mobiele fase, de lichtverstrooiing gemeten en omgezet werd in een elektrisch signaal.

Mogelijke analysemethoden van de analyse van suikers en suikerderivaten, o.a. suikeralcoholen zoals cyclitolen, zijn gekend. Voor de bepaling zijn meerdere technieken beschikbaar waarvan een kort overzicht hieronder wordt gegeven.

Zo o.m. GC technieken: omdat suikers en suikerderivaten niet vluchtig zijn, dient ook hier een derivatiestap ingevoegd te worden. Zowel trimethylsilering als acetylering zijn gekend. Als detector kan zowel een algemene vlamionisatiedetector als een massaspectometer gebruikt worden.

Verder HPLC technieken: daar de analieten niet UV-actief zijn, dienen ze gederivatiseerd te worden vooraleer een UV-detectie mogelijk is. UV-actieve stoffen worden gemaakt door o.a. derivatisatie benzylchloride of d.m.v. UV-actieve ion-pair reagentia. Naast UV-detectie kan ook refractieve index detectie, gepulseerde amperometrische detectie, massaspectrometrie of electron light scattering detectie, zonder derivatisatie, gebruikt worden. Zowel Ci8-kolommen als anion uitwisseling kolommen kunnen gebruikt worden. Wanneer anion uitwisseling kolommen worden gebruikt, worden de suikers omgezet in anionen met behulp van een base.

Andere mogelijke technieken zijn enzymatische essays, capillaire elektroforese en dunne laag chromatografie-densitometrie. Bij dunne laag chromatografie beschreven door Pothier wordt, gebaseerd op de fingerprinting door middel hiervan, geprobeerd om ook D-pinitol te scheiden van de andere stoffen in het decoct, omdat TLC methoden snel en relatief goedkoop zijn.

D-pinitol (standaard) en het staal werden opgelost in gedistilleerd water en 50% methanol-50 % water. Als mobiele fase werden ethyacetaat-mierenzuur-azijnzuur-water (67,5:7,5:7,5:17,5), chloroform - methanol - water (54,5:36,5:9), chloroform - methanol - water (55:36:9), chloroform - methanol - water (46,5:46,5:7) en chloroform - methanol - water (33:53,5:13,5) gebruikt.

D-pinitol was niet zichtbaar onder UV licht op de platen met UV indicator F254S, zelfs niet bij zeer hoge concentratie (10 mg/ml), terwijl bij gebruik van anijsaldehyde of thymol als sproeireagens, meerdere vlekken werden gezien bij de standaard.

Hierdoor werd beslist om een methode te ontwikkelen waarbij een andere analysetechniek gebruikt wordt. Omdat in de literatuur voldoende GC-methoden beschreven staan om D-pinitol te analyseren, gaschromatografie een meer gevoelige techniek is dan met HPLC-derivatisatie, werd beslist om een GC-methode te ontwikkelen.

Gebaseerd op de bepaling van D-chiro-lnositol in boekweit m.b.v. HPLC-ELSD, werd geprobeerd om een vloeistofchromatografische methode te ontwikkelen parallel met de gaschromatografische methode. De eerste experimenten gaven aan dat de herhaalbaarheid zeer laag was. Daarom werd deze methode niet verder geoptimaliseerd.

Aldus werd meteen overgegaan op gaschromatografie. Het is gekend om verschillende kolommen te gebruiken voor de analyse van suikers en suikérderivaten. In onderstaande tabel wordt een overzicht gegeven van enkele van deze kolommen.

Tabel 3.1

De kolommen DB-5 en HP-5 (5% fenyl 95% methylplysiloxaan) en AT™ - 5MS/RTX-5MS (5% fenyl polysilfenyleen siloxaan), van het type Alltech welke matig polair zijn, en de kolom AT™ -1/RTX-1 (100% methylpolysiloxaan) van het type Restek welke een kolom is met een apolaire stationaire fase, werden ingezet. Omdat een decoct bekomen wordt door plantenmateriaal in water op te koken en het dus voornamelijk polaire stoffen bevat, was verwacht dat de analieten meer retentie zou hebben op de 5% fenyl 95% methylpolysiloxaan kolom dan de 100% methylpolysiloxaan kolom, en dat dit een betere scheiding zou geven. Daarom werd de HP-5 kolom verkozen boven de AT™- 1/RTX-1 kolom voor de analyse van het decoct. Een kolom met cyanoalkylsiliconen als stationaire fase is de kolom AT™-264,6 % cyanopropylfenyl en 94% methylsiloxaan.

Een inwendige standaard moest verder bepaald worden. Omdat met gaschromatografie werd gewerkt, diende een inwendige standaard toegevoegd te worden om de variatie op de injectie te corrigeren. Een inwendige standaard moet qua gedrag gelijken op de te analyseren- stof. Daarom werd geopteerd voor enkele stoffen met structuur gelijkaardig als D^pinitol die beschikbaar waren, namelijk suikeralcoholen zoals sorbitol, mannitol, dulcitol, xylitol, en inositol, die hiernavolgend weergegeven zijn.

Monosacchariden zoals lactose werden echter niet gekozen omdat ze door anomerisatie twee pieken gaven in het chromatogram. Hierdoor vergroot de kans op interferentie met de inwendige standaard, m.a.w. is de kans groter dat pieken van het staal overlappen met deze van de , inwendige standaard. Bij disacchariden is er steeds kans op afbraak, wat moeilijk te controleren is en niet wenselijk is voor een kwantitatieve analyse. Suikers of suikerderivaten met een hoge moleculaire massa in vergelijking met D-pinitol elueren laattijdig en verlengen zodus de duur van de analyse, waardoor ook niet voor deze verbinding werd gekozen.

Van de vijf geselecteerde suikeralcoholen zijn dulcitol en inositol slecht oplosbaar in methanol, maar wel oplosbaar in water. Deze stoffen zijn geen eerste keuze omdat water en ook sporen van water afbraak kunnen veroorzaken van de TMS-derivaten, wat een kwantitatieve analyse niet ten goede komt. Een ander voordeel is dat water droogdampen langer duurt dan methanol. Daarenboven kunnen zeer kleine hoeveelheden, i.h.b. sporen, water niet met het blote oog gezien worden en zou een droogstof moeten gebruikt worden. Van deze stof dient dan ook de invloed op de analyse nagegaan worden.

Mannitol, sorbitol en xylitol zijn wel oplosbaar in methanol, maar de retentietijd van manni,tol en sorbitol overlapt met deze van een andere onbekende in het staal zoals zichtbaar uit onderstaande tabel 3.2. Xylitol elueert op een tijd waar geen andere stof elueert in het chromatogram en enkel ruis zichtbaar is. Ook structureel is xylitol een betere keuze dan mannitol of sorbitol omdat xylitol eenzelfde aantal hydroxylgroepen bevat als D-pinitol. Dit is belangrijk omdat de derivatiseringsreactie doorgaat ter hoogte van de hydroxylgroepen. Tabel 3.2 hieronder bevat een overzicht der retentietijden van de mogelijke inwendige standaarden.

Tabel 3.2

Wat de derivatisatie betreft kunnen suikerderivaten gederivatiseerd worden tot vluchtige derivaten door acetylering of silylering. In de literatuur worden verschillende reagentia gebruikt, o.a. BSTFA + TMCS in pyridine, HMDS + TFA, HMDS + TMCS in pyridine, STOX + HMDS + TFA, TMSI + pyridine, azijnzuuranhydride + pyridine, en AcO-N-methylimidazol. Onder al deze mogelijkheden werd gekozen om acetylering met azijnzuuranhydride en pyridine en trimethylsilylering met BSTFA + 1 % TMCS (+pyridine) uit te voeren en te vergelijken.

De acetylering werd uitgevoerd met azijnzuuranhydride en pyridine in een verhouding 2:1. Het derivatiseringsmengsel werd bij de afgewogen hoeveelheid vaste stof, D-pinitol , en sorbitol als inwendige standaard toegevoegd. Hierbij diende naar het juiste volume derivatiseringsmengsel gezocht te worden zodat D-pinitol erin oplosbaar is. Het mengsel werd ofwel 30 minuten verwarmd in de oven bij 60°C, ofwel werd de vial bij kamertemperatuur overnacht bewaard. Na het derivatiseren werden de stalen drooggedampt onder een stikstofstroom, waarna de derivaten heropgelost werden in ethylacetaat en geanalyseerd. Hiervoor werd een AT™-264 kolom gebruikt, naar analogie met de literatuur waar, vóór analyse van acetylatiederivaten (Ac20- N-methylimidazol), een DB-225 kolom wordt gebruikt. De temperatuur van de oven was 200°C en werd met 5°C/minuut verhoogd tot 220°C welke 20 minuten werd aangehouden.

De pieken hadden een zeer grote variatie wat betreft retentietijd en de herhaalbaarheid van de piekoppervlakten liet te wensen over. Een verklaring zou kunnen zijn dat de derivaten relatief gezien niet vluchtig genoeg zijn, daar er vijf hydroxylgroepen moeten gederivatiseerd worden.

Bij toepassing van Trimethylsilyering werden D-pinitol en sorbitol afgewogen en opgelost in 2 ml methanol. Sorbitol werd gebruikt voor de eerste derivatisatie-experimenten, pas later werd de inwendige standaard gekozen zoals hierboven beschreven. 100 pl werd drooggedampt ónder stikstofstroom en hierbij werd 100 microliter BSTFA + 1 % TMSC en 40 μΙ pyridine toegevoegd. De vial werd 3 uur bij 70°C in een oven bewaard. Daarna werd het derivatiseringsreagens weggedampt en werd het residu heropgelost in 300 μΙ hexaan: Elk niveau werd één maal afgewogen maar in duplo gederivatiseerd en in triplo geïnjecteerd. De reactie van de derivatisering van een stof met hydroxylgroep met BSTFA wordt hiernavolgend weergegeven :

Tabel 3.3 hieronder toont een overzicht van concentratieverhouding en oppervlakteverhouding voor D-pinitol /inwendige standaard.

Tabel 3.3

Figuur 4 toont een ijklijn bekomen na derivatiseren met BSTFA, die er lineair uitziet. Op het eerste zicht lijkt deze methode zodus lineair en ook de retentietijd blijft dezelfde. Uit de resultaten van de eerste experimenten kon afgeleid worden dat de cjerivatiseringsnnethode succesvoller is dan de acetylering. Met deze derivatiseringsmethode werd dan ook verder gewerkt.

Aldus werd met xylitol als gekozen inwendige standaard de derivatisatie verder bekeken. Er werd hierbij eveneens nagegaan of de reactieduur iets verandert aan de oppervlakten.

Een methanolische D-pinitol en xylitoloplossing werd bereid ter hoogte van respectievelijk (25 mg/50 ml) en (10 mg/50 ml). In maatkolfjes van 10 ml werd 2 ml inwendige standaard toegevoegd en een verschillende hoeveelheid D-pinitol. Daarna werd deze aangelengd. Van deze oplossing werd 500 pl drooggedampt onder een stikstofstroom. Bij elke vial werd 0,1 ml derivatiseringsmengsel toegevoegd en de vials werden gedurende 3 uur, 6 uur en overnacht in een oven geplaatst bij 70°C. Nadien werd het derivatiseringsreagens weggedampt, het residu heropgelost in 300 μΙ hexaan en in duplo ingespoten in de GC.

De tabel 3.4 hieronder geeft een overzicht van de concentratieverhouding, en oppervlakteverhouding na drie uur derivatiseren wijzend op lineariteit.

tabel 3.4

Figuur 5 is een grafische voorstelling van de concentratie- en oppervlakteverhoudingen na 3 uur derivatiseren.

De tabel 3.5 hieronder geeft een overzicht van de concentratie- en oppervlakteverhoudingen na 6 uur derivatiseren, terwijl Figuur 6 een grafische voorstelling is van.de concentratie- en oppervlakteverhoudingen na 6 uur derivatiseren.

tabel 3.5

De tabel 3.6 hieronder geeft een overzicht weer van de concentratie- en oppervlakteverhoudingen na overnacht derivatiseren, terwijl Figuur 7 een grafische voorstelling is van de concentratie- en oppervlakteverhoudingen na overnacht derivatiseren.

tabel 3.6

Ongeacht de derivatisatietijd is er een grote intervariabiliteit voor een punt met dezelfde concentratie zoals zichtbaar in figuren 5 tot 7 en in de 3 tabellen hierboven. Hieruit konden geen conclusies worden getrokken betreffende de volledigheid van de derivatiseringsreactie. Een ander probleem was dat wanneer stalen overnacht in de oven werden gelaten, er vials zijn die ’s morgens leeg waren en waarvan het derivatiseringsreagens waarschijnlijk verdampt was. Dit is ook niet wenselijk wanneer er kwantitatief wordt gemeten. Stalen 6 uur laten derivatiseren is praktisch gezien zeer moeilijk.

Er werd dan geopteerd om een verwarmingsblok te gebruiken om dit te voorkomen. Ook werden reactie-vials aangewend, welke de warmte beter geleiden. Met deze methode zou één uur derivatiseren voldoende zijn. Van een oplossing D-pinitol en xylitol ter hoogte van respectievelijk 12,5 mg/100 ml en 10 mg/50 ml werd 2 ml inwendige standaard en een verschillende hoeveelheid D-pinitol in 10 ml maatkolfjes gepipetteerd en aangelengd. Van deze oplossing werd 50 μΙ drooggedampt onder een stikstofstroom. Bij elke vial werd 50 μΙ derivatiseringsmengsel toegevoegd en de vials werden gedurende een uur in het verwarmingsblok geplaatst bij 70°C. Nadien werd 100 μΙ hexaan toegevoegd, gevortext en in duplo ingespoten in de GC. De tabel 3.7 hieronder toont een overzicht van de concentratie- en oppervlakteverhoudingen na een uur derivatiseren in een warmteblok terwijl Figuur 8 een grafische voorstelling hiervan is.

tabel 3.7

In een volgend experiment werd een hogere concentratie xylitol gebruikt en geen hexaan meer toegevoegd nadat de derivatiseringreactiê is doorgegaan. Hiermee werd een extra stap in de analÿseprocedure vermeden. De tabel 3.8 hieronder toont een overzicht van de concentratie- en oppervlakteverhoudingen na een uur derivatiseren in een warmteblok.

tabel 3.8

Wanneer de derivatiseringsreactie doorgaat in reactie-vials en in een thermisch verwarmingsblok, zijn er geen punten van de ijklijn meer die uitschieten. Er is dus een duidelijk verschil t.o.v. het gebruik van de oven. Wanneer beide grafieken vergeleken worden, blijkt dat het toevoegen van hexaan geen grote invloed heeft op de methode. Toch werd verkozen om deze stap over te slaan om niet onnodig solvent te gebruiken en om de analyse minder arbeidsintensief te maken.

Nu de extractie. Om kwantitatief te werken, moet ook de extractie van het staal volledig zijn. In volgend experiment werd gezocht naar de beste extractiemethode.

In een eerste experiment werd geëxtraheerd d.m.v. een ultrasoon trilbad. Hiervoor werd telkens ongeveer 100 mg staal afgewogen. Hierbij werd 2 ml inwendige standaard xylitol (18 mg/50 ml) toegevoegd en aangelengd tot 10 ml met methanol. Hiervan werd 50 μΙ drooggedampt, gederivatiseerd en ingespoten in de GC. In onderstaande tabel wordt een overzicht gegeven van de oppervlakteverhouding D-pinitol/xylitol wanneer 2, 3 of 4 keer geëxtraheerd wordt, en wanneer er meer volume gebruikt wordt. De tabel 3.9 hieronder toont een overzicht oppervlakteverhouding Ü-pinitol/inwendige standaard per 100 mg staal na verschillende keren extraheren op ultrasoon trilbad terwijl Figuur 10 een grafische voorstelling hiervan is, waarin 1 staat voor 2x extraheren, 2 voor 2x extraheren in 20 ml i.p.v. 10 ml, 3 voor 3x extraheren en 4 voor4x extraheren, resp.

Tabel 3.9

Uit de tabel hierboven en figuur 10 kan aldus geconcludeerd worden dat de extractie na twee of zelfs drie keer extraheren nog niet volledig is. Om te weten of de extractie na vier keer volledig is,. diende ze een vijfde keer uitgevoerd te worden. Dit was een te arbeidsintensief proces en er werd dus verder onderzocht hoe de stof het best geëxtraheerd wordt. Ook een groter volume speelt een rol : wanneer het volume verdubbelt, stijgt de oppervlakteverhouding eveneens.

In een volgend experiment werden de stalen in 50 ml en 100 ml methanol opgelost, samen met evenveel inwendige standaard als voorheen. De stalen werden 30 minuten resp. een uur gëtrild op het ultrasoon trilbad. Nadien werd een bepaalde hoeveelheid drooggedampt, gederivatiseerd en geanalyseerd. In onderstaande tabel 3.10 worden de gegevens weergegeven, welke een overzicht geeft van de oppervlakteverhouding D-pinitol/inwendige standaard per 100 mg staal na verschillende keren extraheren op één ultrasoon trilbad.

Tabel 3.10

Figuur 11 is een grafische voorstelling hiervan, waarin 1 staat voor 50 ml, 30 min, 2 voor 50 ml, 1 uur, 3 voor 100 ml, 30 min en 4 voor 100 ml, 1 uur, resp.

Wanneer een volume van 50 ml wordt gekozen, neemt de verhouding niet meer toe wanneer het volume vergroot wordt. Wel is er een significant verschil tussen 30 minuten of een uur extraheren zoals blijkt uit tabel 3.10 en figuur 11. Toch is de extractie op deze manier ook niet volledig aangezien de verhouding nog kleiner is dan deze na vier extracties in 10 ml methanol.

Uit voorgaande experimenten blijkt dat vooral de tijd vs. het aantal keren extraheren een belangrijke factor is. Doch wanneer een staal in het trilbad staat, warmt dit ook op, zodat ook de factor warmte dient nagegaan te worden. Onderstaande tabel geeft een overzicht van de oppervlakteverhouding D-p.initol/inwendige standaard per 100 mg staal na verschillende keren extraheren op een verwarmd ultrasoon trilbad.

Tabel 3.11

Figuur 10 is een grafische voorstelling hiervan, waarin 1 staat voor 1x extraheren, 2 voor 2x extraheren, 3 voor 3x extraheren en 4 voor 4x extraheren, resp.

Gemiddeld geeft de extractie in een verwarmd trilbad na twee keer extraheren een maximale opbrengst. Na één, drie of vier keer extraheren stijgt de verhouding niet meer. De verhouding na twee keer verwarmd ultrasoon trillen is opmerkelijk groter dan een maal een uur extraheren zonder warmte, zoals verwacht uit tabel 3.11 en figuur 12. Om de invloed van warmte na te gaan werd een andere techniek, t.w. refluxen, ook toegepast. Onderstaande tabel geeft een overzicht van de oppervlakteverhouding D-pinitol/inwendige standaard per 100 mg staal na verschillende keren extraheren op een verwarmd ultrasoon trilbad.

Tabel 3.12

De verhoudingen bekomen m.b.v. refluxen zijn vergelijkbaar na een, twee, drie en vier keer refluxen en ook wanneer een keer een uur wordt gerefluxt zoals blijkt uit tabel 3.12 en figuur 13. Om in de buurt van deze waarde te komen, dient minstens twee keer getrild worden in een ultrasoon trilbad. Ook liggen de waarden bekomen met refluxen net iets hoger. Of dit toeval is kan uit deze twee experimenten niet bevestigd worden. Toch blijkt hieruit dat refluxen de meest rendabele en minst arbeidsintensieve extractiemethode is zoals getoond in figuur 14.

Bij het uitwerken van een finale methode werd eerst gekeken naar de inwendige standaard oplossing waarbij 10,5 mg xylitol in een maatkolf werd afgewogen op een balans en opgelost in methanol. Er werd aangelengd tot 100 ml. Van deze oplossing werd 25 ml gepipetteerd in een maatkolf van 250 ml en aangelengd tot 250 ml. De hoeveelheid inwendige standaard gaf een verhouding D-pinitol/xylitol in het staal gelijk aan 1.

Vervolgens werd voor de staalvoorbereiding 100 mg van het decoct afgewogen in een rondbodemkolf. Daarna wérd 50 ml van de inwendige standaard oplossing toegevoegd. Dit mengsel werd gedurende 30 minuten gerefluxt. Na afkoelen werd dit overgebracht in een buisje en gecentrifugeerd gedurende 5 minuten aan 3000 g. Het supernatans werd overgebracht in een recipiënt. Hiervan werd 150 pl in een reactie-vial gepipeteerd en drooggedampt onder een stikstofstroom. Daarna werd 50 μΙ derivatiseringsreagens (BSTFA 1% TMCS - pyridine 2:1) toegevoegd en gevortext. De reactie-vials werden gedurende één uur verwarmd in het verwarmingsblok op 70°C. Na afkoelen van de vials werd de inhoud getransfereerd naar vials die compatibel zijn met de GC auto-injector.

Wat de analyse betreft werd er gewerkt met volgende temperatuursgradiënt: gedurende de eerste twee minuten was de temperatuur 65°C, daarna werd de temperatuur opgedreven tot 300°C aan 6°C/min. 300°C werd gedurende 15 minuten aangehouden. Er werd een gas gebruikt met een flow van 1,3 ml/min.

Nu de validatie van de methode. De validatie van analytische methodes gebeurde volgens de ICH richtlijnen. Volgens deze richtlijnen dient voor een assay de lineariteit, herhaalbaarheid en intermediaire precisie, accuraatheid, specificiteit en range geëvalueerd te worden.

Bij de bepaling van het calibratiemodel en range dient onder lineariteit te worden verstaan dat resultaten worden bekomen die evenredig zijn met de concentratie van het analiet in het staal. De , range is het interval tussen de laagste en hoogste concentratie analiet waarbinnen aangetoond is dat de analytische methode accuraat, precies en lineair is.

De responsfunctie werd bepaald door 5 standaarden, met een concentratie tussen 40 en 200% van de theoretische waarde, in duplo te injecteren. Om na te gaan of het calibratiemodel lineair is, wordt de ijklijn visueel geïnspecteerd en wordt lineaire regressie analyse uitgevoerd.

Figuur 15 toonfdat de responscurve er lineair uitziet en dus een rechte is.

Tabel 3.13

Tabel 3.13 toont de toepassing van regressieanalyse met een t-test op de helling en 95% confidentie interval snijpunt (0,0). Uit de regressieanalyse blijkt dat de correlatiecoëfficiënt. 0,999298 voldoende hoog is, m.a.w. > 0,99. Uit tabel 3.13 hierboven blijkt dat er een significante helling is van de rechte, wat. ook duidelijk visueel waar te nemen is in figuur 15. Wanneer het 95% confidentie-interval van het snijpunt wordt berekend, is het duidelijk dat de rechte niet door het punt (0,0) gaat.

De residuelen y, - <y,> worden uitgezet tegen x, of <y,> om na te gaan of de residuelen random verdeeld zijn, m.a.w. dat homoscedasticiteit geldt. Fig. 16 toont dat de residu’s gelijk verdeeld zijn en het model homoscedastisch is. Het residu dat het meest afwijkt heeft nog steeds een afwijking van minder dan 5% ten opzichte van de verwachte waarde.

Een ANOVA lack of fit test werd uitgevoerd om na te gaan of het model correct is. Wanneer het gemiddelde van de twee meetwaarden - per concentratie - te ver afwijkt van de ijklijn ten opzichte van de variantie tussen de twee meetwaarden, zou de F-waarde groter zijn dan de kritische en is het model fout gekozen. De berekende F-waarde is 0,7 en dus kleiner dan 4,534. Uit al deze gegevens blijkt dat het calibratiemodel lineair is.

Wat de precisie of herhaalbaarheid betreft wanneer met een bepaalde methode analyses worden uitgevoerd op hetzelfde staal, wordt verwacht dat de methode steeds dezelfde resultaten geeft. Hiervoor wordt de precisie of herhaalbaarheid van de methode nagegaan op verschillende niveaüs. De herhaalbaarheid op de injectie werd bepaald door eenzelfde staal 6 keer te injecteren. Op drie verschillende dagen werden 6 stalen geanalyseerd om de herhaalbaarheid binnen een dag en de intermediaire precisie na te gaan.

Ook op verschillende concentratieniveaus, nl. de laagste en hoogste concentratie van de range, bijvoorbeeld 50% en 200% van de theoretische waarde, werd de precisie geanalyseerd.

Om de herhaalbaarheid op de injectie te analyseren, werden van de meetresultaten volgende parameters berekend: het gemiddelde, de standaardafwijking en de relatieve standaardafwijking.

Tabel 3.14 hieronder toont de gehaltes D-pinitol voor zes injecties van hetzelfde staal met gemiddelde, standaardafwijking en relatieve standaardafwijking in procent uitgedrukt.

Uit deze tabel 3.14 volgt dat de standaardafwijking en de relatieve standaardafwijking zeer klein zijn, m.a.w. dat de injectie herhaalbaar is.

Tabel 3.14

Tegenover herhaalbaarheid en intermediaire precisie wordt naast dezelfde berekeningen als bij de precisie van de injectie, ook het 95% confidentie-interval, de binnen dag en tusseti dag variatie berekend. Hiertoe wordt een unifactoriële variantie analyse uitgevoerd, nl. een ANOVA single factor test. Hiervoor dient eerst nagekeken te worden of de varianties van de groepen niet significant van elkaar verschillen, anders mag er geen ANOVA test gebruikt worden. Tabel 3.15 hieronder toont een overzicht van de gehaltes D-pinitol op de verschillende dagen met gemiddelde, standaardafwijking, en relatieve standaardafwijking in procent uitgedrukt.

tabel 3.15

Wanneer deze tabel beschouwd wordt, blijkt dat de standaardafwijkingen klein zijn en deze van dag 2 kleiner is, ongeveer de helft, dan deze van de andere dagen. Ook de variantiecoëfficiënten zijn eerder gering. Om na te gaan of er een verschil is tussen de resultaten van de verschillende dagen, werd een ANOVA test uitgevoerd. Vooraleer deze test uit te voeren, diende nagegaan te worden of de varianties gelijk zijn. Hiervoor wordt de Cochran test gebruikt waarvan de formule , (1) hieronder gegeven wordt:

(1)

Tabel 3.16 hieronder toont een samenvatting van de varianties voor de verschillende dagen en berekende en kritische Cochran waarde.

,7

Tabel 3.16

Deze tabel leert dat de berekende Cochran waarde kleiner is dan de kritische waarde. M.a.w. worden de varianties als gelijk beschouwd wat betekent dat een ANOVA test kan uitgevoerd worden.

Tabel 3.17 hieronder toont een overzicht van de variantie analyse: kwadratensom, vrijheidsgraden, gemiddelde kwadraten en F-waarden.

Tabel 3.17

De berekende F-waarde is groter dan de kritische F-waarde. Hieruit kan besloten worden dat er een verschil is tussen de resultaten van de verschillende dagen. Om na te gaan of de afwijking nog aanvaardbaar is wordt de RSD%tUssen vergeleken met de 2/3 RSD%Horwitz >wat een schatting geeft van de maximale RSD% die in eenzelfde labo mag gemaakt worden. De formule (2) houdt enkel rekening met de concentratie en is de volgende:

met C de concentratie (m/m) (2)

Tabel 3.18 hieronder toont standaardafwijkingen, relatieve standaardafwijkingen uitgedrukt in procent, RSDHOrowitz en maximale relatieve standaardafwijkingen.

Tabel 3.18

Op deze tabel is te zien dat de RSD% tussen kleiner is dan de RSDmax waaruit kan besloten worden dat de methode toch precies is, ondanks er toch verschillen werden aangetoond met de ANOVA test. Vermits de RSD% op de resultaten binnen eenzelfde dag erg klein zijn, vergroot de kans dat er een significant verschil zal gevonden worden met de ANOVA test. Figuur 17 is een grafische voorstelling van de individuele metingen en gemiddelden op verschillende dagen, waarin te zien is dat de metingen onderling overlappen.

Tabel 3.19

De intermediaire precisie op verschillende concentratieniveaus is hiernavolgend onderzocht. In tabel 3.19 hierboven worden de gehaltes aan D-pinitol in 50 mg, 100 mg en 200 mg staal weergegeven met per reeks het gemiddelde, standaardafwijking en relatieve standaardafwijking. Aldus geeft deze tabel 3.19 een overzicht van de gehaltes D-pinitol op de verschillende dagen met gemiddelde, standaardafwijking, en relatieve standaardafwijking in procent uitgedrukt.

Uit deze tabel blijkt dat de fout op de standaardafwijking t.o.v. elk gemiddelde overal in dezelfde grootteorde ligt. Om na te gaan of er een significant verschil is tussen de metingen bij verschillende concentratieniveau's werd ook hier een ANOVA test uitgevoerd nadat bevestigd werd dat de varianties niet significant verschillend zijn.

Tabel 3.20 hieronder toont een samenvatting van de varianties voor de verschillende dagen en berekende een kritische Cochran waarde.

Tabel 3.20

Ook hier is de berekende Cochran waarde kleiner dan de kritische waarde waaruit besloten kan worden dat er geen significant verschil tussen de varianties van de verschillende groepen kan aangetoond worden.

Onderstaande tabel 3.21 toont een overzicht van de variantie analyse: kwadratensom, vrijheidsgraden, gemiddelde kwadraten en F-waarden.

Tabel 3.21

Uit de ANOVA test in tabel 3.21 hierboven volgt dat de berekende F-waarde groter is dan de kritische F-waarde en dat er dus een significant verschil is tussen de verschillende groepen. Grafisch overlappen de resultaten bij 50% en 200% niet met alle resultaten bij 100%. Toch is de variatie tussen de groepen nog aanvaardbaar voor de methode, daar de relatieve standaardafwijking in procent uitgedrukt, de variantiecoëfficiënt, kleiner is dan de RSDmax, de . maximale afwijking die in een labo mag gevonden worden.

Tabel 3.22 hieronder toont standaardafwijkingen, relatieve standaardafwijkingen uitgedrukt in procent, RSDH0rowitz en maximale relatieve standaardafwijkingen.

Tabel 3.22

Wanneer de grafiek van Figuur 16 beschouwd wordt, kan besloten worden dat er geen trend is wat betreft de concentratieniveaus. Hieruit kan ook besloten worden dat er voldoende solvent wordt gebruikt en er geen probleem met de oplosbaarheid is, anders zouden de waarden stijgen naarmate het aantal mg staal afneemt.

Wat de accuraatheid betreft, zijn er drie soorten proefopzetten mogelijk om na te gaan of de waarde die gemeten wordt ook de juiste waarde is: de proefmengselmethode, de standaardadditiemethode en de vergelijking met een algemeen aanvaarde methode. Enkel de standaardadditiemethode kan hier toegepast worden, daar er van hét plantenmateriaal gèen gereconstitueerd product kan gemaakt worden, aangezien immers alle bestanddelen niet gekend zijn, en er nog geen aanvaardbare methode aanwezig is vermits er één diende ontwikkeld te worden. De standaardadditiemethode houdt in dat aan een hoeveelheid staal een gekende hoeveelheid standaardoplossing wordt toegevoegd. Daarna wordt nagegaan hoeveel van de stof er wordt teruggevonden aan de hand van volgende formule:

Tabel 3.23 hieronder toont de recovery waarden met gemiddelde, standaardafwijking, relatieve standaardafwijking en 95% confidentie-interval.

Tabel 3.23 ) /

Overeenstemmende Figuur 19 is een grafische voorstelling van de teruggevonden waarden na standaardadditiemethode, waarin 1 = 50% toegevoegd; 2 = 100% toegevoegd; 3 = 125% toegevoegd.

Tabel 3.24 hieronder toont de recovery waarden met gemiddelde, standaardafwijking, residuele standaardafwijking en 95% confidentieinterval.

Tabel 3.24

Zoals tevens op de overeenstemmende Figuur 20 die de teruggevonden waarden voorstelt na standaardadditiemethode, waarin 1 = 50% toegevoegd; 2 = 100% toegevoegd; 3 = 125% toegevoegd, liggen de waarden waar 50% werd toegevoegd, iets lager dar) waar 100% of 125% werd toegevoegd. Om na te gaan of dit enkel variatie is, diende het experiment nog een keer herhaald te worden. Algemeen werd iets meer dan 100% teruggevonden, wat wel verrekend moet worden wanneer analyses worden uitgevoerd. Hierbij dient ook nog opgemerkt te worden dat het recovery experiment enkel relatieve systematische fouten aan het licht brengt en geen absolute, daar de matris vóór en na toevoegen dezelfde is.

Wat de specificiteit betreft werd de analyse herhaald met massaspectrometrische detectie om na te gaan of enkel het analiet werd gemeten en geen andere stoffen. Ook werd de analyse uitgevoerd zonder inwendige standaard om na te gaan of er toch geen andere stof elueerde op dezelfde tijd. Figuur 21 toont een gedeeltelijk chromatogram van de analyse zonder inwendige standaard. Op 20 tot 21 minuten waren geen interferenten zichtbaar.

Figuur 22 toont een gedeeltelijk chromatogram van de analyse met inwendige standaard. Op de plaats waar xylitol zit in het chromatogram zitten geen interferenten.

Ook de massaspectroscopische analyse bevestigde dat de methode specifiek is. De bijhorende massaspectra zijn in de desbetreffende fig. 25 e.v. weergegeven waar fig. 23 een volledig chromatogram van de analyse zonder inwendige standaard die de spanning in mV weergeeft i.f.v. minuten.

Fig. 24 toont een volledig chromatogram van de analyse van de standaarden die de.spanning in mV i.f.v. minuten, waar de Piek bij Rt = 20 min. Xylitol is, terwijl de piek bij Rt = 22,45 D-pinitol is. Fig. 25 tot 28 tonen resp. de specificiteit via een massaspectrum standaard xylitol; xylitol in staal; D-pinitol staal en standaard D-pinitol, die de relatieve overvloed in % weergeeft in functie van het grootste signaal.

Wat de in vivo evaluatie van het hepatoprotectief effect van Desmodium adscendens decoct betreft, heeft D-pinitol een hepatoprotectieve werking. Eén van de inhoudstoffen van Desmodium adscendens is D-pinitol. Voor de in vivo evaluatie van het hepatoprotectief effect van Desmodium adscendens decoct blijkt uit voorgaande analyses dat het decoct van de plant oorspronkelijk ongeveer 0,65% D-pinitol bevat, wat echter nier meer representatief is. In dit in vivo experiment werd de preventieve werking van een decoct van Desmodium adscendens tegen leverschade geïnduceerd door galactosamine, nagegaan op ratten. Als referentiemiddel wordt silymarine gebruikt. Silymarine is een mengsel van verschillende flavanolignanen van de vruchten van de Mariadistel, Silybum marianum. De hoofdbestanddelen zijn silybine, silychristine en silydianine. Daarnaast komt nog een kleine hoeveelheid isosilybine voor in de Mariadistel.

Aldus werd een aantal in vivo experimenten in proefdieren uitgevoerd met het oog op de, optimalisatie van de toegediende dosis en het behandelingsschema en het nagaan van een eventueel gunstig effect op leverschade door ethanol maar ook met acetaminophen.

In het uitgevoerde experiment werd volgend schema gebruikt voor zes groepen proefdieren: Desmodium decoct 20 mg/kg ;

Desmodium decoct 5 mg/kg ; D-pinitol 20 mg/kg ;

Silymarine 20 mg/kg (positieve controle) ; .

y~

Geen behandeling, enkel galactosamine intoxicatie met dosis 650 mg/kg (negatieve controle) ;

Geen behandeling, geen intoxicatie.

Het behandelingsschema was als volgt :

Dag 0 : voorbehandeling met Desmodium decóct : 20 mg/kg of 5 mg/kg „ r voorbehandeling met D-pinitol : 20 mg/kg voorbehandeling met Silymarine : 20 mg/kg Dag 1 : voorbehandeling met Desmodium decoct : 20 mg/kg of 5 mg/kg voorbehandeling met D-pinitol : 20 mg/kg voorbehandeling met silymarine : 20 mg/kg onmiddellijk gevolgd door gelactosamine toediening Dag 2 : alle groepen bloedafname (24 h) behandeling met Desmodium decoct: 20 mg/kg of 5 mg/kg behandeling met D-pinitol : 20 mg/kg behandeling met silymarine : 20 mg/kg Dag 3 :alle groepen bloedafname (48 h).

De volgende drie controlegroepen dienden in elk experiment aanwezig te zijn:

Silymarine 20 mg/kg (positieve controle) ;

Geen behandeling, enkel galactosamine intoxicatie 650 mg/kg (negatieve controle); ° Geen behandeling, geen intoxicatie.

In het uitgevoerde experiment bleek het effect na 24 h nog niet zo uitgesproken te zijn, wel na 48 h. Daarom werd er in opvolgexperimenten geen 24 h bloedafname gedaan, maar pas na 48 h, gevolgd door een tweede afname na minstens opnieuw 24 h, en eventueel een derde bloedafname op een nog later tijdstip.

Optimalisatie van dosis en behandelingsschema werc| uitgevoerd in experimenten met D-pinitol. Daarna werd deze dosis berekend naar Desmodium decoct voor een nieuw experiment.

Om het hepatoprotectief effect van het te testen preparaat na te gaan, ondergingen aldus de geselecteerde proefdieren, namelijk Sprague Dawley ratten, een voorbehandeling op dag 0 en dag 1, vooraleer het hepatotoxisch agens toegediend werd (dag 1). Op dag 2 volgde dan nog een éénmalige nabehandeling. Zowel het Desmodium decoct, het zuivere actieve bestanddeel D-pinitol, als de positieve controle silymarine werden oraal toegediend door gavage.

Dit resulteerde in de voorgenoemde 6 testgroepen, nl.

Controle geen hepatotoxisch agens (vehiculum), geen behandeling (vehiculum)

Hepatotox: hepatotoxisch effect, geen behandeling (vehiculum)

Desmodiuml : hepatotoxisch effect, behandeling met Desmodium equivalent met 20 mg/kg D-pinitol

Desmodium2 hepatotoxisch effect, behandeling met Desmodium equivalent met. 5 mg/kg D-pinitol D-pinitol : hepatotoxisch effect, behandeling met zuiver D-pinitol 20 mg/kg

Silymarine: hepatotoxisch effect, behandeling met silymarine 20 mg/kg.

Samengevat was het behandelingsschema als volgt. Op dag 0 en dag 1 werd een voorbehandeling gegeven met één-van de testpfépafàten. Na de voorbehandeling kregen dé betreffende groepen proefdieren op dag 1 een hepatotoxisch product toegediend: D-galactosamine 650 mg/kg IP 2% in fysiol. opl. Op dag 2 wordt eveneens een behandelingsdosis toegediend. Op dag 2 en dag 3 werd 1,5 ml bloed gecollecteerd uit de startvene. De leverschade en het eventueel hepatoprotectief effect werd geëvalueerd door in serum de volgende paramaters te bepalen: ALT (= GPT), AST (= GOT), ALP.

De resultaten van die proeven waren als volgt waarvoor verwezen wordt naar de desbetreffende tabellen en figuren. Na toediening van het hepatotoxisch agens D-galactosamine kon zowel na 24 uur als na 48 uur leverschade vastgestéld worden door een sterke stijging van de drie bepaalde parameters (controle vs. hepatotox).

Na 24 uur was voor AST (GOT) en ALP geen significante daling vast te stellen voor geen enkele behandeling t.o.v. de hepatotoxische groep, dus ook niet voor de positieve controle silymarine. Voor ALT (GPT) was er wel een significante daling voor beide Desmodium groepen en voor silymarine.

Na 48 uur waren de resultaten meer uitgesproken: zowel AST (GOT) en ALT (GPT) zijn significant gedaald in vergelijking met de hepatotoxische groep voor alle behandelingen: beide

Desmodium dosissen, D-pinitol en Silymarine. Enkele opvallende vaststellingen bestaan erin dat de laagste Desmodium dosis (equivalent met 5 mg/kg D-pinitol) reeds een zeer uitgesproken effect heeft die vergelijkbaar is met de hoogste dosis (equivalent met 20 mg/kg D-pinitol); dat beide Desmodium dosissen actiever zijn dan, of minstens even actief als silymarine; en dat beide Desmodium dosissen actiever zijn dan of minstens even actief als 20 mg/kg zuiver D-pinitol.

.Wat betreft de ALP parameter, was er na de toegepaste behandeling nog geen effect waar te nemen. Mogelijk dient daarvoor langer behandeld te worden.

Aldus kan besloten worden dat het hepatoprotectief effect van het gestandardiseerde Desmodium adscendens preparaat in het gebruikte behandelingsschema duidelijk aangetoond is. Verder onderzoek naar de dosisafhankelijkheid van het effect is aangewezen, gezien de goede resultaten verkregen met de laagste dosis Desmodium decoct. Ook het effect van langere voorbehandeling, van een therapeutische behandeling die pas start na toediening van het hepatotoxische agens, en een combinatie van beide, kan verder onderzocht worden, mogelijks op een meer uitgebreide set van parameters voor leverschade.

Een experiment bestond in het opstellen en uitvoeren van een experiment met ethanol-geïnduceerde leverschade -in plaats van galactosamine-, met dezelfdè Desmodium decoct dosissen als in een vorig experiment.

De antihepatotoxische activiteit van een gestandaardiseerd Desmodium adscendens decoct en D-pinitol tegen chemisch geïnduceerde leverschade in ratten werd onderzocht, met name het beschermend effect van Desmodium adscendens decoct tegen ethanol-geïnduceerde leverschade.

Het doel van het experiment is de evaluatie van de hepatoprotectieve effecten van een decoct van Desmodium adscendens tegen ethanol-geïnduceerde leverschade, gestandaardiseerd op zijn belangrijkste inhoudsstof D-pinitol.

Materialen en methoden : 66 mannelijke Wistar ratten van 200-225g (Charles River, Brussel, België) werden random verdeeld in 6 groepen: de negatieve controle groep (CON: geen hepatotoxisch agens, geen behandeling: 8 ratten), de hepatotoxische groep (HEP: inductie van hepatotoxiciteit, geen behandeling: 20 ratten), de Desmodium I groep (inductie van hepatotoxiciteit, behandeling met Desmodium adscendens decoct, equivalent aan 2 mg/kg D-pinitol: 10 ratten), de Desmodium II groep (inductie van hepatotoxiciteit, behandeling met

Desmodium adscendens decoct, equivalent aan 10 mg/kg D-pinitol: 10 ratten), de D-pinitol groep (PIN: inductie van hepatotoxiciteit, behandeling met 10 mg/kg D-pinitol: 10 ratten), de positieve controle groep (SIL: inductie van hepatotoxiciteit, behandeling met 20 mg/kg Silymarine: 8 ratten). 2 dagen voor ethanol toediening, werd een geschikte hoeveelheid van gelyofiliseerd decoct, pinitol of Silymarine gesuspendeerd in water en toegediend door gavage (of vehiculum voor de controle groep). Hepatotoxiciteit werd geïnduceerd door dagelijks orale gavage met een 55% ethanol oplossing (uitgezonderd de negatieve controle groep). Een initiële dosis van 2g/kg ethanol werd gradueel verhoogd tot een dosis van 6g/kg gedurende de eerste week van het experiment. Ethanol werd toegediend gedurende een periode van 7 weken. Dagelijks werd, afhankelijk van de groep, specifiek behandeld met het decoct, pinitol of Silymarine (orale gavage) tot het einde van het experiment. Voor ethanol toediening (basiswaarden), en in weken 3, 4, 5 en 6 werden bloedstalen (1.5 ml) genomen uit de laterale staartvene (Multivette 600, Sarstedt). Dit experiment werd goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven van de Universiteit Antwerpen (17-01-2011, 2010-37).

Een schematisch overzicht van de verschillende behandelingsgroepen is hiernavolgend gegeven. Enzymconcentraties van aspartaat transaminase (AST, GOT) en alanine transaminase (ALT, GPT) werden in de serumstalen van de proefdieren bepaald door middel van routine laboratorium technieken (Senior, 2009). Verhoogde levels kunnen worden beschouwd als een indicatie van levercel destructie of een verandering in membraan permeabiliteit.

Statistiek : om het verschil tussen CON en HEP te analyseren voor AST en ALT, en tussen HEP en DES 1, DES 2, PIN en SIL voor AST en ALT, werd een mixed model analyze uitgevoerd. De log-rank test werd uitgevoerd voor de statistische analyse van de overlevingsdata.

Resultaten

Serum AST en ALT waarden in weken 4, 5 en 6 van de studie worden getoond in tabellen 1-6, en figuren 1-3, 5-7. Gemiddelde AST en ALT waarden op verschillende tijdspunten (weken 0, 2-6) worden getoond in figuren 4 en 8. Tabellen 7 en 8 en figuur 9 tonen de overlevingstijd in de verschillende diergroepen.

Serum AST

Tabel 2.1

Tabel 2.1 hierboven toont Serum AST waarden na 4 weken van ethanol toediening.

Figuur 1. toont Serum AST waarden na 4 weken van ethanol toediening; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 CON versus HEP; +p<0,05 HEP versus DES 1, DES2, PIN, SIL (Mixed model analyse).

Tabel 2. hieronder toont Serum AST waarden na 5 weken van ethanol toediening.

Figuur 2. toont Serum AST waarden na 5 weken van ethanol toediening; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 CON versus HEP; +p<0,05 HEP versus DES 1, DES2, PIN, SIL (Mixed model analyse).

Tabel 3. hieronder toont Serum AST waarden na 6 weken van ethanol toediening.

!

Figuur 3. toont Serum AST waarden na 6 weken van ethanol toediening; * p<0,05; ** p<0,01;,, *** p<0,001 CON versus HEP; +p<0,05 HEP versus DES 1, DES2, PIN, SIL (Mixed model änalyse).

Figuur 4. toont Gemeelde AST waarden per tijdspunt (weken 0,2,3,4,5,6).

Serum ALT

Tabel 4. hierboven toont Serum ALT waarden na 4 weken van ethanol toediening.

Tabel 5-,.

Tabel 5. hierboven toont Serum ALT waarden na 5 weken van ethanol toediening.

Figuur 5. toont Serum ALT waarden na 4 weken van ethanol toediening; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 CON versus HEP; +p<0,05 HEP versus DES1, DES2, PIN, SIL (Mixed model analyse).

Figuur 6. toont Serum ALT waarden na 5 weken van ethanol toediening; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 CON versus HEP; tp<0,05 HEP versus DES 1, DES2, PIN, SIL (Mixed model analyse).

Tabel 6. hieronder toont Serum ALT waarden na 6 weken van ethanol toediening.

Figuur 7. toont Serum ALT waarden na 6 weken van ethanol toediening; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 CON versus HEP; +p<0,05 HEP versus DES 1, DES2, PIN, SIL (Mixed model analyse).

Figuur 8. toont Gemiddelde ALT waarden per tijdspunt (weken 0,2,3,4,5,6).

Mortaliteit

Tabel 7. toont Overleving van de proefdieren in de testgroepen over een periode van 6 weken.

Figuur 9. toont Overleving van de proefdieren in de test groepen over een periode van 6 weken. Tabel 8. toont Log-rank test voor bepaling van verschil in overleving van de proefdieren over een periode van 6 weken.

In dit experiment, waarbij het preventief effect van Desmodium adscendens decoct tegen ethanól-geïnduceerde leverschade werd geëvalueerd, toonde de hepatotoxische groep (HEP) significant verhoogde serumlevels van AST en ALT na 4 weken van dagelijkse ethanol toediening (Fig. 1-3,5-7). Behandeling met Desmodium adscendens (2 mg/kg en 10 mg/kg), pinitol (10 mg/kg) of Silymarine (20mg/kg) werd gestart 2 dagen voor ethanol toediening en dagelijks verder gezet tot het einde van het experiment, 6 weken later. Zoals getoond in figuren 1-3 en 5-7 werd voor geen enkele behandeling een significante daling waargenomen met betrekking tot serum AST (Fig. 1, 2, 3 na behandeling van resp. 4, 5 en 6 weken) en ALT levels (Fig. 5, 6 en 7, na behandeling van resp. 4, 5 en 6 weken).

Evaluatie van de mortaliteit van de dieren in de verschillende behandelingsgroepen (Fig. 9; Tabel 7), toonde een grote uitval in de onbehandelde hepatotoxische groep (HEP), terwijl overleving in DES 2 beter was. Bovendien overleefde, na 6 weken van ethanol-toediening, 60% van de ratten die Desmodium adscendens decoct kregen, terwijl de overleving in de pinitol en Silymarine behandelde groepen respectievelijk 40% en 22% was. Statistische analyse van de overlevingsdata (Tabel 8) toonde een statistisch significant verschil in overleving tussen controle en hepatotoxische groep (p < 0,01), en een trend naar significantie (p = 0,06) tussen de Desmodium adscendens groep DES 2 (eq. aan 10 mg/kg pinitol) en de onbehandelde hepatotoxische groep. Er werd geen statistisch verschil van de DES 1 groep (eq. aan 2 mg/kg pinitol), pinitol groep (10 mg/kg) of silymarine groep (20 mg/kg) met de hepatotoxische groep waargenomen.

.Aangezien een periode van ten minste 4 weken nodig bleek om significante ethanol-geïnduceerde hepatotoxische effecten in ratten te veroorzaken en een grote uitval van de onbehandelde hepatotoxische dieren werd geobserveerd, was het niet mogelijk de hepatocuratieve effecten van Desmodium adscendens decoct in dit experiment te onderzoeken.

Een verder experiment bestond in het opstellen en uitvoeren van een experiment met acetaminophen-geïnduceerde leverschade in plaats van galactosamine.

Het experiment had tot doel de evaluatie van de hepato-curatieve effecten van een afkooksel van Desmodium adscendens, gestandardiseerd op zijn hoofdcomponent D-pinitol, tegen acetaminofen (paracetamol) -geïnduceerde leverschade.

De hiertoe aangewende materialen en methoden bestonden in 40 mannelijke Wistar ratten van 200-225g die random verdeeld werden in 5 groepen: de negatieve controle groep (CON: geen hepatotoxisch agens, geen behandeling: 8 ratten); de hepatotoxische groep (HEP: inductie van hepatotoxiciteit, geen behandeling: 8 ratten); de Desmodium I groep (inductie van hepatotoxiciteit, behandeling met Desmodium adscendens decoct, equivalent aan 2 mg/kg D-pinitol : 8 ratten); de Desmodium ll groep (inductie van hepatotoxiciteit, behandeling met Desmodium adscendens decoct, equivalent aan 10 mg/kg D-pinitol : 8 ratten); de positieve controle groep (SIL: inductie van hepatotoxiciteit, behandeling met 20mg/kg silymarine: 8 ratten). Acute hepatotoxiciteit werd geïnduceerd door orale gavage met 2 g/kg acetaminofen (behalve .de controle groep). 24 h na hepatotoxiciteit-inductie, werd behandeling geïnitieerd met de juiste hoeveelheid (zie hoger) gelyofiliseerd afkooksel van Desmodium adscendens of silymarine, gesuspendeerd in water en toegediend door gavage (of vehiculum voor de controle en hepatotoxische groepen). Bloedstalen werden afgenomen uit de laterale start vene (1,5 ml, Multivette 600, Sarstedt) 24h, 48h en 72h na acetaminofen toediening. Dit experiment werd goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven van de Universiteit Antwerpen (17-01-2011, 2010-37).

Een schematisch overzicht der verschillende behandelingsgroepen is hierna weergegeven: CON: geen acetaminofen, geen behandeling HEP: 2g/kg acetaminofen, geen behandeling DES 1: 2g/kg acetaminofen, Desmodium adscendens behandeling equivalent met 2 mg/kg D-pinitol DES 2: 2g/kg acetaminofen, Desmodium adscendens behandeling equivalent met 10 mg/kg D-pinitol SIL : 2g/kg acetaminofen, silymarine behandeling (20 mg/kg).

Enzymeniveaus van aspartaat transaminase (AST, GOT) en alanine transaminase (ALT, GPT) werden bepaald in serumstalen van proefdieren met routine laboratorium technieken (Senior, 2009). Verhoogde gehalten kunnen worden beschouwd als indicatie van levercel destructie of een verandering in membraan permeabiliteit.

Statistisch gezien werd, om het verschil tussen CON en HEP voor AST en ALT, en tussen HEP en DES 1, DES 2, en SIL voor AST en ALT, te analyseren, een One way ANOVA uitgevoerd, gevolgd door Dunnett post-hoc test (SPSS-statistiek programma).

De resultaten voor Serum AST en ALT waarden bij 48h en 72h na acetaminofen toediening worden getoond in de tabellen 1-4, en figuren 1-3.

Tabel 1

Tabel 2

Figuur, toont Serum AST waarden 48h na acetaminofen toediening; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 CON versus HEP (Statistiek : One-Way Anova, Dunnett post-hoc versus HEP).

Serum ALT

Tabel 3 & 4 tonen Serum ALT waarden 48 en 72h na acetaminofen toediening.

Figuren, tonen Serum ALT waarden 48h en 72h na acetaminofen toediening; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 CON versus HEP (Statistiek : One-Way Anova, Dunnett post-hoc versus HEP).

In dit experiment, dat het curatief effect van Desmodium adscendens décoct tegen acetaminofen-geïnduceerde leverschade evalueerde, toonde de hepatotoxische groep (HEP) significant verhoogde niveaus van serum AST en ALT op 24h en 48h na acetaminofen-toediening (p < 0,001), en ook op 72h na acetaminofen-toediening voor ALT (p < 0,05). Een orale behandeling van Desmodium adscendens (2 mg/kg en 10 mg/kg) of Silymarine (20 mg/kg, positieve controle groep) werd 24h en 48h na acetaminofen-toediening gegeven. Zoals getoond in figuren 1-3 kon voor geen enkele behandeling een significante daling (p > 0,05) geobserveerd worden voor serum AST en ALT levels bij bloedstaalname punten 48h en 72h. De resultaten van dit experiment in een ratmodel van acute leverschade, geïnduceerd door acetaminofen, tonen aan dat Desmodium adscendens geen hepatocuratief effect heeft wanneer toegediend in een dagelijkse dosis tot 10 mg/kg.

Tenslotte werd een zogenoemde AMES test uitgevoerd op stalen UA: Desmodium extract. Het extract werd overeenkomstig de OECD-richtlijn getest met 5 Salmonella typhimurium stammen (TA98, TA100, TA102, TA1535 en TA1537) in de aan- en afwezigheid van een metaboliserende S9-fractie. Voor dit experiment werd gewerkt met nieuwe stammen, resp. ook S9 en andere benodigdheden zoals NADPH, petriplaten, enz.

In overeenstemming met de richtlijnen werd vertrokken van een maximale testconcentratie van 5 mg/plaat waarna verdunningen werden uitgevoerd met 6 dosissen. Een negatieve (solvent) controle werd gebruikt met 4 petriplaten, zowel als een positieve controle met 3 petriplaten. Positieve controles maken deel uit van de aanbevolen lijst controles in de aanbevolen testconcentratie. Er is een lijst van positieve controles die we gebruikten, en hun concentratie.

Er werden voor elke concentratie dus drie petriplaten gemaakt en voor de negatieve controle 4. De resultaten gaven het gemiddelde hiervan weer, met name gemiddelde aantal revertanten ± SD. De test is gelukt wanneer de negatieve en positieve concentraties binnen de verwpchte range liggen en er geen tekenen van toxiciteit te zien waren. Dit werd nagegaan door de achtergrondlaag bacteriën na te kijken waarbij de afwezigheid van een achtergrbndlaag op toxiciteit duidt. Er werden geen tekenen van toxiciteit gevonden en alle stammen en controles gaven de verwachte respons op TA102 na. Een teststof is positief “mutageen” wanneer er een verdubbeling van het aantal revertanten wordt waargenomen t.o.v. de negatieve (solvent) controle en wanneer een dosis-effect relatie wordt waargenomen.

Een synthese der resultaten is hieronder weergegeven.

Bovenstaande gegevens wijzen erop dat het monster niet mutageen is in de stammen TA98, TA100 en TA1535, en dit zowel in de aan- als afwezigheid van S9. Voor TA1537 werd in aanwezigheid van S9 bij de hoogste concentratie t.w. 5 mg/plaat, net een verdubbeling van de mutatiefrequentie gevonden t.o.v. de negatieve controle, maar geen uitgesproken dosis-effect relatie. Voor alle zekerheid werd de test herdaan. Er werd geen dosis-effect relatie gevonden en ook geen verdubbeling t.o.v. de controle, wat doet besluiten dat er ook geen mutageen effect is gevonden in stam TA1537.

Experimenteel kon worden vastgesteld dat er vrijwel geen mutageen effect is. Het Desmodium extract is niet mutageen in de Ames test, noch in de afwezigheid, noch in de aanwezigheid van een metaboliserende S9 fractie. Er is wel een toename van het aantal spontane revertanten waar te nemen bij de hoogste dosis maar deze was niettemin onvoldoende groot om van mutageniciteit te mogen spreken. Herhaalexperimenten (tenminste 1 per stam) bevestigen de afwezigheid van mutageniciteit.

Claims (39)

1. Werkwijze voor het vervaardigen van een op pinitol gekwantificeerd plantenextract, waarbij uit de Desmodium familie een plant geselecteerd wordt Desmodium adscendens, waarbij een fractie van plantendelen Desmodium afgezonderd wordt, waarbij een plantenextract afgeleid wordt van genoemde fractie hiervan, daardoor gekenmerkt dat een gekarakteriseerd extract uit Desmodium adscendens afgeleid wordt waaruit een preparaat van genoemd plantenextract gekwantificeerd wordt op pinitol.

2 Werkwijze volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat een gevalideerde analysemethode toegepast wordt voor voorgenoemde kwantificatie van Desmodium adscendens op pinitol, i.h.b. D-pinitol, waarbij een specifiek gekwantifieerd Desmodium adscendens preparaat voortgebracht wordt.

3. Werkwijze volgens de vorige conclusie, daardoor gekenmerkt dat een biologisch gestuurde isolatie uitgevoerd wordt in voornoemde analysemethode die ontwikkeld wordt met verkrijgen van een op D-pinitol gequantifieerd preparaat, waarbij het preparaat product telkens aangerijkt wordt en talrijke fracties geïsoleerd worden, en waarbij een decoct verkregen wordt dat een hoeveelheid D-pinitol bevat.

4. Werkwijze volgens één van de vorige conclusies, daardoor gekenmerkt dat de inhoudstoffen van voorgenoemd preparaat gestandardiseerd worden met vastleggen van de reproduceerbaarheid van het productieproces.

5. Werkwijze volgens één van de conclusies 2 tot 4, daardoor gekenmerkt dat de hoofdcomponenten der inhoudstoffen in Desmodium adscendens en de totale hoeveelheid van D-pinitol bepaald worden door middel van een hiertoe aangepaste analytische methode, i.h.b. waarbij het extractieproces, de verkregen producten na extractie en de voorwaarden geëvalueerd en geoptimaliseerd worden.

6. Werkwijze volgens één van de vorige conclusies, daardoor gekenmerkt dat voornoemd plantenextract afgeleid wordt van een fractie bestaande uit bovengrondse delen van Desmodium adscendens, hetzij met inbegrip van bladeren, takken, stengels en/of bloemen of vruchten hiervan.

7. Werkwijze volgens één van de vorige conclusies, daardoor gekenmerkt dat voornoemd plantenextract afgeleid wordt van een fractie bestaande uit bovengrondse delen van Desmodium adscendens, hetzij met inbegrip van bloemen of vruchten.

8. Werkwijze volgens één van de vorige conclusies, daardoor gekenmerkt dat voornoemd plantenextract afgeleid wordt van een fractie bestaande uit ondergrondse delen van Desmodium adscendens hetzij met inbegrip van wortels hiervan.

9. Werkwijze volgens de vorige conclusie, daardoor gekenmerkt dat voornoemde plantendelen vooraf gedroogd worden.

10. Werkwijze volgens één van de vorige conclusies, daardoor gekenmerkt dat voornoemde plantendelen vervolgens fijner gemaakt worden of gefragmenteerd.

11. Werkwijze volgens de vorige conclusie, daardoor gekenmerkt dat voornoemde plantendelen verpulverd worden in poedervorm.

12. Werkwijze volgens de vorige conclusie, daardoor gekenmerkt dat een extract van voornoemde plantendelen van Desmodium adscendens bereid wordt door extractie met o.m. methanol en/of ethanol.

13. Werkwijze volgens de vorige conclusie, gekenmerkt doordat dat een extract van genoemde plantendelen van Desmodium adscendens bereid wordt door extractie met water.

14. Werkwijze volgens één van beide vorige conclusies, daardoor gekenmerkt dat een extract van voornoemde plantendelen van Desmodium adscendens bereid wordt door extractie met minder polaire of apolaire solventen zoals maar niet uitsluitend n hexaan of combinaties ervan.

15. Werkwijze volgens één van de vorige conclusies, daardoor gekenmerkt dat een waterig afkooksel van voornoemde plantendelen van Desmodium adscendens vervolgens warm bereid wordt tot een decoct door een bepaalde hoeveelheid gedroogde, desgevallend verpulverde plantendelen op te koken in een bepaalde hoeveelheid water, i.h.b. gedestilleerd water, gedurende een bepaalde tijdspanne.

16. Werkwijze volgens de vorige conclusie, daardoor gekenmerkt dat voornoemd waterig afkooksel van voornoemde plantendelen van Desmodium adscendens vervolgens afgekoeld wordt, waarna de verkregen porties samengevoegd en gefilterd werden, waarna het verkregen filtraat geconcentreerd wordt, i.h.b. onder vacuüm, en daarna gelyofiliseerd.

17. Werkwijze volgens conclusie 15, daardoor gekenmerkt dat voornoemd waterig afkooksel van voornoemde plantendelen van Desmodium adscendens vervolgens afgekoeld wordt, waarna de verkregen porties samengevoegd en gefilterd werden, waarna het verkregen filtraat geconcentreerd wordt, i.h.b. onder vacuüm, en daarna gesproeidroogd.

18. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot 14, daardoor gekenmerkt dat een waterig product van voornoemde plantendelen van Desmodium adscendens vervolgens koud bereid wordt tot een extract, i.h.b. door een bepaalde hoeveelheid gedroogde, desgevallend verpulverde plantendelen op te nemen in een bepaalde hoeveelheid water, i.h.b. gedestilleerd water, gedurende een bepaalde tijdspanne.

19. Werkwijze volgens één van de conclusies 9 tot 18, daardoor gekenmerkt dat uitgaande van 1 kg gedroogde plantendelen van 60 tot 70 g, i.h.b. ca. 65 g, van extract bekomen wordt, resp. volgens een verhouding 10-20 : 1, meer bepaald 14-16 : 1.

20. Werkwijze volgens één van de conclusies 7 tot 19, daardoor gekenmerkt dat vervolgens een bepaalde hoeveelheid voornoemd extract onderworpen wordt aan kolomchromatografie, met methanol elutie, waarbij bepaalde fracties verzameld en geanalyseerd worden met dunne laag chromatografie, en Me0H/H20:5:1 als mobiele fase, en waarbij hun chromatografisch patroon bepaald wordt.

21. Werkwijze volgens de vorige conclusie, daardoor gekenmerkt dat ca. 20 g, voornoemd extract onderworpen wordt aan kolomchromatografieT op Sephadex LH-20 met methanol elutie, waarbij ca. 100 ml verzameld en geanalyseerd worden met dunne laag chromatografie-silicagel met laagdikte van ca. 0,25 cm, en Me0H/H20:5:1 als mobiele fase, en waarbij hun chromatografisch patroon bepaald wordt op basis van deze parameters.

22. Werkwijze volgens één van beide vorige conclusies, daardoor gekenmerkt dat voornoemde fracties gecombineerd worden in een aantal, i.h.b. 11, subfracties volgens hun chromatografisch patroon.

23. Werkwijze volgens de vorige conclusie, daardoor gekenmerkt dat voornoemde subfracties 5-11, i.h.b. 200 mg, die een vlek vertonen met een groene kleur, na sproeien met anijsaldehyde 1% H2S04 in MeOH, en verhitten tot ca. 120°C gedurende 10 min, worden samengevoegd, waarbij deze fractie onderworpen wordt aan een verdere kolomchromatografie geëlueerd met MeOH, waarbij opnieuw bepaalde fracties, i.h.b. van 100 ml, verzameld worden en geanalyseerd.

24. Werkwijze volgens de vorige conclusie, daardoor gekenmerkt dat voornoemde subfracties 4-5, i.h.b. 120 mg, van deze kolom gecombineerd worden, waarbij deze onderworpen worden aan een nog verdere kolomchromatografie onder dezelfde voorwaarden, waarna een wit product verkregen wordt.

25. Werkwijze volgens één van de conclusies 3 tot 24, daardoor gekenmerkt dat voornoemd extract afgezonderd wordt en het geïsoleerd product geïdentificeerd wordt als het gemethyleerde cyclitol 3-O-methyl-chiro-inositol, nl. D-pinitol.

26. Werkwijze volgens de vorige conclusie, daardoor gekenmerkt dat als inwendige standaard suikeralcoholen gekozen worden, meer bepaald xylitol, met name bij gaschromatografie.

27. Werkwijze volgens de vorige conclusie, daardoor gekenmerkt dat ook gekozen wordt voor andere suikeralcoholen zoals sorbitol, mannitol, en desgevallend dulcitol en inositol, i.p.v. voormelde xylitol, beide laatstgenoemde in een mindere mate.

28. Werkwijze volgens één van de vorige conclusies, daardoor gekenmerkt dat L-pinitol voortgebracht wordt uit voornoemd extract waaruit het afgezonderd wordt.

29. Werkwijze volgens één van de vorige conclusies, daardoor gekenmerkt dat vertrokken wordt van een plantextract van Desmodium adscendens van tropische oorsprong.

30. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot 29, daardoor gekenmerkt dat een gestandaardiseerd extract afgeleid wordt van de plant Desmodium adscendens, gequantifieerd op D-pinitol in haar werking tegen hepatitis, i.h.b. preventief, met afzondering van D-pinitol uit Desmodium adscendens, waarbij D-pinitol een actief bestanddeel vormt.

31. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot 29, daardoor gekenmerkt dat een gestandaardiseerd extract afgeleid wordt van de plant Desmodium adscendens, gequantifieerd op D-pinitol in haar curatieve werking tegen hepatitis, met afzondering van D-pinitol uit Desmodium adscendens, waarbij D-pinitol een actief bestanddeel vormt.

32. Plantenextract verkregen volgens een werkwijze zoals bepaald in één van de vorige conclusies voor gebruik in een werkwijze voor het beschermen van de lever bij een zoogdier, ter preventie van een leveraandoening bij een zoogdier.

33. Plantenextract verkregen volgens een werkwijze zoals bepaald in één van de conclusies 1 tot 31 voor behandeling van een leveraandoening bij een zoogdier.

34. Extract van een plant volgens één beide vorige conclusies, daardoor gekenmerkt dat het gestandaardiseerd is zijnde afgeleid van plant Desmodium adscendens, gekwantificeerd op de molecule D-pinitol actief tegen hepatitis, waarbij D-pinitol geïsoleerd is uit Desmodium adscendens waavan D-pinitol een actief bestanddeel vormt.

35. Extract van een plant volgens één van de conclusies 32 tot 34, daardoor gekenmerkt dat het plantenextract tussen 0,1 en 10 %, bij voorkeur van 4 tot 5 % pinitol omvat, i.h.b. D-pinitol.

36. Extract van een plant volgens één van de conclusies 32 tot 35, daardoor gekenmerkt dat het D-pinitol bevattend plantenextract aan een zoogdier gegeven wordt onder de vorm van een samenstelling die deze bevat, waarbij voornoemde samenstelling geselecteerd wordt uit de groep bestaande uit een farmaceutische samenstelling, een voedingsamenstelling en/of een dranksamenstelling.

37. Extract uit een plant Desmodium adscendens volgens één van de conclusies 32 tot 36, voor gebruik in een werkwijze van preventie van een leveraandoening bij een zoogdier, dewelke de stap omvat bestaande in het toedienen van een effectieve hoeveelheid van voornoemd extract van Desmodium adscendens hieraan.

38. Extract uit Desmodium adscendens volgens één van de conclusies 32 tot 37, voor gebruik in een werkwijze van behandeling van een leveraandoening bij een zoogdier, dewelke de stap omvat bestaande in het toedienen van een effectieve hoeveelheid van voornoemd extract van Desmodium adscendens hieraan.

39. Gebruik van een plantenextract zoals bepaald in één van de conclusies 32 tot 38, daardoor gekenmerkt dat dit aangewend wordt als antioxiderend middel bedoeld voor specifieke doelgroepen, i.h.b. waarbij de bedoelde doelgroep gevormd is door de mens, meer i.h.b. door alcoholisten en/of door suikerziektepatiënten van diabetes type 2.