CN104661668A - 从山蚂蝗属制备植物提取物的方法及其提取物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备以松醇定量的植物提取物的方法，其中植物疏果山蚂蝗选自山蚂蝗属家族，其中级分提取自山蚂蝗属植物部分，其中植物提取物来源于其所述级分，其特征在于特征的提取物来源于疏果山蚂蝗，来源于疏果山蚂蝗的所述植物提取物的制剂以松醇定量。

Description

从山蚂蝗属制备植物提取物的方法及其提取物

技术领域

本发明涉及从山蚂蝗属，更特别是疏果山蚂蝗(Desmodium adscendens)制备植物提取物的方法。

背景技术

自古以来，植物因其药用价值被使用。许多现有药物是植物的活性成分，例如来自短叶红豆杉的紫杉醇(Taxol)和来自罂粟的吗啡，或其衍生物。同样在非洲的传统医药中，使用了许多植物，包括疏果山蚂蝗。事实上，依据地理分布和使用，该植物原产于许多非洲热带和亚热带国家，并且也产于南美洲，它生长于开阔平原、草地以及沿途，使得该植物随意可得。这使得该植物作为药物对于由于药物的费用而购买药物通常很困难的人群有吸引力。因此，该植物在传统医药中，例如，用于哮喘、疼痛、发烧、癫痫、肝炎和肌肉痉挛。为此，使用煎煮作为叶子、树枝或茎的热水提取物。

已经有一些该植物的含黄酮的叶提取物的商业制剂在流通中，这些制剂以膳食补充剂销售，其具有改善身体健康的一些特性。另外对于肝脏疾病的治疗，已经使用药用植物达几个世纪。所以，水飞蓟(Silybum marianum)、胡黄连(Picrorrhizakurroa)、姜黄(Curcuma longa)、光果甘草(Glycyrrhiza glabra)、苦味叶下珠(Phyllantus amarus)和穿心莲(Andrographis panicuiata)是被猜想有肝保护作用的植物。肝脏是人体非常重要的器官，其确保许多重要任务，使肝脏失调对身体有重大影响。事实上，肝硬化是西方世界中一个主要死亡原因。另外，黄疸是由于非共轭或间接胆红素，或共轭或直接胆红素的增加产生的疾病，并且引起皮肤和虹膜变黄。硬化是渐进坏死的结果，具有瘢痕(纤维化)，在瘢痕间产生结节性再生并且破坏正常结构。这导致充血、门静脉高压、脑病、腹水等等。60至70％的肝硬化案例是由酒精滥用引起。其它原因是病毒性肝炎、胆道疾病和原发性血色病。肝功能衰竭是由病毒性肝炎、药物和化学制品、慢性肝疾病引起的肝脏大块性坏死的末期，和不具有坏死的肝功能缺陷(瑞氏综合征)的末期。

为了了解肝损伤的机制并且为了深刻理解细胞损伤的程度，测量血液指标，例如转氨酶丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。ALT仅存在于细胞质中，而AST还出现于线粒体中。转氨酶升高迅速，因为即使在细胞壁损伤期间其也被释放。AST升高晚于ALT，表明更严重的坏死正在发生。膜酶例如γ-谷氨酰转酞酶(γGT)和碱性磷酸酶(AP)存在于几乎所有体细胞的细胞膜上。在病毒或细菌肝炎情况下或在药物或酒精中毒情况下γ-GT升高。碱性磷酸酶也被确定用于诊断和跟进肝脏失调。这些指标提供了肝损伤的情况。

考虑中的植物疏果山蚂蝗尤其包括黄酮类，如牡荆素(1)、芦丁(2)、异牡荆素、四氢异喹啉猪毛菜碱(3)、大豆皂苷包括大豆皂甙I(4)、β-苯基乙胺如酪胺(5)和大麦芽碱(6)(分别显示于下列(1)至(6))和吲哚-3-烷基胺。

现有技术

科技论文MUANDA等人2011涉及疏果山蚂蝗叶子。其显示在肝脏感染情况下的阳性作用。还公开了一种分析方法，其中鉴定了酚类化合物，其提及某些成分的存在但有些不存在，然而，尽管如此，如下将进一步呈现的，其在本研发中将具有中心位置，因此这使得至少基于本文引用的关键组成，在此讨论的该文献极为重要。

文献EP 0309342A1(TUBERY)描述了山蚂蝗属在治疗A或B型病毒性肝炎和中毒性肝炎中的用途(但是先验并不对抗所有其它肝脏疾病)以及用于这些疾病的药物，特别是用于成瘾人群或癌症治疗。因此，该文献也涉及山蚂蝗属，特别是疏果山蚂蝗，其以肝脏作为用途的靶器官。除了来自于干燥植物的粉末，还提及煎剂作为一种使用形式。该文献进一步提及山蚂蝗属包含吲哚生物碱作为活性成分这一基本要素。更特别地，该文献仅涉及未特征化的蔬果山蚂蝗提取物。其没有进一步提供关于吲哚生物碱的定性或定量信息。换言之，该文献没有提供经验证的分析方法用于定量其指明的关键组成。另外，该文献显示疏果山蚂蝗仅为治疗肝炎的药物。

迄今为止，一方面肝脏疾病非常难治疗，另一方面肝脏疾病甚至不可能避免。因此，本文还提出一个问题：如何预防这些肝脏疾病。

本发明的目的

因此，首先，本发明的主要目的是来自于疏果山蚂蝗的定量的提取物的制剂，其可以提供上述问题的解决方法。在这方面，研究了疏果山蚂蝗提取物的肝保护性质。当寻找用于肝脏疾病的合适物质时，测试了来自肌醇的物质。这些代表了一类化合物，其包含六羟基环己烷衍生物，特别是环糖醇。

肌醇如糖一样形成人类常见食谱的一部分，其没有毒性。数项研究(包括人类中的研究)已经显示D-松醇发挥类似于胰岛素作用的作用从而改善血糖(glycaemy)的所需控制。所述研究事实上教导D-松醇和胰岛素之间在次最大浓度下似乎存在协同作用，然而这在葡萄糖运输中并不明显。

D-松醇是具有低分子量的环状糖醇。它是D-手性肌醇的甲基衍生物。D-松醇和D-手性肌醇在结构上都与磷脂酰肌醇相关，其形成胰岛素诱导的信号转导中的链接。D-松醇(其结构如下列出)存在于许多蔬菜、豆类产品和松树中(但不排除其它)，并且它在体内代谢为手性肌醇。

由于其特殊的活性，D-松醇不同于其它肌醇。应当理解在本文中两种异构体都被涵盖，因此也包括非活性的L-松醇。

D-松醇与其它肌醇的另一不同在于其包含甲醚基团。考虑到所述组成，D-松醇对葡萄糖代谢具有天然影响，因此对糖尿病也具有天然影响。体外药理学性质事实上提示D-松醇的效果，包括降血糖、抗动脉粥状硬化活性以及对免疫系统的影响。就降血糖活性而言，D-松醇可以改善葡萄糖运输和胰岛素敏感性。这是由于人类中的D-松醇被部分代谢为D-手性肌醇，其实际上是负责生物活性的材料。D-手性肌醇(由D-松醇的部分代谢形成)对糖尿病特别是对2型糖尿病有作用，其是起阳性作用的化合物。换言之，改善了胰岛素敏感性或耐受性。事实上，据显示D-松醇在人类中特别是在2型糖尿病中被代谢为D-手性肌醇，并且它还被原样提取到。

换言之，在考虑到先验有用的前提下，不能够显而易见地推断出D-松醇对于本文所讨论的肝脏疾病的预防或其治疗应当提供重大贡献或至少作为重要因素提供重大贡献。

发明内容

因此，根据本发明提供了一种制备以松醇定量的植物提取物的方法，其中植物选自山蚂蝗属家族，级分(fraction)提取自山蚂蝗属植物部分，并且植物提取物来源于所述级分，其特征在于，选择了疏果山蚂蝗，特征的提取物来源于疏果山蚂蝗，来源于疏果山蚂蝗的该植物提取物的制剂以松醇定量。

根据本发明，提供松醇作为主要的活性组成，其起到关键作用，因此占据中心位置，特别是D-松醇。

然而，MUANDA没有提及D-松醇为疏果山蚂蝗的组成。

然而，相反地，AMICOGEN的文献WO 2004/084875A1确实涉及用于肝保护的松醇，或包含松醇的植物提取物。然而，该文献提及的植物为大豆、松树、北枳椇(Hovenia dulcis)、刺五加(Acanthopanax senticosus)和角豆树，但是也没有提及山蚂蝗属，更没有提及疏果山蚂蝗。此外，该文献仅大致涉及未特征化的植物。对于组成没有提供定性或定量的信息，而仅仅是它们含有松醇或手性肌醇。

BEVERIDGE等人的文章，Aust.J.Chem.,1977,30,1583-1590还报道在两种山蚂蝗属物种中D-松醇的气相色谱分析。但是该文章是关于西班牙三叶草(D.intortum)和银叶藤(D.uncinatum)，这两个物种在植物学上不同于疏果山蚂蝗。

类似地，FORD等人的文章，Aust.J.Agric.Res.1978,29,963-974报道了在两种山蚂蝗属物种中存在D-松醇。但是该文献是关于西班牙三叶草和南美山蚂蝗(D.tortuosum)，这两个物种也在植物学上不同于疏果山蚂蝗。

数据库CA(化学文摘)也同样如此，其引用中国期刊(Zhongcaoyao 2007,38(8),1157-1159)，并报道了在小叶三点金(D.microphyllum)中存在松醇，其依然是在植物学上不同于疏果山蚂蝗的物种。

数据库NAPRALERT也是如此，其引用了印度杂志(Curr.Sci.1982,51,936-937)并且报道在三点金(Desmodium triflorum)中存在(+)-松醇，即D-松醇。然而，该文章涉及三点金，其也是另一个在植物学上不同于疏果山蚂蝗的物种。

总之，可以这么说其它山蚂蝗属物种(不同于疏果山蚂蝗)显示含有D-松醇或松醇，然而对该产品在疏果山蚂蝗中存在或不存在没有预测价值。属于相同属的两种不同物种通常定性和定量地具有不同的次级代谢产物的化学图谱。有无数种植物物种(其也含有D-松醇)属于其它属和其它植物家族。在一般参考书《Dictionary of Natural Products on DVD》中，其明确指出D-松醇“广泛分布于植物中”。因此，这意味着山蚂蝗属和D-松醇之间没有一致的或可预测的关系。

人们根据上述文献(其还提及在其它山蚂蝗属物种中存在松醇)将包含松醇的山蚂蝗属制剂区分为“整个”或整体(totum)，相反地，其不意味着可以预期在疏果山蚂蝗中存在松醇。这看起来都非常目光短浅。事实上，其它山蚂蝗属物种(其不同于疏果山蚂蝗)显示包含松醇的事实对该产品松醇在疏果山蚂蝗中存在或不存在没有预测价值。一般公知特定植物物种的药用价值通常非常专有地限制于所述唯一种类，而不存在于相同属和/或科的其它物种中。事实上，通常是只有一个来自整个植物家族的特定植物用于获得某一作用，如在这种情况下，来自山蚂蝗属家族的疏果山蚂蝗主要旨在对抗某些如进一步指出的疾病，或者还如罂粟相对于吗啡。

最后，公开的简报型论文NARAYANAN仍然涉及松醇。但是其没有涉及疏果山蚂蝗，而是叶子花(Bougainvillea spectabilis)。

根据本发明一个有利的实施方案，提供经验证的分析方法以定量D-松醇，其中特殊定量化的疏果山蚂蝗制剂以“整体”形式制备。

根据本发明一个特定实施方案，开发了一种分析方法用于获得以D-松醇定量的制剂，其中提供生物控制的分离，其中产物被重复富集并且分离到众多级分，且其中获得的煎剂还包含大量的D-松醇。因此，由于根据本发明的生物控制分离，可以更定向的方式分离特别选自一般植物家族的植物中的所需组分，这提供了节约大量研究即发现具有所需作用的该植物成分的巨大优势。

根据本发明一个特定有利的实施方案，组成被标准化。由于植物的自然变异，均需要保证关于组成的热带源和栽培源的再现性，并因此保证组成的标准化。

根据本发明特殊的实施方案，糖醇(更特别是木糖醇)被选作内标物。事实上，内标物必须总被添加于气相色谱中以校正注射的变化性。这些被选择的物质具有类似于被分析物质(在本案中为D-松醇)的行为。因此，除了上述木糖醇，还可能选择其它糖醇，例如山梨醇、甘露醇、半乳糖醇和肌醇，但是最后提及的两种通常很少选择。木糖醇作为优选是出于结构原因：木糖醇与D-松醇具有相同数目的羟基基团，在这种情况下其是决定性因素，因为衍生化反应发生在羟基基团上。

使用合适的分析方法，确定疏果山蚂蝗中主要成分和D-松醇的总量。评价和优化提取方法、提取后获得的产品和条件。

根据本发明限定的实施方案，首先，使用疏果山蚂蝗地上植物部分，特别是很少或完全不受季节影响的那些。结果是收割这些部分提供了全年可用性的优势，并且它还被实验上建立和实施。

根据本发明另一个实施方案，所述植物提取物同样地从疏果山蚂蝗的更多的临时地上植物部分(其更是季节依赖性的，例如花和果实，甚至种子)制备。因此，可能简化植物的收割而不必挖出所述植物。

根据本发明进一步另外的实施方案，疏果山蚂蝗的地下植物部分(其实际上更为季节依赖性)也可以用于制备所述植物提取物。因此，所述疏果山蚂蝗的几乎所有植物部分都可以被使用，特别是叶子、茎、树枝和/或其它地上部分，还有其地下部分，如果需要，还包括其花和果实，或者甚至种子。

因此这提供了巨大优势，该植物几乎所有部分都可以被使用，以至于几乎没有浪费。然后这提供了财政上有利可图的方法，该方法还是完全的环保责任性，其完美地符合现今循环经济指导概念，因此这对相关的热带和亚热带地区特别有意义，在此这是决定性标准。

根据本发明方法的基本实施方案的另一个方面，所述疏果山蚂蝗的植物部分首先被干燥。

根据本发明的一个优选实施方案，所述疏果山蚂蝗的级分首先被磨碎，特别是磨碎成粉末形式。该粉末可以任选直接被转化为药物形式。

根据本发明一个更优选的实施方案，然后，通过在一定量的水中，特别是蒸馏水中，煮沸一定量的干燥、任选粉末状的叶子，持续一段时间，特别是各自为5x 200g叶子、3L水和持续1小时，将疏果山蚂蝗的所述叶子和/或树枝的水煎剂制成煎剂。

根据本发明的一个更特别优选的实施方案，所述使用的疏果山蚂蝗植物部分(例如叶子或树枝)的水煎剂然后被冷却；依然更特别地，其中然后将获得的部分合并和过滤，然后将获得的滤液特别是在真空下浓缩，然后冷冻干燥或喷雾干燥。

根据本发明的一个甚至更优选的实施方案，采用溶剂的辅助，例如，但不限于水、低级烷基醇、非极性溶剂或其组合以及超临界条件下的溶剂，制备所述疏果山蚂蝗的地上和/或地下部分的提取物。

除了水，作为煎剂或浸渍剂(macerate)，即热的或凉的，还可以使用低级烷基醇，例如，但不限于甲醇、乙醇和异丙醇或其水醇组合和更少极性至非极性溶剂，例如，但不限于乙酸乙酯和正己烷或其组合。任选地，还可以使用超临界条件下的溶剂，例如，但不限于二氧化碳。最后，还可以使用不经进一步提取的植物材料的干燥粉末作为提取物的替换。

根据本发明的一个特别的实施方案，从1kg干燥叶子起始可以获得60至70g，特别是大约65g的干燥煎剂。

根据本发明的一个更有利的实施方案，使一定量，特别是约20g所述煎剂经历柱色谱法，特别是Sephadex LH20，采用甲醇洗脱，然后收集某些级分，特别是100ml，并用薄层色谱法分析，特别是硅胶，层厚度0.25cm，MeOH/H₂O:5:1作为流动相，并且确定它们的色谱图。

根据本发明的另一实施方案，根据它们的色谱图，将所述级分合并成数个亚级分(sub-fraction)，特别是11个亚级分。

根据本发明进一步的实施方案，将部分选择的所述级分5-11，特别是200mg，更特别是显示色斑的那些合并，然后使这些级分经历进一步的柱色谱法，特别是在Sephadex LH-20上，采用甲醇洗脱，于是再次收集和分析某些级分，特别是100ml的级分。

根据本发明依然进一步的实施方案，将来自该柱的所述亚级分4-5，特别是120mg合并，于是使这些材料在相同条件下经历进一步柱色谱法，之后获得纯的产物，特别是白色的产物。

根据本发明特殊的实施方案，所述提取物被分离，并且分离到的产物被鉴定为甲基化的环醇3-O-甲基-手性肌醇，也被称为(+)-D-松醇或D-松醇。

另外，根据具有应用于其的相关数据的本发明进一步的实施方案，疏果山蚂蝗制剂的延伸特征根据本发明的一个基本实施方案可能具有黄酮类分布。

另外，MUANDA报道最重要的酚类成分“二水槲皮素(quercetin dihydrate)”，而在表1中使用了术语“糖苷基槲皮素(quercetin glucosyl)”和“二水槲皮素”。也没有报道牡荆素及其衍生物的存在。

根据本发明的一个特别的实施方案，标准化的提取物来自植物疏果山蚂蝗，依据其对肝炎的作用特别是预防性作用以D-松醇定量，并且从疏果山蚂蝗分离D-松醇，其中D-松醇构成活性组成，特别是涉及化学、物理、传染或免疫源的肝损伤。

然而，相反地，文献WO 2004/084875涉及用于肝保护的松醇，或包含松醇的植物提取物。该文献还报导植物为大豆、松树、北枳椇、刺五加和角豆树，但是也没有讨论山蚂蝗属，更没有讨论疏果山蚂蝗。而且，该文献描述SOD和谷胱甘肽为肝保护作用的指标。因此该文献没有描述来自含有D-松醇植物的提取物用于保护肝功能的用途(其显示预防任何肝脏失调的任何方法)，甚至更没有治疗相同疾病，更不会描述异国植物，即热带植物并且使用D-松醇或任何包含该成分的提取物。

此外，其涉及降血糖和抗糖尿病活性，但绝不涉及肝保护作用，也不涉及肝脏失调的治疗。

本发明还涉及根据上述方法获得的植物提取物，其用于保护哺乳动物的肝脏，即预防其肝脏失调。

考虑到所述其它山蚂蝗属物种不是该情况，在其它山蚂蝗属物种中存在松醇当然不会减损发现以其含量为特征的疏果山蚂蝗的制剂具有肝保护作用。然而，依据本发明，确实允许来自于已知植物疏果山蚂蝗的标准化提取物的制剂，在其对抗肝炎作用中以D-松醇分子定量。需要指出的是本文讨论的来自于疏果山蚂蝗的D-松醇的提取决不是已知的，因为相关植物疏果山蚂蝗被用于多个目的，甚至比本文提及的那些更多的其它目的。然而，技术方案指向的范围在于其某些指示的精心的和定向的选择。虽然有提及包括氨基酸等的多个产物，但是根本没有清楚地提及D-松醇负责特定植物疏果山蚂蝗对抗肝脏失调的活性，也没有这方面的教导，并且也没有提及D-松醇具有作为该植物的主要成分在本文中以大量所呈现的另外的优势，该D-松醇可以进一步根据本发明被合适地分离。

根据本发明的另一个实施方案，所述植物提取物用于治疗哺乳动物中的肝脏失调，特别是由化学原因导致的或者由感染(特别是由细菌或病毒感染)导致的肝脏失调，以及由物理或免疫原因导致的肝脏失调。

根据本发明一个特别的实施方案，参考定量的疏果山蚂蝗煎剂的抗肝毒性活性和D-松醇对抗化学诱导的肝损伤，特别是民族药学(ethno-pharmacology)的部分，将包含D-松醇的植物提取物以包含其的组合物的形式施用于哺乳动物，其中所述组合物选自药物组合物、食品组合物和/或饮料组合物。

根据本发明的方法的其它特征或特性在其它从属权利要求中被定义。进一步的细节并入下列根据本发明方法的一些优选的示例性实施方案的描述中，基于所附的附图阐明这些细节。

附图说明

图1显示流程图形式的根据本发明方法的功能性工作图；图2是疏果山蚂蝗叶子和花的代表性样品的真实复制；图3为胰岛素信号转导的示意图；图4为BSTFA衍生化之后获得的校正曲线的图示；图5至7分别为分别衍生化3小时之后和6小时之后和整夜衍生化之后浓度和面积比的图示；图8和9各自为在加热块中衍生化1小时之后浓度和面积比的图示；图10和11各自为在超声波振动浴中对于100mg提取样品D-松醇/内标物面积比的图示；图12和13各自为在超声波振动浴中和提取/回流下每100mg提取样品D-松醇/内标物面积比的图示；图14为各种提取方法的平均面积比的图示；图15为响应函数的图示；图16为给出残余物概况的干扰物的图示；图17和18各自为在各天的个体测量和平均值的图示；图19和20各自为使用所谓的标准添加方法之后回收值的图示；图21和22各自为以mV计的电压对比于分钟显示的分别不包含和包含内标物分析的局部色谱图；图23和24为以mV计的电压对比于分钟显示的标准物分析的完整色谱图，；图25至28各自为以百分率计的相对影响对比于依据特异性的最高强度信号显示的各种物质和木糖醇标准物的质谱；图29至31显示施用对乙酰氨基酚之后48小时的血清AST值，和施用对乙酰氨基酚之后48和72小时的血清ALT值；图32至38类似地显示另外的实验数据，其中，图35、39显示峰A-F进一步的UV光谱，图40显示图解的生存率和图41显示另外的色谱图。

具体实施方式

说明

本发明通常涉及一种方法，其中图示描述了各种步骤，且该方法用于从疏果山蚂蝗制备特定的植物提取物，在该制备方法中，疏果山蚂蝗的地上和/或地下部分用作起始产品。疏果山蚂蝗是一种属于豆科、山蚂蝗属的草本植物，其片段显示于图2中。这是一种耐寒植物，其可以生长成0.5-1m高并且具有带细槽的圆的、多毛的、蔓生茎。该植物为3叶的。支撑的小叶在外缘是多毛的至无毛的，0.5-1mm长和1.5-3mm宽。它们是耐寒的。叶柄是多毛的且1-3cm长。叶子是椭圆形-叶倒卵形，在顶部的是钝的和扇形的，且在底部是楔形-圆形的。叶子在顶部主要是无毛的且在下面是非常多毛的。

开花的方式由轴向和末端簇组成。叶柄是槽形的且丰富多毛至细毛。初始苞叶是椭圆形的，具有尖顶，3.5-5mm长和1.5-2mm宽。花柄具有与叶柄相同毛发图案，且0.4-1.7cm长。花瓣主要是成对的。花冠长于花萼且是椭圆形的。果实具有0.5-2mm长延伸的果柄且为1-5个，倾斜低拉长3.5-55mm x 2.5-3mm的尺寸。种子是横向椭圆形且2.5-5mm长和1.5mm宽。

疏果山蚂蝗具有数个药理性质。在神经药理学领域，该植物的提取物对中枢神经系统具有抑制活性。乙醇提取物具有镇痛和降温活性且抑制强直阵挛性惊厥的传播。

该植物的水和乙醇提取物减少平滑肌收缩且减少激活肺中平滑肌细胞的物质的释放。研究了该提取物的多个级分。一个亚级分通过抑制磷脂酶抑制由抗原诱导的平滑肌细胞收缩，其发生是由于钙激活钾受体的活化。皂苷存在于该级分中。此外，包含四氢异喹啉类似物的级分抑制细胞色素P450NADPH-依赖性单加氧酶反应，其产生环氧和羟基类花生酸。该级分增强COX活性，其导致增加的前列腺素产生。

在实验部分，首先进行了一些体外试验，然后进行了另外的体内试验。下列所述试验的顺序图示显示于图1的流程图中。

在来自于加纳的疏果山蚂蝗植物材料和其提取物的植物化学研究中，使用了叶子的水煎剂，其通过在3l蒸馏水中煮沸5x200g干燥和经粉碎的叶子1小时来制备。冷却后，将各部分合并且过滤。将滤液真空下浓缩然后冻干。从1kg干燥叶子起始，通常获得大约65g干燥煎剂。

然后，使20g煎剂经历在Sephadex LH20(120X 4cm)上的柱色谱法，甲醇洗脱。收集100ml级分并通过薄层色谱法分析(硅胶Merck，层厚度0.25cm，流动相MeOH/H2O:5:1)。在UV光下，特别是366nm波长以下检测斑点。喷洒MeOH中1％茴香醛/H2SO4之后，将薄层板加热至120℃10分钟从而获得色斑。根据它们的色谱图，将级分合并成11个亚级分。亚级分5-11(200mg)显示绿色斑点，且被合并。使该级分经历进一步在Sephadex LH20(60x 3cm)上的柱色谱法，甲醇洗脱，再次收集100ml级分且如所述进行分析。将来自于该柱的亚级分4-5(120mg)合并，在相同条件下的新柱色谱法之后，获得结晶的产物。

通过¹H、¹³C NMR和质谱的光谱学检测以及比旋度的测量的结构鉴定阶段导致分离的产物鉴定为甲基化的环醇3-O-甲基-手性肌醇，也被称为(+)-松醇或D-松醇。

采用0.5和1mM D-松醇处理3T3-L1脂肪细胞增加了葡萄糖转运蛋白(GLUT4)、胰岛素受体底物(IRS)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)的mRNA表达。1mM D-松醇增加脂联素mRNA，一种具有抗炎、抗糖尿病和抗动肪粥样化性质的脂肪细胞因子的表达，其表达还可以通过胰岛素增加。D-松醇的胰岛素模拟物性质可以解释一些因子的增加的表达。

在L6大鼠肌细胞中，D-松醇诱导GLUT4迁移至细胞膜(如胰岛素那样)，使其准备用于葡萄糖的摄取，见图3。

关于抗动肪粥样化的活性，已发现通过减少细胞因子例如TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1、IL-1β和IL-8的分泌和表达且通过减少巨噬细胞清道夫受体、CD36和CD86的表达，D-松醇适度地降低泡沫细胞的形成。D-松醇的胰岛素模拟活性可能对此负责。

关于对免疫系统的作用，已发现D-松醇具有免疫药理学性质且D-松醇在体外和体内，通过抑制MAPK活化和NF-kB的迁移来减少MHC-I、MHC-II和共刺激因子例如CD80和CD86的表达，且在LPS诱导的树状骨髓细胞中降低大量IL-12和促炎性细胞因子的产生。这导致这些细胞成熟的抑制。采用D-松醇处理树突细胞阻止这些细胞诱导正常细胞介导的免疫应答，当采用D-松醇处理LPS-刺激的树突细胞时，T细胞的增殖和通过CD4+细胞的INF-γ的产生受到消极的影响。在中性粒细胞中，D-松醇抑制TNF-α的表达。

D-松醇以剂量依赖性和时间依赖性方式抑制基本的和诱导的NF-kB活化。该抑制不是细胞特异性的的且通过抑制IKK活化、IkBa降解和磷酸化、细胞核的磷酸化和p65的迁移而发生。D-松醇还减少NF-kB-依赖性报告基因表达并抑制在细胞增殖、抗凋亡、入侵和血管生成中涉及的NF-kB-依赖性基因产物。这可以解释为什么D-松醇类似物，例如唑核苷类似物，具有抗肿瘤性质。D-松醇的其它衍生物例如氨基环醇类抑制糖苷酶。

在试验动物中研究了体内药理学性质。在体内进行的实验中，肝脏受到损伤且研究了预防和/或治疗作用。直到那个时候，没有证明涉及的分子具有治愈作用，虽然其预防特性已被很好证明。除了在糖尿病小鼠和大鼠中的活性，在链脲霉素诱导的糖尿病小鼠中(其中D-松醇具有急性和慢性降血糖作用)，其通过干预胰岛素信号转导增加L6肌细胞中2-脱氧葡萄糖的基础摄取。D-松醇在严重胰岛素耐受小鼠中无效。在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠中，D-松醇降低血糖血红蛋白且增加胰岛素，同时D-松醇还使肝脏中天冬氨酸转氨酶(AST)、转氨酶丙氨酸转氨酶(ALT)和碱性磷酸酯值正常化且具有降脂质的作用。抗氧化作用显示于脂质过氧化和氢过氧化的减少，非酶抗氧化剂的增加和酶抗氧化剂超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GP)、过氧化氢酶和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的正常化。

就肝保护作用而言，在采用半乳糖胺诱导肝损伤之后该物质使天冬氨酸转氨酶(AST)和转氨酶丙氨酸转氨酶(ALT)肝脏值和TNF-α值正常化。另外，D-松醇降低脂质过氧化且使谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶值正常化。

它还具有抗炎作用：在大鼠研究中D-松醇具有抗炎性质，既对抗急性炎症(角叉菜胶诱导的爪子水肿)也对抗亚急性炎症(棉球肉芽肿)。该物质还具有驱虫活性。

关于对免疫系统的作用，在具有OVA诱导的哮喘的小鼠中，D-松醇减少在支气管肺泡灌洗液中炎性细胞的数量且降低这些细胞渗透入细支气管周的和血管周的区域。在肺部的炎症因此被对抗。通过摄取D-松醇，减少了Th2细胞因子例如IL-4、IL-5和嗜酸细胞活化趋化因子且增加了Th1细胞因子例如INF-γ，INF-γ阳性CD4细胞也是如此。通过增加的Th1转录因子T-bet的表达和转录因子GATA-3的降低(其在Th2病理学中是提高的)，D-松醇还校正了Th1/Th2平衡。降低了在肺组织中MMP-9的明胶液化活性，该明胶液化活性在炎性细胞从血液迁移至组织中很重要。D-松醇因此降低了哮喘中观测的高敏性和炎症。

人类中的研究

在2型糖尿病患者中，D-松醇对空腹血糖值、HbA1c值和胰岛素具有有利作用。采用每天2x 60mg D-松醇治疗13周之后，总胆固醇、LDL/HDL比和收缩和舒张血压降低，然而HDL胆固醇值增加。在不受控制的2型糖尿病患者中，除了常规治疗，采用D-松醇20mg/kg/天治疗12周，改善了空腹和餐后血糖值以及HbA1c值，但是没有显著改变脂联素、瘦素、C反应蛋白(CRP)和游离脂肪酸的水平。当以20mg/kg/天的剂量短周期4周摄取D-松醇时，该物质对胰岛素耐受患者中的基础血糖和胰岛素介导的葡萄糖或脂质代谢没有影响。在年长的、非糖尿病患者中，摄取6周的D-松醇对胰岛素介导的葡萄糖代谢没有影响。

以下呈现具有相应的确认的疏果山蚂蝗煎剂中D-松醇的分析方法的开发。在从植物材料可以制备标准化制剂之前，该植物中活性成分的浓度必须是已知的。为此目的，使用可重现的、精确的、不耗时的且还优选经济的标准方法。主要研究的目标是开发一种用于确定疏果山蚂蝗煎剂中D-松醇含量的分析方法。为此目的考察了多个参数，例如分析技术(GC、HPLC、TLC)、柱、检测器和可选择的纯化。一旦开发了可能的方法，其还应当通过ICH标准验证。因此将会考察线性、范围、重现性、精确度和特异性。

选择的材料包括甲醇、分析品质级的HPLC、吡啶(99+％)、BSTFA 1％TMCS、标准品D-松醇(95％)、木糖醇(99％最小值)和半乳糖醇(99+％)、甘露醇(分析纯)和山梨醇、氦、氢气和空气、氯化钠(分析纯)、D(+)-半乳糖胺盐酸盐(99％最小值)和水飞蓟素。

按照以下方式制备疏果山蚂蝗的煎剂：将3升蒸馏水加至200g植物材料中。将整个产品煮沸1小时，然后将其冷却并过滤。通过使用旋转蒸发仪的蒸发完成体积的缩减。作为最后一步，将煎剂冷冻干燥。

在薄层色谱技术中，固定相是在塑料或玻璃支撑物上。固定相可以是硅胶或改性二氧化硅，还可以是氧化铝、纤维素或硅藻土。

将待分析的1-10μl溶液点于从板的底部边缘起约1.5cm处。然后，将薄层板置于包含约1cm流动相层的展开槽中。流动相通过毛细作用力上升，物质洗脱快或慢取决于溶液中物质的类型。当液体前端几乎到达薄层板的顶部边缘时，将薄层板从展开槽中移出并且蒸发流动相。然后使用UV光或者采用喷显剂处理可以显现点的图案且计算保留时间。使用光密度计可以进行定性测量，其测量点的强度并将其转换成密度图(densitogram)。

在实验中使用了硅胶F₂₅₄硅胶TLC-板，Lichrospher硅胶F₂₅₄HPTLC-板和硅胶60RP-18F₂₅₄板。

气相色谱法GC是一项分析技术，其中通过在固定液相和流动气相之间分隔来分离分析物。由于注射块中的高温，在注射期间溶剂和分析物均蒸发并且在冷却器柱上凝结。当柱温升高时，相对较小挥发的分析物也进入气相并最终达到检测器。越是非极性，分析物越易挥发，其与气相更加亲和并且保留时间越短。更大极性或更少挥发性的分析物对更大极性的固定相更具亲和力，且越晚到达检测器。可能的检测器是火焰离子化检测器、电子捕获检测器、氮磷检测器、热导检测器、硫检测器和质谱仪。

在这些实验中使用具有FID检测器的型号Trace GC Ultra的GC-FID。为了检查特异性，使用了具有Voyager EI MS检测器的型号Trace 2000GC的GC-MS。

在这些实验中使用火焰离子化检测器(FID)和质谱仪(MS)。火焰离子化检测器是通用的和敏感的检测器。将洗脱物与H₂和空气混合，并燃烧。结果是，有机化合物电离，且离子在恒定电压下增加了相对于集电极的电流强度。质谱通过分子的离子化而工作，然后测量离子。

液相色谱法是另一分析技术，其中通过在固定相和液体流动相之间分布的不同而发生分离。如果固定相极性大于流动相，那么使用术语“正相色谱法”，然而如果固定相是非极性的，则使用术语“反相色谱法”。采用洗脱液洗脱分析物，其组成和由此的极性可以被改进以更快或更慢洗脱分析物。可能的检测器是UV检测器、RI检测器、安培检测器、质谱仪和蒸发光散射检测器(ELSD)。

在这些实验中使用ELSD，其中蒸发流动相之后，测量光散射并将其转化为电信号。

用于分析糖和糖衍生物(包括糖醇如环醇)的可能的分析方法是已知的。数种技术可用于测定，其简单概况列于下面。

例如，关于GC技术，由于糖和糖衍生物不是挥发性的，因此，此处还必须增加衍生化步骤。三甲硅烷基化和乙酰化都是已知的。常规的火焰离子化检测器和质谱仪都可以用作检测器。

进一步，HPLC技术：由于分析物不是UV活性的，因此可能在UV检测之前必须将其衍生化。除了别的之外，通过苄基氯的衍生化或借助于UV活性离子对试剂制备UV活性物质。除了UV检测，还可以使用不经衍生化的示差折光检测、脉冲安培检测法、质谱法或电子光散射检测。可以使用C₁₈-柱和阴离子交换柱。如果使用了阴离子交换柱，那么在碱辅助下将糖转化为阴离子。

其它可能的技术是酶法测定、毛细管电泳和薄层色谱法-密度测定法。在如Pothier所述的薄层色谱法中，基于指纹识别并借助于其，还尝试从煎剂中的其它物质分离出D-松醇，因为TLC方法是快速的和相对廉价的。

将D-松醇(标准品)和样品溶解于蒸馏水和50％甲醇-50％水中。使用的流动相为乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水(67.5:7.5:7.5:17.5)、氯仿-甲醇-水(54.5:36.5:9)、氯仿-甲醇-水(55:36:9)、氯仿-甲醇-水(46.5:46.5:7)和氯仿-甲醇-水(33:53.5:13.5)。

采用UV指示剂F_254s在薄层板上在UV光下D-松醇是不可见的，甚至在非常高浓度(10mg/ml)下也是不可见的，然而当使用茴香醛或百里酚作为喷显剂时可见标准物的数个点。

因此，决定开发使用不同分析技术的方法。由于文献已描述了用于分析D-松醇的足够的GC方法，且气相色谱法相比于HPLC衍生化是更敏感的技术，因此决定开发GC方法。

基于使用HPLC-ELSD测定荞麦中D-手性肌醇，尝试开发液相色谱法，以平行于气相色谱法。初步实验表明重现性非常低。因此，没有进一步优化该方法。

因此，立即对气相色谱法进行了改变。已知多种柱子可以用于分析糖和糖衍生物。在下表中，给出了一些这类柱子的概况。

表1

使用了适度极性的、Alltech类型的柱DB-5和HP-5(5％苯基95％甲基聚硅氧烷)和AT^TM–5MS/RTX-5MS(5％苯基聚硅亚苯基硅氧烷)，和Restek类型的柱AT^TM–1/RTX-1(100％甲基聚硅氧烷)，其是具有非极性固定相的柱。由于煎剂是通过在水中煮沸植物材料而获得，所以煎剂主要含有极性物质，已预期分析物在5％苯基95％甲基聚硅氧烷柱上相比于在100％甲基聚硅氧烷柱上具有更长的保留，这将提供更好的分离。因此，选择HP-5柱而非AT^TM-1/RTX-1柱用于分析煎剂。具有氰基烷基硅酮作为固定相的柱为柱AT^TM-264,6％氰基丙基苯基和94％甲基硅氧烷。

还必须确定内标物。由于此处使用了气相色谱法，因此必须添加内标物以校正注射的变化性。内标物必须行为上相似于被分析的物质。因此，选择使用了一些可得的结构上类似于D-松醇的物质，即糖醇例如山梨醇、甘露醇、半乳糖醇、木糖醇和肌醇，其显示于下面。

然而，没有选择单糖例如乳糖，因为它们由于正位异构化作用在色谱中产生了两个峰。这增加了内标物干扰的机会；换言之，样品峰存在更多机会与内标物的峰重叠。至于双糖，总是存在裂解的机会，这难于监测，并且对定量分析而言是不理想的。相比于D-松醇具有高分子量的糖或糖衍生物在更晚时间洗脱，因此延长了分析的持续时间，所以也没选择该类化合物。

在选择的五个糖醇中，半乳糖醇和肌醇难溶于甲醇，但溶于水。这些物质不是首选，因为水即使是痕量也能引起TMS衍生物的降解，这不利于定量分析。另一个优势是水相比于甲醇花费更长时间蒸发至干燥。此外，非常少量的水(即痕量)对裸眼是不可见的，因此应当使用干燥剂。然后也应当确定该物质对分析的影响。

甘露醇、山梨醇和木糖醇溶于甲醇，但是甘露醇和山梨醇的保留时间与样品中其它未知物质的保留时间重叠，如下面的表2所示。木糖醇洗脱于没有其它物质在色谱中洗脱的时间，唯一的噪音是明显的。结构上木糖醇相比于甘露醇或山梨醇也是更好的选择，因为木糖醇包含与D-松醇相同数目的羟基基团。这是重要的，因为衍生化反应发生在羟基基团上。下表2包括可能内标物的保留时间的概况。

表2

就衍生化而言，糖衍生物可以通过乙酰化或甲硅烷基化衍化为挥发性衍生物。在文献中已经使用多种试剂，包括吡啶中的BSTFA+TMCS，HMDS+TFA，吡啶中HMDS+TMCS，STOX+HMDS+TFA，TMSI+吡啶，乙酸酐+吡啶，和AcO-N-甲基咪唑。在这些可能中，决定采用乙酸酐+吡啶进行乙酰化且采用BSTFA+1％TMCS(+吡啶)进行三甲硅烷基化并且比较结果。

采用乙酸酐和吡啶以2:1比例进行乙酰化。将衍生化混合物加至称量量的固体D-松醇中，且加入山梨醇作为内标物。在该方法中，需要探索衍生化混合物的正确体积从而使得D-松醇能够溶解于其中。混合物或者在烘箱中于60℃加热30分钟，或者将小瓶在室温存储过夜。衍生化之后将样品在氮气流中蒸发至干燥，然后将衍生物重新溶解于乙酸乙酯中并进行分析。AT^TM-264柱用于此目的，与文献类似，其中DB-225柱用于分析乙酰化衍生物(Ac20-N-甲基咪唑)。烘箱的温度为200℃并且以5℃/分钟升温至220℃，其保持20分钟。

关于保留时间峰显示出非常大的变化，并且峰面积的重现性令人不满意。从相对视角来看，一个解释可能是所述衍生物挥发性不够，因为5个羟基基团必须被衍生化。

当使用三甲硅烷基化时，称取D-松醇和山梨醇并溶解于2ml甲醇中。山梨醇用于最初的衍生化实验，然后如上所述选择内标物。加入100毫升BSTFA+1％TMSC和40μl吡啶，在氮气流下将100μl蒸发至干燥。将小瓶在烘箱中于70℃放置3小时。然后，蒸去衍生化试剂并将残余物重新溶解于300μl己烷中。每一级称重一次，但是衍生化一式两份且注射一式三份。包含羟基基团的物质与BSTFA的反应显示在下面：

下表3给出D-松醇/内标物的浓度比和面积比。

表3

图4显示采用BSTFA衍生化之后获得的校正曲线，其呈线性。乍一看，该方法呈线性且保留时间也保持相同。从最初实验结果能够确定该衍生化方法比乙酰化更成功。因此，该衍生化方法被进一步使用。

然后，采用木糖醇作为选择的内标物进一步研究衍生化。此外，确定反应时间是否引起面积的任何改变。

分批制备D-松醇和木糖醇的甲醇溶液，分别为(25mg/50ml)和(10mg/50ml)。将2ml内标物溶液置于10ml容量瓶中且加入各种量的D-松醇。然后将其稀释。在氮气流下将500μl溶液蒸发至干燥。然后，将0.1ml衍生化混合物加至每个小瓶中且将小瓶于70℃置于烘箱中持续3小时、6小时和过夜。然后将衍生化试剂蒸去，将残余物重新溶解于300μl己烷中且一式两份注射入GC。

下表4给出衍生化3小时之后浓度比和面积比的概况，呈现线性。

表4

表5

图5为衍生化3小时之后浓度比和面积比的图示。

上表5给出衍生化6小时之后浓度比和面积比的概况，而图6为衍生化6小时之后浓度比和面积比的图示。

下表6给出过夜衍生化之后浓度比和面积比的概况，而图7为过夜衍生化之后浓度比和面积比的图示。

表6

不管衍生化时间，具有相同浓度的点存在极大内在变化(intervariability)，如图5至7和上面的3个表格中所示。关于衍生化反应的完成，从该情况无法得出结论。另一个问题是当样品被置于烘箱过夜时，一些小瓶在次日上午是空的，衍生化试剂显然被蒸发。这对定量测量也是不利的。出于实践目的，允许样品衍生化6小时是非常困难的。

然后做出的选择是使用加热块(heating block)以阻止该情况。还使用进行更好加热的反应小瓶。采用该方法衍生化一小时应当是充分的。从D-松醇和木糖醇溶液(各自量为12.5mg/100ml和10mg/50ml)，吸取2ml内标物和不同量的D-松醇加至10ml容量瓶中并稀释。在氮气流下将50μl溶液蒸发至干燥。将50μl衍生化混合物加至每个小瓶且将小瓶于70℃置于加热块中持续1小时。然后加入100μl己烷，涡旋并一式两份注射入GC。下表7显示在加热块中衍生化1小时之后浓度比和面积比的概况，而图8为其图示。

在随后的实验中，使用了更高浓度的木糖醇且在衍生化反应完成之后没有进一步加入己烷。以该方式能够在分析过程中避免附加步骤。上表8显示在加热块中衍生化1小时之后浓度比和面积比的概况。

当衍生化反应在反应小瓶中和在保热加热块中进行时，校正曲线上各点不再有任何离群值。因此，相对于烘箱的使用存在明显差异。对比两个图表可以看出，己烷的加入对所述方法有巨大影响。尽管如此，选择跳过该步骤以使得不使用不必要的溶剂且使得分析更少劳动密集。

现在提取：为了定量完成，样品的提取还必须完全。在以下实验中寻找最好的提取方法。

在第一次实验中，采用超声波振动浴进行提取。为此，在每个情况下，称取约100mg样品。在这种情况下，加入2ml内标物木糖醇(18mg/50ml)并且采用甲醇稀释为10ml。将50μl该溶液蒸发至干燥、衍生化并注射入GC。下表给出了提取2、3或4次和当使用更大体积时D-松醇/木糖醇的面积比的概况。下表9显示在超声波振动浴上多次提取之后每100mg样品D-松醇/内标物的面积比的概况，而图10为其图示，其中分别为，1代表2x提取，2代表2x提取20ml对比于10ml，3代表3x提取且4代表4x提取。

表9

因此，从上表和图10可以推断：两次甚至三次提取循环之后提取任然是不完全的。为了考察4次循环之后提取是否完全，必须进行第五次循环。该方法太过劳动密集，因此针对如何被最好提取物质进行进一步研究。更大体积也发挥作用；当体积加倍时，面积比同样增加。

在接下来的实验中，将样品如前与相同量的前述内标物一起溶解于50ml和100ml甲醇中。将样品在超声波振动浴上振动30分钟或1小时。然后，将一定量蒸发至干燥、衍生化并分析。下表10中数据显示在超声波振动浴上多个提取循环之后每100ml样品D-松醇/内标物的面积比的概况。

表10

图11是该情况的图示，其中分别为，1代表50ml-30分钟，2代表50ml-1小时，3代表100ml-30分钟且4代表100ml-1小时。

当选择50ml体积时，当增加体积时比例没有进一步增加。然而，如表10和图11所示，提取30分钟或1小时存在明显不同。尽管如此，该方式的提取依然是不完全的，因为该比例依然小于在10ml甲醇4次提取之后的比例。

从前述实验明显看出主要地时间对比于提取次数为重要的因素。然而，当样品在振动浴中，样品还加热，因此还应当追踪加热因素。下表11给出在加热的超声波振动浴中多个提取循环之后每100mg样品D-松醇/内标物的面积比的概况。

表11

图10为该情况的图示，其中分别为，1代表1x提取，2代表2x提取，3代表3x提取且4代表4x提取。

通常，在加热的振动浴中的提取提供了2x提取之后最大产量。1、3或4次提取循环之后比例没有进一步增加。如基于表11和图11已预期那样，加热超声波振动两次循环之后的比例显著大于不经加热1x 1小时的提取之后的比例。为了追踪加热的效应，还使用了另一种技术，回流。下表给出在加热的超声波振动浴上多个提取循环之后每100mg样品D-松醇/内标物的面积比的概况。

表12

如表12和图13所示，回流1、2、3和4次循环之后和当回流进行一次1小时之后，通过回流获得的比例是相似的。为了达到这些值的范围，必须在超声波振动浴中进行至少两次振动。通过回流获得的值也只是有点高。从这两个实验中不能确定这是否是巧合。尽管如此，如图14所示，很明显回流是最多产出和最少劳动密集的提取方法。

在开发最终的方法中，在内标物溶液中进行了初步研究，其中在天平上称取10.5mg木糖醇加至容量瓶中并溶解于甲醇中。将其稀释至100ml。将25ml该溶液吸取至250ml容量瓶中并稀释至250ml。内标物的量给出样品中D-松醇/木糖醇比＝1。

然后用于样品制备，称取100mg煎剂至圆底烧瓶。然后加入50ml内标物溶液。将混合物回流30分钟。冷却之后，将混合物转移至管中且在3000g离心5分钟。将上清液转移至接受容器中。然后将150μl该溶液吸取至反应小瓶并且在氮气流下蒸发至干燥。然后加入50μl衍生化试剂(BSTFA 1％TMCS–吡啶2:1)并涡旋。在加热块中于70℃加热反应小瓶1小时。小瓶冷却之后，将内含物转移至与GC自动进样器匹配的小瓶中。

以下温度梯度用于分析：在最初2分钟温度为65℃，然后以6℃/分钟的速度将温度升至300℃。然后保持300℃ 15分钟。使用流速为1.3ml/分钟的气体。

现在验证该方法。根据ICH指南(ICH guidelines)进行分析方法的验证。根据这些指南，评价了试验的线性、重现性和中间精密度、精确度、特异性和范围。

在确定校正模型和范围中，由于获得了结果因此定义了线性，这些结果相当于样品中分析物的浓度。范围是在分析物最低浓度和最高浓度之间，其中其显示该分析方法是精确的、精密的和线性的。

通过一式两份注射理论值的40至200％之间的浓度的5个标准品来确定响应函数。为了确定校正模型是否为线性，目测校正曲线且进行线性回归分析。图15显示应答曲线呈线性，因此是直线。

表13

表13阐明斜率t检验的回归分析的应用和95％置信区间交叉点(0,0)。从回归分析明显看出相关系数0.999298足够高，换言之>0.99。表13明显看出右侧存在明显斜率，其还明显可视于图15。当95％置信区间被计算用于交叉点时，很清楚直线没有通过(0,0)。

残差y_i-<y_i>按x_i或<y_i>绘图以确定残差是否随机分布，换言之，应用同方差性。图16显示残差为均匀分布且模型为同方差的。具有最大偏差的残差依然具有相比于预期值5％以下的偏差。

进行ANOVA失真检验(lack of fit test)以确定该模型是否正确。当两个测量值(对于每个浓度)的平均值关于两个测量值之间的方差太过偏离校正曲线时，F值应当在临界值以上，且模型被错误选择。计算的F值为0.7，因此小于4.534。所有这些值显示校正模型是线性的。

关于精确度或重现性，当采用指定的方法在相同样品上进行分析时，预期所述方法总给出相同的结果。为此，方法的精确度或重现性在不同水平被验证。通过注射相同样品6次确定注射的重现性。在不同的三天，分析了6个样品从而检查在一天内的重现性和中间精密度。

而且在不同浓度水平，即在理论值范围内(例如理论值的50％和200％)的最低浓度和最高浓度，分析了精密度。

为了分析进样的重现性，从测量结果：平均值、标准偏差和相对标准偏差计算下列参数。

下表14显示用于相同样品的六个进样的D-松醇比例，以及平均值、标准偏差和以％表示的相对标准偏差。由该表推断标准偏差和相对标准偏差非常小，即进样是可重复的。

依据重现性和中间精密度，除了如对于进样精密度相同的计算，计算了95％置信区间、日内变化和日间变化。为此，进行了方差的单因素分析，即ANOVA单因素检验。为此，必须首先检查各组方差彼此是否明显不同，否则可能不使用ANOVA检验。下表15给出在各天的D-松醇含量的概况，以及平均值、标准偏差和以％表示的相对标准偏差。

看到此表，其显示标准偏差很小且第2天的标准偏差更小，约为其它天标准偏差的一半。变异系数也相对很小。为了确定不同天结果之间是否存在差异，进行了ANOVA检验。在进行该检验之前，必须确定方差是否相等。为此使用Cochran检验，其中下面给出公式(1)：

$c=\frac{{S^2}_{\max }}{{\mathrm{\&Sigma;}}_j{S}^2}---\left(1\right)$

下表16显示各天的方差和计算的和临界的Cochran值的总结。

表16

该表显示计算的Cochran值低于临界值。换言之，方差被认为相等，这意味着可以进行ANOVA检验。

下表17给出方差分析的概况：平方和、自由度、均方和F值。

表17

计算的F值高于临界的F值。据此可以推断不同天的结果之间存在差异。为了确定偏差是否仍可接受，将RSD％_间(RSD％_between)与2/3RSD％_霍维茨(RSD％_Horwitz)比较，其估计出可以在单个实验室进行的最大RSD％。因此公式(2)仅仅考虑浓度且为以下所示：

RSD％_霍维茨＝2^(1-0.5logC)     其中C为浓度(m/m)     (2)

下表18显示标准偏差、以百分比表示的相对标准偏差、RSD_霍维茨和最大相对标准偏差。

表18

该表显示RSD％间小于RSD最大，据此可以推断该方法仍然是精确的尽管事实是对比于ANOVA检验看到了差异。由于单一天内结果的RSD％非常小，因此增加了在ANOVA检验内发现显著差异的机会。图17为在各天的个体测量和平均值图示，其显示测量的重叠。

表20                                   表19

下面将检测在各浓度水平的中间精密度。在上表19中显示50mg、100mg和200mg样品中D-松醇的含量，以及对每个系列的平均值、标准偏差和相对标准偏差。因此该表19给出在各天的D-松醇含量的概况，以及平均值、标准偏差和以％表示的相对标准偏差。

从该表明显看出对于所有平均值的标准偏差的误差在各处都是同一数量级。为了确定在各浓度水平之间的测量是否存在显著差异，此处也进行ANOVA检验，之后确认差异不显著。

上表20显示不同天的方差的总结且计算临界的Cochran值。

此处计算的Cochran值也低于临界值，据此可以推断各组方差之间不存在显著差异。

下表21给出方差分析的概况：平方和、自由度、均方和F值。

表21

由上表21中的ANOVA检验推断计算的F值大于临界的F值，因此不同组之间存在显著差异。图表上，在50％和200％的结果没有与在100％的所有结果重叠。尽管如此，组间方差对方法而言依然是可接受的，因为以百分比表示的相对标准偏差(变异系数)小于RSD_最大(可以在实验室中发现的最大偏差)。

下表22显示标准偏差、以百分比表示的相对标准偏差、RSD_霍维茨和最大相对标准偏差。

表22

看到图16的曲线图，可以推断依据浓度水平不存在趋势。据此还可以推断使用了充足的溶剂且溶解度不存在问题，否则随着样品mg数量的减少值会增加。

就精确度而言，三种类型的测试设置能够发现测量值是否也是正确值：测试混合物方法，标准加入法和与常规接受方法的比较。此处仅可以应用标准加入法，因为不能从植物材料获得重建产品，因为不是所有组成都已知，且还没有一种可接受可行的方法，因为需要开发方法。标准加入法意味着将一些量的样品加入到已知量的标准溶液中。然后确定使用以下公式回收多少物质：

下表23显示回收值以及平均值、标准偏差、相对标准偏差和95％置信区间。

表23                               表24

相应的图19为根据标准加入法的回收值的图示，其中1＝50％加入，2＝100％加入，3＝125％加入。

下表24显示回收值以及平均值、标准偏差、剩余标准偏差和95％置信区间。

如相应图20也同样明显，其阐明使用标准加入法发现的值，其中1＝50％加入，2＝100％加入，3＝125％加入，50％加入的值稍微低于100％或125％加入时的值。为了确定其是否是简单的可变性，实验必须再次重复。通常，稍微多于100％被回收，当进行分析时这是被预期的。还应当注意回收实验仅显示相对系统误差，不是绝对系统误差，因为在加入之前和之后模型(matrix)是相同的。

为了确定特异性，采用质谱检测重复分析以确定是否仅分析物被测量且没有其它物质。还进行不加入内标物的分析以确定在相同时间是否没有洗脱其它物质。图21显示没有加入内标物的分析的局部色谱图。在20至21分钟没有见到干扰物。

图22显示加入内标物的分析的局部色谱图。在色谱图中在木糖醇的位置不存在干扰物。

质谱分析也证明该方法是特异性的。相应的质谱显示于单独的图23ff，其中图23是不加入内标物的完整的分析色谱图，显示以mV计电压对比于分钟。

图24显示标准物分析的完整色谱图且以mV计电压对比于分钟，其中R_t＝20分钟处的峰为木糖醇，而R_t＝22.45处的峰为D-松醇。

图25至28分别显示标准品木糖醇、样品中木糖醇、D-松醇样品和标准品D-松醇的质谱的特异性，显示相对于最高信号的以百分比计的相对丰度。

就疏果山蚂蝗煎剂的肝保护作用的体内评价而言，D-松醇具有肝保护作用。疏果山蚂蝗成分之一为D-松醇。关于疏果山蚂蝗煎剂的肝保护作用的体内评价，之前的分析显示该植物煎剂原始包含约0.65％D-松醇，虽然这不再是代表性的。在该体内实验中，在大鼠中考察了疏果山蚂蝗煎剂对抗由半乳糖胺诱导的肝损伤的预防作用。水飞蓟素用作参考剂。水飞蓟素是来自于奶蓟草植物水飞蓟(Silybummarianum)果实的多种黄酮木质素类的混合物。主要成分为水飞蓟宾(silybin)、水飞蓟亭(silychristine)和水飞蓟宁(silydianine)。另外，少量的异水飞蓟宾存在于奶蓟草中。

因此在试验动物中进行了若干体内实验，目标为优化施用的剂量和治疗方案以及寻找(由乙醇和对乙酰氨基酚诱导)对肝损伤的可能作用。

在进行的实验中，对六组试验动物使用了下列方案：

山蚂蝗属煎剂20mg/kg；

山蚂蝗属煎剂5mg/kg；

D-松醇20mg/kg；

水飞蓟素20mg/kg(阳性对照)；

无处理，单剂量650mg/kg半乳糖胺中毒(阴性对照)；

无处理，无中毒。

处理方案如下：

-第0天：采用山蚂蝗属煎剂处理：20mg/kg或5mg/kg

采用D-松醇预处理：20mg/kg

采用水飞蓟素预处理：20mg/kg

-第1天：采用山蚂蝗属煎剂预处理：20mg/kg或5mg/kg

采用D-松醇预处理：20mg/kg

采用水飞蓟素预处理：20mg/kg

随后立即使用半乳糖胺

-第2天：所有血液组(24小时)

采用山蚂蝗属煎剂处理：20mg/kg或5mg/kg

采用D-松醇处理：20mg/kg

采用水飞蓟素处理：20mg/kg

-第3天：所有血液组(48小时)。

下列3个对照组必须出现在每个实验中：

-水飞蓟素20mg(阳性对照)；

-无处理，仅650mg/kg半乳糖胺中毒(阴性对照)；

-无处理，无中毒。

在进行的实验中，24小时之后的作用似乎不很显著，但是48小时之后很显著。因此，在后继实验中在24小时不再采集血液样品，但是仅在48小时之后采集血液样品，至少另外24小时之后采集第二次样品，和可能地，在甚至更晚时间采集第三次样品。

在实验中采用D-松醇进行剂量和处理方案的优化。然后，基于山蚂蝗属煎剂计算用于另一个实验的剂量。

因此，为了确定待测试制剂的肝保护作用，所选择的实验动物(即斯普拉-道来大鼠)在第0天和第1天在施用肝毒剂之前(第1天)经历预处理。在第2天还有一次后处理。全部通过灌胃口服施用山蚂蝗属煎剂、纯活性成分D-松醇和阳性对照水飞蓟素。

这导致上述6个试验组，即：

总之，处理方案如下：在第0天和第1天采用试验制剂之一预处理。在预处理之后，在第1天给予考察中各组实验动物肝毒产品：650mg/kg D-半乳糖胺IP生理溶液中2％。在第2天施用同样的处理剂量。在第2天和第3天，从尾静脉采集1.5ml血液。通过确定血清中下列参数：ALT(＝GPT)、AST(＝GOT)、ALP评价肝损伤和可能的肝保护作用。

试验结果如下；见各自的表和图29ff。施用肝毒剂D-半乳糖胺之后，24小时之后和48小时之后，在三个测定参数中通过显著增加观察到肝损伤(对照对比于肝毒)。

24小时之后，相比于肝毒组在任何处理组没有看到AST(GOT)和ALP的显著降低，因此在阳性对照水飞蓟素组也没看到。在两个山蚂蝗属组和水飞蓟素组看到ALT(GPT)的显著降低。

48小时之后，结果更显著：相比于肝毒组，所有处理组：两个山蚂蝗属剂量、D-松醇和水飞蓟素，AST(GOT)和ALT(GPT)已经显著降低。少数值得注意的观察是最低山蚂蝗属剂量(相当于5mg/kg D-松醇)已经具有非常显著的作用，其可相比于最高剂量(相当于20mg/kg D-松醇)；两个山蚂蝗属剂量活性好于水飞蓟素，或者至少活性相当于水飞蓟素；且两个山蚂蝗属剂量活性好于或者至少活性相当于20mg/kg纯的D-松醇。

就参数ALP而言，在施用处理之后，还没有看到作用。也许，对此还需要更长处理。

因此，可以推断在所使用的处理方案中清楚证明了标准化的疏果山蚂蝗制剂的肝保护作用。鉴于最低剂量的山蚂蝗属煎剂获得的良好结果，进一步研究表明剂量依赖性作用。更长预处理的作用，治疗性处理的作用仅在施用肝毒剂之后开始，可以进一步考察二者的组合，可能在更广泛的一套肝损伤参数上进行考察。

另一个实验由实验设计和执行构成，其中乙醇诱导的肝损伤替换了半乳糖胺，采用如前述实验中相同剂量的山蚂蝗属煎剂。

在大鼠中考察了标准化的疏果山蚂蝗煎剂和D-松醇对抗化学诱导的肝损伤的抗肝毒活性，特别是疏果山蚂蝗煎剂对抗乙醇诱导的肝损伤的保护作用。

实验的目的是评价以其主要成分：D-松醇标准化的疏果山蚂蝗煎剂对抗乙醇诱导的肝损伤的肝保护作用。材料和方法：66只200-225g雄性维斯塔大鼠(CharlesRiver,Brussels,Belgium)被随机分成6组：阴性对照组(CON：无肝毒剂，无处理：8只大鼠)，肝毒组(HEP：引入肝毒性，无处理：20只大鼠)，山蚂蝗属I组(引入肝毒性，采用疏果山蚂蝗煎剂处理，相当于2mg/kg的D-松醇：10只大鼠)，山蚂蝗属II组(引入肝毒性，采用疏果山蚂蝗煎剂处理，相当于10mg/kg的D-松醇：10只大鼠)，D-松醇组(PIN：引入肝毒性，采用10mg/kg的D-松醇处理：10只大鼠)，阳性对照组(SIL：引入肝毒性，采用20mg/kg的水飞蓟素处理：8只大鼠)。在施用乙醇之前2天，适量冻干煎剂、松醇或水飞蓟素悬浮于水中并通过灌胃施用(或空载体用于对照组)。通过每天灌胃口服55％乙醇溶液引入肝毒性(阴性对照组除外)。在实验的第一周，乙醇由初始剂量2g/kg逐渐增加至剂量6g/kg。在7周的时间施用乙醇。根据采用特定煎剂、松醇或水飞蓟素(灌胃口服)处理的组，每天施用乙醇至实验的结束。对于乙醇的施用(缺省值)，在第3、4、5和6周，从侧面尾静脉(Multi Fat 600,Sarstedt)采集血液样品(1.5ml)。该实验通过安特卫普大学动物实验伦理委员会(Ethics Committee for AnimalExperiments of the University of Antwerpen)批准(17-01-2011,2010-37)。

下文中给出不同处理组的图解概况。通过常规实验室技术(Senior,2009)确定来自于试验动物血清样品中的酶天冬氨酸转氨酶(AST,GOT)和丙氨酸转氨酶(ALT,GPT)的浓度。升高的水平可以被认为是肝细胞破坏的指示或膜通透性改变的指示。

统计学分析CON和HEP之间关于AST和ALT的不同，和HEP和DES 1、DES 2、PIN和SIL之间关于AST和ALT的不同的统计是一个进行的混合模型分析。进行对数秩检验(log-rank test)用于存活数据的统计分析。

结果：在研究第4、5和6周血清AST和ALT值显示于表26-31，和图32-34、36-38中。在时间不同点(第0、2-6周)平均AST和ALT值显示于图35和39中。表32和33和图40显示在不同动物组中的存活时间。

表27                               表26

上面右侧的表26显示施用乙醇4周之后的血清AST值。图32显示施用乙醇4周之后的血清AST值，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001vs HEP CON；vs HEP DES 1、DES2、PIN、SIL(混合模型分析)。

上面左侧的表27显示施用乙醇5周之后的血清AST值。

图33显示施用乙醇5周之后的血清AST值，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001vs HEP CON；vs HEP DES 1、DES2、PIN、SIL(混合模型分析)。

下面右侧的表28显示施用乙醇6周之后的血清AST值。

图34显示施用乙醇6周之后的血清AST水平，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001vs HEP CON；vs HEP DES 1、DES2、PIN、SIL(混合模型分析)。

图35显示每个时间点(第0、2、3、4、5、6周)的AST平均值。

上表29显示施用乙醇4周之后的血清ALT值。

上表30显示施用乙醇5周之后的血清ALT值。

图36显示施用乙醇4周之后的血清ALT值，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001vs HEP CON；vs HEP DES 1、DES2、PIN、SIL(混合模型分析)。

图37显示施用乙醇5周之后的血清ALT值，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001vs HEP CON；vs HEP DES 1、DES2、PIN、SIL(混合模型分析)。

上表31显示施用乙醇6周之后的血清ALT值。

图*p<0.05,**p<0.01，图38显示施用乙醇6周之后的血清ALT水平，***p<0.001vs HEP CON；vs HEP DES 1、DES2、PIN、SIL(混合模型分析)。

图39显示每个时间点(第0、2、3、4、5、6周)的ALT平均值。

死亡率

表32显示经历6周时间试验组中试验动物的存活率。

图40显示经历6周时间试验组中试验动物的存活率。表33显示对数秩检验，其用于确定经历6周时间动物存活率的差异。

表33

在该实验中，其中评价了疏果山蚂蝗煎剂对抗乙醇诱导的肝损伤的预防作用，肝毒组(HEP)显示每日施用乙醇4周之后AST和ALT血清水平显著增加(图32-34、36-38)。在施用乙醇之前2天开始采用疏果山蚂蝗(2mg/kg和10mg/kg)、松醇(10mg/kg)或水飞蓟素(20mg/kg)处理，进一步每天处理直至实验结束，6周之后。如图32-34和36-38所示，对于任何处理，没有观察到关于血清AST水平(图32、33&34分别对应第4、5&6周处理之后)和血清ALT水平(图36、37&38分别对应第4、5&6周处理之后)显著降低。在不同处理组中动物的死亡率的评价(图40，表32)显示未处理组肝毒(HEP)中大量减少，而存活率在DES 2中更好。而且，施用乙醇6周之后，给予疏果山蚂蝗煎剂的60％大鼠存活，而在松醇和水飞蓟素处理组中存活率分别为40％和22％。存活数据的统计分析(表33)显示对照和肝毒组之间统计上的显著差异(p<0.01)，疏果山蚂蝗组DES 2(相当于10mg/kg松醇)和未处理组肝毒之间朝向显著性的趋势(p＝0.06)。DES 1组(相当于2mg/kg松醇)、松醇组(10mg/kg)或水飞蓟素组(20mg/kg)和肝毒组之间没有观察到统计上的显著差异。

由于在大鼠中需要至少4周时间产生显著的乙醇诱导的肝毒作用，且观察到了大量减少的肝毒未处理动物，因此不可能在该实验中考察疏果山蚂蝗煎剂的肝保护作用。

进一步的实验在于建立和进行对乙酰氨基酚(替换半乳糖胺)诱导的肝损伤的实验。

实验的目的在于评价以其主要成分D-松醇标准化的疏果山蚂蝗煎剂对抗对乙酰氨基酚(扑热息痛)诱导的肝损伤的肝治疗作用。

用于此目的的材料和方法由以下构成：40只200-225g雄性维斯塔大鼠，其被随机分成5组：阴性对照组(CON：无肝毒剂，无处理：8只大鼠)，和肝毒组(HEP：引入肝毒性，无处理：8只大鼠)，和山蚂蝗属I组(引入肝毒性，采用疏果山蚂蝗煎剂处理，相当于2mg/kg的D-松醇：8只大鼠)，和山蚂蝗属II组(引入肝毒性，采用疏果山蚂蝗煎剂处理，相当于10mg/kg的D-松醇：8只大鼠)，和阳性对照组(SIL：引入肝毒性，采用20mg/kg的水飞蓟素处理：8只大鼠)。通过灌胃口服2g/kg对乙酰氨基酚引入急性肝毒性(对照组除外)。引入肝毒性之后24小时，开始处理：将适量(参见上面)的冻干疏果山蚂蝗提取物或水飞蓟素悬浮于水中并通过灌胃施用(或空载体用于对照组和肝毒)。在施用对乙酰氨基酚之后24小时、48小时和72小时从侧面尾静脉采集血液样品(1.5ml，Multi Fat 600，Sarstedt)。该实验通过安特卫普大学动物实验伦理委员会批准(17-01-2011,2010-37)。

不同处理组的概况显示于下面：

CON：无对乙酰氨基酚，无处理；HEP：2g/kg对乙酰氨基酚，无处理

DES 1：2g/kg对乙酰氨基酚，疏果山蚂蝗处理，相当于2mg/kg的D-松醇

DES 2：2g/kg对乙酰氨基酚，疏果山蚂蝗处理，相当于10mg/kg的D-松醇

SIL：2g/kg对乙酰氨基酚，水飞蓟素处理(20mg/kg)。

通过常规实验室技术(Senior，2009)确定来自于动物血清样品中的冬氨酸转氨酶(AST、GOT)和丙氨酸转氨酶(ALT、GPT)的酶水平。

增加的水平可以被认为是肝细胞破坏的指示或膜通透性改变的指示。为了统计目的，进行单因素方差分析(One way ANOVA)，以便分析CON和HEP之间关于AST和ALT的不同，和HEP和DES 1、DES 2和SIL之间关于AST和ALT的不同，随后进行Dunnett事后检验(SPSS统计程序)。施用对乙酰氨基酚之后48小时和72小时的血清AST和ALT值的结果显示于表34-37，和图29-31中。

表34                                 表35

图29显示施用对乙酰氨基酚之后48小时的血清AST值，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001vs.CON HEP(统计学：单因素方差分析，事后Dunnett对比于HEP)。

血清ALT

下表36&37显示施用对乙酰氨基酚之后48小时和72小时的血清ALT值。

图30、31显示施用对乙酰氨基酚之后48小时和72小时的血清ALT值，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001vs.CON HEP(统计学：单因素方差分析，事后Dunnett对比于HEP)。

在该实验中，评价了疏果山蚂蝗煎剂对抗对乙酰氨基酚诱导的肝损伤的治疗作用，肝毒组(HEP)显示施用对乙酰氨基酚之后24小时和48小时的血清AST和ALT水平显著增加(p<0.001)，且施用对乙酰氨基酚之后72小时的血清ALT水平也显著增加(p<0.05)。在施用对乙酰氨基酚之后24小时和48小时给予疏果山蚂蝗(2mg/kg和10mg/kg)或水飞蓟素(20mg/kg，阳性对照组)的口服处理。如图29-31所示，对于任何处理，在48小时和72小时时间点的血液样品中可以观察到血清AST和ALT水平没有显著降低(p>0.05)。在由对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤大鼠模型中，该实验的结果显示当以日剂量高达10mg/kg施用时，疏果山蚂蝗没有肝治疗作用。

最后，对UA样品：山蚂蝗属提取物进行所谓的埃姆斯试验。根据OECD指南，在代谢S9级分(metabolising S9fraction)不存在和存在下采用5种鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株(TA98、TA100、TA102、TA1535和TA1537)测试该提取物。在该实验中使用新鲜的菌株，以及S9和其它需要的材料例如NADPH、皮氏培养皿等。

根据该指南，采用最大试验浓度5mg/板开始试验，之后使用6个剂量进行稀释。阴性(溶剂)对照使用4个皮氏培养皿，以及阳性对照使用3个皮氏培养皿。阳性对照是推荐试验浓度的对照推荐列表的一部分。我们使用的阳性对照的列表和它们的浓度是可得的。

因此，制备3个皮氏培养皿用于每个浓度且制备4个皮氏培养皿用于阴性对照。结果显示其平均值，特别是逆转株±SD的平均数。如果阴性和阳性浓度在预期范围内且看不到毒性迹象，那么试验是成功的。这通过检查细菌的背景层来确定，其中背景层确实表明毒性。没有发现毒性迹象，且所有菌株和对照对TA102作出预期应答。如果相比于阴性(溶剂)对照看到加倍数量的逆转株，且如果观察到剂量-效应关系，那么试验物质肯定是“诱变的”。

综合的结果在下面列出。上面的数据表明在S9存在和不存在的情况下，菌株TA98、TA100和TA1535中的样品不是诱变的。对于TA1537，相比于阴性对照，仅在最高浓度，5mg/板，在S9存在下发现了加倍的突变频率，但是没有发现显著的剂量-效应关系。为了确认，重复了该实验。没有发现剂量-效应关系，也没有发现相比于对照的加倍，这证实在菌株TA1537中也没有诱变效应。

实验上可以确定实际上没有诱变效应。在代谢S9级分不存在或存在的情况下在埃姆斯试验中山蚂蝗属提取物不是诱变的。在最高剂量一些自发的逆转株的数目可见增加，但是这不足够充分使用术语“诱变性”。重复的实验(每菌株至少1次)证实不存在诱变性。

关于疏果山蚂蝗冻干粉中黄酮含量和分布，

在应用的方法中，首先制剂样品：

为了制备标准物(参考溶液)，称取5.0mg牡荆素加入10.0ml容量瓶中且溶解于甲醇中。吸取3ml该溶液至20.0ml容量瓶且用50％甲醇稀释。

为了制备样品(试验溶液)，在每个情况下称取约100mg粉末(冻干粉)加入25.0ml容量瓶中并加入20ml 50％甲醇。然后在超声波浴中声处理溶液15分钟。样品冷却之后，用50％甲醇将其稀释至25.0ml。通过尼龙针头式过滤器过滤试验溶液和参考溶液。

HPLC条件

使用的流动相为A：水中1.0％(v/v)磷酸和B：乙腈。梯度条件如下：

开始条件：5％B

0-5分钟→10％B 5-80分钟→50％B 85-90分钟→5％B

流速1.0ml/min。在360nm处检测。使用的柱为Grace smart柱或Lichrosphere柱(250x 4.5微米)。

结果：典型的疏果山蚂蝗冻干粉中黄酮类如牡荆素的总含量(其中所有峰具有黄酮类典型的UV光谱)总计为：1.122％

典型的HPLC图谱

指示的峰显示黄酮类的UV光谱特征。

疏果山蚂蝗冻干粉

扩展成具有色谱图谱和含量的黄酮类

使用的方法

样品制备见上面。

HPLC条件’

流动相使用A：含有0.1％甲酸的H2O和B：乙腈。梯度条件如下：

开始条件：15％B

0-5分钟→15％B 5-39分钟→23％B39-43分钟→100％B

43-45分钟→100％B45-47分钟→15％B 47-55分钟→15％B

流速1.0ml/分钟。在334nm处检测(DAD)。使用Luna C18柱(Phenomenex)(250x 4mm，5um)作为柱。

结果

黄酮分布和鉴定

应用指定的方法，获得如附图中所示的色谱图。二极管阵列检测器(DAD)的标记信号(A-F)导致所示的UV光谱。所有标记信号(峰A-峰F)显示黄酮类特征性的UV光谱。

所涉及的产物分离之后，基于质谱和NMR波谱法，鉴定主要成分(峰E)为牡荆素-2”-木糖苷。与公开的数据比较，该表显示¹H和¹³C-NMR波谱的归属。以该方式，还可以光谱上鉴定峰F为牡荆素。

含量测定

在典型的疏果山蚂蝗(煎剂)冻干粉中，以牡荆素表示的，确定为标记信号总和的黄酮类的总含量为1.05％。

表

峰E(吸收在DMSO-d₆中)和牡荆素-2”-木糖苷的¹H和¹³C-NMR归属

13C(ppm)1H(ppm)13C(ppm)1H(ppm)

2163.8164.2

3 102.5 6.70 102.8 6.80s

4 181.6 182.4

5 160.6 13.10(OH)160.9

6 99.0 6.1898.5 6.27s

7 162.5 163.1

8 104.1 104.0

9156 156.9

10 103.3 104.1

1'121.7 121.9

2',6'128.9 7.99(d,8,4Hz)8:04 129.2(d,8,6Hz)

3',5'116.3 6.89d,8,4Hz)116.3 6.94(d,8,6Hz)

4'161.7 161.5

Glc-1 71.9 4.79(d,71.9 4.83(d,9,8Hz)

Glc-2 81.7 3.24 82.1 3.32m

Glc-3 78.8 3.46 78.6 3.58

Glc-4 70.5 3.42 70.5 3.54

Glc-5 80.8 4.06 81.6 4.09br t

Glc-6 61.2 3.73 61.3 3.79 3:54,3.60

Xyl-1 106.2 3.88 106.1 3.91(d,7,0Hz)

Xyl-2 73.0 2.75 74.0 2.80dd

Xyl-3 76.0 2.84 76.2 2.90br t

Xyl-4 69.0 3.07 69.7 3.02

Xyl-5 65.7 3.07,2.33 65.8 3.02,2:39

Claims (46)

1.一种制备由松醇定量的植物提取物的方法，其中植物疏果山蚂蝗Desmodiumadscendens选自山蚂蝗属家族，其中级分提取自山蚂蝗属植物部分，其中植物提取物来源于其所述级分，其特征在于，特征的提取物来源于疏果山蚂蝗，来源于疏果山蚂蝗的所述植物提取物的制剂以松醇定量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行经验证的分析方法用于所述以松醇特别是D-松醇的疏果山蚂蝗的定量，其中特定的、定量的疏果山蚂蝗制剂以“整体”形式制备。

3.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，在所述分析方法中进行生物控制的分离，其进行伴随着产生以D-松醇定量的组合物，其中所述组合物产物被重复富集并且分离到众多级分，且其中获得了包含大量D-松醇的煎剂。

4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物的组成被标准化并获得了生产方法的重现性。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，借助于用于其的合适的分析方法确定疏果山蚂蝗中组成的主要成分，和D-松醇的总量，特别是其中评价和优化了提取方法、提取之后获得的产物以及条件。

6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述植物提取物来源于由疏果山蚂蝗的地上部分组成的级分，所述地上部分包括其叶子、树枝、茎和/或花或果实。

7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述植物提取物来源于由疏果山蚂蝗的地上部分组成的级分，所述地上部分是季节性的，包括其花或果实、任选的种子。

8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述植物提取物来源于由疏果山蚂蝗的地下部分组成的级分，所述地下部分包括其根。

9.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述植物部分首先被干燥。

10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述植物部分然后被研磨或破碎。

11.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述植物部分被粉碎成粉末形式。

12.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述粉末被转化为药物形式。

13.根据前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，通过使用低级烷基醇的提取制备所述疏果山蚂蝗的植物部分的提取物。

14.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，通过使用低级烷基醇的提取制备所述疏果山蚂蝗的植物部分的提取物，所述低级烷基醇包括甲醇、乙醇和/或异丙醇，或其组合。

15.根据前述两项权利要求之一所述的方法，其特征在于，通过使用水的提取制备所述疏果山蚂蝗的植物部分的提取物。

16.根据权利要求13或14之一所述的方法，其特征在于，通过使用更少极性或非极性溶剂例如乙酸乙酯和正己烷或其组合的提取制备所述疏果山蚂蝗的植物部分的提取物。

17.根据权利要求13或14任一项所述的方法，其特征在于，通过使用在超临界条件下的溶剂，例如二氧化碳的提取制备所述疏果山蚂蝗的植物部分的提取物。

18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，然后通过在一定量的水中，特别是蒸馏水中，煮沸一定量的干燥的、任选粉末状的叶子，持续一段时间，将所述疏果山蚂蝗的植物部分的水煎剂加温制成煎剂。

19.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，然后将所述疏果山蚂蝗的植物部分的所述水煎剂冷却，然后将获得的部分合并并过滤，之后特别是在真空下将获得的滤液浓缩，然后冷冻干燥以形成冻干粉。

20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，然后将所述疏果山蚂蝗的植物部分的所述水煎剂冷却，然后将获得的部分合并并过滤，之后特别是在真空下将滤液浓缩，然后喷雾干燥。

21.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其特征在于，然后将所述疏果山蚂蝗的植物部分的作为浸渍剂的水产物冷处理为提取物，特别是通过将一定量的干燥的、任选粉碎的植物部分加入至一定量的水，特别是蒸馏水中，持续一段时间。

22.根据权利要求9至21中任一项所述的方法，其特征在于，从1kg干燥的植物部分起始，分别根据10-20:1，更特别是14-16:1的比例，获得60至70g，特别是约65g提取物。

23.根据权利要求7至22中任一项所述法方法，其特征在于，然后使一定量的所述煎剂经历柱色谱法，采用甲醇洗脱，其中收集某些级分并用薄层色谱法分析，且MeOH/H₂O:5:1作为流动相，且其中确定了它们的色谱图。

24.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，使约20g所述提取物经历Sephadex LH-20柱色谱法，采用甲醇洗脱，由此收集约100ml并用薄层色谱法分析，硅胶层厚度约为0.25cm，且MeOH/H2O:5:1作为流动相，且其中基于这些参数确定了它们的色谱图。

25.根据前述两项权利要求之一所述的方法，其特征在于，根据它们的色谱图，将所述级分合并成数个亚级分，特别是11个亚级分。

26.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，将在用MeOH中茴香醛1％H2SO4喷洒且加热至约120℃10分钟之后具有绿色斑点的，特别是200mg的，所述亚级分5-11合并，其中使所述级分经历进一步的柱色谱法，采用甲醇洗脱，其中再次收集和分析某些级分，特别是100ml的级分。

27.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，将来自该柱的，特别是120mg的，所述亚级分4-5合并，其中使后者在相同条件下经历进一步柱色谱法，然后获得纯的产物，特别是白色的产物。

28.根据权利要求3至27中任一项所述的方法，其特征在于，所述提取物被分离，并且分离到的产物被鉴定为甲基化的环醇3-O-甲基-手性肌醇，即D-松醇。

29.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，尤其在气相色谱法中，糖醇特别是木糖醇被选作内标物。

30.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，除了上述木糖醇，其它糖醇也被选择，例如山梨醇、甘露醇、任选的半乳糖醇和肌醇，其中后面两种很少被选择。

31.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，L-松醇产生于所述提取物并被从其中分离。

32.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，方法开始于热带来源的疏果山蚂蝗的植物提取物。

33.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其特征在于，方法开始于栽培来源的疏果山蚂蝗的植物提取物。

34.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，疏果山蚂蝗制剂的延伸特征具有黄酮分布。

35.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，牡荆素被鉴定，其中在典型的疏果山蚂蝗煎剂冻干粉中，以牡荆素表示的，定义为获得信号总和的黄酮类的总量为约1.05％，如同疏果山蚂蝗冻干粉中黄酮比例和分布为0.1至5％之间，特别是其中所述比例为1％量级。

36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其特征在于，标准化的提取物来源于植物疏果山蚂蝗，在其对抗肝炎的作用特别是预防作用中以D-松醇被定量化，且从疏果山蚂蝗中分离D-松醇，其中D-松醇构成活性成分。

37.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其特征在于，标准化的提取物来源于植物疏果山蚂蝗，在其对肝炎的治疗作用中以D-松醇被定量化，且从疏果山蚂蝗中分离D-松醇，其中D-松醇构成活性成分。

38.根据前述两项权利要求之一所述的方法，其特征在于，标准化的提取物来源于植物疏果山蚂蝗，在其具有对抗涉及化学、物理、传染或免疫源的肝损伤的肝炎的活性中以D-松醇被定量化。

39.根据前述权利要求之一定义的方法获得的植物提取物，其用于保护哺乳动物肝脏的方法，和预防哺乳动物肝脏疾病的方法。

40.根据权利要求1至35中任一项定义的方法获得的植物提取物，其用于治疗哺乳动物肝脏疾病。

41.根据前述两项权利要求之一所述的植物提取物，其特征在于，其来源于植物疏果山蚂蝗，以抗肝炎活性的分子D-松醇被定量化，其中D-松醇从疏果山蚂蝗中分离得到且为标准化形式，疏果山蚂蝗的D-松醇为活性成分。

42.根据权利要求39至41中任一项所述的植物提取物，其特征在于，所述植物提取物包含0.1至10％之间，优选4至5％的松醇，特别是D-松醇。

43.根据权利要求39至42中任一项所述的植物提取物，其特征在于，所述包含D-松醇的植物提取物以包含后者的组合物的形式给予哺乳动物，其中所述组合物选自药物组合物、食品组合物和/或饮料组合物。

44.根据权利要求39至43中任一项所述的植物疏果山蚂蝗的提取物，其用于预防哺乳动物肝脏疾病的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的所述疏果山蚂蝗的提取物的步骤。

45.根据权利要求39至44中任一项所述的疏果山蚂蝗的提取物，其用于治疗哺乳动物肝脏疾病的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的上述疏果山蚂蝗的提取物的步骤。

46.根据权利要求39至45中任一项定义的植物提取物的用途，其特征在于，其被用作旨在特定目标群体的抗氧化剂，特别是其中目标群体为人，更特别是酗酒者和/或具有代谢综合征的患者，甚至更特别是具有2型糖尿病的糖尿病患者。