CN117470792B - 一种检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法 - Google Patents
一种检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一种检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法，属于化学品含量测定技术领域。其中制备供试品溶液包括：称定溶液蛋白冻干粉于第一离心管中后加水溶解，再加入乙醇‑氯化钠饱和溶液摇匀后离心，取上清液转移至第二离心管，再加入乙醇‑氯化钠饱和溶液至第一离心管中充分冲洗管壁及沉淀后，将洗液吸取至第二离心管中，离心后取上清液置于水浴条件下，用空气吹扫法将上清液浓缩后，加水溶解获得供试品溶液。本申请方案利用不同浓度梯度的对照品溶液拟合出浓度与吸光度的直线回归方程，可计算供试品中聚山梨酯80浓度，该分析方法具有良好的专属性、可重复性、准确性和耐用性，适于蛋白制品中聚山梨酯80含量的检测。
Description
技术领域
本申请涉及一种检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法，属于化学品含量测定技术领域。
背景技术
聚山梨酯80（或吐温80）是一种有机物，化学式是C64H124O26，为非离子型表面活性剂，有异臭，温暖而微苦，为聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系列产品之一。其为淡黄色至橙黄色的黏稠液体，易溶于水、乙醇、甲醇或乙酸乙酯，在矿物油中极微溶解，其为油/水型乳化剂，可用作稳定剂、扩散剂、抗静电剂、纤维润滑剂等，在工业生产中具有较多的应用场景，医药、食品、化妆品领域均有使用情况，其在医药行业的使用途径有口服、肌肉注射、静脉注射、皮肤外用等方式。由于聚山梨酯80静脉毒性中等，胃肠道摄取毒性中等，并对眼有刺激性，需要控制应用过程中聚山梨酯80的含量在标准范围内，因此需要对其进行含量的检测分析。
现有技术中，对于聚山梨酯80残留量的测定方法参见《中国药典》2020版中“3203聚山梨酯80残留量测定法”一节，其中供试品溶液的制备直接采用供试品溶液，在应用于测定融合蛋白制品中聚山梨酯80含量的分析时，存在如下问题：第一，其标准曲线的制备方法不容易重现；第二，采用紫外可见分光光度计检测时，现有技术每个对照品溶液的吸光度较低，尤其是较低浓度的前3个点位非常低，导致该方法对检测仪器的灵敏度要求极高；第三，不同人员制定标准曲线的可重复性较差；第四，标准曲线线性相关系数难以符合要求，线性关系较差；第五，检测结果的准确性有待提高。
鉴于应用现有技术中《中国药典》公开的聚山梨酯80残留量测定法去测定融合蛋白制品中聚山梨酯80的含量存在的问题，亟需一种专属性、可重复性、准确性和耐用性良好的聚山梨酯80含量检测方法，满足融合蛋白制品中聚山梨酯80含量检测的需要。
发明内容
为了解决上述问题，提供了一种检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法，该方法具有良好的专属性、可重复性、准确性和耐用性，适于蛋白制品中聚山梨酯80含量的检测。
根据本申请的一个方面，提供了一种检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法，所述分析方法包括如下步骤：
1）制备供试品溶液：取蛋白冻干粉于第一离心管中后加水溶解，再加入乙醇-氯化钠饱和溶液摇匀后离心，取上清液转移至第二离心管，再加入乙醇-氯化钠饱和溶液至第一离心管中充分冲洗管壁及沉淀后，将洗液吸取至第二离心管中，离心后取上清液置于水浴条件下，用空气吹扫法将上清液浓缩后，加水溶解获得供试品溶液；
2）制备对照品溶液：分别取不同体积的聚山梨酯80标准溶液与水混匀制备获得不同浓度梯度的对照品溶液；
3）空白对照溶液：采用二氯甲烷溶液作为空白对照溶液；
4）测试方法：分别取步骤1）制备的供试品溶液和步骤2）制备的不同浓度梯度的对照品溶液，加入二氯甲烷和硫氰钴铵溶液后混匀，室温振摇16～20h，测定前弃上清液，使用紫外分光光度计测定620nm波长处下层二氯甲烷溶液的吸光度，利用不同浓度梯度的对照品溶液所得数据拟合出聚山梨酯80浓度与吸光度的直线回归方程后，计算供试品溶液中聚山梨酯80浓度，根据供试品聚山梨酯80浓度即可计算出聚山梨酯80含量。
可选的，所述步骤1）具体包括如下过程：
称定融合蛋白冻干粉130~180mg于第一离心管中，加水0.5~2ml溶解，再加乙醇-氯化钠饱和溶液4~6ml，摇匀后离心，取上清液转移至第二离心管，再加入乙醇-氯化钠饱和溶液0.5~2ml至第一离心管中，充分冲洗管壁及沉淀后，将洗液吸取至第二离心管中，离心后取上清液置于50~60℃水浴条件下，用空气吹扫法将上清液浓缩至0.1~0.5ml后，加0.5~2ml水溶解获得供试品溶液。
可选的，所述步骤1）具体包括如下过程：
称定融合蛋白冻干粉130~180mg于第一离心管中，加水1ml溶解，再加乙醇-氯化钠饱和溶液5ml，摇匀后离心，取上清液转移至第二离心管，再加入乙醇-氯化钠饱和溶液1ml至第一离心管中，充分冲洗管壁及沉淀后，将洗液吸取至第二离心管中，离心后取上清液置于50~60℃水浴条件下，用空气吹扫法将上清液浓缩至0.1~0.5ml后，加1ml水溶解获得供试品溶液。
可选的，所述充分冲洗管壁及沉淀包括使用漩涡震荡仪充分混旋，使其能充分覆盖离心管内壁洗涤的操作。
可选的，所述充分覆盖离心管内壁洗涤的时间为1~3分钟；优选的，为1~2分钟。
可选的，所述步骤1）中离心条件包括2500~3500rpm离心处理5~15min。
可选的，所述步骤2）具体包括如下过程：
分别称定聚山梨酯80标准溶液0ul、40±5ul、100±10ul、200±20ul、300±30ul、400±40ul，与0.5~2ml水在离心管中混匀获得不同梯度的对照品溶液，所述聚山梨酯80标准溶液中聚山梨酯80的浓度为0.5~2mg/ml。
可选的，所述步骤2）具体包括如下过程：
分别称定聚山梨酯80标准溶液0ul、40ul、100ul、200ul、300ul、400ul，与1ml水在离心管中混匀获得不同梯度的对照品溶液，所述聚山梨酯80标准溶液中聚山梨酯80的浓度为1mg/ml。
可选的，所述步骤4）具体包括如下过程：
分别取步骤1）制备的供试品溶液和步骤2）制备的对照品溶液，加入二氯甲烷3~5ml、硫氰钴铵溶液5~7ml并混匀，室温振摇16~20h，测定前弃上清液，使用紫外分光光度计测定600~640nm波长处下层二氯甲烷溶液的吸光度，利用对照品溶液所得数据拟合聚山梨酯80浓度与相应吸光度的直线回归方程后，计算供试品溶液中供试品聚山梨酯80浓度。
可选的，所述步骤4）具体包括如下过程：
分别取步骤1）制备的供试品溶液和步骤2）制备的对照品溶液，加入二氯甲烷4ml、硫氰钴铵溶液6ml并混匀，室温振摇16~20h，测定前弃上清液，使用紫外分光光度计测定620nm波长处下层二氯甲烷溶液的吸光度，利用对照品溶液所得数据拟合聚山梨酯80浓度与相应吸光度的直线回归方程后，计算供试品溶液中供试品聚山梨酯80浓度。
可选的，所述根据供试品聚山梨酯80浓度计算聚山梨酯80含量的公式为：
聚山梨酯80含量%（g/100ml）=×B对×100%；
上式中，M1为聚山梨酯80含量测定值，单位mg/ml，M2为平均装量，单位g，M3为称量冻干粉样品重量，单位g，V为制剂标示复溶体积，单位ml，B对为聚山梨酯80对照品含量。
根据本申请的另一个方面，提供了任一上述的检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法在融合蛋白质量检测中的应用。
本申请的有益效果包括但不限于：
1．根据本申请的检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法，检测方法具有专属性，程序可重复性，且检测结果具有准确性与精确性，检测范围具有宽泛性，并具有一定的耐用性。
2．根据本申请的检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法，解决了现有技术药典中聚山梨酯80含量分析方法无法检测蛋白冻干粉中聚山梨酯80含量的问题，提供了一种检测蛋白冻干粉中聚山梨酯80含量的有效方案。
3．根据本申请的检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法，能够准确检测蛋白冻干粉中聚山梨酯80含量，对蛋白冻干粉产品的品质和安全监控具有重要的意义，鉴于目前蛋白冻干制剂的广泛应用，本申请方案具有广泛的工业应用场景，对蛋白冻干制剂产品的生产具有重要的应用价值。
4．根据本申请的检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法，作为对药典方法的改进，扩展了药典方法中聚山梨酯80检测在蛋白冻干制剂这一细分场景的应用，对药典公开方法具有重要的补充意义，也对其他产品中聚山梨酯80的检测具有借鉴意义。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例，如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。
本申请方案中使用到的标准品及试剂相关信息和来源如下：聚山梨酯80测定对照品，货号1547969，可用于鉴别试验，有关物质检查，含量测定等药物分析，也可用于仪器的校正；硝酸钴，来源国药，货号10026-22-9；二氯甲烷，来源国药，货号75-09-2；乙醇，来源国药，货号64-17-5；氯化钠，来源国药，货号7647-14-5；硫氰酸铵，来源国药，货号1762-95-4。
实施例1
硫氰钴铵溶液制备：称取硝酸钴6.0g、硫氰酸铵40.0g，加水溶解并稀释至200ml。
供试品制备：精密称定冻干粉150mg于15ml离心管中，用1ml灭菌注射用水至完全溶解，加乙醇-氯化钠饱和溶液5ml，摇匀，以每分钟3000转离心10分钟。取上清液转移至另一离心管中，再用乙醇-氯化钠饱和溶液1.0ml充分冲洗管壁及沉淀，具体包括使用漩涡震荡仪充分混旋2.0ml乙醇-氯化钠饱和溶液，使其能充分覆盖离心管内壁洗涤1~2分钟的操作，将洗液完全吸取至另一离心管中，以每分钟3000转离心10分钟，上清液置55℃水浴中，用空气吹扫法将其浓缩至0.3ml，加1ml水完全溶解。
对照品制备：精密量取聚山梨酯80对照品溶液（取聚山梨酯80 100mg，精密称定，加水溶解后置100ml量瓶中，加水稀释至刻度）0ul、40ul、100ul、200ul、300ul、400ul，加入预先加入1ml水的离心管中混匀。
空白对照：用二氯甲烷作空白对照。
测试方法及标准：
分别于对照品、供试品（2份）中，准确加入二氯甲烷4.0ml、硫氰钴铵溶液6.0ml，加塞，混匀。室温摇床振摇18h，测定前静置半小时，弃上层液，按照《安捷伦Cary60紫外分光光度计使用标准操作规程》进行操作，在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度。通过软件自动拟合聚山梨酯80浓度与相应吸光度的直线回归方程，并自动计算供试品聚山梨酯80浓度。并按照下列公式进行计算聚山梨酯80含量%。
聚山梨酯80含量%（g/100ml）=×B对×100%；
式中：上式中，M1为聚山梨酯80含量测定值，单位mg/ml，M2为平均装量，单位g，M3为称量冻干粉样品重量，单位g，V为制剂标示复溶体积，单位ml，B对为聚山梨酯80对照品含量。
要求直线回归方程中相关系数R≥0.98，具体的，本申请方案中，冻干粉为一种融合蛋白，且该融合蛋白产品中聚山梨酯80含量（%）要求满足不大于0.0025%~0.0055%。由于在常温下不稳定的药物均需制成冻干制剂，能确保产品质量，且低温、真空干燥下水分低，再真空后密封即可长期保存，而且药品复溶性好，产品质地疏松，加水后迅速溶解并恢复药液原有的特性，封装后产品剂量准确，外观优良，同时容易实现无菌操作，还能改善生产环境，避免有害粉尘，因此冻干制剂在工业生产中具有较大的应用场景。
融合蛋白又称嵌合蛋白，是指通过连接两个或更多原本独立编码蛋白质的基因而产生的蛋白质。融合蛋白是通过重组DNA技术人工合成，可用于生物研究或治疗。在本申请使用到的融合蛋白为采用融合蛋白原液与辅料赋形剂、保护剂等使用冷冻干燥法制得的注射用无菌粉末，对于本领域技术人员应该可以理解的是，本申请方案并不限定仅用于融合蛋白，同样适用于其他的蛋白冻干制剂的聚山梨酯80的检测。
实施例2
硫氰钴铵溶液制备：称取硝酸钴6.0g、硫氰酸铵40.0g，加水溶解并稀释至200ml。
供试品制备：精密称定冻干粉130 mg于15 ml离心管中，用0.5 ml灭菌注射用水至完全溶解，加乙醇-氯化钠饱和溶液7ml，摇匀，以每分钟2500转离心15分钟。取上清液转移至另一离心管中，再用乙醇-氯化钠饱和溶2.0ml充分冲洗管壁及沉淀，具体包括使用漩涡震荡仪充分混旋2.0ml乙醇-氯化钠饱和溶液，使其能充分覆盖离心管内壁洗涤1~2分钟的操作，将洗液完全吸取至另一离心管中，以每分钟2500转离心15分钟，上清液置50℃水浴中，用空气吹扫法将其浓缩至0.5ml，加0.5ml水完全溶解。
对照品制备：精密量取聚山梨酯80对照品溶液（取聚山梨酯80 100mg，精密称定，加水溶解后置100ml量瓶中，加水稀释至刻度）0ul、45ul、110ul、220ul、330ul、440ul，加入预先加入2ml水的离心管中混匀。
空白对照：用二氯甲烷作空白对照。
测试方法及标准：
分别于对照品、供试品（2份）中，准确加入二氯甲烷3.0ml、硫氰钴铵溶液7.0ml，加塞，混匀。室温摇床振摇16h，测定前静置半小时，弃上层液，按照《安捷伦Cary60紫外分光光度计使用标准操作规程》进行操作，在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度。通过软件自动拟合聚山梨酯80浓度与相应吸光度的直线回归方程，并自动计算供试品聚山梨酯80浓度。并按照下列公式进行计算聚山梨酯80含量%。
聚山梨酯80含量%（g/100ml）=×B对×100%；
式中：M1为聚山梨酯80含量测定值，单位mg/ml，M2为平均装量，单位g，M3为称量冻干粉样品重量，单位g，V为制剂标示复溶体积，单位ml，B对为聚山梨酯80对照品含量。
实施例3
硫氰钴铵溶液制备：称取硝酸钴6.0g、硫氰酸铵40.0g，加水溶解并稀释至200ml。
供试品制备：
精密称定冻干粉180 mg于15 ml离心管中，用2 ml灭菌注射用水至完全溶解，加乙醇-氯化钠饱和溶液6 ml，摇匀，以每分钟3500转离心5分钟。取上清液转移至另一离心管中，再用乙醇-氯化钠饱和溶液0.5ml充分冲洗管壁及沉淀，具体包括使用漩涡震荡仪充分混旋2.0ml乙醇-氯化钠饱和溶液，使其能充分覆盖离心管内壁洗涤1~2分钟的操作，将洗液完全吸取至另一离心管中，以每分钟3500转离心5分钟，上清液置60℃水浴中，用空气吹扫法将其浓缩至0.1ml，加2ml水完全溶解。
对照品制备：精密量取聚山梨酯80对照品溶液（取聚山梨酯80约100mg，精密称定，加水溶解后置100ml量瓶中，加水稀释至刻度）0ul、35ul、90ul、180ul、270ul、360ul，加入预先加入0.5ml水的离心管中混匀。
空白对照：用二氯甲烷作空白对照。
测试方法及标准：
分别于对照品、供试品（2份）中，准确加入二氯甲烷5.0ml、硫氰钴铵溶液5.0ml，加塞，混匀。室温摇床振摇20h，测定前静置半小时，弃上层液，按照《安捷伦Cary60紫外分光光度计使用标准操作规程》进行操作，在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度。通过软件自动拟合聚山梨酯80浓度与相应吸光度的直线回归方程，并自动计算供试品聚山梨酯80浓度。并按照下列公式进行计算聚山梨酯80含量%。
聚山梨酯80含量%（g/100ml）=×B对×100%；
式中：M1为聚山梨酯80含量测定值，单位mg/ml，M2为平均装量，单位g，M3为称量冻干粉样品重量，单位g，V为制剂标示复溶体积，单位ml，B对为聚山梨酯80对照品含量。
对比例1
对比例1方法为现有技术《中国药典》中记载的方法，本法系依据聚山梨酯80中的聚乙氧基（Polyethoxylated）和铵钴硫氰酸盐反应形成蓝色复合物，可溶于二氯甲烷，用比色法测定聚山梨酯80含量。
测定法：精密称定冻干粉150mg于15ml离心管中，用1ml灭菌注射用水至完全溶解（药典中此步骤原文为：量取供试品1.0ml于离心管中，由于药典中供试品本身为液体，而本申请方案的检测对象为融合蛋白的冻干粉，因此此处适应性修改），加乙醇-氯化钠饱和溶液5ml，摇匀，以每分钟3000转离心10分钟，取上清液，再用乙醇-氯化钠饱和溶液1.0ml小心冲洗管壁，洗液与上清液合并，以每分钟3000转离心10分钟，上清液置55℃水浴中，用空气吹扫法将其浓缩至0.1~0.5ml，加1ml水溶解。
准确加入二氯甲烷2.0ml、硫氰钴铵溶液（称取硝酸钴6.0g、硫氰酸铵40.0g，加水溶解并稀释至200ml）3.0ml，加塞，混匀，室温放置1.5小时，每15分钟振荡1次，测定前静置半小时，弃上层液，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度。用二氯甲烷作空白对照。
精密量取聚山梨酯80对照品溶液（取聚山梨酯80约100mg，精密称定，加水溶解后置100ml量瓶中，加水稀释至刻度）0μl、10μl、25μl、50μl、75μl、100μl，加入预先加入1ml水的离心管中混匀，准确加入二氯甲烷2.0ml、硫氰钴铵溶液3.0ml，加塞，混匀，室温放置1.5小时，每15分钟振荡1次，测定前静置半小时，弃上层液，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度。用二氯甲烷作空白对照。
以上述聚山梨酯80对照品溶液系列浓度（mg/ml）对其相应的吸光度作直线回归，相关系数应不低于0.98，将供试品溶液吸光度代入直线回归方程，求得供试品溶液中聚山梨酯80含量（mg/ml）。
测试例1
本测试例中，采用对比例1药典中的方法进行对聚山梨酯80建立标准曲线，具体操作步骤如下。
精密量取聚山梨酯80对照品溶液（取聚山梨酯80约100mg，精密称定，加水溶解后置100ml量瓶中，加水稀释至刻度）0μl、10μl、25μl、50μl、75μl、100μl，加入预先加入1ml水的离心管中混匀，准确加入二氯甲烷2.0ml、硫氰钴铵溶液3.0ml，加塞，混匀，室温放置1.5小时，每15分钟振荡1次，测定前静置半小时，弃上层液，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度。用二氯甲烷作空白对照。
测试方法及标准：分别于对照品、供试品（2份）中，准确加入二氯甲烷4.0ml、硫氰钴铵溶液6.0ml，加塞，混匀。室温摇床振摇18h，测定前静置半小时，弃上层液，按照《安捷伦Cary60紫外分光光度计使用标准操作规程》进行操作，在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度。通过软件自动拟合聚山梨酯80浓度与相应吸光度的直线回归方程。
重复5次，拟合结果分别如下表1~5所示。
表1
表2
表3
表4
表5
分析表1~表5中标准曲线的数据结果可以看出，相同浓度的对照吸光度值差异较大，相关系数有些不能满足大于0.98的要求，不同人员不同时间测试时，存在相关系数不符合标准的情况。由此可知，现有技术药典中利用聚山梨酯80对照品溶液拟合直线回归方程的相关步骤需要进行优化，需要解决其相关系数不稳定，难以满足大于0.98要求的问题。
测试例2
本测试例中，采用实施例1方案中方法进行对聚山梨酯80建立标准曲线，具体操作步骤如下。
对照品制备：精密量取聚山梨酯80对照品溶液（取聚山梨酯80 100mg，精密称定，加水溶解后置100ml量瓶中，加水稀释至刻度）0ul、40ul、100ul、200ul、300ul、400ul，加入预先加入1ml水的离心管中混匀。空白对照：用二氯甲烷作空白对照。
测试方法及标准：分别于对照品、供试品（2份）中，准确加入二氯甲烷4.0ml、硫氰钴铵溶液6.0ml，加塞，混匀。室温摇床振摇18h，测定前静置半小时，弃上层液，按照《安捷伦Cary60紫外分光光度计使用标准操作规程》进行操作，在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度。通过软件自动拟合聚山梨酯80浓度与相应吸光度的直线回归方程。
重复3次，拟合结果分别如下表6~9所示。
本测试例中标准曲线建立的步骤与测试例1中主要区别在于，提高了每个标准溶液的浓度。
表6
表7
表8
分析表6~表8中标准曲线数据结果如下可以看出，相同浓度的对照吸光度值差异接近，相关系数均大于0.98，而且不同人员不同时间测试时，存在相关系数均能达到0.99以上，符合要求。
现有技术中的标准曲线制备方法不容易重现，且现有技术每个对照品溶液的吸光度较低，尤其是较低浓度的前3个点位非常低，所以对检测仪器的灵敏度要求极高。通过优化标准曲线的对照品加入量，提高了每个样品的吸光度测定值，使不同人员制定标准曲线的可重复性提高，直线回归方程拟合后的线性相关系数符合药典要求，即大于0.98，线性关系良好。
实验例1
本实验例，展示了发明人在基于药典方法针对融合蛋白中聚山梨酯80含量检测方法建立过程中的优化过程，在本实施例中发明人最终通过增加对照溶液及样品溶液体积、增加比色皿淋洗次数以及进行乙醇-氯化钠饱和溶液充分混匀，使得最终数据更加准确。
1）未增加样品体积，未进行乙醇-氯化钠饱和溶液充分混匀
下表9为未增加样品体积，未进行乙醇-氯化钠饱和溶液充分混匀（相比于实施例1），表9实验结果中包含直线回归方程相关的结果，以及平行制备样品20230401-1与20230401-2的结果。
表9
根据表9结果可知，平行制备的两个样品20230401-1与20230401-2，这两个样品的数据检测值分别为0.015mg/ml与0.037mg/ml，相对偏差为42%，偏差非常大。
为了考察偏差非常大的因素，发明人进一步还采用了理论含量为0.050mg/ml的标准品溶液6份与样品溶液2份再进行了测试，结果如下表10所示，表10中包含回归直线拟合结果以及标准品溶液6份与样品溶液2份的浓度数据。
表10
根据表10结果可知，为了进一步验证上面出现大偏差的原因，发明人平行制备的理论含量为0.050mg/ml的标准品溶液6份与样。其中6份标准溶液的回收率分别为：86%、130%、88%、60%、50%、54%，可知回收率不稳定，而2份样品溶液检测值分别为0.008mg/ml与-0.004mg/ml，与样品溶液的理论量0.040mg/ml相比，基本无回收，由此可知现有技术的药典方法不适用于本申请方案的检测需要。
2）增加样品体积，同时乙醇-氯化钠饱和溶液充分混匀
通过加样品体积，同时乙醇-氯化钠饱和溶液充分混匀，制备平行样品202305S35-1、202305S35-2、202305S35-3、202305S35-4进行测试，结果如表11所示，表11中包含拟合回归直线方程的结果以及样品的浓度数据结果。
表11
根据表11结果可知，制备的平行样品202305S35-1、202305S35-2、202305S35-3、202305S35-4的浓度检测值分别为0.143mg/ml、0.132mg/ml、0.128mg/ml、0.129mg/ml，相对偏差为5.5%，其中第一个数据偏差较大的而原因，是因检验员在进行高浓度对照6样品测试后，未充分淋洗比色皿，造成检测数据偏高，故如果舍弃第一个因操作失误的测试数据，计算剩余3个样品，浓度的相对偏差仅为1.5%。
除此之外，还由另一检验员制备平行样品202305S35-1、202305S35-2、202305S35-3、202305S35-4进行重复实验，以验证本申请方案的性能，结果见表12所示。
表12
根据表12中由另一检验员制备平行样品202305S35-1、202305S35-2、202305S35-3、202305S35-4的结果可知，这四个样品的测量值数据检测值分别为0.132mg/ml、0.135mg/ml、0.123mg/ml、0.133mg/ml，根据前一个操作人员的经验，在进行分析测试时，注意淋洗比色皿操作，最终结果相对偏差为4.6%。
在上述实验过程中，所用的测试样品理论含聚山梨酯80约为0.127mg/ml，可知本申请方案的分析方法的准确度在96%~104%之间，能够应用于融合蛋白制备中聚山梨酯80的含量分析检测。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括如下步骤：
1）制备供试品溶液：称定融合蛋白冻干粉130~180mg于第一离心管中，加水1ml溶解，再加乙醇-氯化钠饱和溶液5ml，摇匀后离心，取上清液转移至第二离心管，再加入乙醇-氯化钠饱和溶液1ml至第一离心管中，充分冲洗管壁及沉淀后，将洗液吸取至第二离心管中，离心后取上清液置于50~60℃水浴条件下，用空气吹扫法将上清液浓缩至0.1~0.5ml后，加1ml水溶解获得供试品溶液，所述步骤1）中离心条件包括2500~3500rpm离心处理5~15min，所述充分冲洗管壁及沉淀包括使用漩涡震荡仪充分混旋，使其能充分覆盖离心管内壁洗涤的操作，所述充分覆盖离心管内壁洗涤的时间为1~3分钟；
2）制备对照品溶液：分别称定聚山梨酯80标准溶液0ul、40ul、100ul、200ul、300ul、400ul，与1ml水在离心管中混匀获得不同梯度的对照品溶液，所述聚山梨酯80标准溶液中聚山梨酯80的浓度为1mg/ml；
3）空白对照溶液：采用二氯甲烷溶液作为空白对照溶液；
4）测试方法：分别取步骤1）制备的供试品溶液和步骤2）制备的对照品溶液，加入二氯甲烷4ml、硫氰钴铵溶液6ml并混匀，室温振摇16~20h，测定前弃上清液，使用紫外分光光度计测定620nm波长处下层二氯甲烷溶液的吸光度，利用对照品溶液所得数据拟合聚山梨酯80浓度与相应吸光度的直线回归方程后，计算供试品溶液中供试品聚山梨酯80浓度；
根据供试品聚山梨酯80浓度计算聚山梨酯80含量的公式为：
聚山梨酯80含量=×B对×100%；
上式中，M1为供试品聚山梨酯80含量测定值，单位mg，M2为平均装量，单位g，M3为称量冻干粉样品重量，单位g，V为制剂标示复溶体积，单位ml，B对为聚山梨酯80对照品含量。
2.如权利要求1所述的检测蛋白冻干制剂中聚山梨酯80含量的分析方法在融合蛋白质量检测中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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