CN101639439A - 一种测定蛋白质溶液中聚山梨酯含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定蛋白质溶液中聚山梨酯含量的方法，该方法包括以下步骤：(1)将被检测样品与三氯甲烷和硫氰钴铵水溶液混合，得到混合液；(2)使所述混合液分层；(3)测量分层后得到的三氯甲烷层在紫外－可见波长下的吸光度；(4)根据所测得的吸光度计算所述被检测样品中聚山梨酯的浓度。该方法不需要对制剂中的蛋白质进行沉淀处理而直接进行测定，也不需要将样品过夜反应，并且克服由于二氯甲烷易挥发而检测时间间隔过长造成的差异。该方法可用于对蛋白质溶液中聚山梨酯含量进行控制。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及测定聚山梨酯含量的方法，特别涉及测定蛋白质溶液中聚山梨酯含量的方法。
背景技术
表面活性剂在与人体接触的体系如药物、食品、化妆品及个人卫生用品中的应用越来越广泛，但是表面活性剂及其代谢产物对机体可能造成毒副作用，包括急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性、对生育繁殖的影响、胚胎毒性、致畸性、致突变性、致癌性、致敏性、溶血性等等。因此需要根据制品用途、表面活性剂的种类等情况对表面活性剂在制品中的含量加以控制。
非离子表面活性剂毒性较低，其中聚山梨酯类非离子表面活性剂在药剂中广泛用作乳化剂、分散剂、增溶剂和稳定剂，主要用于制造多种液体制剂(如芳香水剂、合剂、洗剂、乳剂等)、半固体制剂(如油膏剂、乳膏剂、栓剂等)，包括无菌、灭菌制剂(如滴眼剂、眼膏剂、注射液等)，一般含量为0.1％～2.0％。根据国内外临床和非临床安全性试验研究结果，这在安全范围之内。对于生物类药剂而言，这类物质在制剂(特别是注射类制剂)中的含量一般不高于0.05％。
对于其中使用聚山梨酯作为稳定剂的蛋白质制剂而言，即使不需考虑毒性方面的因素，也需要控制聚山梨酯的含量。这是因为蛋白质的性质比较脆弱，如果聚山梨酯的含量过低，则达不到稳定效果，如果聚山梨酯的含量过高，则反而可能促使蛋白质降解。
目前，测定聚山梨酯含量的方法主要有分光光度法、荧光光度比色法和分子排阻-蒸发光散射(SEC-ELSD)法。其中，荧光法和SEC-ELSD法实验条件要求较高，不利于推广，而分光光度法灵敏度高且操作简便，应用范围最广。《中国药典》中规定的聚山梨酯80残留量测定方法就是分光光度法(参见《中国药典》(2005年版)三部附录VIH)，其原理是利用聚山梨酯80中的聚乙氧基和铵钴硫氰酸盐反应形成的蓝色复合物溶于二氯甲烷后在620nm处有特异吸收，并且在一定剂量范围内，其吸收值呈剂量依赖。但该方法需要对样品中的蛋白质进行沉淀、洗涤、分离，并且还需要进行空气吹扫，样品在处理过程中容易丢失，会造成较大偏差；同时该方法需要在室温下放置过夜，时间较长，而二氯甲烷又易挥发，这也会影响实验结果。
已有人提出在上述测定蛋白质溶液中聚山梨酯含量的方法中使用90℃水浴来代替空气吹扫以浓缩样品溶液，其中仍需要进行蛋白质沉淀、洗涤、分离等步骤(参见“聚山梨酯80含量测定方法的改进验证”，崔志伟、杨黎明、高琼，科技资讯，2006年第12期第186页)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种测定蛋白质溶液中聚山梨酯含量的方法，该方法不需要对制剂中的蛋白质进行沉淀处理而直接进行测定，也不需要将样品过夜反应，并且克服由于二氯甲烷易挥发而检测时间间隔过长造成的差异。
为此，本发明提供一种测定蛋白质溶液中聚山梨酯含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将被检测样品与三氯甲烷和硫氰钴铵水溶液混合，得到混合液；
(2)使混合液分层；
(3)测量分层后得到的三氯甲烷层在紫外-可见波长下的吸光度；
(4)根据所测得的吸光度计算被检测样品中聚山梨酯的浓度。
在步骤(1)中，优选将被检测样品与三氯甲烷和硫氰钴铵水溶液以1∶2∶3的体积比混合。步骤(2)优选包括：将混合液置于60-65℃的水浴中5-30分钟，从而使所述混合液分层。步骤(3)优选包括：测量三氯甲烷层在620nm波长下的吸光度。步骤(4)优选包括：根据聚山梨酯标准品的吸光度-浓度标准曲线计算被检测样品中聚山梨酯的浓度。
聚山梨酯优选为聚山梨酯20或聚山梨酯80。蛋白质优选为非糖蛋白。蛋白质还优选为分子量在10千道尔顿以下的蛋白质。
硫氰钴铵水溶液优选是由3重量份的硝酸钴和20重量份的硫氰酸铵加水溶解至100体积份配制而成的。
本发明的方法的优点在于用三氯甲烷代替二氯甲烷，不需要使用乙醇-氯化钠饱和溶液等试剂对蛋白质进行沉淀，从而也不需要洗涤沉淀和分离沉淀，也不需要浓缩、放置过夜等步骤，并且克服由于二氯甲烷易挥发而检测时间间隔过长造成的差异，操作简便、快速、重复性好。
附图说明
图1是聚山梨酯20含量测定的线性标准曲线；
图2是聚山梨酯20和聚山梨酯80含量测定的线性标准曲线比较。
具体实施方式
本发明方法中所涉及的聚山梨酯(吐温(Tween))是指聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，包括聚山梨酯20(聚氧乙烯(20)失水山梨醇月桂酸酯)、聚山梨酯40(聚氧乙烯(20)失水山梨醇棕榈酸酯)、聚山梨酯60(聚氧乙烯(20)失水山梨醇硬脂酸酯)、聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)失水山梨醇油酸酯)等，其中优选的是聚山梨酯20和聚山梨酯80。
本发明方法中所涉及的蛋白质包括糖蛋白和非糖蛋白，优选非糖蛋白。蛋白质含量优选在2mg/ml以内。蛋白质的分子量优选为在10千道尔顿以下。
本发明方法中所用的硫氰钴铵水溶液可按常规方法将硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)和硫氰酸铵(NH4SCN)溶于水配制而成。在一个实施方案中，将3重量份的硝酸钴和20重量份的硫氰酸铵加水至100体积份而得到硫氰钴铵水溶液。例如，将6g硝酸钴和40g硫氰酸铵加水溶解并稀释至200ml而得到硫氰钴铵水溶液。
在本发明方法的步骤(1)中，可按常规方法混合被检测样品与三氯甲烷和硫氰钴铵水溶液，例如将被检测样品与三氯甲烷和硫氰钴铵水溶液置于容器中每间隔一段时间震荡一次，并重复几次。
在本发明方法的步骤(2)中，可按常规方法使所述混合液分层，例如在室温下将混合液静置至分层，或者在水浴中将混合液静置至分层。优选将混合液在60-65℃的水浴中静置5-30分钟，更优选将混合液在60℃的水浴中静置10分钟。
在本发明方法的步骤(3)中，可按常规方法测量分层后得到的三氯甲烷层在紫外-可见波长下的吸光度，例如使用紫外-可见分光光度剂测量620nm波长下的吸光度。
在本发明方法的步骤(4)中，可以根据聚山梨酯标准品的吸光度-浓度标准曲线计算所述被检测样品中聚山梨酯的浓度。其中聚山梨酯标准品的吸光度-浓度标准曲线可按如下方法得到：制备一系列浓度的聚山梨酯标准溶液；将这些聚山梨酯标准溶液按照本发明方法步骤(1)、(2)和(3)进行操作分别得到吸光度；以聚山梨酯标准溶液的浓度为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，作直线回归，求回归方程。将被检测样品的吸光度代入方程即得被检测样品中聚山梨酯的浓度。
对聚山梨酯标准溶液按照本发明方法步骤(1)、(2)和(3)进行的操作可以与对被检测样品按照本发明方法步骤(1)、(2)和(3)进行的操作同时进行，也可以不同时进行，例如先进行或后进行。
以下参照实施例来对本发明进行进一步说明，应该理解本发明不限于这些实施例。
实施例1重组人红细胞生成素(Fc)融合蛋白【rhEPO-Fc】注射液中Tween-20(聚山梨酯20)含量的测定
取rhEPO-Fc注射液(Lot.20060301)进行试验，注射液中Tween-20的含量为0.01％，即约100μg/ml。试验步骤为：
(1)分别取0、20、40、60、80、100μl Tween-20标准溶液(1mg/ml)到带塞玻璃试管中，补水至1ml；
(2)每管分别加入2ml三氯甲烷和3ml硫氰钴铵水溶液(称取硝酸钴6.0g、硫氰酸铵40.0g，加水溶解并稀释至200ml)，混匀；每间隔15分钟充分震荡混匀1次，共4次；
(3)静置于60℃水浴中10分钟；
(4)尖细移液管移去上层溶液，取下层溶液测定OD620值，并以浓度为横坐标，对应的OD620为纵坐标绘制标准曲线(见图1)；
(5)取被检测样品500μl(补水至1ml)、1000μl，按本例子中步骤(2)、(3)、(4)同法处理；
(6)根据本例子中步骤(4)绘制的标准曲线(见图1)求出被检测样品中Tween-20的含量。
结果见表1。
表1：rhEPO-Fc注射液中Tween-20含量测定结果
| 加样体积(μl) | Tween-20含量测定值(μg) | Tween-20含量理论值(μg) | 偏差(％) |
| 500 | 52.45 | 50 | 4.90 |
| 1000 | 91.66 | 100 | 8.34 |
实施例2常规方法与改良方法的比较试验
取rhEPO-Fc注射液(Lot.20060301)(含50μg/ml Tween-20)和自配制的100μg/ml BSA(牛血清白蛋白)溶液(分别含50、80μg/mlTween-20)作为试验样品。改良方法按照实施例1执行。常规方法如下：
(1)分别取上述样品1.0ml于带塞离心管中，加乙醇-氯化钠饱和溶液5ml，摇匀，在3000rpm下离心10分钟；
(2)取上清液，再用1.0ml乙醇-氯化钠饱和溶液小心冲洗管壁，洗液与上清液合并，在3000rpm下离心10分钟；
(3)取上清液置55℃水浴中，用电吹风吹扫，将其浓缩至0.1-0.5ml，加1ml水溶解；
(4)加入二氯甲烷2.0ml、硫氰钴铵水溶液3.0ml，加塞，混匀，室温放置过夜，间隔15分钟振荡1次，测定前静置30分钟；
(5)弃上层液，在波长620nm处测定下层二氯甲烷溶液的吸收值，其中用二氯甲烷作空白对照；
(6)准备梯度浓度的Tween-20标准溶液各1ml，按本例子中步骤(4)、(5)执行。
结果见表2。
表2：常规方法与改良方法测定不同蛋白制剂中Tween-20含量结果比较
该结果表明：通过改良方法测定的结果与常规方法比较，结果同样稳定可靠，而且操作更加简便，试验更加快捷。
实施例3不同蛋白质对聚山梨酯含量测定的影响
采用上述改良方法分别检测不同浓度的rhEPO-Fc、重组人淋巴细胞相关因子(Fc)融合蛋白【rhLFA-Fc】、重组人甲状旁腺激素1-34【rhPTH1-34】、Exendin-4和BSA溶液对聚山梨酯含量测定的影响。实验结果见表3。
表3：几种蛋白质溶液中聚山梨酯含量测定结果比较
| 蛋白名称 | 蛋白含量(μg/ml) | Tween-20含量理论值(μg/ml) | Tween-20含量测定值(μg/ml) | 偏差(％) |
| rhEPO-Fc | 50 | 50 | 48.63 | 2.74 |
| rhEPO-Fc | 100 | 50 | 45.68 | 8.64 |
| rhEPO-Fc | 150 | 50 | 不能取样检测 | - |
| rhLFA-Fc | 50 | 50 | 45.48 | 9.04 |
| rhLFA-Fc | 100 | 50 | 51.53 | 3.06 |
| rhLFA-F c | 150 | 50 | 47.21 | 5.58 |
| rhPTH1-34 | 500 | 50 | 48.43 | 3.14 |
| rhPTH1-34 | 1000 | 50 | 52.66 | 5.32 |
| rhPTH1-34 | 2000 | 50 | 47.24 | 5.52 |
| Exendin-4 | 500 | 50 | 44.32 | 11.36 |
| Exendin-4 | 1000 | 50 | 47.05 | 5.90 |
| Exendin-4 | 2000 | 50 | 40.85 | 18.30 |
| BSA | 500 | 50 | 49.44 | 1.12 |
| BSA | 1000 | 50 | 55.62 | 11.24 |
| BSA | 2000 | 50 | 不能取样检测 | - |
具体实验过程中，观察到以下现象：
(1)糖蛋白rhEPO-Fc和rhLFA-Fc融合蛋白：其浓度在50μg/ml内，加热前基本能分层，浓度高于50μg/ml时，不能分层；但加热后，浓度在150μg/ml内能分层，其中100μg/ml内能够取样检测；浓度高于150μg/ml，即使加热也不能分层；
(2)甲状旁腺激素1-34和Exendin-4：其为分子量约4千道尔顿的小肽分子，其浓度在2mg/ml以内加热前后都能较好的分层；
(3)BSA：其分子量约为66千道尔顿，如果其蛋白质浓度高于100μg/ml不能很好分层，加热后浓度在1mg/ml也能分层检测。
以上现象及结果表明：不同蛋白质对聚山梨酯含量测定的影响不同，大分子蛋白对检测的影响高于小分子蛋白，糖蛋白对检测的影响程度远高于非糖蛋白。随着被检测样品中蛋白浓度的提高，检测体系溶液分层效果越差，通过静置加热，在一定浓度条件下，分层效果明显改善，并能检测聚山梨酯的含量。
该法聚山梨酯的线性范围在0～400μg/ml，检测回收率在95％～110％之间，偏差在20％以内。
实施例4聚山梨酯20及80标准曲线的比较
本实验的目的在于比较最常用到的两种聚山梨酯对该法的适应性及相互之间的关系。用本发明阐述的方法同时作Tween-20和Tween-80的标准曲线，选取的标准溶液浓度都为5、10、20、40、60、80、100μg/ml，测定的OD620与对应的标准溶液做线性回归计算(见图2)。实验得出：Tween-20和Tween-80在相同浓度条件下，吸收值具有较高的一致性，线性关系好。结果表明本发明方法对于聚山梨酯都适用。
本发明不局限于上述实施例，应该理解本领域的技术人员可以在不脱离本发明的实质和范围的条件下对本发明做出各种修改和改变。
Claims (9)
1.一种测定蛋白质溶液中聚山梨酯含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将被检测样品与三氯甲烷和硫氰钴铵水溶液混合，得到混合液；
(2)使所述混合液分层；
(3)测量分层后得到的三氯甲烷层在紫外-可见波长下的吸光度；
(4)根据所测得的吸光度计算所述被检测样品中聚山梨酯的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)中，将所述被检测样品与三氯甲烷和硫氰钴铵水溶液以1∶2∶3的体积比混合。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)包括：将所述混合液置于60-65℃的水浴中5-30分钟，从而使所述混合液分层。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)包括：测量所述三氯甲烷层在620nm波长下的吸光度。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)包括：根据聚山梨酯标准品的吸光度-浓度标准曲线计算所述被检测样品中聚山梨酯的浓度。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚山梨酯为聚山梨酯20或聚山梨酯80。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质为非糖蛋白。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质为分子量在10千道尔顿以下的蛋白质。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述硫氰钴铵水溶液是由3重量份的硝酸钴和20重量份的硫氰酸铵加水至100体积份配制而成的。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100203 |