CN111033261A - 聚山梨醇酯的定量分析 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种定量样品中聚山梨醇酯的方法，包括以下步骤：a)提供包含至少一种聚山梨醇酯的样品；b)将样品与羰花青染料混合；c)测定混合物的荧光；及d)将荧光与聚山梨醇酯的含量相关联。

Description

聚山梨醇酯的定量分析
背景技术
聚山梨醇酯是一类非离子型表面活性剂，在药品和食品工业中广泛用作赋形剂。聚山梨醇酯20(PS20)和聚山梨醇酯80(PS80)-亦称为吐温20(
Figure BDA0002377883800000011
20)和吐温80(
Figure BDA0002377883800000012
80)-是最常用的表面活性剂，用于防止治疗蛋白吸附到界面和相关的不稳定情况。PS20和PS80在生物药品中对蛋白质稳定性的贡献得到了广泛认可，它们都是监管机构批准的肠胃外给药赋形剂。大多数包含肽、蛋白质、抗体和疫苗的生物制药产品都采用聚山梨醇酯配制。例如，大约80％的商业单克隆抗体(MAb)都含有PS20或PS80。它们较高的亲水亲油平衡值(HLB)及较低的临界胶束浓度(CMC)使它们即使在低浓度下也具有非常高的表面活性。生物药品中聚山梨醇酯的典型浓度是0.001-0.1％(w/v)，对应于0.01-1mg/ml。
虽然人们对其稳定作用的分子详细情况尚未完全了解，但众所周知的是聚山梨醇酯通过两种不同的机制稳定蛋白质，即(i)竞争吸附到疏水界面上和/或(ii)直接与蛋白质结合。在第一种机制中，与蛋白质相比，聚山梨醇酯每单位面积的吸附能量更大，从而与蛋白质有效竞争，防止其吸附到疏水界面上。此外，聚山梨醇酯可以与蛋白质直接相互作用，通过与暴露的疏水区结合及保护暴露的疏水区而提高其在溶液中的稳定性。这样通过减少蛋白质-蛋白质之间的相互作用，防止蛋白质聚集。对具体的蛋白质的稳定来说，这两种机制中哪种机制占主导作用取决于蛋白质及聚山梨醇酯。
聚山梨醇酯具有两亲性结构。它们的亲水性级分包含脱水山梨糖醇头部基团，每个羟基与聚乙二醇链(PEG/聚氧化乙烯链/POE)结合。疏水性部分的特点是其羟基被酯化的脂肪酸(FA)。从理论上来说，不同的聚山梨醇酯可以通过那些脂肪酸区分。实际上，商业聚山梨醇酯包含结构上相关的分子，仅大约20％(w/w)的聚山梨醇酯材料与理论分子结构相符。
除合成期间形成的副产物之外，降解反应(氧化和水解)可能也是聚山梨醇酯溶液不均匀的原因。聚山梨醇酯降解产物的形成会导致制剂内表面活性剂浓度损失。
除此之外，它们还可能丧失表面活性剂性质。这可能影响蛋白质的稳定性，并且会导致形成蛋白质聚集体和颗粒。因此，必须防止降解反应。聚山梨醇酯的降解综述及它们的降解分析见Martos,A.et.al.；Journal of Pharmaceutical Sciences；2017；doi:10.1016/j.xphs.2017.03.001。
由于对治疗蛋白制剂中聚山梨醇酯的浓度及聚山梨醇酯的降解进行监测是非常重要的，因此，人们已经开发了几种分析样品中聚山梨醇酯含量及其降解产物含量的方法。通常，在脱除蛋白质(例如，通过有机溶剂使蛋白质沉淀或通过固相萃取)的样品制备后，使样品通过反相液相色谱(RP-HPLC)，从而分离样品的各组分(聚山梨醇酯)，并采用质谱、ELSD或CAD检测对它们进一步进行分析。此外，聚山梨醇酯80可以在水解释放出油酸后，采用紫外/可见光(UV/Vis)检测。这些方法中的大多数方法比较复杂、耗时长，并且对蛋白质干扰比较敏感。接下来，是采用这种荧光染料法进行定量。最常见的分析方法是基于N-苯基-1-萘胺(NPN)的荧光胶束分析(FMA)，这种方法依据的是荧光染料与特别是超过CMC的胶束中存在的疏水环境之间的相互作用。这种分析方法的缺点是缺乏PS的特异性(即NPN可能与蛋白质、硅油相互作用，而且可能受到溶液粘度的影响)，并且PS的定量仅在浓度超过CMC时才可行。
因此，本发明的目的是提供能够快速理想地自动或半自动检测和定量聚山梨醇酯的新方法。
发明内容
本发明人惊讶地发现，样品中聚山梨醇酯的含量可以采用羰花青染料，特别是选自1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)或其衍生物DID(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰花青4-氯苯磺酸盐)和DiO(3,3'-双十八烷基氧代羰花青高氯酸盐)的羰花青染料准确地定量。
因此，在第一方面，本发明涉及一种定量样品中聚山梨醇酯的方法，包括以下步骤：
a)提供包含至少一种聚山梨醇酯的样品；
b)将样品与羰花青染料混合；
c)测定混合物的荧光；及
d)将荧光与聚山梨醇酯的含量相关联。
另一方面，本发明涉及羰花青染料用于定量样品中聚山梨醇酯的用途。
本发明还涉及孔板，例如，96-孔板，其中至少一些孔或甚至每个孔中都包含限定量的羰花青染料。
另一方面，本发明涉及定量样品中聚山梨醇酯的试剂盒，该试剂盒包括：
a)羰花青染料；
b)稀释缓冲溶液；
c)任选地校准样品。
在一具体实施例中，试剂盒包括孔板，该孔板的每个孔内包含限定量的羰花青染料。
附图说明
图1：优选染料1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)(A)、3,3'-双十八烷基氧代羰花青高氯酸盐(DiO)(B)、1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰花青4-氯苯磺酸盐(DiD)(C)的结构。
图2：DiI存在下聚山梨醇酯20(PS20)的荧光发射特性：
(A)PS20-DiI-荧光发射光谱(550nm下激发(Exc.))。加入DiI(357nM)后不同PS20浓度(0.0002-0.0025％(w/v))的荧光光谱(560-620nm发射(EM.))。采用基于比色皿(cuvette)的荧光分光光度计进行测定：0％(w/v)PS20-..-..-、0.0002％(w/v)PS20-.-.-.-、0.0003％(w/v)PS20….、0.0005％(w/v)PS20----、0.0009％(w/v)PS20----、0.0015％(w/v)PS20-------、0.0025％(w/v)PS20-------。
(B)(A)的低强度范围的放大情况。
(C)615nm下PS20-DiI-校准曲线(0.0008-0.0021％(w/v))。观察到的最大荧光强度对相应的PS20浓度绘制的图形。
图3：DiD存在下PS20的荧光发射特性：
(A)PS20-DiD-荧光发射光谱(646nm下激发)。加入DiD(357nM)后不同PS20浓度(0.0002-0.0025％(w/v))的荧光光谱(656-800nm)。采用基于比色皿的荧光分光光度计进行测定：0％(w/v)PS20-..-..-、0.0002％(w/v)PS20-.-.-.-、0.0003％(w/v)PS20….、0.0005％(w/v)PS20----、0.0009％(w/v)PS20----、0.0015％(w/v)PS20-------、0.0025％(w/v)PS20-------。
(B)(A)的低强度范围的放大情况。
(C)665nm下PS20-DiD-校准曲线(0.0008-0.0021％(w/v))。观察到的最大荧光强度对相应的PS20浓度绘制的图形。
图4：DiI存在下聚山梨醇酯80(PS80)的荧光发射特性：
(A)PS80-DiI-荧光发射光谱(550nm下激发)。加入DiI(357nM)后不同PS80浓度(0.0002-0.0025％(w/v))的荧光光谱(560-620nm)。采用基于比色皿的荧光分光光度计进行测定：0％(w/v)PS80-..-..-、0.0004％(w/v)PS80-.-.-、0.0006％(w/v)PS80...、0.0010％(w/v)PS80----、0.0016％(w/v)PS80---、0.0027％(w/v)PS80-----、0.0045％(w/v)PS80------。
(B)(A)的低强度范围的放大情况。
(C)615nm下PS80-DiI-校准曲线(0.0007-0.0018％(w/v))。观察到的最大荧光强度对相应的PS80浓度绘制的图形。采用酶标仪(plate reader)进行测定。
图5：DiD存在下PS80的荧光发射特性。
(A)PS80-DiD-荧光发射光谱(646nm下激发)。加入DiD(357nM)后不同PS80浓度(0.0002-0.0045％(w/v))的荧光光谱(656-800nm)。采用基于比色皿的荧光分光光度计进行测定：0％(w/v)PS80-..-..-、0.0004％(w/v)PS80-.-.-.-、0.0006％(w/v)PS80....、0.0010％(w/v)PS80----、，0.0016％(w/v)PS80----，、0.0027％(w/v)PS80-------、0.0045％(w/v)PS80-------。
(B)(A)的低强度范围的放大情况。
(C)665nm下的PS80-DiD-校准曲线(浓度分别是-●-0.0011-0.0026％(w/v)和--△--0.0014-0.0026％(w/v))。观察到的最大荧光强度对相应的PS80浓度绘制的图形。采用酶标仪进行测定。
图6：硅油液滴的影响。针对水(----)、浓度为0.002％(w/v)(---)和0.03％(w/v)(….)的硅油水溶液，采用比色皿荧光计测定的550nm激发后DiI(357nM)的荧光发射光谱(560-620nm)。
图7：校准曲线(不含蛋白质--●--)，示出了采用酶标仪测定的646nm激发后DiD(357nM)在665nm的荧光发射强度。校准曲线用于对样品中PS20的浓度进行定量，0.00175％(w/v)理论浓度以□表示。
图8：校准曲线(不含蛋白质--●--)，示出了采用酶标仪测定的550nm激发后DiI(357nM)在665nm的荧光发射强度。校准曲线用于对样品中PS80的浓度进行定量，0.0007％(w/v)理论浓度以□表示。
图9：校准曲线(不含蛋白质--·--及含15mg/mL IgG 1--□--)，示出了采用酶标仪测定的550nm激发后DiI(357nM)在615nm的荧光发射强度。校准曲线用于对样品1至5中PS20的浓度进行定量，理论浓度为0.002％(w/v)PS20。
图10：在96孔板内在37℃摇动(40rpm)条件下，采用357nM DiI直接培养PS20样品后DiI的荧光强度(550nm下激发)。
(A)PS20-DiI-校准曲线(0.0004-0.0015％(w/v))，在565nm下发射，加入DiI 0分钟后(□)、15分钟后(·)和30分钟后(△)直接测定。
(B)PS20-DiI-校准曲线(0.0004-0.0015％(w/v))，在615nm下发射，加入DiI 0分钟后(□)、15分钟后(·)和30分钟后(△)直接测定。
图11：在96孔板内采用357nM DiI培养PS20样品后DiI的荧光强度(550nm下激发)。40rpm摇动、37℃条件下培养(□)。不摇动、37℃条件下培养(■)。涡旋(·)条件及室温、不摇动条件下培养(△)。
(A)在565nm下激发的PS20-DiI-校准曲线(0.0004-0.0015％(w/v))。
(B)在615nm下激发的PS20-DiI-校准曲线(0.0004-0.0015％(w/v))。
图12：三批DiI的PS20-DiI-校准曲线(0.0004-0.0030％(w/v))(1批□，2批·和3批△)。在96孔板内，在37℃、40rpm摇动条件下采用357nM DiI培养PS20 15分钟后的DiI荧光强度(550nm下激发；565nm下发射)。
图13：根据多国药典的三种不同PS20的PS20-DiI-校准曲线(0.0004-0.0020％(w/v))(□1类，·2类和△3类)。在96孔板内，在37℃、40rpm摇动条件下采用357nM DiI培养PS20样品后的DiI荧光强度(550nm下激发；565nm下发射)。
图14：根据多国药典的三种不同PS80的PS80-DiI-校准曲线(0.0004-0.0020％(w/v))(□1类，·2类和△3类)。在96孔板内，在37℃、40rpm摇动条件下采用357nM DiI培养PS80样品后的DiI荧光强度(550nm下激发；565nm下发射)。
图15：不同浓度1-15mg/ml IgG1(黑柱)、1-10mg/mL Fc-融合蛋白(条纹柱)和1-5mg/mlIgG3(白柱)存在下采用350nM DiI培养～0.006％(w/v)PS20(A)和PS80(B)时的荧光强度(激发：550nm，发射：615nm)。图16：冻干前(黑柱)、96孔板内冻干和重构后(白柱)350nMDiI的荧光强度(激发：550nm，发射：615nm)。
1：在MilliQ水中350nM DiI。
2：在MilliQ水中350nMDiI+0.002％(w/v)PS20。
3：在10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)+1％(w/v)甘露醇中350nMDiI。
4：在10mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)+1％(w/v)甘露醇中350nMDiI+0.002％(w/v)PS20。
5：在10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)中350nMDiI。
6：在10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)中350nMDiI+0.002％(w/v)PS20。
具体实施方式
本发明涉及采用荧光羰花青染料对样品中的聚山梨醇酯进行定量的新方法。
因此，一方面本发明涉及定量样品中聚山梨醇酯的方法，包括以下步骤：
a)提供包含至少一种聚山梨醇酯的样品；
b)将所述样品与羰花青染料混合；
c)测定混合物的荧光；及
d)将所述荧光与聚山梨醇酯的含量相关联。
任选地，样品是液体样品，可以按其原样在该方法中使用，或适当稀释后使用。或者，样品可以是固体材料，例如冻干组合物。此时，样品应在进行步骤c)，或甚至在进行步骤b)之前先进行重构。优选包含至少一种聚山梨醇酯的样品是含水样品，或者，如果以固体材料形式提供的话，在步骤c)或b)之前，先采用含水液体溶剂重构形成含水样品。但是，任何可以进行荧光测定的样品都是合适的。在一些实施例中，样品是溶于非水溶剂中的液体样品。
在许多情况下，样品还包括一种或多种蛋白质、肽、小分子和/或其它化合物。优选地，样品包括含水缓冲溶液。因此，在一优选实施例中，样品包括缓冲剂。
合适的缓冲剂是本领域技术人员熟悉的。含蛋白质或肽的样品的一些常用缓冲剂包括TRIS、HEPES、乙酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸和磷酸盐。
在最优选的实施例中，样品是包含至少一种聚山梨醇酯的含水缓冲溶液。
或者，样品是不含水的液体样品。样品的溶剂可以是任何合适的溶剂。合适的溶剂包括但不限于甲醇、乙醇或二甲基亚砜(DMSO)。任选地，样品包含水和有机溶剂，例如，甲醇、乙醇或DMSO。
任选地，样品包括一种或多种其它化合物。在优选的实施例中，样品还包括一种或多种具有药物或化妆活性的化合物。
在一优选实施例中，样品包括具有药物活性的化合物。更优选地，样品包括选自包括蛋白质、抗体、肽、核酸、病毒样颗粒、细胞、细菌、病毒和小分子的组的具有药物活性的化合物。在一特别优选的实施例中，样品包括蛋白质。
所述方法特别适合用于定量聚山梨醇酯20或80，但并不限于这些聚山梨醇酯。所述方法适合其它聚山梨醇酯，且可能适合其它表面活性剂。在一优选的实施例中，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。
羰花青染料优选亲脂体性羰花青染料。目前最优选的羰花青染料有称为DiI-族的染料，特别是DiI(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐)、DiO(3,3'-双十八烷基氧代羰花青高氯酸盐)和DiD(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰花青4-氯苯磺酸盐)。这些染料的结构如图1A、B和C所示。另一种合适的羰花青染料是CM-DiI。
因此，在本发明优选的实施例中，羰花青染料是选自DiI、DiO、DiD和CM-DiI的染料。在另一个优选的实施例中，羰花青染料是DiI。
与现有技术的方法相比，本发明方法的优点是荧光检测更迅速且更便宜，并且很容易实现自动或半自动检测。本发明的方法还比常用NMP分析更具有特异性。
所述方法可以采用任何合适的荧光检测器，优选采用荧光计进行。在一些实施例中，可以采用比色皿荧光计。在一替代实施例中，所述方法采用基于酶标仪的荧光分光光度计进行。或者，可以采用荧光检测器，样品可以通过配备或未配备柱的HPLC/UPLC系统引入到检测器内。
通常，优选测定规定波长下的荧光强度。本发明人能够确定采用不同羰花青染料定量聚山梨醇酯时的合适波长。
激发波长及检测发射波长必须根据羰花青染料和聚山梨醇酯进行调整。例如，本发明人发现，在存在聚山梨醇酯20时，DiI的荧光出现蓝移，而在存在聚山梨醇酯80时，荧光光谱似乎比较稳定。
在本发明优选的实施例中，羰花青染料是DiI，聚山梨醇酯是PS20或PS80，激发波长是大约550nm，检测波长是大约615nm或者565nm。
在另一个优选的实施例中，羰花青染料是DiD，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，激发波长是大约644nm，检测波长是大约665nm。
在另一个优选的实施例中，羰花青染料是DiD，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，激发波长是大约490nm，检测波长是大约504nm。在一替代实施例中，羰花青染料是DiD，聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，激发波长是大约490nm，检测波长是大约540nm。
本发明人发现，采用羰花青染料测定聚山梨醇酯含量，能够对聚山梨醇酯快速且准确地定量，并且与是否存在降解产物无关。本发明人还发现，对于含蛋白质、其它赋形剂和/或硅油的样品，本发明方法也能够提供可靠的结果。因此，该方法能够迅速地为储存样品(例如，相关药物包装材料，如小瓶或预装注射器内的生物药品)提供质量控制。
本发明方法的另一个优点是所述方法可以在不同温度下进行。但是，优选为步骤c)，即进行荧光测定，及在进行实际测量之前在步骤b)期间或之后，为了保持样品而选择特定温度范围。特别是，在一系列测量中，所述温度优选保持相对恒定。
关于步骤c)，荧光测定优选分别在大约10至大约40℃之间进行，优选在大约15至大约37℃之间进行，更优选在大约15至大约35℃之间进行，例如大约17至大约30℃之间进行，或大约20至大约30℃之间进行，特别是大约22至大约27℃之间进行。在特别优选的实施例中，所述方法在大约15、18、20、22、25、27或30℃下进行。在另一个特别优选的实施例中，该方法在大约20、25或30℃下进行。
在测定之前，样品优选采用染料培养，这可以理解为步骤b)和步骤c)之间增加的一步骤。优选在开始测定前将样品培养至少大约1分钟。培养时间应根据培养时的温度进行选择。优选在测定前将样品培养至少大约1、2、3、4、5、7、10、15、20或30分钟。在一替代的优选实施例中，样品培养大约10至60分钟，例如，大约10、20、30、40、50或60分钟。当然，也可以选择更长的培养时间，特别是如果样品在选择的培养温度物理上和化学上都相对稳定的话。
在一个实施例中，培养温度选择范围是大约20至45℃。在另一个优选实施例中，培养温度的范围是大约25至40℃，或大约30至40℃，例如，大约30、35、37或40℃。也可以选择更高的培养温度，特别是如果样品物理上和化学上相对稳定，或者如果选择的培养时间较短的话。
上文所述优选的培养时间、培养温度及荧光测定的温度应综合理解。例如，在一优选实施例中，本发明方法采用的培养温度是大约20至45℃，培养时间是大约10至60分钟，测定温度是大约10至40℃。在另一个特定实施例中，培养温度是大约37℃，培养时间是大约30分钟，测定温度是大约室温或大约23℃。本领域技术人员很容易确定特定样品的其它测定条件。
除上面的方法以外，本发明进一步涉及羰花青染料定量样品中聚山梨醇酯的用途。特别是，本发明涉及DiI、DiO、DiD或CM-DiI定量样品中聚山梨醇酯的用途。在具体的实施例中，本发明涉及羰花青染料用于定量样品中聚山梨醇酯的用途。在另一个实施例中，本发明涉及DiI或DiD用于定量样品中聚山梨醇酯，优选聚山梨醇酯20或80的用途。
在另一个实施例中，本发明涉及DiI用于定量样品中聚山梨醇酯的用途。在最具体的实施例中，本发明涉及DiI用于定量样品中聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80的用途。
本发明人发现，所述方法通过使用可以进行荧光分析的96-孔板和96-孔酶标仪很容易实现平行测定。因此，本发明提供了一种快速、大规模平行测定样品中聚山梨醇酯含量的方法。因此，该方法为例如质量保证实验室提供了巨大的改进。
因此，本发明还涉及包含羰花青染料的孔板。在一优选实施例中，本发明涉及一种孔板，其中至少一个孔包含限定量的羰花青染料。在一个实施例中，本发明涉及一种孔板，其中多个孔包含限定量的羰花青染料，其中至少一个孔还包含限定量的聚山梨醇酯。
在一优选实施例中，孔板是96孔板。但是，其它任何类型的孔板也适合。孔板的至少一些孔包含一定量的羰花青染料。还优选孔板的每个孔内都包含相同量的羰花青染料。在本发明的一些实施例中，孔板的一些孔内还包含限定量的聚山梨醇酯。在本文中，选择羰花青染料的同样偏好适用本发明方法上文所述。
优选地，孔内的染料及任选其它组分(如聚山梨醇酯)以冻干形式提供在孔内。在本发明的一替代实施例中，孔包括含有染料的液体溶液，任选一些孔内还包含限定量的聚山梨醇酯。除冻干之外，还可以使用其它干燥方法。本领域技术人员了解合适的方法。
在具体的优选实施例中，本发明涉及一种孔板，包括：
a)一组孔，其中该组孔中的每个孔内包含限定量的羰花青染料；及
b)一组孔，其中该组孔中的每个孔内包含羰花青染料和限定量的聚山梨醇酯。
正如本文所使用的那样，一组(或子组)孔是孔板的一子组孔；一组(或子组)包括至少两个孔。优选地，包含羰花青染料和限定量聚山梨醇酯的孔包括不同量的聚山梨醇酯；更优选的是，所述一组孔可用于生成聚山梨醇酯校准曲线。
在一些实施例中，孔板还包括空孔或不包含羰花青染料的孔，这些孔作为空白。
在优选的实施例中，所述板包括一组或多组如上所定义的包含羰花青染料和限定量聚山梨醇酯的孔。在这些情况下，每组孔可以包含相同或不同的聚山梨醇酯。
在一些实施例中，孔包括冻干组合物。在这些情况下，优选板还在孔内或孔内组合物内另外包括缓冲化合物和/或稳定化合物。
本发明人发现，为了使包含孔的孔板具有羰花青染料，其中一些孔另外包含聚山梨醇酯，组合物可以配制为含水组合物，先将这些组合物装入到孔内，然后冻干。
终端用户仅需将他的样品加入到限定的一组孔内，在剩余的孔内填充限定量的水即可。
根据组孔，所述含水组合物可以仅包含限定量的羰花青染料及任选聚山梨醇酯。这样允许在重构组合物后，充分恢复荧光信号。
本发明人发现，如果组合物进一步包括缓冲溶液及任选稳定剂，优选糖类，更优选甘露醇，则在冻干组合物重构后，可以实现荧光信号的最佳恢复。
在优选的实施例中，所述稳定剂的浓度不超过10％(w/v)。在具体实施例中，所述稳定剂的浓度是0.1％至10％(w/v)。优选所述稳定剂的浓度至多5％(w/v)，具体地0.5至5％(w/v)。在具体的优选实施例中，稳定剂的浓度是大约1％(w/v)。
任何缓冲溶液可能都是合适的，日常应用的缓冲溶液是本领域技术人员熟悉的。优选地，所述缓冲溶液不产生除DiI外的荧光信号。一种合适的缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液。
另一方面，本发明涉及定量样品中聚山梨醇酯含量的试剂盒，该试剂盒包括：
a)羰花青染料；
b)稀释缓冲溶液；
c)任选地一组标准溶液，每个标准溶液包含限定量的聚山梨醇酯。
在本发明的一些实施例中，羰花青染料在比色皿中。更优选地，所述试剂盒包括至少一个比色皿，其内包含限定量的羰花青染料。在具体实施例中，所述比色皿是微量比色皿。
试剂盒任选还包括其它化合物，特别是使用说明。在具体实施例中，试剂盒包括选自DiI、DiD、DiO、CM-DiI的羰花青染料。最优选地，试剂盒包括DiI。在一些实施例中，稀释缓冲溶液是浓缩缓冲溶液。
标准溶液可以是即用型溶液，或可以稀释的溶液。优选地，标准溶液是浓缩溶液。在一些实施例中，试剂盒包括在不同溶剂中的不同标准溶液。
标准溶液可能根据不同的基础应用调整。具体地，标准溶液包括限定量的不同聚山梨醇酯。优选地，标准溶液包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或它们的混合物。
在本发明的优选实施例中，试剂盒包括如上所述的孔板。
实例
方法
绘制PS-校准曲线
配制PS20和PS80储备溶液(1.0％(w/v)，用水配制)，并于-20℃下按1mL份储存。这些储备溶液用于所报告的所有实验。通过用水或缓冲溶液进行一系列稀释，范围大约是0.0002至0.007％(w/v)，从而绘制PS校准曲线。对照采用仅含水或相应缓冲溶液的样品。
荧光分析
DiI-VybrantTM储备溶液是采用乙醇配制的1mM DiI溶液。将2μL初始染料溶液加入到98μL Milli-Q水中，配制溶于水中的中间储备溶液(浓度20μM)。这种DiI-工作溶液(DiI-WS)在加到样品中之前现配。将DiI加入到不同的样品中，用于绘制PS校准曲线。分析样品中DiI的最终浓度是357nM。将染料加入到样品中之后，立即涡旋，并在37℃下避光培养30分钟。采用类似的方法配制和处置DiD-VybrantTM(1mM DID乙醇溶液)样品。
DiI的荧光测定比色皿系统
采用FP-8500荧光计(德国Jasco)和10×2mm石英比色皿进行测定。激发波长设定在550nm(带宽2.5nm)，而发射记录范围是560-620nm(带宽：2.5nm，间隔：1nm，速度：低，灵敏度：高，累积数：1)。总是采用水作为参照。所有实验都在21℃下进行(恒温仪器)。
荧光测定酶标仪系统
对于基于孔板的测定，采用酶标仪(瑞士Tecan Safire2；Tecan Group AG)。DiI的激发波长固定在550nm(带宽：5nm)，发射采集范围560-620nm(带宽：5nm；发射波长步长：1nm)。读取次数设定为20。增益和z-位由仪器根据PS浓度最高的孔确定。增益最终固定在120，z-位调节到8100μm。测定采用黑色平底96-孔板重复测定二次。每孔的最终容积是200μL。测定常规板及低结合板。所有实验都在大约23℃下进行(非恒温仪器)。
紫外/可见光-测定
紫外/可见光测定采用Safire 2多功能酶标仪(Multimode Reader)进行。溶液通过进行一系列稀释提供，并采用相应的溶剂(水/缓冲溶液)研究其它样品作为空白。吸收光谱为2次累积得到，记录范围是270-999nm。在此实验中，采用96-孔板，每孔的最终容积是150μL。
DiI或DiD存在下PS20的荧光分析
采用基于比色皿的荧光计，在DiI存在下，对PS20的荧光特性进行了评估。为此，配制了浓度范围为0.0002至0.0025％(w/v)的样品。结果在图2A、2B和2C中示出。最大荧光强度出现在大约590nm处。PS20浓度超过0.0005％(w/v)时，最大荧光强度移到更低波长(～565nm)处。
615nm处的荧光信号表明，重复测定得到的结果一致。除此之外，上述波长的强度与测试浓度成比例，如图1C所示。
根据这些结果，将PS20定量测定的发射波长固定在615nm。为了检查内滤效应，在进一步的实验中测定发射和激发波长处的吸收。根据这些实验，选择DiI和PS的浓度，以消除荧光分析期间的内滤效应。
采用DiD和PS20进行同样的实验，并得到了类似的结果，参见图3A、3B和3C。DiD的发射波长选择为665nm。
DiI和DiD存在下PS80的荧光分析
适用于PS20定量的荧光分析，亦用于测定PS80。首先，按照DiI和DiD存在下PS20测定时的设定参数，采用荧光计测定相应的荧光特性。
根据得到的数据绘制不同的图形。图4A、4B、5A和5B给出了所有测定样品在615nm(DiI)或665nm(DiD)处得到的荧光强度情况。图4C和5C是PS80浓度0.00045至0.00114％(w/v)的样品校准曲线。
硅油对DiI荧光的影响
在进一步的实验中，测定了组合物中其它化合物对DiI荧光的影响。在荧光计的第一次测定中，分析了样品中硅油液滴的影响。
在此实验中，测定了DiI水溶液的荧光，并与含0.002％(w/v)和0.03％(w/v)硅油的DiI水溶液的荧光进行比较。结果见图6。
结果表明，硅油液滴并未显著改变DiI的荧光。
采用酶标仪进行DiD/DiI荧光测定和样品分析
为了测试本方法进行平行测定的可能性，采用酶标仪(瑞士Tecan Safire2；TecanGroup AG)进行DiD和PS20及DiI和PS80的荧光测定。
采用酶标仪，绘制了PS20和DiD组合的校准曲线，及对含0.00175％(w/v)PS20的样品进行了测定。结果如图7所示，并总结在表1中。
表1.PS20浓度[％](w/v)和PS20-浓度测定的回收率[％]，其中样品不含蛋白质，含0.00175％(w/v)PS20，溶于10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)中。采用PS20-DiD-校准曲线用于定量。
Figure BDA0002377883800000121
*回收率＝PS20计算浓度/PS20预期浓度*100
PS20预期浓度：0.00175％(w/v)
采用酶标仪，绘制了PS80和DiI组合的校准曲线，及对含0.0007％(w/v)PS80的样品进行了测定。结果如图8所示，并总结在表2中。
表2.PS80浓度[％](w/v)和PS80-浓度5次测定的回收率[％]，其中样品不含蛋白质，包含0.00126％(w/v)和0.00112％(w/v)PS80，溶于10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)中。采用PS80-DiI-校准曲线用于定量。
Figure BDA0002377883800000122
*回收率＝PS80计算浓度/PS80预期浓度*100
PS80预期浓度：0.0007％(w/v)
蛋白质对采用DiI定量PS时的影响
在进一步的实验中，测试了样品中包含两种不同单克隆抗体(IgG 1和IgG2)作为代表性蛋白质时对DiI定量PS20的影响。采用酶标仪测定校准曲线，以及测定一些含PS20的样品。15个结果见图9和表3。
表3.PS20浓度[％](w/v)和PS20-浓度测定的回收率[％]，其中样品中包含0、5和15mg/mL IgG1和IgG2，且包含0.002％(w/v)PS20，溶于10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)中。采用酶标仪，分别在550nm激发后，在615nm处测定PS20-DiI-校准曲线(不含蛋白质--·--，含15mg/mL IgG1--□--)，并用于定量。
Figure BDA0002377883800000131
*回收率＝PS20计算浓度/PS20预期浓度*100
PS20预期浓度：0.002％(w/v)
培养时间对DiI荧光的影响
在进一步的实验中，分析了预测定培养时间对含PS样品的DiI荧光强度是否有影响。按照上文所述制备样品，并直接测定或在培养15或30分钟后测定。结果如图10所示。如图中所示，培养时间对DiI荧光和PS20校准曲线的影响可以忽略不计。
培养期间平板摇动及温度对DiI荧光的影响
在另一个实验中，对培养期间培养温度及平板摇动对荧光测定的影响进行了分析，以确定在96孔板进行分析的具体要求。
制备一组样品(PS20校准曲线)，将其在37℃在(i)摇动或(ii)不摇动条件下及(iii)室温不摇动条件下培养15分钟。
实验结果如图11所示。结果清楚表明，摇动或培养温度对校准曲线都没有影响。
不同染料批次的影响
在进一步的实验中，分析了不同批次DiI染料所得结果的重现性。在此实验中，采用样品供应商提供的不同批次的DiI，分析了三个样品(PS20校准曲线)。所有样品均在37℃下培养15分钟后分析。
结果如图12所示。结果表明，这些结果相当，而与染料批次无关。
DiI分析对不同供应商PS20和PS80的适用性
采用不同供应商提供的PS20或PS80进行类似实验。按照前面与DiI相同的方式，分析三个不同供应商提供的聚山梨醇酯。结果如图13和14所示。再次表明，结果相当，而与PS20或PS80供应商无关。因此，单条PS校准曲线可用于定量样品中的PS，而与原供应商无关。
不同蛋白质对DiI荧光的影响
在进一步的实验中，测定了包含0.006％w/v聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80及不同浓度不同蛋白质(IgG1，Fc融合蛋白或IgG)的样品。结果如图15所示，结果表明，测试蛋白质的存在对荧光测定没有影响。
冻干对DiI荧光的影响
在一个实验中，制备了几个样品，并装入到96-孔板内，测定DiI荧光强度。然后，将样品在96-孔板内冻干，然后重构，并在重构后测定荧光强度。制备和测定下述样品：
1：在MilliQ水中的350nMDiI。
2：在MilliQ水中的350nMDiI+0.002％(w/v)PS20。
3：在10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)+1％(w/v)甘露醇中的350nMDiI。
4：在10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)+1％(w/v)甘露醇中的350nMDiI+0.002％(w/v)PS20。
5：在10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)中的350nMDiI。
6：在10mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0)中的350nMDiI+0.002％(w/v)PS20。
结果如图16所示。结果表明，该分析法可以制备具有冻干组合物的板，冻干和重构后，保留了DiI荧光特性。结果表明，采用包含稳定剂(如甘露醇)的缓冲组合物，改善了结果。

Claims (22)

1.一种定量样品中聚山梨醇酯的方法，包括以下步骤：
a)提供包含至少一种聚山梨醇酯的样品；
b)将所述样品与羰花青染料混合；
c)测定混合物的荧光；及
d)将所述荧光与聚山梨醇酯的含量相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述羰花青染料选自由1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)、3,3’-双十八烷基氧代羰花青高氯酸盐(DiO)、1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二羰花青4-氯苯磺酸盐(DiD)和CM-DiI组成的组。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述羰花青染料是1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述样品还包含药物活性化合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述药物活性化合物是蛋白质。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述样品还包含化妆品化合物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述样品被冻干，并且在步骤c)之前在溶剂中重构。
9.一种孔板，其中多个孔包含限定量的羰花青染料，其中所述多个孔的至少一个孔还包含限定量的聚山梨醇酯。
10.根据权利要求9所述的孔板，其中所述羰花青染料选自由1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)、3,3’-双十八烷基氧代羰花青高氯酸盐(DiO)、1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二羰花青4-氯苯磺酸盐(DiD)和CM-DiI组成的组。
11.根据权利要求10所述的孔板，其中所述羰花青染料是1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(DiI)。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的孔板，其中所述孔板包括一子组孔，其中子组中的每一个孔还包含限定量的聚山梨醇酯。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的孔板，其中至少一个孔还包含缓冲溶液。
14.根据权利要求13所述的孔板，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的孔板，其中所述孔中的至少一个孔还包含稳定剂。
16.根据权利要求15所述的孔板，其中所述稳定剂是糖类。
17.根据权利要求16所述的孔板，其中所述糖类是甘露醇。
18.根据权利要求9至17中任一项所述的孔板，其中所述孔板包括至少两个不同子组的孔，两组中的每一组中的每一个孔包含组合物，该组合物包括：
a)限定量的羰花青染料；
并且其中至少一个子组孔中的每一个孔内的组合物还包含：
b)缓冲溶液；及
c)稳定剂；
d)限定量的聚山梨醇酯。
19.根据权利要求18所述的孔板，其中所述组合物是冻干组合物。
20.羰花青染料用于定量样品中聚山梨醇酯的用途。
21.定量样品中聚山梨醇酯的试剂盒，包括：
a)羰花青染料；
b)样品的标准稀释缓冲溶液；及
c)任选地校准样品。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述羰花青染料在比色皿中提供或在根据权利要求9至19中任一项所述的孔板中提供。
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