CN103403544A - 测定聚山梨醇酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定含蛋白质样品中的聚山梨醇酯的方法。本发明的方法包括在比色测定之前通过碱性水解预处理样品，所述比色测定基于分析物与硫氰酸盐试剂的金属复合物，其中所述复合物被提取到与水不混溶的有机溶剂中。由于所述碱性水解，干扰性蛋白质被移除，并且较之于与分析物类似的表面活性剂的选择性，如Tween80较之于Triton X-100的选择性得到增强。

Description

测定聚山梨醇酯的方法

技术领域

本发明涉及一种测定含蛋白质样品中的聚山梨醇酯的方法。本发明的方法包括在比色测定之前通过碱性水解预处理样品。

背景技术

病毒安全性是治疗性蛋白的基本要求，尤其对于血浆源（plasma-derived）药物来说。近年间，通过几乎消除病毒传播的风险已使病毒安全性取得相当大的进展。被设计用来去除或灭活病毒的特定步骤被开发、验证并引入治疗上使用的血浆蛋白的制造工艺中。凝血因子如因子VIII或因子IX、血浆蛋白酶抑制剂例如抗凝血酶、抗胰蛋白酶或C1抑制剂以及白蛋白和免疫球蛋白的制造工艺必须具有至少一个针对脂质包膜病毒有效的灭活步骤以满足安全性要求，并且国家和国际监管团体已设立全面的监管框架以确保病毒安全性的维持和进一步改善。举例来说，作为欧洲药品管理局（European Medicines Agency）（EMA）的机构，专利药品科学委员会（Scientific Committee forProprietary Medicinal Product）（CPMP）颁布了涵盖生物制剂的病毒安全性的指导原则。为了将血浆源药物引起的病毒传播的风险降到最低，除在起始物质血浆的层级上采取的其他预防性措施以外，CPMP指导原则强烈推荐在制造工艺中并入两个独立作用的病毒灭活程序。

去污剂用于病毒灭活的有效性以及色谱蛋白质纯化方法的可用性的知识已显示出在血浆蛋白加工中利用去污剂进行病毒灭活的方法。主要目标病毒HIV、HBV和HCV都是脂质包膜的。因此，有效的病毒灭活策略合理地利用病毒对单独的去污剂或对充分确定的溶剂-去污剂（S/D）程序的敏感性。所有这些程序的作用在于特异性破坏病毒脂质包膜，同时对除脂蛋白以外的治疗性蛋白的完整性具有相对低的影响。

非离子型去污剂聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯（聚山梨醇酯80、Tween^TM 80）是最常用的聚山梨醇酯杀病毒去污剂。病毒灭活步骤之后，制造工艺必须包括可有效去除灭活剂的纯化步骤，例如蛋白质的色谱吸附。然而，为了监测去污剂去除程序的效率以及检查病毒灭活期间去污剂浓度是否符合规定的并经过验证的限度，去污剂的测定必须在不同且有时候高浓度的蛋白质例如血浆蛋白的存在下进行。聚山梨醇酯如聚山梨醇酯80的化学组成和结构多样性、这些化合物的低反应性、蛋白质/缓冲液基质以及其他可能存在的物理化学上相关的去污剂例如烷基酚醚如具有不同数目的环氧乙烷残基的Triton^TM X-100，致使测定困难。对于与牛海绵状脑病（BSE）相关的风险的关注已导致引入由植物脂肪而非牛脂制造的植物源形式的聚山梨醇酯80。尽管存在相等的杀病毒功效，但这些具有可能不同的脂肪酸分布的聚山梨醇酯可能在分析灵敏度方面有所差异。

早期基于形成聚山梨醇酯80与淀粉的复合物并且通过淀粉与碘的反应测量过量游离淀粉的比色分析法已被改适用于含有氨基酸、糖和蛋白质的组织培养基和疫苗。基于聚氧乙烯链与硫氰酸根合钴(II)酸盐的复合并且将复合物提取到氯仿中的另一种比色分析法最初被开发用于测定水溶液中聚乙二醇脂肪酸酯的浓度。此后，其使用已被扩展到其他聚乙氧基化的非离子型表面活性剂，例如对异辛基苯酚聚氧乙烯醚（可以商品名Triton^TM X-100、Igepal^TM CA-630、Nonidet^TM P40或Tergitol^TM NP40获自多个制造商），其中乙醚、二氯甲烷或氯仿作为提取剂。

然而此方法对于生物制剂的应用受到蛋白质存在的限制，蛋白质强烈干扰并且因此必须在进行分析之前去除。为了克服蛋白质相关的基质效应，引入分离技术，例如在硫氰酸根合钴(II)酸盐比色法之前通过离心去除蛋白质的冷乙醇沉淀步骤、尺寸排阻色谱法与柱后比色衍生化、聚山梨醇酯80的基础浓度高于临界胶束浓度以防止胶束聚集的尺寸排阻色谱法以及在235nm下UV检测、将蛋白质捕捉在离子交换型HPLC柱上的未结合的聚山梨醇酯的蛋白质耗尽色谱法（protein-depletion chromatography）、固相提取与脱脂质、比色衍生化以及通过凝胶渗透色谱法分离硫氰酸根合钴(II)酸盐复合物、酸性水解与脂肪酸的HPLC或GC测定、或轻度皂化与所释放脂肪酸的HPLC测定、薄层色谱法、或液相提取与HPLC分离以及质谱检测。后面依赖于聚山梨醇酯的脂肪酸部分的方法受到分析物的不同脂肪酸组成的阻碍。另一种最新方法测量的是并入聚山梨醇酯胶束中的5-十二烷酰基氨基荧光素的荧光偏振。然而，这些方法或者极为耗时，样品处理量有限，或者需要复杂的器械操作和对每一步骤的单独验证。

因此，强烈需要提供一种通过比色分析法测定含蛋白质样品中的聚山梨醇酯的方法，其中可以一种快速且简单的方式消除蛋白质的干扰。此种方法应允许在例如病毒灭活期间以及在经纯化蛋白质的最终浓缩物中测定实际的去污剂浓度。

通过提供权利要求书中表征的实施方式来满足此需要。

发明内容

本发明涉及一种测定含蛋白质样品中的聚山梨醇酯的方法，所述方法基于在比色测定之前通过碱性水解预处理样品。

具体实施方式

本发明涉及一种测定含蛋白质样品中的聚山梨醇酯的方法，其包括以下步骤：

(a)对样品进行碱性水解；

(b)在碱性水解后中和所述样品；

(c)任选地，从经过中和的样品中去除变性的沉淀物；

(d)向任选经过过滤的样品中添加硫氰酸根合金属复合物的水性混合物以形成山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合金属复合物；

(e)将步骤(d)中形成的所述山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合金属复合物提取到非水混溶性有机溶剂中；

(f)测量步骤(e)中获得的提取物的吸光度，以定量步骤(d)中形成的所述山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合金属复合物的量；以及

(g)从步骤(f)中测定的所述山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合金属复合物的量，计算样品中所含的聚山梨醇酯的量。

在本文中使用时，术语“聚山梨醇酯”是指任何聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯（聚山梨醇酯）。优选的聚山梨醇酯包括聚山梨醇酯20、40、60以及80。聚山梨醇酯80是尤其优选的。所述聚山梨醇酯80可来源于动物或来源于植物。

在本文中使用时，术语“含蛋白质样品”是指含有至少一种蛋白质的任何样品。样品可例如来自重组蛋白的制备工艺，其中所述样品可在所述工艺的任何阶段取出，或可能是所述工艺的最终产物。此外，样品可例如来自血浆源蛋白质的制备工艺，其中所述样品可在所述工艺的任何阶段取出，或可能是所述工艺的最终产物。优选地，样品是在血浆源蛋白质的制备工艺中的病毒灭活步骤之后取出。因此，样品中所含的蛋白质可能是一种或多种血浆蛋白。此外，含蛋白质样品可能是血浆。此外，含蛋白质样品可能是含有疫苗和/或肽的样品。

含蛋白质样品可进一步含有异辛基苯酚聚氧乙烯醚（Triton^TMX-100）和/或磷酸三正丁酯（TNBP），其可能已例如在血浆源蛋白质的制备工艺中的病毒灭活步骤中添加。

因为如蛋白质的大分子可能含有由一组疏水性和亲水性氨基酸构成的结构性实体，其可能模拟去污剂特征，所以它们也可能干扰这样的测定分析法。去污剂与蛋白质结构的结合也可能通过防止复合物形成导致分析物的回收率较低而影响测定。因此，在比色测定之前，伴随的蛋白质必须被破坏以提供无偏见的结果来防止这种干扰。使用如乙醇的溶剂进行蛋白质沉淀是在进行分析法之前去除蛋白质的一种可能性。然而，考虑到复杂的蛋白质混合物还可能含有低分子量蛋白质例如载脂蛋白A1、或者在乙醇有效浓度下几乎不沉淀的蛋白质如α1-酸糖蛋白，这种样品制备步骤的应用相当有限。取而代之的是，本发明采用的样品预处理依赖于特别是在升高温度下的碱性水解。在如稍后进一步示例的那些条件下，蛋白质将被破坏到一定程度以至于其不再能够发挥其对分析法的干扰影响。尽管所应用的水解不会导致蛋白质完全分解成氨基酸，但它还是令人惊讶地严苛到足以消除假阳性反应以及去污剂的结合。

优选地，本发明方法的步骤(a)，即对样品进行碱性水解，包括在高温下用碱性试剂处理样品特定的持续时间。优选地，所述碱性试剂选自：NaOH、KOH、LiOH、Ba(OH)₂、Sr(OH)₂、Ca(OH)₂、氢氧化四甲铵、氢氧化四乙铵、氢氧化四丙铵、氢氧化四丁铵，以及均一或非均一取代的四级氢氧化烷基铵和四级氢氧化环烷基铵。更优选地，所述碱性试剂是NaOH，优选至少3N的NaOH，更优选约10N的NaOH。所述高温优选至多100℃且至少约80℃，更优选至少约90℃，最优选至少约95℃。在尤其优选的实施方式中，碱性水解是在约95℃到约100℃下进行的。碱性水解的持续时间优选至少约15分钟，更优选至少约30分钟，最优选至少约45分钟。此外，碱性处理的持续时间优选至多120分钟，更优选至多90分钟。在尤其优选的实施方式中，碱性处理的持续时间为约45分钟到约90分钟，更优选约45分钟到75分钟，更优选约50分钟到70分钟，且最优选60分钟。

本发明方法的步骤(b)，即在碱性水解之后中和样品，优选地包括用酸例如乙酸来中和样品至pH值为约7到约8。在本文中可使用的其他酸包括甲酸、丙酸、丁酸、乳酸、羟基丁酸、烷烃和环烷烃的单羧酸、二羧酸以及三羧酸。

优选地，本发明方法的步骤(c)，即从经过中和的样品中去除变性的沉淀物，可以通过过滤或离心来完成，因为其取决于蛋白质溶液，所以如果确实执行该步骤的话，则其包括使用不结合聚氧乙烯山梨醇酐的滤器来离心样品或过滤样品。在优选的实施方式中，所述滤器是亲水性滤器，例如，由醋酸纤维素制成的滤器。滤器的孔径不受特定限制，只要足以截留沉淀物即可，并且可为例如0.22μm。

步骤(d)中添加的硫氰酸根合金属复合物优选地为Co(NO₃)₂·6H₂O与NH₄SCN的水性混合物并且所形成的山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合金属复合物是山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合钴酸盐(II)复合物。

在本发明方法的步骤(d)中优选地添加到经过滤样品中的Co(NO₃)₂·6H₂O与NH₄SCN的水性混合物优选地在蒸馏水中含有约1%（w/v）到约4%（w/v）、优选约1.5%（w/v）到约4%（w/v)、更优选约2%（w/v）到约4%（w/v）且最优选3%（w/v）的Co(NO₃)₂·6H₂O，和约10%（w/v）到约30%（w/v）、优选15%（w/v）到约25%（w/v）、更优选约20%（w/v）的NH₄SCN。

优选地，在本发明方法的步骤(e)中用于提取在步骤(d)中形成的山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合金属复合物的与水不混溶的有机溶剂选自：氯仿、二氯甲烷、邻二氯苯、溴仿和三氯乙烯，其中二氯甲烷是尤其优选的。

此外，优选在步骤(f)中，在约300nm到约340nm、更优选约310nm到约330nm的范围内、最优选在约324nm下，测量本发明方法的步骤(e)中获得的提取物的吸光度。在一个或多个特定波长下测量样品的吸光度的方法为本领域技术人员所知并且包括例如使用标准UV/VIS分光光度计。

此外，用于执行本发明方法步骤(g)的方法为本领域技术人员所知，所述步骤(g)即从步骤(f)中测定的所述山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合金属复合物的量，计算样品中所含的聚山梨醇酯的量。

在优选的实施方式中，本发明的方法在步骤(a)之后且在步骤(b)之前进一步包括将碱性水解后的样品冷却、优选冷却到室温的步骤。此外，本发明的方法可在步骤(b)之后且在步骤(c)之前包括将样品保持在室温至少15分钟、优选至少30分钟的步骤，以允许可能变性的沉淀物的完全形成。

为了避免由于任何聚山梨醇酯非特异性吸附到样品容器表面，例如吸附到塑料表面，而引起的分析物损失，本发明的方法可包括在碱性水解之前将样品与蛋白质溶液、例如白蛋白溶液混合的步骤。具有低蛋白质含量的样品，例如蛋白质含量低于1mg/ml的样品特别可能发生这样的吸附。

此外，本发明的方法可包括使用具有已知浓度的聚山梨醇酯和一种或多种蛋白质的样品来建立标准曲线以校准吸光度测量的步骤。建立各标准曲线的方法为本领域技术人员所知。

附图说明

图1显示聚山梨醇酯在100℃下15分钟到120分钟的水解时间之后的比色测量结果。数据点是在碱性水解进行至少60分钟时差异小于4%的两种独立水解混合物的平均值。

图2显示含有100ppm聚山梨醇酯80的对照样品的21次测定的结果以确定分析法的精确度和线性。平均值的两个标准偏差的范围被示出。

图3显示出在有样品预处理（B）或没有任何样品预处理（A）的情况下，掺有分别来自牛和植物来源的聚山梨醇酯80的校准曲线。

图4显示出（A）没有样品预处理的聚山梨醇酯80以及Triton^TMX-100的校准曲线，以及（B）碱性水解之后，聚山梨醇酯80以及聚山梨醇酯80、磷酸三正丁酯（TNBP）和Triton^TM X-100的混合物的校准曲线。

本发明将在以下实施例中得以进一步说明但并不受其任何限制。

实施例

材料：

除非另外说明，否则所使用的所有化学品都是分析级。NaOH、96%乙酸、六水合硝酸钴（Co(NO₃)₂·6H₂O）、二氯甲烷（Lichrosolv^TM）、Triton^TM X-100、磷酸三正丁酯（TNBP）和硫氰酸铵（NH₄SCN）购自德国的默克公司（Merck,Germany）。来自牛以及来自植物来源的两批次聚山梨醇酯80（Tween^TM80）购自美国的ICI公司（ICI,USA）。含量为1%（w/v）的去污剂水溶液经制备并随后用于分析。

使用来自奥地利维也纳的百特生物科学公司（Baxter BioScience,Vienna,Austria）的血浆蛋白分级中间体和浓缩物研究若干种血浆蛋白对分析法准确性的影响。简单地说，使用以下人类血浆蛋白浓缩物来研究通过碱性水解进行样品预处理的适宜性：白蛋白、免疫球蛋白、抗凝血酶、蛋白C、发育的活化和非活化凝血酶原复合物浓缩物（aPCC和PCC）、高纯度因子IX浓缩物以及血清类粘蛋白（α₁-酸糖蛋白）。最后，所述方法也在全血浆中进行，使用由百特公司（奥地利维也纳的百特生物科学诊断分公司（Baxter BioScience Diagnostics,Vienna,Austria））供应的冻干人类参比血浆。

碱性水解本身在具有螺旋盖的100×15mm的聚丙烯管（奥地利的格瑞纳公司（Greiner,Austria））中进行，并且后续比色测定在具有螺旋盖的玻璃管中进行。所用滤器是0.22μm MINISART（德国的赛多利斯公司（Sartorius,Germany））。比色测量是在LKB Ultrospec K4053分光光度计上使用具有螺旋盖的1cm Suprasil石英池（德国的豪玛公司（Hellma,Germany））来进行的。在除水解以外的所有程序步骤期间保持室温（20-25℃）。

实施例1：碱性水解

向含有1ml样品、标准物或聚山梨醇酯含量小于400mg/L=400ppm的对照物的聚丙烯管中，添加0.5ml10M NaOH。溶液在沸水浴中保持60±10分钟。冷却到室温后，通过用指示条（德国的默克公司）检查pH值，利用0.5ml10M乙酸将碱性水解产物中和到pH值为约7到8。中和之后，将样品在室温下保持至少30分钟。视蛋白质溶液而定，出现沉淀物，在比色测定程序之前通过使用Minisart0.22μm滤器过滤去除所述沉淀物。将蛋白质含量小于1mg/mL的样品与白蛋白溶液在水解之前混合以避免分析物由于非特异性吸附到塑料表面而损失，所述情形在程序期间可能发生。向1ml个别样品中添加0.1ml浓度为200mg/ml的人类白蛋白溶液证明可有效预防聚山梨醇酯80的非特异性损失。在计算样品的聚山梨醇酯浓度时必须考虑样品的这种稀释。

实施例2：比色测量

如下进行比色测定。简单地说，将1ml经中和的蛋白质水解产物、或者基本上不含蛋白质的聚山梨醇酯水溶液，与3ml硫氰酸根合钴酸盐试剂混合。该试剂含有溶解于蒸馏水中的3%（w/v）的Co(NO₃)₂·6H₂O和20%（w/v）的NH₄SCN，并且是每天新鲜制备的。然后添加2ml二氯甲烷。在强力摇动后，在20-25℃下允许相分离至少30分钟。最后，在螺旋盖封盖的比色皿中以分光光度测定方式在320nm下针对二氯甲烷空白测量二氯甲烷相。

实施例3：分析法的校准

通过分析涵盖10ppm到400ppm的聚山梨醇酯80的标准稀释液来校准分析法。通过向蛋白质溶液中掺入聚山梨醇酯水溶液来制备这些标准溶液。因为本文所述的水解条件实际上破坏迄今为止所测试的任何蛋白质溶液的影响，所以任何蛋白质溶液，包括全血浆，都应该是适合的。然而，遵循在相同情形下比较的原则，选择血浆蛋白溶液，其与所关注的溶液尽可能地相似。因此，使用发育的PCC建构涵盖范围为10ppm到400ppm聚山梨醇酯80并含有浓度5、10、20、50、100、200和400ppm的标准曲线，并且在执行分析法时每次一式两份地分析。

实施例4：水解时间的最佳化

为了确定适当的水解时间，选择发育的aPCC（活化的凝血酶原复合物浓缩物）作为已知实质上干扰聚山梨醇酯80的比色测定的蛋白质基质。尽管这种基质基本上不含去污剂，但在通过用乙醇沉淀尝试去除蛋白质之后在分析这种溶液时观测到假阳性反应。在约25mg/ml的蛋白质浓度下，含有广泛多种不同血浆蛋白例如凝血酶原、间-α-胰蛋白酶抑制剂、补体和玻连蛋白的这种基质被掺入100ppm的聚山梨醇酯80。如所述进行碱性水解，将样品在沸水浴中保持15分钟到120分钟。如上文所述进行进一步加工。

聚山梨醇酯在100℃下15分钟到120分钟的水解时间之后的比色测量结果显示于图1中。所选蛋白质基质即使在极短水解时间之后也不显示假阳性反应，其中所述蛋白质基质已知含有在用乙醇使蛋白质沉淀之后进行测定时产生假阳性反应的组分。在100℃下水解15分钟后，所添加的100ppm聚山梨醇酯80不可完全回收，并且仅测得79%的掺入量。这种回收率水平是研究中发现的最低的，并且另外显示与在延长的水解之后获得的所有其他回收率相比更高的标准偏差。因此，短暂碱性水解不足以完全消除蛋白质对分析法的干扰，并且观测到较低回收率，这指示蛋白质与去污剂之间可能的相对紧密关联可能阻止去污剂参与比色测定。然而，进行30分钟的碱性水解得到90%的回收率，并且分别在45分钟、60分钟、90分钟和120分钟后分析的以下样品分别显示100%、99%、99%和97%的回收率，各值特征为变异系数低于2.5%。根据这些研究结果，选择60±10分钟的水解时间用于所有其他实验。

实施例5：不同血浆蛋白基质中的分析法准确性

关于方法验证的官方指导原则限定，分析程序的准确性指的是真实值与实测值之间的一致程度。存在若干种评估分析方法准确性的方法。因为没有在血浆蛋白存在下用于聚山梨醇酯80的经证实的参比材料，所以遵循向空白参比样品中掺入已知浓度的分析物的方法。由于已知蛋白质对分析法有影响而选择这种掺入相关蛋白质溶液的方法。由于一级、二级和三级结构的差异，蛋白质针对碱处理的抗性可能显著不同，其中应用于聚山梨醇酯80测定的程序不如包括在120℃下加热15小时的总的碱性水解剧烈。

为了研究本文使用的碱性水解条件是否足以允许聚山梨醇酯80在极不相同的蛋白质基质中的准确分析，使用包括白蛋白、免疫球蛋白、血清类粘蛋白、抗凝血酶、蛋白C和凝血因子以及全血浆的血浆蛋白溶液来检查聚山梨醇酯80的回收率。所研究的样品的蛋白质浓度在1mg/mL到50mg/mL范围内。表1包含掺料实验的结果，其中添加10ppm、50ppm、100ppm或200ppm聚山梨醇酯80到空白基质中。

表1：聚山梨醇酯80（p80）在不同血浆蛋白溶液中的回收率

*)-：未测定

在所研究的所有蛋白质溶液中，发现聚山梨醇酯80的添加量的回收率在90%与106%之间。根据这些结果，所测试的所有样品都满足由AOAC（美国官方分析化学家协会（American Association of OfficialAnalytical Chemists））公开的关于回收率数据随分析物浓度而变化的准则。根据这些说明，100ppm的分析物应以90%到107%回收，而10ppm的回收率的限度为80%到110%以保证可靠结果。我们的结果证明所应用的水解条件适于消除蛋白质的干扰影响，而与蛋白质种类无关，至少在所研究的蛋白质浓度中如此。甚至在已知极为复杂且含有数百种不同蛋白质但也含有低分子量组分的血浆基质中也显示这种情形。100ppm以及200ppm聚山梨醇酯80的添加量可以小于6%的偏差回收。此外，尽管测试的是不同浓度下结构上不相关的蛋白质，但没有任何一种掺有聚山梨醇酯的纯化蛋白质妨碍了成功的回收。因此，例如高度糖基化的蛋白质血清类粘蛋白，其为一种已知结合各种药物的具有超过3的等电点的酸性极强的蛋白质，以及白蛋白，其可结合脂肪酸，都没有抑制测定，即使是在所使用的高浓度下。甚至在定量限10ppm聚山梨醇酯80的掺料浓度下，分析法也得到与存在的蛋白质浓度无关的准确结果。向浓度为每毫升10mg和30mg蛋白质的发育的aPCC中掺入10ppm聚山梨醇酯，与分析法中的蛋白质浓度无关，获得94%和100%的回收率，因此再次满足上文给出的AOAC的建议。

实施例6：分析法的精确度和线性

根据用于分析方法验证的官方指导原则，方法的精确度是一系列样品的多次测定的单个测试结果的一致程度，而分析程序的线性描述的是其获得与样品中分析物的浓度成正比的测试结果的能力。为了描述分析法的这些基本性能参数，使用在发育的PCC中具有100ppm聚山梨醇酯80的对照样品。分析的结果显示在图2中。使用对照样品的21次测定，对于批间分析精确度和批内分析精确度，样品平均值分别具有4.0%和3.7%的相对标准偏差（sd）。两种偏差都符合由AOAC给出的建议值，对于测量100ppm分析物的各天之内或各天之间的精确度，所述建议值为5.3%。21次测定中的仅一次测定得到双标准偏差限定范围外的值，但包括在平均值±3sd范围内。图表还显示由误差条标注的批内分析变异。在20ppm的浓度下进一步研究分析法的精确度，其中测得3.0%的值。对在灭活工艺期间抽取出的、150g聚山梨醇酯80/L的高浓度样品进行分析，得到2.9%（n=6）的平均标准偏差，因此证实所述方法也适于测量在病毒灭活工艺期间出现的高浓度。

分析法的校准曲线涵盖5ppm到400ppm的聚山梨醇酯80并显示处良好线性，浓度和320nm下测量的消光之间的平均相关系数r=0.999（n=21）。线的斜率的特征在于批间分析变异为7.7%（n=21）并且测得定量限（LOQ）为10ppm±0.4ppm，如根据ICH建议所计算的。

实施例7：不同来源的聚山梨醇酯的比较

为评估聚山梨醇酯80的来源是否影响分析性能，比较来自植物和牛来源的批料。两种形式都是在上述蛋白质溶液存在下遵循相同碱性水解程序分析的。另外，在蛋白质不存在下，在无样品预处理情况下执行用硫氰酸根合钴酸盐试剂进行的比色测定，因此模拟试验性乙醇沉淀去除蛋白质后存在的条件。

最初用于病毒灭活的聚山梨醇酯80制剂由牛脂制备。随着牛海绵状脑炎（BSE）的出现，在治疗性蛋白制造中避免牛源物质以及改为植物源去污剂变得必要。从那以后，聚山梨醇酯80可以两种形式获得，并且植物源Tween80已被用于生物医药制造中的病毒灭活工艺中。

为了评估用植物脂肪作为源材料的这种变化的影响，使用无任何进一步样品预处理的分析法来比较两种聚山梨醇酯制剂的反应性，其中所述植物脂肪在构成脂肪酸的组成上与牛脂不同并且可具有按推测不同的、富含油酸级分的脂肪酸分布。结果显示在图3A中，其中显示了两个校准曲线。所得图的斜率不同：比较相等量的材料时，植物源聚山梨醇酯显示明显更高的响应，得到的斜率为0.0025，与之相比动物源去污剂的斜率为0.0023。此外，在分析若干批次的两种聚山梨醇酯时，可证实这种观测结果与批次无关。这些研究结果得到图3B中所示结果进一步支持，其中在碱性水解后获得的两个校准曲线显示难以区分。

以校准曲线斜率表示的分析法的灵敏性在某种程度上低于无碱性水解的情形。因此，在碱性水解后测得0.0021的平均斜率，其低于在无水解时获得的值。这表明去污剂的未经水解的脂肪酸部分也可能参与了复合物的形成或影响复合物的可提取性。

实施例8：评估分析法关于Triton ^TM  X-100的选择性

研究分析法关于紧密相关的去污剂异辛基苯酚聚氧乙烯醚（Triton^TM X-100）以及关于溶剂磷酸三正丁酯（TNBP）的选择性，其两者都包括在用于病毒灭活的确定的溶剂-去污剂工艺中。因此，在无碱性水解下分析含有Triton^TM X-100和聚山梨醇酯80的水溶液以评估比色测定的选择性。此外，比较含有比率为1:0.3:0.3%（w/v）的Triton^TMX-100、聚山梨醇酯80和TNBP的三元溶剂-去污剂灭活混合物与聚山梨醇酯80溶液在碱性水解后的响应。此外，蛋白质浓度为约25mg/ml的发育的aPCC充当蛋白质基质。最后，在蛋白质存在下和不存在下评估在用碱性水解进行样品预处理后极高浓度的Triton X-100对分析法的影响。对于这个实验，应用100、300、1000、2000、5000和10000ppm的Triton^TM X-100浓度。

极通常使用的溶剂-去污剂（SD）病毒灭活混合物由TNBP与两种紧密相关的去污剂Triton^TM X-100和聚山梨醇酯80的三元配方组成。因此，所述分析法是否能够区分这些结构上相关的去污剂变得引人关注。由于两者都含有牵涉到比色测定的聚乙氧基，因此不出意料地，Triton^TM X-100也可通过原始分析法检测。图4A比较两种去污剂在无任何样品预处理的分析法中的响应。在12ppm到200ppm范围内测量的两种去污剂的反应性显著不同。在整个浓度范围内Triton^TM X-100仅得到聚山梨醇酯80的响应的约70%。

由于这些研究结果，且尤其由于两种去污剂具有不同的响应因子，因此在存在两种去污剂时不可使用原始分析法。如果分析法中包括通过碱性水解进行样品预处理，那么观测到完全不同的效果。图4B给出上文已描述的由比率为1.0:0.3:0.3%（w/v）的Triton^TM X100、聚山梨醇酯80和TNBP组成的SD混合物相比于单独的聚山梨醇酯80的校准曲线。比较校准曲线的相关参数斜率和截距，可注意到基本上无差异。如表2中所示，无论是斜率还是截距都没有不同，其中，所述斜率在两种情况下均为0.0023，所述截距对于聚山梨醇酯为-0.005，对于SD混合物为-0.007。

表2：有碱性水解和无碱性水解情况下的Triton^TM X-100的反应性

这些结果显示，尽管Triton^TM X-100的浓度高了三倍，但所述分析法可在不存在任何由紧密相关的去污剂Triton^TM X-100造成的可检测干扰的情况下应用于分析SD混合物中的聚山梨醇酯80的浓度。令人惊讶的是，碱性水解能够增强比色测定的选择性。进行另外的实验来阐明Triton^TM X-100的反应性是否被完全破坏或仅在某种程度上被破坏。如表4中所概述，含有少于300μg/ml Triton^TM X-100的溶液不显示任何可测量的响应，并且因此对所测量的值无影响。因此，正如由实验所示的，碱性水解导致分析法的选择性大幅增大，其中30倍过量的Triton^TM X-100甚至对仅10ppm聚山梨醇酯80的信号也不显示任何可测量的影响。发现甚至介于1000ppm与10000ppm之间，远超过聚山梨醇酯80的校准浓度范围的Triton^TM X-100的浓度，也只是适度反应，证实通过在比色测定之前进行碱性水解使Triton^TM X-100反应性的几乎99%被去除。

表3：在碱性水解后Triton^TM X-100的反应性

结论

具有不同水解时间的上述实验的结果（参考实施例4）显示短至15分钟的碱处理已足以降低既定蛋白质溶液的影响，先前显示所述蛋白质在应用乙醇进行蛋白质沉淀的方法中造成聚山梨醇酯浓度的明显高估。可证实，即使使用电荷和尺寸不同的众多蛋白质，也可在不受蛋白质基质的任何实质性干扰的情况下对聚山梨醇酯80进行分析（参考实施例5）。具体来说，在蛋白质浓度为约50mg/ml的血清类粘蛋白（α₁-酸糖蛋白）中，可在99%的回收率下测定50μg聚山梨醇酯80/mL。此种酸性极强的蛋白质得以分析而没有带来任何干扰的事实证实了通过碱性水解进行样品预处理的适宜性。此外，在白蛋白中测定聚山梨醇酯80已毫无困难，白蛋白是众所周知结合脂肪酸的一种蛋白质。因为聚山梨醇酯80每个分子平均含有单个脂肪酸残基，所以可能发生亲脂性部分与白蛋白的结合。然而，在白蛋白中的回收率在这方面没有产生任何担忧。

如血浆中存在的低分子量生物化合物（例如氨基酸、糖、肽、尿素、肌酸酐）造成的干扰也可以通过碱性水解被有利地避免。全血浆例如含有一些在乙醇存在下不会沉淀的未进一步明确的组分。使用大约稀释一半直到蛋白质含量为30mg/ml的血浆，成功证实了本发明方法的适宜性。因此，碱性水解的适宜性可在极为不同的蛋白质溶液中得到证明。同时，所有执行的回收率实验的结果都符合由AOAC建议的用于同行验证过的方法的准则，并且测得的精确度使得能够将该系统引入作为质量控制程序的一部分。

BSE的出现导致对血浆分级行业中使用的所有辅助材料进行仔细的检查。植物脂肪替代牛脂作为聚山梨醇酯80中的油酸的原材料。关于用于富集油酸的相当原始的分级工艺，比较合成所用的不同来源的材料，明显的是由牛或植物脂肪获得的聚山梨醇酯的脂肪酸组成可能至少轻微不同。与牛脂相比，最常见植物脂肪的特征是多不饱和C₁₈脂肪酸的含量更高。观测到聚山梨醇酯Tween^TM20（月桂酸酯）、Tween^TM40（棕榈酸酯）和Tween^TM80（油酸酯）对于硫氰酸根合钴酸盐具有不同的复合特性，导致水性复合物在620nm下的消光对于Tween^TM80来说比Tween^TM20和40更低。尽管含有约80%油酸的Tween^TM80的脂肪酸分布最均匀且显著不同于Tween^TM20、40和60（硬脂酸酯）的脂肪酸分布，但植物源聚山梨醇酯80与动物源聚山梨醇酯80之间的脂肪酸组成的微小差异最有可能解释所测量到的差异，所述差异为观测到的未经样品准备的植物源材料的反应性更高。这种解释得到以下事实的进一步支持：两种来源的聚山梨醇酯之间的这种差异可通过碱性水解完全消除（参考实施例7）。这种样品处理不仅将导致蛋白质分解，而且还将造成聚山梨醇酯的皂化，从而导致脂肪酸部分从去污剂断裂，其因而使比色测定或所形成复合物的可提取性不会产生偏差。去污剂的脂肪酸部分的任何变化将不再影响测定，并且方法的稳固性可显著增强。通过解释和消除两种聚山梨醇酯80变体之间的这种非预期差异，在相同情形下比较的基本原则在这种情况下似乎失去重要性，可使用任何来源的聚山梨醇酯80来进行分析法的校准。

关于在620nm下，30ppm聚山梨醇酯80的定量限的早期研究结果，在这些实验中测定的在320nm下10ppm聚山梨醇酯80的LOQ与所述早期研究结果一致性良好，因为消光系数ε_320nm约为ε_620nm的六倍，其中所述早期研究结果使用开发用于重组蛋白的比色方法获得且未进一步表征。一个甚至更重要的发现是通过碱性水解使得针对聚山梨醇酯的选择性有利增强。通常与聚山梨醇酯组合应用的异辛基苯酚聚氧乙烯醚Triton^TM X-100的比色响应可被消除，只要使得两种聚氧乙基化去污剂的定量（在无水解情况下，对于聚山梨醇酯和Triton^TM X-100取和，以及水解后对于Triton^TM X-100，通过减去残余聚山梨醇酯的浓度）变得可行（参考实施例8）。因为聚氧乙烯酚醚桥以与木材木质素中的β-羟基烷基酚醚类似的方式最有可能易受碱性水解，所以在醚裂解时将会释放出游离的短的聚乙二醇（n_av～9）链，其硫氰酸根合钴酸盐复合物可能不会定量提取到有机相中，而是似乎只提取至多1.5%。因此，即使在300μg/ml的浓度下，Triton X-100也不会显示出可测量的干扰。

概述所有结果，通过引入样品预处理，有可能进行一种极简单且通用的方法以用于在血浆蛋白存在下以及另外在Triton^TM X-100存在下测定聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯80）。所述方法可以适当的准确性和精确度进行，因此允许在病毒灭活工艺期间以及在最终容器中测定例如聚山梨醇酯80的浓度。此外，主要被设计用来使得能够在与蛋白质溶液性质无关的蛋白质存在下执行分析法的碱性水解步骤，结果能够增强所述分析法关于由通常应用的去污剂Triton^TM X-100所造成的干扰的选择性。最后，还致使所述方法针对聚山梨醇酯的脂肪酸部分的改变稳固，所述聚山梨醇酯的皂化排除了对比色测定的任何贡献。

Claims (17)

1.测定含蛋白质样品中的聚山梨醇酯的方法，其包括以下步骤：

(a)对所述样品进行碱性水解；

(b)在碱性水解后中和所述样品；

(c)任选地，从经过中和的样品中去除变性的沉淀物；

(d)向任选经过过滤的样品中添加硫氰酸根合金属复合物的水性混合物以形成山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合金属复合物；

(e)将步骤(d)中形成的所述山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合金属复合物提取到与水不混溶的有机溶剂中；

(f)测量步骤(e)中获得的提取物的吸光度，以定量步骤(d)中形成的所述山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合金属复合物的量；以及

(g)从步骤(f)中测定的所述山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合金属复合物的量，计算样品中所含的聚山梨醇酯的量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中聚山梨醇酯是聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯（聚山梨醇酯80）。

3.根据权利要求2所述的方法，其中聚山梨醇酯80来源于动物。

4.根据权利要求2所述的方法，其中聚山梨醇酯80来源于植物。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中添加的硫氰酸根合金属复合物是Co(NO₃)₂·6H₂O与NH₄SCN的水性混合物，并且所形成的山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合金属复合物是山梨醇酐聚氧乙烯硫氰酸根合钴酸盐(II)复合物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述水性混合物含有约3%（w/v）的Co(NO₃)₂·6H₂O和约20%（w/v）的NH₄SCN。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述样品还含有异辛基苯酚聚氧乙烯醚（Triton^TM X-100）。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述样品还含有磷酸三正丁酯（TNBP）。

9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的碱性水解包括用碱性试剂进行水解，所述碱性试剂选自：NaOH、KOH、LiOH、Ba(OH)₂、Sr(OH)₂、Ca(OH)₂、氢氧化四甲铵、氢氧化四乙铵、氢氧化四丙铵、氢氧化四丁铵，以及均一或非均一取代的四级氢氧化烷基铵和四级氢氧化环烷基铵。

10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的碱性水解在约80℃到约100℃范围内的温度下进行至少15分钟。

11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的碱性水解包括在约95℃到约100℃的温度下用至少3N的NaOH水解至少45分钟。

12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中步骤(c)中使用的滤器不结合聚氧乙烯山梨醇酐。

13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中步骤(e)中使用的与水不混溶的有机溶剂选自：二氯甲烷、氯仿、邻二氯苯、溴仿和三氯乙烯。

14.根据权利要求1到13中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的有机溶剂是二氯甲烷。

15.根据权利要求1到14中任一项所述的方法，其中在步骤(f)中在约324nm下测量步骤(e)中获得的提取物的吸光度。

16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其在步骤(a)之后且在步骤(b)之前进一步包括以下步骤：

(a2)在碱性水解后冷却所述样品。

17.根据权利要求1到16中任一项所述的方法，其在步骤(b)之后且在步骤(c)之前进一步包括以下步骤：

(b2)使所述样品在室温下保持至少30分钟以允许形成变性的沉淀物。

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