JP2001249135A - ペプチド結合でタンパク質に結合したホモシステインの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 被験者の負担が軽く、しかも正確に動脈硬化
症発症の危険度を判断することのできる血中ホモシステ
インの測定方法を提供する。 【解決手段】 例えばヒト血漿等のペプチド結合でホモ
システインが結合したタンパク質、遊離したホモシステ
イン及び／又は低分子量ホモシステイン誘導体、並びに
ジスルフィド結合でホモシステインが結合したタンパク
質を含む原被検体から、ジスルフィド結合で結合したホ
モシステインを遊離させて被検体を調製し、この被検体
から、遊離したホモシステイン及び低分子量ホモシステ
イン誘導体を除去してペプチド結合でホモシステインが
結合したタンパク質を分離した後、分離された当該タン
パク質を加水分解等の方法により分解してホモシステイ
ン又はその誘導体を得、次いで得られたホモシステイン
又はその誘導体の量を測定し、その測定値に基づいて被
検体中に存在するタンパク質にペプチド結合で結合した
ホモシステインの量を決定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はペプチド結合でタン
パク質に結合したホモシステインの測定方法、および当
該ホモシステインの動脈硬化症危険因子又は腎症マーカ
ーとしての使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】メチオニンは人間の必須アミノ酸で、タ
ンパク質を構成すると共に、生体内のメチル化反応にお
いてドナーとなるなど重要な働きをしている。ホモシス
テイン（以下Ｈｃｙと表記することもある）はメチル基
転位反応の結果メチオニンが脱メチル化され生成するア
ミノ酸である。生体内で発生するＨｃｙは葉酸からメチ
ル基を受け取り再びメチオニンに変換されるか、または
セリンと縮合し、シスタチオニンを経てシステインへと
変換される。

【０００３】通常、血中Ｈｃｙは上述の代謝系により低
濃度（数μＭ）に保たれているが、Ｈｃｙ代謝系の酵素
（シスタチオニンβシンターゼ、メチルテトラヒドロ葉
酸メチルトランスフェラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉
酸レダクターゼなど）の異常やＨｃｙ代謝系の酵素反応
に必要な補酵素（葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ６
など）の不足により、血中Ｈｃｙ濃度が増加することが
知られている［J. Clin. Invest., 98, 24-29(1996)、N
ature Med., 4, 386-389(1996)、N. Engl. J.Med.,338,
1042-1050(1998)］。

【０００４】Ｈｃｙは側鎖にメルカプト基を持っている
ので、チオール化合物とジスルフィド結合を介して結合
しやすく、血中Ｈｃｙは、全体の７０％以上がタンパク
質中のシステイン残基（側鎖にメルカプト基を持つ）に
ジスルフィド結合で結合しているといわれている［J. C
lin. Invest., 77, 1482-1486(1986)］。現在、臨床検
査の場で測定されている血中Ｈｃｙ濃度は、総Ｈｃｙ濃
度と呼ばれており、遊離のＨｃｙ濃度とタンパク質にジ
スルフィド結合で結合したＨｃｙ濃度の両者を合計した
値を指す。

【０００５】総Ｈｃｙ濃度測定法としては、種々の方法
が報告されている。これらの方法は、通常、血漿また
は血清を、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイト
ール、水素化ホウ素ナトリウム等で還元し、タンパク質
にジスルフィド結合で結合したＨｃｙを遊離させる工
程、限外濾過膜等を用いた分子量分画またはトリクロ
ロ酢酸添加による酸沈殿などにより、タンパク質を除去
する工程、及び種々の方法にてＨｃｙを定量する工程
という３つの工程から構成されており、３番目の工程の
定量法としては、高速液体クロマトグラフィー法（以下
ＨＰＬＣと表記する場合がある）［Clin. Chem., 39, 1
764-1779(1993)］、抗体法（特表平８−５０６４７８号
公報、特表平９−５１２６３４号公報）、酵素法（PCT/
GB97/02266）が報告されている。

【０００６】報告により多少ばらつきがあるが、総Ｈｃ
ｙ濃度が１５μＭ以上の人を高Ｈｃｙ血症と言い、この
ような症状の人は動脈硬化症を発症しやすくなることが
明らかとなっている［N. Engl. J. Med., 324, 1149-11
55(1991)、JAMA, 274, 1049-1057(1995)、JAMA, 277, 1
775-1781(1997)］。また、高Ｈｃｙ血症患者に葉酸、ビ
タミンＢ６、ビタミンＢ１２を数mg〜数十mg摂取させる
と、多くの場合、総Ｈｃｙ濃度が正常値まで低下する事
も知られており［JAMA, 274, 1049-1057(1995)、Nutrit
ion, 8, 28-34(1997)］、このことから、総Ｈｃｙ濃度
を測定して異常値の場合には、該値を正常範囲に保つよ
うに適切な処置を行なえば、動脈硬化症発症が抑制でき
ると思われる。このように、総Ｈｃｙ濃度は動脈硬化症
の新たな危険因子として注目を集めている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ところで、血中総Ｈｃ
ｙとして測定されている、遊離Ｈｃｙとジスルフィド結
合でタンパク質に結合したＨｃｙの量は食事の影響を受
けることが知られており、通常、食後２〜４時間で上昇
し、約８時間後には食事前のレベルに低下する。どれく
らい上昇するかは食事の内容により異なる。このため、
血中総Ｈｃｙ測定は、上記食事の影響を避けるため、約
１２時間絶食した後の空腹時に採血して行なう必要があ
り、検査を受ける者にとって負担となっている。

【０００８】また、葉酸とビタミンＢ１２が不足してい
る人は空腹時の血中総Ｈｃｙ濃度が上昇するのに対し、
ビタミンＢ６が不足している人は、一定量のメチオニン
を飲んだ後における総Ｈｃｙ濃度は健常人の約２倍に増
加するにもかかわらず、空腹時の総Ｈｃｙ濃度は正常値
であることが知られている［J. Clin. Invest., 98,177
-184(1996)］。ビタミンＢ６不足群も動脈硬化症発症の
危険が高いと考えられており、このような被験者につい
て正確に動脈硬化症発症の危険度を判断するためには、
一定量のメチオニン（体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ）を
経口摂取させ、時間を追って（多くの場合、摂取直前、
摂取後４時間、摂取後８時間）血中総Ｈｃｙを測定する
メチオニン負荷試験を行なう必要がある。しかしなが
ら、該メチオニン負荷試験は、検査に要する時間が長
く、また、被験者の負担も大きいので、広く実施される
には至っておらず、空腹時血液を用いる従来の血中総Ｈ
ｃｙ測定法では、このような人達を見落とすことが懸念
されている。

【０００９】このように、被験者の負担が軽く、正確に
動脈硬化症発症の危険度を判断できるＨｃｙの測定方法
はこれまで知られておらず、このようなＨｃｙの測定方
法が望まれている。そこで、本発明は、簡便かつ正確に
動脈硬化症発症の危険度を判断できるＨｃｙの新たな測
定法を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく、鋭意研究を行ってきたところ、血中にはペ
プチド結合でタンパク質に結合したＨｃｙ（以下、単に
「ＰＢ−Ｈｃｙ」ともいう）が存在することを確認する
に至った。

【００１１】なお、ＰＢ−Ｈｃｙ、換言すればペプチド
結合によりＨｃｙが結合したタンパク質（以下、単に
「Ｈｃｙ化タンパク質」ともいう）は、培養細胞におい
ては存在することが確認されており［J. Biol. Chem.,
272, 1935-1942(1997)］、血中においても、存在するこ
とが示唆されてはいるものの［Atherosclerosis, 69, 1
09-113(1988)、Atherosclerosis, 88, 61-68(1991)］、
血中におけるその存在はこれまで確認されていないもの
である。

【００１２】そして上記のような新たな知見に基づき更
に検討を行なった結果、従来の血中総Ｈｃｙを測定する
定法では測定することができないＰＢ−Ｈｃｙの量を測
定する方法を見出すと共に、該方法によって測定された
ＰＢ−Ｈｃｙ濃度（量）は従来測定されていた空腹時血
漿を用いて測定された総Ｈｃｙ濃度と良好な相関関係を
有し、動脈硬化症の危険因子や腎症マーカーとなり得る
こと、さらに該ＰＢ−Ｈｃｙ量は食事の影響を受けない
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１３】即ち、本発明は、ペプチド結合でホモシス
テインが結合したタンパク質（Ｈｃｙ化タンパク質）、
遊離したホモシステイン及び／又は低分子量ホモシステ
イン誘導体を含む被検体から、遊離したホモシステイン
及び低分子量ホモシステイン誘導体を除去してペプチド
結合でホモシステインが結合したタンパク質を分離した
後、分離された当該タンパク質を分解してホモシステイ
ン又はその誘導体を得、次いで得られたホモシステイン
又はその誘導体の量を測定し、その測定値に基づいて被
検体中に存在するタンパク質にペプチド結合で結合した
ホモシステイン（ＰＢ−Ｈｃｙ）の量を決定することを
特徴とするペプチド結合でタンパク質に結合したホモシ
ステイン（ＰＢ−Ｈｃｙ）の測定方法である。

【００１４】上記本発明の測定方法では、ペプチド結合
でホモシステインが結合したタンパク質（Ｈｃｙ化タン
パク質）、遊離したホモシステイン及び／又は低分子量
ホモシステイン誘導体、並びにジスルフィド結合でホモ
システインが結合したタンパク質を含む原被検体から次
のような方法により調製した被検体が好適に使用でき
る。

【００１５】すなわち、前記原被検体から遊離したホモ
システイン及び低分子量ホモシステイン誘導体を除去す
る工程、及び該工程を経た原被検体中のジスルフィド結
合でホモシステインが結合したタンパク質から当該タン
パク質に結合していたホモシステインを不可逆的に遊離
させる工程を含む方法により調製した被検体；または、
原被検体中のジスルフィド結合でホモシステインが結合
したタンパク質から当該タンパク質に結合していたホモ
システインを不可逆的に遊離させる方法により調製した
被検体が好適に使用できる。

【００１６】また、これら本発明の測定方法においてＨ
ｃｙ化タンパク質を分解する前に当該Ｈｃｙ化タンパク
質に結合したＨｃｙのメルカプト基を保護した場合には
上記のＨｃｙ化タンパク質の分解をするときにより多く
の方法が使用可能となるばかりでなく、前記原被検体か
ら被検体を調製する場合において、ジスルフィド結合で
ホモシステインが結合したタンパク質から当該タンパク
質に結合していたホモシステインを不可逆的に遊離さ
せ、除去するときの操作条件が大幅に緩和されるという
メリットがある。

【００１７】また、他の本発明は、ペプチド結合でタン
パク質に結合したホモシステイン（ＰＢ−Ｈｃｙ）の動
脈硬化症危険因子、又は腎症マーカーとしての使用であ
り、更に他の発明は、ペプチド結合でホモシステインが
結合したタンパク質（Ｈｃｙ化タンパク質）の動脈硬化
症危険因子、又は腎症マーカーとしての使用である。

【００１８】なお、一般に、Ｈｃｙ化タンパク質の生成
にはホモシステインチオラクトン（以下ＨｃｙＴと表記
する）が関係していると考えらている[Nature Med., 4,
386-389(1996)]。該ＨｃｙＴはタンパク質合成の際に
Ｈｃｙより酵素反応により生成することが示されている
［FEBS Lett., 317, 237-240(1993)］。タンパク質とＨ
ｃｙＴが混在すると、ＨｃｙＴは非酵素的にタンパク質
のアミノ基に結合し、Ｈｃｙ化タンパク質が生成する
［Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis., 4, 70-77(1994)、
J. Biol. Chem., 272, 1935-1942(1997)］。このため、
ペプチド結合でタンパク質に結合したＨｃｙ（ＰＢ−Ｈ
ｃｙ）濃度は、ＨｃｙＴ濃度と高ＨｃｙＴ持続時間によ
り規制を受けると考えられる。さらにＨｃｙＴの生成量
はＨｃｙ量と比例関係にあることが示されていることか
ら、本発明の測定方法によって測定されるＰＢ−Ｈｃｙ
量は、例えば、糖化タンパク質が血中グルコース濃度の
中長期的マーカーとして使用されているように、血中Ｈ
ｃｙ濃度の中長期的マーカーとしても使用できることが
期待される。

【００１９】さらに、前記したように、空腹時の血中総
Ｈｃｙ濃度は正常値であるビタミンＢ６が不足している
人は一定量のメチオニンを飲んだ後にＨｃｙ量が健常人
の約２倍に増加することから、ビタミンＢ６不足群にお
いては食後のＨｃｙＴ量も上昇し、それに伴いＰＢ−Ｈ
ｃｙ濃度も上昇していると思われる。このことから、Ｐ
Ｂ−Ｈｃｙ濃度を測定することによりビタミンＢ６不足
群を見分けることができるようになることも期待され
る。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明のＰＢ−Ｈｃｙの測定方法
では、ペプチド結合でホモシステインが結合したタンパ
ク質（Ｈｃｙ化タンパク質）、並びに遊離したホモシス
テイン及び／又は低分子量ホモシステイン誘導体を含む
被検体中のＰＢ−Ｈｃｙの量を測定する。

【００２１】ここで、ＰＢ−Ｈｃｙとは、タンパク質中
のアミノ酸残基のアミノ基とＨｃｙのα−カルボキシル
基との間で形成されたペプチド結合を介して、タンパク
質に結合したＨｃｙを指す。Ｈｃｙがペプチド結合で結
合するアミノ酸の種類は特に限定されない。例えば、ア
ミノ酸のα−アミノ基にＨｃｙが結合したＰＢ−Ｈｃ
ｙ、または、リジンのε−アミノ基にＨｃｙが結合した
ＰＢ−Ｈｃｙなどがこれに含まれる。

【００２２】また、ペプチド結合でＨｃｙが結合したタ
ンパク質（Ｈｃｙ化タンパク質）とは、ＰＢ−Ｈｃｙで
述べた様式によりＨｃｙがペプチド結合で結合したタン
パク質を指す。なお、ペプチド結合により結合したＨｃ
ｙは、ホモシステイン酸の形態を採ることもある。本発
明で使用されるＨｃｙ化タンパク質は生体由来のもので
も化学的に合成されたものであってもよい。

【００２３】Ｈｃｙ化タンパク質を合成する場合は、例
えば文献記載のNaruszewicsらの方法［Nutr. Metab. Ca
rdiovasc. Dis., 4, 70-77(1994)］やFergusonらの方法
［J. Lipid Res., 39, 925-933(1998)］に従って、タン
パク質とホモシステインチオラクトン（ＨｃｙＴ）を反
応させることにより得ることができる。

【００２４】また、遊離したホモシステインとは被検体
中に遊離して存在するホモシステイン（Ｈｃｙ）を意味
し、遊離した低分子量ホモシステイン誘導体とは、ホモ
システイン酸、２分子のＨｃｙがジスルフィド結合によ
り結合したホモシスチン、システイン（以下Ｃｙｓと表
記することもある）にジスルフィド結合でＨｃｙが結合
したもの、及びグルタチオンのような低分子量のＣｙｓ
含有ペプチド（分子量５０００以下）にジスルフィド結
合でＨｃｙが結合したものであって、タンパク質に結合
せずに被検体中に遊離して存在するものを意味する（以
下、これらを総称して「遊離Ｈｃｙ等」ともいう）。遊
離Ｈｃｙ等には、はじめから被検体中に存在するものの
他、後述するような原被検体中に存在するジスルフィド
結合でＨｃｙが結合したタンパク質に処理を施して当該
タンパク質から遊離されたＨｃｙやホモシステイン酸も
含まれる。

【００２５】本発明で使用される被検体は、Ｈｃｙ化タ
ンパク質および遊離Ｈｃｙ等を含有する溶液であれば特
に限定されない。例えば、血漿、血清、尿等の体液、或
いは生体から採取した臓器、組織、細胞等を含む溶液、
体液或いは組織等から特定の成分を分離或いは精製する
ことにより得られた画分、或いはこれらに何らかの処理
を施した溶液、人工的に調製されたＨｃｙ化タンパク質
溶液等が使用できる。

【００２６】ただし、正確にＰＢ−Ｈｃｙを定量するた
めには、０．１〜１０ｍｇのタンパク質を含有する被検
体を用いるのが望ましい。

【００２７】また、被検体がジスルフィド結合でＨｃｙ
が結合したタンパク質、即ちタンパク質中のシステイン
（Ｃｙｓ）残基にジスルフィド結合を介してＨｃｙが結
合したタンパク質を含有しない場合にはそのまま被検体
とすることができるが、該タンパク質を含有する場合
（本発明ではこのようなタンパク質を含む被検体を「原
被検体」といい、被検体と区別して用いる）には、ＰＢ
−Ｈｃｙの測定精度の観点から、当該タンパク質にジス
ルフィド結合で結合しているホモシステインを不可逆的
に遊離させる処理（単に「遊離化処理」ともいう。）を
施したものを被検体とするのが好適である。

【００２８】例えば、後述するように、ＰＢ−Ｈｃｙ、
Ｈｃｙ化タンパク質は、動脈硬化症の危険因子、または
腎症マーカーとして使用することができるので、臨床検
査の目的で本発明のＰＢ−Ｈｃｙ測定法を使用する場合
は、採取し易い体液由来の溶液若しくは懸濁液について
測定を行なうのが好適であるが、これら溶液若しくは懸
濁液は、一般にジスルフィド結合でＨｃｙが結合したタ
ンパク質を含むので、遊離化処理を行なうのが好適であ
る。

【００２９】原被検体を遊離化処理する方法は、ジスル
フィド結合を切断し、タンパク質からジスルフィド結合
により結合したＨｃｙを切り離すことができる方法であ
れば特に限定されず、還元または酸化によりジスルフィ
ド結合を切断する方法等が採用できる。

【００３０】還元によるジスルフィド結合の切断は、還
元剤を用いて行なうことができる。この時、好適に使用
できる還元剤を例示すれば、トリ−ｎ−ブチルフォスフ
ィン、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノー
ル、水素化ホウ素ナトリウム等が挙げられる。この方法
では、原被検体に上記還元剤を終濃度０．１〜１００ｍ
Ｍとなるように添加し、１５〜７０℃で０．５〜２時間
放置することにより、ジスルフィド結合を還元し、ジス
ルフィド結合でタンパク質に結合した実質的に全てのＨ
ｃｙをタンパク質から切り離すことができる。なお、Ｐ
Ｂ−Ｈｃｙはペプチド結合でタンパク質に結合している
ので、このような還元処理をおこなってもＨｃｙ化タン
パク質から遊離することはない。

【００３１】酸化によるジスルフィド結合の切断は、過
ぎ酸を用いて酸化することにより好適に行うことができ
る。例えば、新生化学実験講座 第１巻 タンパク質II
一次構造（第１版 東京化学同人 １９９０年発行）７６
ページに記載されているように、９．５ｍｌの９９％ぎ
酸に０．５ｍｌの３０％過酸化水素を加え、室温で２時
間放置して調製した過ぎ酸溶液を、原被検体に適当量添
加し、−５℃にて２．５時間反応させ、過ぎ酸酸化を行
えばよい。このような操作により、ジスルフィド結合は
開裂し、ジスルフィド結合によりタンパク質に結合した
Ｈｃｙはほぼ全量ホモシステイン酸に酸化されて遊離す
る。なお、このような処理でＰＢ−Ｈｃｙはそのメルカ
プト基が酸化されてホモシステイン酸（ホモシステイン
酸は、後述するメルカプト基が保護されたＨｃｙに相当
する）となるが、ペプチド結合は過ぎ酸酸化によって切
断されず、Ｈｃｙ化タンパク質は実質的な影響を受けな
い。

【００３２】このような原被検体の遊離化処理は、予め
原被検体から当該原被検体中にはじめから存在する遊離
Ｈｃｙ等を除去してから行なってもよい。遊離Ｈｃｙ等
の除去は、後述する被検体からの遊離Ｈｃｙ等の除去方
法と同様に行なうことができる。

【００３３】遊離化処理が施された原被検体が本発明の
測定方法で用いられる被検体となるが、原被検体に直接
遊離化処理を行なって被検体を得た場合には、得られる
被検体中の遊離Ｈｃｙ等は、原被検体中にはじめから存
在する遊離Ｈｃｙ等、及び遊離化処理によって遊離した
Ｈｃｙ又はホモシステイン酸になる。これに対し、予め
原被検体から当該原被検体中にはじめから存在する遊離
Ｈｃｙ等を除去してから遊離化処理を行なって被検体を
得た場合には、得られる被検体中の遊離Ｈｃｙ等は、遊
離化処理によって遊離したＨｃｙ又はホモシステイン酸
となる。

【００３４】本発明の測定方法では、先ず、被検体から
遊離したホモシステイン及び低分子量ホモシステイン誘
導体（遊離Ｈｃｙ等）を除去してＨｃｙ化タンパク質を
分離する（このような工程を「Ｈｃｙ化タンパク質分離
工程」ともいう）。被検体から遊離Ｈｃｙ等を除去して
Ｈｃｙ化タンパク質を分離する方法は特に限定されない
が、タンパク質と遊離Ｈｃｙ等との分子量や溶解度の差
異を利用して被検体を分画し、Ｈｃｙ化タンパク質を含
むタンパク質画分を回収することにより好適に行なうこ
とができる。

【００３５】例えば、分子量の差異により遊離Ｈｃｙ等
を除去する場合には、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ー、限外濾過等が利用できる。ゲル濾過カラムクロマト
グラフィーによる場合には、担体を充填したカラムに被
検体を添加し、タンパク質溶出画分を分取すればよい。
担体としては、セファデックスＧ−２５、Ｇ−５０（ア
マシャムファルマシアバイオテク社）、バイオゲルＰ−
２、Ｐ−４（バイオラッド社）等の市販のゲル濾過担体
を使用することができる。また、限外濾過による場合に
は、市販の分画分子量５０００の限外濾過膜（ミリポア
社、ザルトリウス社など）等を使用して被検体を濾過
し、タンパク質画分を回収すればよい。この場合、遊離
Ｈｃｙ等を完全に除去するために、タンパク質画分に、
例えば、緩衝液等の溶液を添加し、３〜５回濾過を繰り
返すのが好適である。

【００３６】また、溶解度の差異により遊離Ｈｃｙ等を
除去する場合には、被検体に酸や有機溶媒を添加し、タ
ンパク質のみを沈殿させ、これを分離回収することによ
り実施することができる。例えば、酸を使用する場合
は、トリクロロ酢酸、過塩素酸等を終濃度５〜５０％と
なるように被検体に添加し、タンパク質を沈殿させた
後、遠心分離にてタンパク質を回収すればよい。また、
有機溶媒を使用する場合には、アセトン、エタノール等
を終濃度１０〜８０％となるように被検体に添加し、遠
心分離にてタンパク質を回収すればよい。これら溶解度
の差異による方法においては、遊離Ｈｃｙ等を完全に除
去するために、回収されたタンパク質画分に、例えば、
５〜９０％の有機溶媒を含む溶液を添加し、遠心分離で
タンパク質画分を回収するという洗浄操作を３〜５回繰
り返すのが好適である。

【００３７】通常、このような方法で遊離Ｈｃｙ等とタ
ンパク質成分とを分離し、９５％以上の回収率でタンパ
ク質成分を回収することができる。

【００３８】なお、原被検体から被検体を調製するに際
し、ジスルフィド結合を過ぎ酸酸化により切断した場合
には、上記Ｈｃｙ化タンパク質分離工程中にジスルフィ
ド結合が再生することはないが、ジスルフィド結合を還
元により切断した場合には、酸素等との接触によりメル
カプト基が再酸化され、ジスルフィド結合によりタンパ
ク質に結合したＨｃｙが再生されることがあるので、還
元後の遊離Ｈｃｙ等の除去操作は、使用するクロマトグ
ラフィー担体、溶液等から酸素を除去し、このような再
生が起こらないように注意深く行う必要がある。ただ
し、後述するメルカプト基の保護を還元操作に続いて実
施すれば、特に酸素に注意しなくてもジスルフィド結合
が再生されることはないので操作の簡便性が高まる。

【００３９】本発明の測定法では、Ｈｃｙ化タンパク質
分離工程で分離されたＨｃｙ化タンパク質を分解してＨ
ｃｙ又はその誘導体を得る。すなわち、上記Ｈｃｙ化タ
ンパク質のペプチド結合を切断し、Ｈｃｙ化タンパク質
からＰＢ−ＨｃｙをＨｃｙ又はその誘導体の形で遊離さ
せる（以下、これら遊離物を総称して、「ＰＢ遊離Ｈｃ
ｙ等」ともいう。また、このような工程を「ＰＢ−Ｈｃ
ｙ遊離工程」ともいう）。

【００４０】ＰＢ−Ｈｃｙ遊離工程においてＨｃｙ化タ
ンパク質からＰＢ遊離Ｈｃｙ等を得る方法としては、前
記の様にして分離された、Ｈｃｙ化タンパク質を含む全
タンパク質（以下、「全分離タンパク質」ともいう）中
の全ペプチド結合を切断する方法（「全ペプチド切断
法」ともいう）、及びＰＢ−Ｈｃｙが結合しているペプ
チド結合を含む特定のペプチド結合を切断する方法
（「選択的ペプチド切断法」ともいう）等が挙げられ
る。

【００４１】全ペプチド切断法としては、例えば、新生
化学実験講座 第１巻 タンパク質II一次構造（第１版
東京化学同人１９９０年 発行）２５〜３０ページ記載
の、酸加水分解法、アルカリ加水分解法、又は酵素加水
分解法等が利用できる。また、選択的ペプチド切断法と
しては、例えば、新生化学実験講座 第１巻 タンパク質
II 一次構造（第１版 東京化学同人１９９０年 発行）
１５３〜１９８ページ記載のエドマン分解法、又はＰＢ
−Ｈｃｙのペプチド結合を特異的に切断する酵素を用い
る方法等が利用できる。以下、これら分解方法について
詳しく説明する。

【００４２】１．全ペプチド切断法 （１）酵素加水分解法 該方法は、酵素を用いた方法の一般的な特徴であるが、
温和な条件（１０〜５０℃、ｐＨ５〜９、常圧）で実施
できるので、Ｈｃｙが破壊されることはない（このこと
は他の酵素を用いた方法についても言えることであ
る）。該方法は、例えば、パパイン、ロイシンアミノペ
プチダーゼ、プロリンジペプチダーゼ等の基質特異性の
広いプロテアーゼとペプチダーゼの混合物を用いて行な
うことができる。

【００４３】（２）酸加水分解法およびアルカリ加水分
解法 酸加水分解法としては、全分離タンパク質に塩酸を加
え、２〜６Ｎ塩酸とし、減圧下１００〜１５０℃にて１
２〜４８時間加水分解するという方法を示すことができ
る。アルカリ加水分解法としては、全分離タンパク質に
水酸化ナトリウム溶液を添加して水酸化ナトリウム濃度
を２０〜８０％とし、減圧下１００〜１５０℃にて１２
〜４８時間加水分解するという方法を示すことができ
る。

【００４４】ただし、これら加水分解法では、Ｈｃｙは
破壊されることがあるため、ＰＢ遊離Ｈｃｙ等の量の測
定が困難となる。このため、測定の正確性を高めるため
に、Ｈｃｙ化タンパク質の分解を行なう前にＰＢ−Ｈｃ
ｙのメルカプト基を保護するのが好適である。

【００４５】Ｈｃｙのメルカプト基の保護は、保護され
たＨｃｙがペプチド結合の加水分解に対して安定となる
ような方法、例えば、Ｈｃｙのメルカプト基を酸化す
る、又はアルキル化する等の方法により好適に行なうこ
とができる。

【００４６】過ぎ酸酸化の結果生じるホモシステイン酸
は、酸加水分解耐性であため、Ｈｃｙのメルカプト基の
酸化による保護は、例えば過ぎ酸を用いた酸化によって
好適に行なうことができる。原被検体から被検体を調製
する際の遊離化処理において過ぎ酸酸化を行なった場合
には、すでにＰＢ−Ｈｃｙはホモシステイン酸の形に変
化しているため、改めてメルカプト基の保護を行なう必
要はない。

【００４７】また、Ｈｃｙのメルカプト基のアルキル化
は、ヨード酢酸、４−ビニルピリジン、４−（アミノス
ルフォニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサ
ジアゾール{4-(Aminosulfonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzox
adiazole；以下「ＡＢＤ−Ｆ」と表記する}、アンモニ
ウム ７−フルオロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジア
ゾール−４−スルフォネート（Ammonium 7-fluorobenzo
-2-oxa-1,3-diazole-4-sulfonate；以下「ＳＢＤ−Ｆ」
と表記する）等のアルキル化試薬を用いて、例えば、新
生化学実験講座 第１巻 タンパク質II 一次構造（第１
版 東京化学同人１９９０年発行）７７〜８０ページ記
載の方法、Toyo'okaらの方法［Anal. Chem.57, 1931-19
37(1985)］、Treuheitらの方法［Anal. Biochem. 212,
138-142(1993)］に従って実施することができる。

【００４８】なお、メルカプト基のアルキル化は、該メ
ルカプト基が酸化されている場合には進行しないので、
このような場合には、トリ−ｎ−ブチルフォスフィン、
ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール等の還
元剤を用いてメルカプト基に還元する必要がある。

【００４９】例えば、還元による遊離化処理とＨｃｙ化
タンパク質分離工程を経て得た全分離タンパク質をアル
キル化する場合には、該分離工程中にメルカプト基が酸
化されてしまう可能性があるので、これに還元剤を０．
１〜１００ｍＭ添加し、１５℃〜７０℃で０．５〜２時
間放置することで還元し、次いで、アルキル化剤を０．
１〜１Ｍ添加し、１０〜７０℃で０．５〜１８時間放置
することでメルカプト基のアルキル化を行うことができ
る。また、例えば、還元による遊離化処理に引き続いて
アルキル化を行う場合は、遊離化処理によって調製した
被検体にアルキル化剤を０．１〜１Ｍ添加し、１０〜７
０℃で０．５〜１８時間放置することでメルカプト基の
アルキル化を行うことができる。なお、メルカプト基の
アルキル化を行う場合は、メルカプト基に特異的に反応
がおこるようにするために、反応液のｐＨを８〜９の範
囲に保つことが必要である。この目的のためには、０．
０１〜５Ｍの緩衝液を使用するればよい。緩衝液の種類
としては、ｐＨ８〜９で緩衝能が高いものであれば、公
知の緩衝液が制限なく使用できる。好適に使用できる緩
衝液を例示すれば、トリス塩酸緩衝液、ほう酸緩衝液等
が挙げられる。

【００５０】アルキル化剤として４−ビニルピリジン、
ＡＢＤ−Ｆ、ＳＢＤ−Ｆを使用する場合は、還元剤とし
てトリ−ｎ−ブチルフォスフィンを用いれば、還元とア
ルキル化が同時に行え、操作を簡便にできる。この場合
は、終濃度０．１〜１Ｍとなるようにアルキル化剤を添
加し、次いで還元剤を終濃度０．１〜１００ｍＭとなる
ように添加し、１５〜７０℃で０．５〜１８時間放置し
反応させれば、ほぼ完全に両反応を行なうことができ
る。

【００５１】２．選択的ペプチド切断法 （１）エドマン分解法 該方法では、遊離のα−アミノ基を持つアミノ酸のみを
タンパク質から切断するので、Ｈｃｙ化タンパク質か
ら、ＰＢ−Ｈｃｙ（誘導体）を遊離させることができ
る。なお、該方法では同時にタンパク質本来のＮ末端ア
ミノ酸も遊離する。

【００５２】該方法では、先ず、トリエチルアミン存在
下にＨｃｙ化タンパク質のＰＢ−Ｈｃｙのアミノ基にフ
ェニルイソチオシアネート（「ＰＩＴＣ」ともいう）を
反応させ、フェニルチオカルバモイル化（ＰＴＣ化）す
る。次いで、これにトリフルオロ酢酸を加えて酸性にし
てアミノチアゾリノン化（ＡＴＺ化）し、遊離させる。

【００５３】なお、遊離したＡＴＺ化されたＨｃｙは、
ヘプタン−酢酸エチル（１：５）またはベンゼン−アセ
トニトリル（２：１）等で抽出し、トリフルオロ酢酸、
塩酸等の酸を添加することによって、フェニルチオヒダ
ントイン化（ＰＴＨ化）することもできる。

【００５４】また、ＰＩＴＣの代わりに、例えば、新生
化学実験講座 第１巻 タンパク質II一次構造（第１版
東京化学同人１９９０年 発行）１８２〜１９４ページ
に記載されている４−ジメチルアミノアゾベンゼン−
４'−イソチオソアネートのようなＰＩＴＣ誘導体を使
用し、同様の操作によりエドマン分解を行うことができ
る。この場合には、使用したＰＩＴＣ誘導体により修飾
されたＨｃｙが遊離する。

【００５５】エドマン分解法を採用する場合も、酸又は
アルカリ加水分解を行なうときと同じ理由により、予め
Ｈｃｙのメルカプト基を保護しておくのが好ましい。

【００５６】（２）ＰＢ−Ｈｃｙのペプチド結合を特異
的に切断する酵素を用いる方法 該方法は、例えば、Ｈｃｙ化タンパク質中のアミノ酸残
基のアミノ基とＨｃｙのα−カルボキシル基との間で形
成されたペプチド結合を特異的に切断する酵素を利用す
ることにより実施できる。このような性質の酵素は、例
えば、微生物、植物、動物組織などの抽出液を合成Ｈｃ
ｙ化タンパク質に作用させ、酵素活性をスクリーニング
することにより得ることができる。

【００５７】ＰＢ−Ｈｃｙ遊離工程においては上述した
ような種々の分解法が使用できるが、定量性、簡便性の
点から、全ペプチド切断法を採用するのが好適であり、
なかでも確実にほぼ全てのペプチド結合を切断できると
いう点で、塩酸を用いた方法を採用するのが特に好適で
ある。

【００５８】本発明の測定方法では前記ＰＢ−Ｈｃｙ遊
離工程において得られたＰＢ遊離Ｈｃｙ等の量を測定す
る。ＰＢ遊離Ｈｃｙ等の定量測定は、ＰＢ−Ｈｃｙ遊離
工程で得られた他の分解生成物（他のアミノ酸）の中か
らＰＢ遊離Ｈｃｙ等を分離し、定量する（このような工
程を「ＰＢ遊離Ｈｃｙ等定量工程」ともいう。）ことに
より実施される。

【００５９】例えば、(i)ＰＢ−Ｈｃｙ遊離工程におい
て酵素を用いた方法を採用した場合には、ＰＢ遊離Ｈｃ
ｙ等としてＨｃｙ又はホモシステイン酸を、(ii)アルキ
ル化によりホモシステインのメルカプト基の保護を行な
いＰＢ−Ｈｃｙ遊離工程を行なった場合は、使用したア
ルキル化試薬の種類に応じて、Ｓ−カルボキシメチルＨ
ｃｙ、Ｓ−４−ピリジルエチルＨｃｙ、Ｓ−ＡＢＤ−Ｈ
ｃｙ、Ｓ−ＳＢＤ−Ｈｃｙ等、およびこれらのＰＴＨ誘
導体（エンドマン分解法を採用した場合）を、(iii)酸
化によりホモシステインのメルカプト基の保護を行ない
ＰＢ−Ｈｃｙ遊離工程を行なった場合は、ホモシステイ
ン酸またはホモシステイン酸のＰＴＨ誘導体（エンドマ
ン分解法を採用した場合）を分離、定量すればよい。

【００６０】ＰＢ−Ｈｃｙ遊離工程で得られた他の分解
生成物（すなわち、他のアミノ酸およびその誘導体等）
との混合物の中からＰＢ遊離Ｈｃｙ等を分離する方法と
しては、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフ
ィー、電気泳動等の公知の方法が特に制限なく利用でき
る。これら方法の中でも、操作の簡便性、分析の容易
さ、定量値の正確さなどから、液体クロマトグラフィ
ー、特に液体カラムクロマトグラフィーを採用するのが
好適である。

【００６１】液体カラムクロマトグラフィーとしては、
イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロ
マトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、等
電点カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラム
クロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ー等が挙げられる。分離に使用するカラムは、市販の充
填済みカラムが何ら制限なく使用できる。また、市販の
クロマトグラフィー担体をカラムに充填し、使用しても
よい。カラムの材質としては特に制限はなく、例えば、
ガラス製、プラスチック製、ステンレス製等のカラムが
使用できる。

【００６２】しかしながら、ＰＢ遊離Ｈｃｙ等の種類に
よって分離に適したクロマトグラフィーがあるので、実
際の測定に際しては、ＰＢ遊離Ｈｃｙ等の種類に応じて
適したクロマトグラフィーを適宜選択すればよい。例え
ば、比較的疎水性の高いＳ−ＡＢＤ−ＨｃｙとＳ−ＳＢ
Ｄ−Ｈｃｙ、及びメルカプト基が保護されたＨｃｙのＰ
ＴＨ誘導体を分離するときには逆相カラムクロマトグラ
フィーを採用するのが好適であり、Ｈｃｙ、ホモシステ
イン酸、Ｓ−カルボキシメチルＨｃｙ、Ｓ−ピリジルエ
チルＨｃｙを分離するときには、逆相カラムクロマトグ
ラフィー又はイオン交換カラムクロマトグラフィーを採
用するのが好適である。

【００６３】また、液体カラムクロマトグラフィーを実
施する際の、カラムへの送液方法は、ポンプを用いずに
静水圧差によって行ってもよいし、ポンプを使用しても
よい。高性能ポンプを搭載した専用装置を使用し、いわ
ゆる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分
離を行うと、短時間に分析ができ、自動化も容易であ
る。被検体の分解産物を各種カラムクロマトグラフィー
によって粗精製し、夾雑物をある程度除去した後にＨＰ
ＬＣにより分析し、ＨＰＬＣによる定量を容易にするこ
ともできる。

【００６４】また、ＰＢ遊離Ｈｃｙ等の分離には、アフ
ィニティーカラムクロマトグラフィーを利用することも
できる。例えば、新生化学実験講座 第１２巻 分子免疫
学III抗原・抗体・補体（第１版 東京化学同人１９９２
年発行）１〜３１ページ記載の方法により、各ＰＢ遊離
Ｈｃｙ等の種類に応じてそれらに特異的な抗体を作製
し、当該抗体を、例えば新生化学実験講座 第１巻 タン
パク質I 分離・精製・性質（第１版 東京化学同人１９
９０発行）２１４〜２５７ページ記載の方法に従って、
抗体が結合したアフィニティー担体を調製し、アフィニ
ティーカラムクロマトグラフィーを実施することで分離
することができる。このとき、抗体作製を容易にするた
めに、ＰＢ遊離Ｈｃｙ等のアミノ基またはカルボキシル
基を修飾し抗原性の高い化合物を結合させ、これを抗原
として特異的な抗体を調製し、アフィニティーカラムク
ロマトグラフィー担体を調製することもできる。

【００６５】このような方法により分離されたＰＢ遊離
Ｈｃｙ等の検出・定量には、公知の方法が何ら制限なく
利用できる。すなわち、吸光度、蛍光、或いは発光の測
定、質量分析、又は電気化学的方法等の公知の方法の中
からＰＢ遊離Ｈｃｙ等の種類に応じて好適な方法を適宜
選択して採用すればよい。

【００６６】例えば、Ｈｃｙはメルカプト基をもつの
で、Malinowらの方法［Circulation,79, 1180-1188(198
9)］と同様に、金−水銀電極を用いた電気化学検出器に
より検出することができる。なお、この検出器によれば
遊離のメルカプト基を特異的に検出することができる。

【００６７】また、メルカプト基が保護されたＨｃｙ、
メルカプト基が保護されたＨｃｙのＰＴＨ誘導体を検出
・定量する場合には、保護剤に特異的な吸光度や蛍光が
あれば、この性質を利用してこれらを定量することがで
きる。保護剤由来の吸光度や蛍光をモニターすれば、保
護剤の結合していない他のアミノ酸は検出されないの
で、液体クロマトグラフィーによる分離が不十分であっ
てもメルカプト基の保護されたＨｃｙの定量が可能にな
る。ただし、Ｃｙｓのメルカプト基もＨｃｙと同様に保
護されるので、ＣｙｓとＨｃｙの分離だけは完全に行わ
なければならない。

【００６８】このようなＰＢ遊離Ｈｃｙ等の検出に利用
できる保護剤を例示すると、４−ビニルピリジン、ＡＢ
Ｄ−Ｆ、ＳＢＤ−Ｆ等が挙げられる。Ｓ−ピリジルエチ
ルＨｃｙは２５４ｎｍに特異的な吸収があり、Ｓ−ＡＢ
Ｄ−ＨｃｙとＳ−ＳＢＤ−Ｈｃｙは蛍光（励起 ３８０
ｎｍ、発光 ５００〜５１０ｎｍ）を発する。特に、Ｓ
−ＡＢＤ−ＨｃｙとＳ−ＳＢＤ−Ｈｃｙは強力な蛍光を
発するので、高感度測定が可能である。また、エドマン
分解の結果生じるメルカプト基が保護されたＨｃｙのＰ
ＴＨ誘導体は、ＰＴＨ誘導体に特異的な吸収（２６９ｎ
ｍ）をモニターすることによっても検出、定量すること
ができる。

【００６９】また、新生化学実験講座 第１巻 タンパク
質II 一次構造（第１版 東京化学同人１９９０年発行）
３０〜５３ページに記載されているアミノ酸分析のよう
に、検出容易な標識物でＰＢ遊離Ｈｃｙ等を標識し、こ
れを検出・定量する方法も好適に採用できる。具体的に
は、イオン交換カラムによってアミノ酸を分離し、ニン
ヒドリン、ｏ−フタルアルデヒド等アミノ酸標識剤によ
りアミノ酸を標識しこれを検出・定量する所謂ポストカ
ラム法、又はｏ−フタルアルデヒドやフェニルイソチオ
シアネート等の標識剤により予めアミノ酸を誘導体化し
た後に逆相カラムで分離し、標識物を検出・定量する所
謂プレカラム法が好適に採用できる。

【００７０】液体カラムクロマトグラフィーによりＰＢ
遊離Ｈｃｙ等を分離し、これを検出・定量する場合に
は、操作の簡便性、正確性という観点から、“ＰＢ遊離
Ｈｃｙ等の種類、クロマトグラフィー法、および検出・
定量法との組み合わせ”としては、ＰＢ遊離Ｈｃｙ等が
Ｈｃｙであり、分離法が逆相カラムクロマトグラフィー
あり、電気化学検出器により検出・定量する組合わせ；
ＰＢ遊離Ｈｃｙ等がＳ−ＡＢＤ−ＨｃｙまたはＳ−ＳＢ
Ｄ−Ｈｃｙであり、分離法が逆相カラムクロマトグラフ
ィーであり、蛍光をモニターすることで検出・定量する
組合わせ等が好適である。

【００７１】本発明の測定方法では、このようにして測
定されたＰＢ遊離Ｈｃｙ等の量に基づいて被検体中、ひ
いては原被検体中に存在するＰＢ−Ｈｃｙの量を決定す
る。該ＰＢ−Ｈｃｙ量の決定は、実際の操作手順に則し
て、前記したＨｃｙ化タンパク質分離工程におけるＨｃ
ｙ化タンパク質の回収率、ＰＢ−Ｈｃｙ遊離工程におけ
るＰＢ遊離Ｈｃｙ等の遊離効率、およびＰＢ遊離Ｈｃｙ
等定量工程に供したサンプルの使用量（より具体的に
は、全サンプル量に対する分析に実際に使用したサンプ
ル量の割合）を考慮して行なえばよい。また、原被検体
中のＰＢ−Ｈｃｙの量は、さらに被検体を調製する際の
希釈率や濃縮率等を考慮することにより簡単に決定する
ことができる。

【００７２】血漿を原被検体とし、ＰＢ−Ｈｃｙ量を測
定する場合を具体例として、以下説明する。

【００７３】すなわち、先ず、一定量のヒト血漿（例え
ばタンパク質量 ０．１〜１０ｍｇ）を原被検体とし、
これを還元アルキル化で使用する緩衝液（ｐＨ８〜９）
で平衡化したゲル濾過カラムでゲル濾過し、遊離Ｈｃｙ
等の低分子量成分を除去し、タンパク質画分を回収す
る。次いで回収されたタンパク質画分にＡＢＤ−Ｆまた
はＳＢＤ−Ｆを添加し、次いで、トリ−ｎ−ブチルフォ
スフィンを添加し、一定時間放置し、ジスルフィド結合
の切断とメルカプト基の保護を行い、被検体を調製す
る。次いで、ゲル濾過により被検体から遊離Ｈｃｙ等
（ジスルフィド結合でタンパク質に結合していたＨｃ
ｙ）を除去し、タンパク質画分（全分離タンパク質）を
回収する。回収した全分離タンパク質に塩酸を添加し、
減圧下封管後加熱しタンパク質成分の全ペプチド結合を
加水分解する。次いで、この分解物の全量を逆相ＨＰＬ
Ｃで分析し、蛍光をモニターすることで、Ｓ−ＡＢＤ−
ＨｃｙまたはＳ−ＳＢＤ−Ｈｃｙを検出・定量する。こ
の場合、Ｈｃｙ化タンパク質分離工程におけるＨｃｙ化
タンパク質の回収率とＰＢ−Ｈｃｙ遊離工程におけるＰ
Ｂ遊離Ｈｃｙ等の遊離効率はほぼ１００％であるので、
原被検体から被検体を調製する際の希釈率を考慮して、
原被検体中のＰＢ−Ｈｃｙ量を決定する。

【００７４】また、上記方法で測定されるＰＢ−Ｈｃｙ
量から決定される、ヒト血漿中のＰＢ−Ｈｃｙ濃度は、
後述する実施例で示されるように、既に動脈硬化症の危
険因子として使用されている血中総Ｈｃｙ濃度と高度に
相関する。また、腎症患者を対象に上記方法と同様にし
て測定されたＰＢ−Ｈｃｙ濃度は、健常者のそれに比べ
て有意に高いことが明らかになった。従って、ペプチド
結合によりタンパク質に結合したＨｃｙは動脈硬化症の
危険因子又は、腎症マーカーとして使用できることが実
証された。

【００７５】また、本発明者らが本発明の測定方法に基
づいて、ヒト血漿についてＰＢ−Ｈｃｙ濃度の測定を行
なったところ、ＰＢ−Ｈｃｙ濃度は血漿中のタンパク質
濃度に比べて著しく低いことから、ヒト血漿中のＨｃｙ
化タンパク質には１分子につき１分子のＰＢ−Ｈｃｙが
結合していることが明らかとなった。したがって、Ｈｃ
ｙ化タンパク質濃度もＰＢ−Ｈｃｙ濃度と同様に動脈硬
化症の危険因子及び、腎症マーカーとして使用できるこ
とが確認された。

【００７６】なお、Ｈｃｙ化タンパク質は、特異的抗体
を用いた方法、または各種液体カラムクロマトグラフィ
ー等のような公知の方法により測定することも可能であ
る。

【００７７】特異的抗体を用いた測定法に使用されるＨ
ｃｙ化タンパク質特異的抗体は、例えば、Fergusonら
［J. Lipid Res., 39, 925-933(1998)］のように、試験
管内でタンパク質とホモシステインチオラクトン（Ｈｃ
ｙＴ）を反応させて合成したＨｃｙ化タンパク質をウサ
ギに注射して調製することができる。または、抗体の調
製を容易にするために、ＰＢ−Ｈｃｙのメルカプト基を
修飾し、抗原性を高めたＨｃｙ化タンパク質誘導体を抗
原とし、当該Ｈｃｙ化タンパク質誘導体特異的抗体を調
製することもできる。

【００７８】特異的抗体を用いた測定方法としては、例
えば、新生化学実験講座 第１２巻分子免疫学III 抗原
・抗体・補体（第１版 東京化学同人１９９２年発行）
３３〜１１７ページ、または、酵素免疫測定法（第３版
医学書院 １９８７年発行）記載のラテックス凝集法、
ラジオイムノアッセイ法、エンザイムイムノアッセイ
法、蛍光イムノアッセイ法、化学発光イムノアッセイ法
等を挙げることができる。

【００７９】Ｈｃｙ化タンパク質の定量に使用する各種
液体カラムクロマトグラフィーとしては、例えば、イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマト
グラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、等電点
カラムクロマトグラフィー等が挙げられる。Ｈｃｙ化タ
ンパク質の検出は、紫外部（２０５〜２８０ｎｍ）での
吸光度によって実施してもよいし、例えば、同仁化学研
究所総合カタログ（第２１版）２４４〜２７７ページ記
載の、市販の各種ラベル化剤によりタンパク質をラベル
し検出してもよい。

【００８０】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明は以下の実施例によって限定されるもので
はない。

【００８１】実施例１［アルブミン中のＰＢ−Ｈｃｙの
測定］ 原被検体としてヒト血液中の主要なタンパク質であるア
ルブミンを含有する液使用し、ＰＢ−Ｈｃｙの測定を行
った。

【００８２】（１）［Ｓ−ＡＢＤ−Ｈｃｙの合成］ １００μｍｏｌのＤＬ−ホモシステイン（シグマ社）を
３ｍｌの純水に溶解し、トリエチルアミンでｐＨを８．
５に調整した。９０μｍｏｌのＡＢＤ−Ｆ（同仁化学研
究所）を１ｍｌのアセトニトリルに溶解し、このＡＢＤ
−Ｆ溶液を全量ホモシステイン溶液に加え、よく混合
し、トリエチルアミンでｐＨを８以上に調整した。６０
℃で２０分間反応させた後、反応液を逆相ＨＰＬＣにて
分離し、Ｓ−ＡＢＤ−Ｈｃｙを分取した。質量分析によ
り目的物の純度検定と同定を行った。逆相ＨＰＬＣの条
件は以下の通りである。

【００８３】ポンプ：６００Ｅ マルチソルベントシス
テム（ウオーターズ） カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ １００ ＲＰ−１８（4.
6×250mm関東化学） 溶媒Ａ：０．０９％トリフルオロ酢酸（以下ＴＦＡと表
記する場合がある） 溶媒Ｂ：０．０７５％ＴＦＡ，８０％アセトニトリル 溶出：０−２８％溶媒Ｂ／２５分 流速：１ｍｌ／分 検出：蛍光（励起 ３８０ｎｍ、発光 ５００ｎｍ）。

【００８４】（２）［アルブミンのメルカプト基のＡＢ
Ｄ−Ｆによる保護］ ０．７９９ｍｌの０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）と２ｍＭ エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）
を含む１００ｍＭ ほう酸緩衝液（ｐＨ８．２）、０．
１ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（シグマ
Ａ３７８２）溶液 、０．１ｍｌの４０ｍＭ ＡＢＤ−Ｆ
溶液（ジメチルホルムアミドに溶解)、０．００１ｍｌ
の０．５Ｍ トリ−ｎ−ブチルフォスフィン溶液(ジメチ
ルホルムアミドで希釈)を混合し、総容量１ｍｌの反応
液を調整した。この反応液を６０℃で３０分間保温し、
アルブミンのメルカプト基とＡＢＤ−Ｆを反応させ、被
検体を調製した。反応終了後、２０ｍｌの０．０５％Ｓ
ＤＳで平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャムファル
マシアバイオテク社）で被検体をゲル濾過し、遊離Ｈｃ
ｙ等（ジスルフィド結合でタンパク質に結合していたＨ
ｃｙ）と過剰の試薬を除去した。ＰＤ−１０によるカラ
ム操作は以下のように行った。１ｍｌの試料をアプライ
し、次いで１．５ｍｌの０．０５％ＳＤＳをアプライ
し、これらの部分の溶出液を廃棄した。２ｍｌの０．０
５％ＳＤＳをアプライし、この時の溶出液（全分離タン
パク質）を回収した。

【００８５】（３）［塩酸によるアルブミンの加水分
解］ 全分離タンパク質（２ｍｌ）に２ｍｌの１２Ｎ塩酸を分
注し、減圧下に封管した。これを１１０℃で２０時間加
熱して全ペプチド結合を加水分解した。

【００８６】（４）［Ｓ−ＡＢＤ−ＨｃｙのＨＰＬＣに
よる分析］ 加水分解後の溶液を試験管に移し、試験管エバポレータ
ー（ＴＶＥ１０００、東京理化器械社）で乾固した。乾
固した試料に１ｍｌの純水を加えて溶解させ、再度エバ
ポレーターで乾固した。同様の操作をもう一度行った
後、２ｍｌの純水に溶解させた試料を小試験管に移し、
遠心濃縮機で乾固した。これに０．５ｍｌの０．０９％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え良く懸濁し、遠心
式フィルター（０．２２μｍ）を用いて、５０００ｒｐ
ｍで1分間遠心することで不溶物を除去し、逆相ＨＰＬ
Ｃにて分離定量した。カラムはＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ
１００ＲＰ−１８（４．６×２５０ｍｍ，関東化学社）
とＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（４．６×２５０ｍ
ｍ，ジーエルサイエンス社）を使用した。溶媒Ａ(０．
０９％ ＴＦＡ)で平衡化したカラムに試料を吸着させ、
溶媒Ｂ(０．０７５％ ＴＦＡ、８０％アセトニトリル)
の濃度を直線的に増加させ（０−２８％溶媒Ｂ／２５
分）、１ｍｌ／分の流速で溶出を行った。Ｓ−ＡＢＤ−
Ｈｃｙは蛍光（励起３８０ｎｍ、発光５００ｎｍ）によ
りモニターした。試料の分析に先立ち、合成Ｓ−ＡＢＤ
−Ｈｃｙを分析し、各逆相カラムでのＳ−ＡＢＤ−Ｈｃ
ｙの溶出位置を確かめた｛図１（カラム：Ｌｉｃｈｒｏ
ｓｏｒｂ １００ＲＰ−１８）、図２（カラム：Ｉｎｅ
ｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２）｝。

【００８７】合成Ｓ−ＡＢＤ−Ｈｃｙと同じ溶出条件
で、試料をＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ １００ＲＰ−１８で
分離し、約２８分のピークを分取した（図３）。この画
分を遠心濃縮機で乾固し、溶媒Ａに溶解し、次にＩｎｅ
ｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２で分離した。（図４）図中矢印
で示したピークがＳ−ＡＢＤ−Ｈｃｙである。このピー
クの同定と純度検定は、ピークを分取し、プレラベル法
のアミノ酸分析と各種逆相ＨＰＬＣにより実施した。

【００８８】Ｓ−ＡＢＤ−Ｈｃｙ量はピーク面積から算
出した。計算には合成Ｓ−ＡＢＤ−Ｈｃｙにより作製し
た検量線を使用した。この結果、３０ｎｍｏｌのアルブ
ミンには０．０３ｎｍｏｌのＰＢ−Ｈｃｙが含まれるこ
とが明らかとなった。即ち、０．１％のアルブミンに、
Ｈｃｙがペプチド結合により結合していることが判明し
た。

【００８９】実施例２［ヒトプール血漿中のＰＢ−Ｈｃ
ｙの測定］ 市販のヒトプール血漿(コスモバイオ社７１２−１０)を
原被検体として、ＰＢ−Ｈｃｙの測定を行った。

【００９０】（１）［血漿中の遊離Ｈｃｙ等の除去］ ＰＤ−１０カラムを２０ｍｌの０．５％ＳＤＳと２ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ ほう酸緩衝液（ｐＨ８．
２）で平衡化した。このカラムを用いて、ヒトプール血
漿１ｍｌをゲル濾過し、血漿溶液を調製した。この操作
により、遊離Ｈｃｙ等が除去できる。ＰＤ−１０のカラ
ム操作は実施例１の（２）と同様に行った。

【００９１】（２）［血漿タンパク質のＡＢＤ−Ｆによ
るメルカプト基の保護］ アルブミン溶液のかわりに実施例２（１）で調製した血
漿溶液を使用する他は実施例１（２）と同様にして、血
漿タンパク質のメルカプト基のＡＢＤ−Ｆによる保護を
実施し、被検体を調製した。反応終了後、実施例１
（２）と同様の方法にて遊離Ｈｃｙ等（ジスルフィド結
合でタンパク質に結合していたＨｃｙ）と過剰の試薬を
除去し、全分離タンパク質（２ｍｌ）を回収した。実施
例１（３）と同様の方法にて全分離タンパク質の塩酸に
よる酸加水分解を実施した。

【００９２】（３）［ＨＰＬＣによるＳ−ＡＢＤ−Ｈｃ
ｙの分析］ 実施例１（４）と同様の方法で、血漿中に含まれるＰＢ
−Ｈｃｙ量を測定した。Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ １００
ＲＰ−１８で分離し、約２８分のピークを分取し（図
５）、次にＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２で分離した
（図６）。図中矢印で示したピークがＳ−ＡＢＤ−Ｈｃ
ｙである。ピーク面積から算出されたＳ−ＡＢＤ−Ｈｃ
ｙ量は２５ｐｍｏｌであった。これは被検体１ｍｌ中に
含まれるＰＢ−Ｈｃｙ量であるので、被検体中のＰＢ−
Ｈｃｙ濃度は０．０２５μＭであることが分かった。被
検体の調製の際に原被検体は２０倍希釈されているの
で、原被検体、すなわち、ヒトプール血漿のＰＢ−Ｈｃ
ｙ濃度は０．５μＭであることが明らかとなった。

【００９３】実施例３［食事のＰＢ−Ｈｃｙ定量値への
影響］ 健常者（１５名）と人工透析を受けている腎症患者（１
０名）から、空腹時（１２時間以上絶食）と、食後２〜
６時間後に採血し、血漿を調製した。これらの血漿を原
被検体とし、実施例２と同様の方法にて血漿中のＰＢ−
Ｈｃｙ濃度の測定を行った（表１）。ＰＢ−Ｈｃｙ濃度
は空腹時と食後でほとんど変化がなく、ＰＢ−Ｈｃｙ濃
度は食事の影響を受けないことが明らかとなった。

【００９４】

【表１】

【００９５】実施例４［健常者血漿と腎症患者血漿中の
ＰＢ−Ｈｃｙの測定］ 健常者血漿（５０検体）と人工透析を受けている腎症患
者血漿（３２検体）を原被検体とし、実施例２と同様の
方法にてＰＢ−Ｈｃｙの測定を行った（図７）。ＰＢ−
Ｈｃｙの測定に使用した血漿は、採血前に特に絶食はし
ていない。本発明の測定方法により測定されたＰＢ−Ｈ
ｃｙ濃度は腎症患者群で健常者の値に比べ高濃度を示す
ことが明らかとなった。

【００９６】実施例５［血中総Ｈｃｙ濃度と血中ＰＢ−
Ｈｃｙ濃度の相関関係］ 実施例４と同じ被験者（健常者５０名、腎症患者３２
名）より、空腹時（１２時間以上絶食）に採血して血漿
を調製し、抗体法（ホモシステインＥＩＡキット、バイ
オラッド社 Ｍ１９４−５３６１）により血中総Ｈｃｙ
を測定した。血中総Ｈｃｙ濃度と、実施例４で測定した
ＰＢ−Ｈｃｙ濃度との相関を示す（図８）。図８から明
らかなように、両者の間には非常に良好な相関関係が見
られた。

【００９７】比較例１［食事の総Ｈｃｙ定量値への影
響］ 健常者（１５名）と人工透析を受けている腎症患者（１
０名）から、空腹時（１２時間以上絶食）と、食後２〜
６時間後に採血し、血漿を調製した。実施例５と同様の
方法にて、血漿中の総Ｈｃｙ濃度を測定した（表２）。
総Ｈｃｙ濃度は食事の影響を受け、食後では正確に測定
できなかった。

【００９８】

【表２】

【００９９】これらの結果から、たとえ食後であって
も、本発明の測定方法を使用すれば、高Ｈｃｙ患者を正
確に見分けることが証明された。また、ＰＢ−Ｈｃｙ濃
度は、動脈硬化症の危険因子である従来法で測定された
血中総Ｈｃｙ濃度と高度に相関するので、ＰＢ−Ｈｃｙ
濃度も動脈硬化症の危険因子として使用できることが明
らかとなった。

【０１００】

【発明の効果】本発明により、ヒト血液中にＰＢ−Ｈｃ
ｙ及びＨｃｙ化タンパク質が存在することが確認され、
これらの量を測定することが可能となったばかりでな
く、血液中のＰＢ−Ｈｃｙ及びＨｃｙ化タンパク質濃度
が腎症マーカーまたは動脈硬化症の危険因子として有用
であることが明らかとなった。さらに、これら濃度は、
被験者の食事の影響を受け難いことも明らかとなり、本
発明の測定法方によれば空腹時血漿を用いなくても高Ｈ
ｃｙ患者を正確に見分ける事が可能となる。

【０１０１】このように、本発明は、臨床検査の上で有
用な新たな項目、およびその測定方法を提供するもので
あり、その意義は大きい。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本図は合成Ｓ−ＡＢＤ−Ｈｃｙを逆相ＨＰＬ
Ｃにて分析したときの溶出プロフィールである。

【図２】 本図は合成Ｓ−ＡＢＤ−Ｈｃｙを逆相ＨＰＬ
Ｃにて分析したときの溶出プロフィールである。

【図３】 本図はアルブミンのメルカプト基をＡＢＤ−
Ｆにより保護した後、酸加水分解し、この加水分解物を
逆相ＨＰＬＣにて分析したときの溶出プロフィールであ
る。

【図４】 本図は図３で分取したピークを逆相ＨＰＬＣ
にて分析したときの溶出プロフィールである。

【図５】 本図は市販のヒトプール血漿中に含まれるタ
ンパク質のメルカプト基をＡＢＤ−Ｆにより保護した
後、酸加水分解し、この加水分解物を逆相ＨＰＬＣにて
分析したときの溶出プロフィールである。

【図６】 本図は図５で分取したピークを逆相ＨＰＬＣ
にて分析したときの溶出プロフィールである。

【図７】 本図は健常者と腎症患者の血漿中のＰＢ−Ｈ
ｃｙ濃度を測定した結果である。

【図８】 本図はＰＢ−Ｈｃｙ濃度と従来の方法で測定
された総Ｈｃｙ濃度との相関図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペプチド結合でホモシステインが結合し
   たタンパク質、遊離したホモシステイン及び／又は低分
   子量ホモシステイン誘導体を含む被検体から、遊離した
   ホモシステイン及び低分子量ホモシステイン誘導体を除
   去してペプチド結合でホモシステインが結合したタンパ
   ク質を分離した後、分離された当該タンパク質を分解し
   てホモシステイン又はその誘導体を得、次いで得られた
   ホモシステイン又はその誘導体の量を測定し、その測定
   値に基づいて被検体中に存在するタンパク質にペプチド
   結合で結合したホモシステインの量を決定することを特
   徴とするペプチド結合でタンパク質に結合したホモシス
   テインの測定方法。
2. 【請求項２】 ペプチド結合でホモシステインが結合し
   たタンパク質、遊離したホモシステイン及び／又は低分
   子量ホモシステイン誘導体、並びにジスルフィド結合で
   ホモシステインが結合したタンパク質を含む原被検体か
   ら、遊離したホモシステイン及び低分子量ホモシステイ
   ン誘導体を除去する工程、及び該工程を経た原被検体中
   のジスルフィド結合でホモシステインが結合したタンパ
   ク質から当該ホモシステインを不可逆的に遊離させる工
   程を含む調製方法により調製された被検体を用いる請求
   項１記載のペプチド結合でタンパク質に結合したホモシ
   ステインの測定方法。
3. 【請求項３】 ペプチド結合でホモシステインが結合し
   たタンパク質、遊離したホモシステイン及び／又は低分
   子量ホモシステイン誘導体、並びにジスルフィド結合で
   ホモシステインが結合したタンパク質を含む原被検体中
   のジスルフィド結合でホモシステインが結合したタンパ
   ク質から当該ホモシステインを不可逆的に遊離させて得
   た被検体を用いる請求項１記載のペプチド結合でタンパ
   ク質に結合したホモシステインの測定方法。
4. 【請求項４】 ペプチド結合でホモシステインが結合し
   たタンパク質を分解する前に、当該ホモシステインのメ
   ルカプト基を保護することを特徴とする請求項１乃至請
   求項３の何れか一つに記載のペプチド結合でタンパク質
   に結合したホモシステインの測定方法。
5. 【請求項５】 ペプチド結合でタンパク質に結合したホ
   モシステインの動脈硬化症危険因子、又は腎症マーカー
   としての使用。
6. 【請求項６】 ペプチド結合でホモシステインが結合し
   たタンパク質の動脈硬化症危険因子、又は腎症マーカー
   としての使用。