JP2014508297A - ポリソルベートの測定方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
本発明は、
(a) サンプルにアルカリ加水分解をおこなう工程;
(b) アルカリ加水分解の後にサンプルを中和する工程;
(c) 場合により中和されたサンプルから変性した沈殿物を除去する工程;
(d) 場合により濾過されたサンプルにチオシアナト金属錯体の水性混合物を加えて、ソルビタンポリオキシエチレンチオシアナト金属錯体を形成する工程;
(e) 工程(d)において形成された前記ソルビタンポリオキシエチレンチオシアナト金属錯体を水非混和性有機溶媒中に抽出する工程;
(f) 工程(e)において得られた抽出物の吸光度を測定して、工程(d)において形成された前記ソルビタンポリオキシエチレンチオシアナト金属錯体の量を定量する工程;および
(g) 工程(f)において定量された前記ソルビタンポリオキシエチレンチオシアナト金属錯体の量からサンプル中に含有されるポリソルベートの量を計算する工程
を含む、タンパク質を含有するサンプル中のポリソルベートの測定方法に関する。
使用したすべての化学物質は、他に記載しない限り分析グレードのものであった。NaOH、96%酢酸、硝酸コバルト六水和物(Co(NO3)2・6H2O)、塩化メチレン(Lichrosolv(商標))、Triton(商標)X-100、リン酸トリ-n-ブチル(TNBP)およびチオシアン酸アンモニウム(NH4SCN)はMerck(ドイツ)より購入した。ウシ由来ならびに植物供給源由来の2つのロットのポリソルベート80(Tween(商標)80)はICI(米国)より購入した。1%(w/v)の含有量を有する界面活性剤の水溶液は、調製した後分析に使用した。
400 mg/L = 400 ppm未満のポリソルベート含有量を有する標準または対照の1 mlのサンプルが入ったポリプロピレン管の中に、0.5 mlの10 M NaOHを加えた。溶液を沸騰水浴中に60±10分間保持した。室温に冷却した後、アルカリ加水分解物を0.5 mlの10 M酢酸を用いて、pH試験紙(Merck、ドイツ)でpHをチェックすることにより、約7〜8のpHに中和した。中和の後、サンプルを30分以上に渡って室温に保持した。タンパク質溶液に依存して沈殿が発生し、それをMinisart 0.22μmフィルターを用いて濾過により除去した後、比色定量法をおこなった。1 mg/mL未満のタンパク質含有量を有するサンプルは、手順中に起こり得るプラスチック表面への非特異的吸着に起因する分析物の損失を回避するために加水分解の前にアルブミン溶液と混合した。200 mg/mlの濃度を有する0.1 mlのヒトアルブミン溶液を1 mlの各サンプルに加えることが、ポリソルベート80の非特異的損失の防止に効果的であることが証明された。このサンプルの希釈はサンプルのポリソルベート濃度を計算する際に考慮に入れなければならない。
比色定量は以下のようにしておこなった。簡単に述べると、本質的にタンパク質を含まない、1 mlの中和されたタンパク質加水分解物またはポリソルベート水溶液を、3 mlのチオシアナトコバルト酸試薬と混合した。この試薬は、蒸留水中に溶解した3 %(w/v)Co(NO3)2・6H2Oおよび20%(w/v)NH4SCNを含有し、毎日新しく調製された。次に、2 mlの塩化メチレンを加えた。激しく振盪した後、20〜25℃で少なくとも30分間、相を分離させた。最後に、塩化メチレン相を、スクリューキャップ付きキュベットに入れ、320 nmで、塩化メチレンブランクに対して分光光度法で測定した。
10〜400 ppmのポリソルベート80の範囲をカバーする標準希釈を分析することにより、アッセイを較正した。これらの標準溶液は、タンパク質溶液にポリソルベート水溶液を添加することにより調製した。本明細書に記載される加水分解条件はこれまでに試験したあらゆるタンパク質溶液の影響を実質的に破壊するので、全血漿を含む任意のタンパク質溶液が好適であるはずである。しかしながら、同様なもの同士を比較するという原則に従って、対象とされる溶液と可能な限り類似している血漿タンパク質溶液を選択した。そこで、10〜400 ppmのポリソルベート80の範囲をカバーする(濃度5、10、20、50、100、200および400 ppmを含む)標準曲線を、発生的PCCを用いて構築し、アッセイをおこなう場合ごとに二回ずつ分析した。
適切な加水分解時間を確立するために、ポリソルベート80の比色定量を実質的に妨害することが既に知られているタンパク質マトリックスとして発生的aPCC(活性化プロトロンビン複合体濃縮物)を選択した。このマトリックスは本質的に界面活性剤を含有しないが、エタノールを用いる沈殿によるタンパク質除去の試みの後にこの溶液の分析をおこなうと、偽陽性反応が観察された。約25 mg/mlのタンパク質濃度を有するこのマトリックス(プロトロンビン、インター-α-トリプシン阻害剤、補体、およびビトロネクチンなどの広いスペクトルの異なる血漿タンパク質を含有する)に、100 ppmのポリソルベート80を添加した。アルカリ加水分解を、前記の通りに、サンプルを15〜120分間沸騰水浴中に保持して実施した。さらなる工程を上記の通りにおこなった。
方法の検証のための公式ガイドライン(Official guidelines for method validation)は、分析手順の正確さは真の値と実測値との間の一致の近さを表すと定義する。分析法の正確さを評価するためのいくつかのアプローチが存在する。血漿タンパク質の存在下でのポリソルベート80に対する認定された参照物質は存在しないので、ブランク標準試料に既知の濃度の分析物を添加するアプローチに従った。この関連するタンパク質溶液への添加のアプローチは、アッセイに対するタンパク質の影響が既に知られているために選択された。ポリソルベート80の定量に適用される方法が120℃で15時間加熱することを含む全アルカリ加水分解よりも強度が低い場合には、第一級、第二級および第三級構造の違いにより、アルカリ処理に対するタンパク質の抵抗性がかなり異なる可能性がある。
分析方法の検証のための公式ガイドラインによれば、方法の精度は、一連のサンプルの複数回の定量の個々の試験結果が一致する程度であり、一方、分析手段の直線性は、サンプル中の分析物の濃度と直接比例する試験結果を得るその能力を表す。アッセイのこれらの本質的性能パラメーターを説明するために、発生的PCC中に100 ppmのポリソルベート80を有する対照サンプルを使用した。分析の結果を図2に示す。対照サンプルの21回の測定を用いて、サンプルの平均は、アッセイ間およびアッセイ内精度に関して、それぞれ4.0%および3.7%の相対標準偏差(sd)を有した。両方の偏差はAOACにより与えられた推奨(100 ppmの分析物の同日中または別の日の測定の精度について5.3%が推奨される)に適合している。21の測定のうち1回のみ標準偏差の2倍と定められる範囲に入らない値が得られたが、この値も平均±3 sdの範囲に含まれた。図表はまた、エラーバーにより示されるアッセイ内変動を示す。さらに、アッセイの精度を20 ppmの濃度で研究して、3.0%の値が得られた。不活性化プロセスの間に採取された150 gポリソルベート80/Lの高濃度を有するサンプルの分析をおこなって、2.9%(n = 6)の平均標準偏差を得た。これにより、この方法がウイルス不活性化法の間に起こる高濃度を測定するのにも適していることが確認された。
ポリソルベート80の起源が分析の成績に影響を与えるかどうかを評価するために、植物およびウシ供給源から得たバッチを比較した。両方の形態を、上記のタンパク質溶液の存在下で、同じアルカリ加水分解手順の後に分析した。さらに、タンパク質が存在しない状態で、サンプルの前処理なしでチオシアナトコバルト酸試薬による比色定量をおこない、それにより、タンパク質を除去するための仮のエタノール沈殿の後に存在する条件を模倣した。
密接に関連する界面活性剤のイソオクチルフェノールポリオキシエチレンエーテル(Triton(商標)X-100)ならびに溶媒のリン酸トリ-n-ブチル(TNBP)(どちらも確立されたウイルス不活性化のための溶媒-界面活性剤法に含まれる)に関するアッセイの選択性を研究した。Triton(商標)X-100およびポリソルベート80を含有する水溶液を、比色定量の選択性を評価するためにアルカリ加水分解をおこなわずに分析した。さらに、Triton(商標)X-100、ポリソルベート80およびTNBPを1:0.3:0.3%(w/v)の比で含有する三成分溶媒-界面活性剤不活性化混合物の反応を、アルカリ加水分解の後に、ポリソルベート80溶液と比較した。ここでも、およそ25 mg/mlのタンパク質濃度を有する発生的aPCCをタンパク質マトリックスとして使用した。最後に、アルカリ加水分解によるサンプル前処理の後のアッセイに対する非常に高濃度のTriton X-100の影響を、タンパク質の存在下および非存在下の両方で評価した。この実験のために、100、300、1000、2000、5000および10000 ppmのTriton(商標)X-100濃度を適用した。
上記の異なる加水分解時間による実験の結果(実施例4を参照されたい)は、以前にエタノールによるタンパク質沈殿の適用によりポリソルベート濃度の明白な過大評価を起こすことが示された特定のタンパク質溶液の影響を減少させるのに、15分間の短さのアルカリ処理が既に十分であることを示した。電荷および大きさが異なる多くのタンパク質と共に、ポリソルベート80を、タンパク質マトリックスの実質的な影響なしで分析することができた(実施例5を参照されたい)。特に、50μgポリソルベート80/mLを、約50 mg/mlのタンパク質濃度のオロソムコイド(α1-酸糖タンパク質)中で99%の回収率で定量することができた。この非常に酸性度の高いタンパク質が何の影響もなく分析できたという事実は、アルカリ加水分解によるサンプル前処理の適合性を証明している。さらに、脂肪酸と結合することが周知のタンパク質であるアルブミン中のポリソルベート80を測定することにも困難はなかった。ポリソルベート80は分子あたり平均1個の脂肪酸残基を有するので、親油性部分のアルブミンへの結合が起こり得る。それにも関わらず、アルブミン中の回収率は、この点において何の懸念も生じさせなかった。
Claims (17)
- (a) サンプルにアルカリ加水分解をおこなう工程;
(b) アルカリ加水分解の後にサンプルを中和する工程;
(c) 場合により中和されたサンプルから変性した沈殿物を除去する工程;
(d) 場合により濾過されたサンプルにチオシアナト金属錯体の水性混合物を加えて、ソルビタンポリオキシエチレンチオシアナト金属錯体を形成する工程;
(e) 工程(d)において形成された前記ソルビタンポリオキシエチレンチオシアナト金属錯体を水非混和性有機溶媒中に抽出する工程;
(f) 工程(e)において得られた抽出物の吸光度を測定して、工程(d)において形成された前記ソルビタンポリオキシエチレンチオシアナト金属錯体の量を定量する工程;および
(g) 工程(f)において定量された前記ソルビタンポリオキシエチレンチオシアナト金属錯体の量からサンプル中に含有されるポリソルベートの量を計算する工程
を含む、タンパク質を含有するサンプル中のポリソルベートの測定方法。 - ポリソルベートがポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(ポリソルベート80)である、請求項1に記載の方法。
- ポリソルベート80が動物起源である、請求項2に記載の方法。
- ポリソルベート80が植物起源である、請求項2に記載の方法。
- 工程(d)において加えられるチオシアナト金属錯体がCo(NO3)2・6H2OとNH4SCNとの水性混合物であり、形成されるソルビタンポリオキシエチレンチオシアナト金属錯体がソルビタンポリオキシエチレンチオシアナトコバルト(II)酸錯体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水性混合物が、約3%(w/v)のCo(NO3)2・6H2Oおよび約20%(w/v)のNH4SCNを含有する、請求項5に記載の方法。
- サンプルがさらにイソオクチルフェノールポリオキシエチレンエーテル(Triton(商標)X-100)を含有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- サンプルがさらにリン酸トリ-n-ブチル(TNBP)を含有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)におけるアルカリ加水分解が、NaOH、KOH、LiOH、Ba(OH)2、Sr(OH)2、Ca(OH)2、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウム、水酸化テトラプロピルアンモニウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、および同種または異種の置換基により置換された水酸化第四級アルキルアンモニウムおよび水酸化第四級シクロアルキルアンモニウムからなる群より選択されるアルカリ試薬による加水分解を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)におけるアルカリ加水分解が、約80℃〜約100℃の範囲の温度で15分以上に渡っておこなわれる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)におけるアルカリ加水分解が、3 N以上のNaOHによる、約95℃〜約100℃の温度での45分以上に渡る加水分解を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(c)において使用されるフィルターがポリオキシエチレンソルビタンに結合しない、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(e)において使用される水非混和性有機溶媒が、塩化メチレン、クロロホルム、o-ジクロロベンゼン、ブロモホルム、およびトリクロロエチレンからなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 水非混和性有機溶媒が塩化メチレンである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(e)において得られた抽出物の吸光度を、工程(f)において約324 nmで測定する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、工程(a)の後、工程(b)の前に、
(a2) アルカリ加水分解後のサンプルを冷却する
工程を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。 - さらに、工程(b)の後、工程(c)の前に、
(b2) 変性した沈殿物を形成させるために、サンプルを30分以上に渡って室温に保持する
工程を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
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