CN111610324B - 一种ripa裂解液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种RIPA裂解液，包括如下原料：NP‑40、NaCl、Tris‑HCl、SDS、脱氧胆酸盐、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、β‑巯基乙醇。本发明还提供了一种RIPA裂解液的制备方法。本发明所述的RIPA裂解液，通过各成分的配合，能更好的兼顾蛋白溶解率与蛋白的稳定，以便提取到的蛋白质在后续的免疫沉淀分析中，可有效地形成抗原抗体免疫复合物。

Description

一种RIPA裂解液及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种RIPA裂解液及其制备方法。
背景技术
RIPA为英文Radio Immunoprecipitation Assay的简称，即放射性免疫沉淀法分析，RIPA裂解液是为开展免疫沉淀法分析而对蛋白质进行抽提的试剂。
现有的RIPA裂解液中，选用不同的去垢剂对蛋白质进行提取。其中，去垢剂过于温和时，无法达到较好的蛋白溶解率，蛋白质提取效率较低。而以SDS作为强离子型去垢剂与脱氧胆酸盐配合使用，则可以达到较好的蛋白质溶解率，因此，含有SDS的RIPA裂解液得到广泛的应用。但是，SDS的使用会对后续的免疫沉淀分析产生较大影响，使抗原抗体免疫复合物的形成受到抑制。
鉴于此，目前亟待提出一种RIPA裂解液，能更好的兼顾蛋白溶解率与蛋白的稳定，以便提取到的蛋白质在后续的免疫沉淀分析中，可有效地形成抗原抗体免疫复合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种RIPA裂解液，以解决蛋白溶解率与蛋白的稳定无法兼顾的问题。
为了解决上述问题，本发明提供一种RIPA裂解液，包括如下原料：NP-40、NaCl、Tris-HCl、SDS、脱氧胆酸盐、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、β-巯基乙醇。
优选地，所述的RIPA裂解液，由各原料组分与纯化水混合而成；各原料组分的终浓度如下：
NP-40为0.7-1.2％；
NaCl为130-210mmol/L；
Tris-HCl为40-60mmol/L；
SDS为0.8-1.2％；
脱氧胆酸盐为0.3-0.7％；
泊洛沙姆为0.1-0.5％；
聚山梨醇酯为1-5％；
β-巯基乙醇为3-5％。
需要说明的是，上述百分号均代表质量百分比。
进一步优选地，各原料组分的终浓度如下：
NP-40为1％；
NaCl为150mmol/L；
Tris-HCl为50mmol/L；
SDS为1％；
脱氧胆酸盐为0.5％；
泊洛沙姆为0.3％；
聚山梨醇酯为2％；
β-巯基乙醇为4％。
优选地，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188。所述Tris-HCl的pH值为8.0。
本发明还提供一种所述的RIPA裂解液的制备方法，包括如下步骤：按用量取NP-40、NaCl、Tris-HCl、SDS、脱氧胆酸盐、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、β-巯基乙醇，将其与纯化水混合均匀而成。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明所述的RIPA裂解液，包括如下原料：NP-40、NaCl、Tris-HCl、SDS、脱氧胆酸盐、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、β-巯基乙醇。通过各成分的配合，能更好的兼顾蛋白溶解率与蛋白的稳定，以便提取到的蛋白质在后续的免疫沉淀分析中，可有效地形成抗原抗体免疫复合物。
其中，各成分作用如下：
NP-40为Nonidet P 40的缩写，中文名称为乙基苯基聚乙二醇，是一种温和的非离子型去垢剂，与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定，尤其适用于蛋白的非变性条件下的溶解。
SDS，中文名称为十二烷基硫酸钠，为强离子型去垢剂，可将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，有效增加蛋白的溶解。
脱氧胆酸盐，为去垢剂，与SDS、NP-40配合，使蛋白被释放出来。
NaCl可保证整个蛋白提取过程中接近于生理盐水的浓度。
Tris-HCl是三(羟甲基)氨基甲烷与盐酸配置形成的缓冲液，可防止pH的大幅度变化，保障裂解在适宜的pH值环境下进行。
泊洛沙姆，为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，可与蛋白产生交联作用，对交联的蛋白形成包裹，避免强离子型去垢剂SDS对蛋白结构的破坏，保障蛋白的稳定。同时，泊洛沙姆具有的部分亲水性的聚氧丙烯链段，使得交联的蛋白的亲水性增强，从而促进蛋白在裂解液中的分散与溶解。泊洛沙姆作为非离子表面活性剂，还可以与NP-40产生协同效应，共同促进蛋白质的溶解。
聚山梨醇酯，为非离子型表面活性剂，可以防止溶解蛋白之间产生非特异性吸附，可以使分散溶解的蛋白，随着时间推移不发生非特异性吸附。同时，聚山梨醇酯具有一定的粘度，与泊洛沙姆配合，可以共同对蛋白起到保护作用。
β-巯基乙醇，具有弱还原作用，可以防止蛋白被氧化而失活。
具体实施方式
本发明各实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。各实施例中所用原料均为市场购得。不同厂家、型号的原料并不影响本发明技术方案的实施及技术效果的实现。
实施例1
本实施例的RIPA裂解液，由各原料组分与纯化水混合而成；各原料组分的终浓度如下：
NP-40的质量百分比为1.2％；
NaCl为210mmol/L；
Tris-HCl为60mmol/L；
SDS的质量百分比为1.0％；
脱氧胆酸盐的质量百分比为0.3％；
泊洛沙姆的质量百分比为0.1％；
聚山梨醇酯的质量百分比为1％；
β-巯基乙醇的质量百分比为4％。
其中，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188；所述Tris-HCl的pH值为8.0。所述聚山梨醇酯为吐温-20。需要说明的是，上述百分号均代表质量百分比。
所述RIPA裂解液的制备方法如下：按用量取NP-40、NaCl、Tris-HCl、SDS、脱氧胆酸盐、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、β-巯基乙醇，将其与纯化水混合均匀而成。
实施例2
本实施例的RIPA裂解液，由各原料组分与纯化水混合而成；各原料组分的终浓度如下：
NP-40的质量百分比为0.7％；
NaCl为275mmol/L；
Tris-HCl为40mmol/L；
SDS的质量百分比为0.8％；
脱氧胆酸盐的质量百分比为0.5％；
泊洛沙姆的质量百分比为0.3％；
聚山梨醇酯的质量百分比为5％；
β-巯基乙醇的质量百分比为5％。
其中，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188；所述Tris-HCl的pH值为8.0。所述聚山梨醇酯为吐温-20。需要说明的是，上述百分号均代表质量百分比。
所述RIPA裂解液的制备方法如下：按用量取NP-40、NaCl、Tris-HCl、SDS、脱氧胆酸盐、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、β-巯基乙醇，将其与纯化水混合均匀而成。
实施例3
本实施例的RIPA裂解液，由各原料组分与纯化水混合而成；各原料组分的终浓度如下：
NP-40的质量百分比为1.0％；
NaCl为130mmol/L；
Tris-HCl为50mmol/L；
SDS的质量百分比为1.2％；
脱氧胆酸盐的质量百分比为0.7％；
泊洛沙姆的质量百分比为0.5％；
聚山梨醇酯的质量百分比为3％；
β-巯基乙醇的质量百分比为3％。
其中，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188；所述Tris-HCl的pH值为8.0。所述聚山梨醇酯为吐温-20。需要说明的是，上述百分号均代表质量百分比。
所述RIPA裂解液的制备方法如下：按用量取NP-40、NaCl、Tris-HCl、SDS、脱氧胆酸盐、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、β-巯基乙醇，将其与纯化水混合均匀而成。
实施例4
本实施例的RIPA裂解液，由各原料组分与纯化水混合而成；各原料组分的终浓度如下：
NP-40的质量百分比为1％；
NaCl为150mmol/L；
Tris-HCl为50mmol/L；
SDS的质量百分比为1％；
脱氧胆酸盐的质量百分比为0.5％；
泊洛沙姆的质量百分比为0.3％；
聚山梨醇酯的质量百分比为2％；
β-巯基乙醇的质量百分比为4％。
其中，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188；所述Tris-HCl的pH值为8.0。所述聚山梨醇酯为吐温-20。需要说明的是，上述百分号均代表质量百分比。
所述RIPA裂解液的制备方法如下：按用量取NP-40、NaCl、Tris-HCl、SDS、脱氧胆酸盐、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、β-巯基乙醇，将其与纯化水混合均匀而成。
对比例1
本对比例的RIPA裂解液，由各原料组分与纯化水混合而成，采用与实施例4相同的原料组分配比，并采用相同的制备方法得到。与实施例4相比，区别仅在于：不包括泊洛沙姆。
对比例2
本对比例的RIPA裂解液，由各原料组分与纯化水混合而成，采用与实施例4相同的原料组分配比，并采用相同的制备方法得到。与实施例4相比，区别仅在于：不包括聚山梨醇酯。
对比例3
本对比例的RIPA裂解液，由各原料组分与纯化水混合而成，采用与实施例4相同的原料组分配比，并采用相同的制备方法得到。与实施例4相比，区别仅在于：不包括β-巯基乙醇。
对比例4
本对比例的RIPA裂解液，由各原料组分与纯化水混合而成，采用与实施例4相同的原料组分配比，并采用相同的制备方法得到。与实施例4相比，区别仅在于：不包括SDS。
对比例5
本对比例的RIPA裂解液，由各原料组分与纯化水混合而成，采用与实施例4相同的原料组分配比，并采用相同的制备方法得到。与实施例4相比，区别仅在于：泊洛沙姆的质量分数为1％。
对比例6
本对比例的RIPA裂解液，由各原料组分与纯化水混合而成，采用与实施例4相同的原料组分配比，并采用相同的制备方法得到。与实施例4相比，区别仅在于：泊洛沙姆的质量分数为0.05％。
对比例7
本对比例的RIPA裂解液，由各原料组分与纯化水混合而成，采用与实施例4相同的原料组分配比，并采用相同的制备方法得到。与实施例4相比，区别仅在于：不包含NP-40。
效果试验例
为验证本发明所述的RIPA裂解液的技术效果，按照实施例1-4、对比例1-7中的配方制备得到裂解液，并进行以下实验：
实验一、
取细胞样品，均分为12份，其中，1份作为空白对照组，另外10份为实验组。分别向11个实验组的细胞样品中加入等量的实施例1-4、对比例1-7中的配方制备得到裂解液，向1个空白对照组的细胞样品中加入等量的水，混合均匀，将11个实验组及1个空白对照组的混合液置于冰上裂解30min，然后以12000rpm的转速，在4℃下离心20min，吸取上清液作为抽提产物。将抽提产物稀释10倍后，分别用紫外分光光度计进行浓度检测，测试结果如下：
序号 OD值 蛋白浓度(μg/μl)
实施例1 2.2304 14.09
实施例2 2.1741 13.76
实施例3 2.2014 13.92
实施例4 2.3225 14.63
对比例1 1.6553 10.72
对比例2 1.7662 11.37
对比例3 2.1587 13.67
对比例4 0.7355 5.33
对比例5 1.4266 9.38
对比例6 1.6706 10.81
对比例7 1.5102 9.87
空白对照组 0.0342 1.22
根据上述结果可知：
(1)相较于本申请的实施例1-4中测得的蛋白浓度，不含有SDS的对比例4，裂解后蛋白浓度最低，由此可见，缺少强离子型去垢剂，对蛋白溶解影响较大；
(2)相较于本申请的实施例1-4中测得的蛋白浓度，不含有泊洛沙姆的对比例1，蛋白浓度有所下降；加入过量泊洛沙姆的对比例5，相较于对比例1蛋白浓度反而略有下降；加入少量泊洛沙姆的对比例6，蛋白浓度与对比例1相差不大；由此可见，泊洛沙姆在适量的范围内才能起到促进蛋白溶解的作用，过多反而造成蛋白溶解效果下降，过少则起不到相应效果；
(3)不含有聚山梨醇酯的对比例2、不含有β-巯基乙醇的对比例3，蛋白浓度仅仅略有下降；说明聚山梨醇酯、β-巯基乙醇对蛋白溶解的促进作用有限。
(4)不含有NP-40的对比例7，相较于包含泊洛沙姆、NP-40的本申请的实施例1-4中测得的蛋白浓度较低，NP-40本身虽具有促进蛋白溶解的作用，但是与泊洛沙姆协同使用时，对于蛋白的溶解具有显著提高的作用。
实验二、
取上述实验一得到的11个实验组及1个空白对照组的抽提产物，进行免疫共沉淀实验：
(1)将12组细胞裂解后的抽提产物扩大至1ml体系，加入30μl protein G/A-plusagarose beads进行预处理，4℃缓慢转动60min。
(2)在4℃、3000rpm下，离心5min，将上清转移至新的离心管中。
(3)加入1-5μg单克隆抗体，4℃缓慢转动4h以上。
(4)加入30μl protein G/A-plus agarose beads，4℃缓慢转动4h以上。
(5)4℃，5000rpm离心5min，弃上清。
(6)用漂洗液漂洗beads 10min。
(7)4℃，5000rpm离心5min，弃上清。
(8)重复步骤(6)-(7)，共计洗5次。
(9)沉淀中加30μl 2×SDS缓冲液，100℃变性10min，3000rpm离心1min。
(10)SDS-PAGE电泳后用相应抗体进行检测。
得到的沉淀物即抗原抗体免疫复合物，用Western blotting进行分析，得到检测结果，检测结果中条带的颜色越深，表明抗原抗体结合的量越多。采用Image J软件量化Western blot检测结果中条带的灰度值，本实验中的灰度值是通过Image J软件将图像每个像素点的颜色分为0-255，共256级，每一像素点对应的数值即灰度，灰度值越小表明条带颜色越深，最小值为0，即纯黑；最大值为255，即纯白。
其实验结果如下：
序号 灰度值
实施例1 42
实施例2 37
实施例3 26
实施例4 13
对比例1 169
对比例2 123
对比例3 63
对比例4 199
对比例5 79
对比例6 152
对比例7 66
空白实验组 236
由上述实验结果可以看出：
(1)相较于本申请的实施例1-4中测得的灰度值，不含有SDS的对比例4，由于裂解后蛋白浓度最低，因此，灰度值较大，除空白实验组外，形成的抗原抗体免疫复合物也最少；
(2)相较于本申请的实施例1-4中测得的灰度值，不含有泊洛沙姆的对比例1，灰度值也较大，形成的抗原抗体免疫复合物较少；加入过量泊洛沙姆的对比例5，形成的抗原抗体免疫复合物相对较多；加入少量泊洛沙姆的对比例6，与对比例1相差不大；由此可见，泊洛沙姆对于保护蛋白结构，促进抗原抗体免疫复合物的形成具有明显作用；
(3)相较于本申请的实施例1-4中测得的灰度值，不含有聚山梨醇酯的对比例2灰度值较大，说明其对于保护蛋白结构，促进抗原抗体免疫复合物的形成具有一定的作用；而实施例1-4以及对比例3、5、7中，泊洛沙姆、聚山梨醇酯同时存在，其测得的灰度值均优于缺少泊洛沙姆、聚山梨醇酯之一的对比例1、2，以及含有少量泊洛沙姆的对比例6；由此可见，泊洛沙姆、聚山梨醇酯配合使用时，对于更好地保护蛋白，进而形成抗原抗体免疫复合物，能取得较好的效果。
(4)相较于本申请的实施例1-4中测得的灰度值，不含有β-巯基乙醇的对比例3，抗原抗体免疫复合物的形成略差。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种RIPA裂解液，其特征在于，由各原料组分与纯化水混合而成；
各原料组分的终浓度如下：
NP-40为0.7-1.2％；
NaCl为130-210mmol/L；
Tris-HCl为40-60mmol/L；
SDS为0.8-1.2％；
脱氧胆酸盐为0.3-0.7％；
泊洛沙姆为0.1-0.5％；
聚山梨醇酯为1-5％；
β-巯基乙醇为3-5％。
2.根据权利要求1所述的RIPA裂解液，其特征在于，各原料组分的终浓度如下：
NP-40为1％；
NaCl为150mmol/L；
Tris-HCl为50mmol/L；
SDS为1％；
脱氧胆酸盐为0.5％；
泊洛沙姆为0.3％；
聚山梨醇酯为2％；
β-巯基乙醇为4％。
3.根据权利要求1所述的RIPA裂解液，其特征在于，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188；所述Tris-HCl的pH值为8.0。
4.一种权利要求1-3中任意一项所述的RIPA裂解液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：按用量取NP-40、NaCl、Tris-HCl、SDS、脱氧胆酸盐、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、β-巯基乙醇，将其与纯化水混合均匀而成。
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