RU2670965C9 - Способ измерения количества полисорбата-80 с применением щелочного гидролиза образца с последующей вэжх - Google Patents
Способ измерения количества полисорбата-80 с применением щелочного гидролиза образца с последующей вэжх Download PDFInfo
- Publication number
- RU2670965C9 RU2670965C9 RU2017143908A RU2017143908A RU2670965C9 RU 2670965 C9 RU2670965 C9 RU 2670965C9 RU 2017143908 A RU2017143908 A RU 2017143908A RU 2017143908 A RU2017143908 A RU 2017143908A RU 2670965 C9 RU2670965 C9 RU 2670965C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- optimally
- polysorbate
- paragraphs
- sample
- minutes
- Prior art date
Links
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 title claims abstract description 46
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 title claims abstract description 46
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 11
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 claims abstract description 19
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 5
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- PBWZKZYHONABLN-UHFFFAOYSA-N difluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)F PBWZKZYHONABLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 claims description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- YXMVRBZGTJFMLH-UHFFFAOYSA-N butylsilane Chemical compound CCCC[SiH3] YXMVRBZGTJFMLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- FPLYNRPOIZEADP-UHFFFAOYSA-N octylsilane Chemical compound CCCCCCCC[SiH3] FPLYNRPOIZEADP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LXQCYGJKOIEWBN-UHFFFAOYSA-N pentylsilane Chemical compound CCCCC[SiH3] LXQCYGJKOIEWBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229960002224 eculizumab Drugs 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000000603 anti-haemophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способам количественного определения полисорбата-80 в растворах терапевтических белков и к способам быстрой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Способ определения концентрации полисорбата-80 в образце, содержащем белок или гликопротеин, включающий проведение щелочного гидролиза проб, отличается тем, что после проведения щелочного гидролиза проводят анализ образца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме в течение 13-30 минут, при скорости потока фазы 0,02-5,0 мл/мин, с объемным соотношением компонентов водно-ацетонитрильной подвижной фазы в диапазоне от 30/70 до 15/95, длина колонки составляет от 30 до 300 мм, размер пор сорбента составляет от 1,7 до 5,0 мкм, детектирование аналита ведется в УФ-области спектра в диапазоне длин волн 190-220 нм, и идентификация продукта реакции производится путем хроматографирования аналитического стандарта олеиновой кислоты с регистрацией времени удерживания ее пика. 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 табл., 4 пр.
Description
Изобретение относится к способам количественного определения полисорбата-80 в растворах терапевтических белков и к способам быстрой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Предложенный способ позволяет значительно сократить время проведения анализа и повысить его чувствительность за счет применения изократической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Полисорбат-80 - один из самых популярных детергентов, предотвращающий агрегацию белка и обладающий выраженной противовирусной активностью. По этой причине его часто добавляют в полупродукты и готовые формы препаратов на основе терапевтических белков. Содержание полисорбата-80 в составе лекарственного средства должно тщательно контролироваться в связи с его склонностью к деградации.
Из уровня техники известны следующие способы решения задачи контроля содержания полисорбата-80 в продуктах: документы WO 2012119724, CN 103403544 и ЕР 2681553 раскрывают способы, включающие проведение щелочного гидролиза проб, дериватизацию продуктов гидролиза полисорбата-80 путем присоединения хромофорных меток, и последующего количественного определения полисорбата-80 оптическими способами (например, спектрофотометрией). Недостатком данного подхода можно считать необходимость предварительного осаждения белковой фракции, длительность и сложность пробоподготовки, а также высокую погрешность метода. Документ CN 101943684 раскрывает количественный анализ полисорбата-80 без гидролиза и дериватизации путем обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ-детектированием сигнала. Недостатками метода являются низкие специфичность и чувствительность, а также относительно большая длительность хроматографии. Если принять во внимание необходимость проведения щелочного гидролиза образца, наиболее близким к предлагаемому способу может быть назван способ, раскрытый в документе WO 2012119724. От известного способа предложенный в настоящей заявке метод отличается тем, что после проведения щелочного гидролиза проводят анализ образца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме, детекция аналита ведется с помощью УФ-детектора, и идентификация продукта реакции производится путем хроматографирования аналитического стандарта олеиновой кислоты с регистрацией времени удерживания ее пика.
В целом, известные подходы, основанные на хроматографическом анализе интактного полисорбата-80, характеризуются недостатками, связанными с необходимостью предварительного осаждения белковой фракции, а также необходимостью использования дополнительных детекторов: испарительного светорассеяния, заряженного аэрозоля; невысокой чувствительностью, нелинейной зависимостью между количеством введенного вещества и откликом детектора. Недостатки подходов, связанных с предварительным проведением щелочного гидролиза полисорбата-80 с последующим присоединением хромофорной метки и
спектрофотометрическим анализом, заключаются в необходимости проведения стадий предварительного осаждения белковой фракции и присоединения метки, что отрицательно сказывается на длительности пробоподготовки и всего анализа.
Основными проблемами в количественном анализе полисорбата-80 является его полимерная природа и отсутствие хромофорных групп, что, во-первых, требует большой длительности применяемых методик хроматографического анализа как для самого полисорбата-80, так и для его характеристических производных, а во-вторых, ведет к высокому уровню ошибок при определении концентрации полисорбата-80 спектрофотометрическим методом.
Для решения проблем количественного анализа полисорбата-80 автор изобретения взял за основу способ щелочного гидролиза, совместив его с высокоэффективной жидкостной хроматографией, во время которой проводится определение количества аналита с помощью УФ-детектора. Тем самым удалось избавиться от стадий осаждения белковой фракции и дериватизации гидролизата. Применение изократического элюирования и короткой колонки позволило сократить время хроматографического анализа, повысить его чувствительность, снизить требования к хроматографической системе и расход подвижной фазы. Применение УФ-детектора в предложенном способе дает значительные преимущества в чувствительности и производительности по сравнению с применением метода ВЭЖХ в сочетании с ELS-детектором: ориентировочный предел детектирования в случае ELS-детектора составляет порядка 1.2 мкг полисорбата-80 против 25 нг в предложенном способе; общая длительность пробоподготовки составляет порядка 1,5 часов против 6 часов для ELS-детектора, а время получения одной хроматограммы составляет 5 минут (против диапазона от 13 до 30 минут, в зависимости от колонки, для ELS). Нелинейное изменение отклика ELS-детектора на ввод разных количеств полисорбата-80 усложняет построение калибровочной кривой и сужает аналитический диапазон метода. Требуется также большее количество образца для анализа: порядка 1 мл (против 0,2 мл у предложенного способа).
Снижение нижнего предела детектирования (LOD) и нижнего предела количественного обнаружения (LLOQ) было достигнуто, прежде всего, за счет минимального дрейфа базовой линии при изократическом режиме хроматографии. Высокая скорость потока и использование колонки с небольшим размером пор сорбента (в диапазоне от 1,7 до 5,0 мкм) позволяет получить узкую хроматографическую фракцию целевого компонента, а, следовательно, увеличить высоту пика, что также снижает пределы LOD и LLOQ. Установка длины волны УФ-детектора для снятия сигнала на уровне 200 нм определяет максимальное соотношение «сигнал : шум» в диапазоне от 190 до 210 нм, таким образом также улучшая параметры LOD и LLOQ.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Построение калибровочной линии на растворе стандартного образца полисорбата-80, конценрация 1 мг/мл.
Фиг. 2. Определение концентрации полисорбата-80 в испытуемых образцах.
Фиг. 3. Хроматографические профили 6 повторных инжекций Экулизумаба серии Р0002701 в разведении 1/10. Отмечены пики олеиновой кислоты.
Фиг. 4. Хроматографические профили 6 повторных инжекций Адалимумаба серии 011115 в разведении 1/100. Отмечены пики олеиновой кислоты.
Фиг. 5. Хроматографические профили первых инжекций модельных образцов полисорбата-80 в концентрации 0,025 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,75 мг/мл, 1,0 мг/мл, 1,25 мг/мл, 1,5 мг/мл. Отмечены пики олеиновой кислоты.
Материалы и методы.
Щелочной гидролиз.
Гидролиз полисорбата-80 проводят добавлением к 0,2 мл образца 0,2 мл 5М раствора КОН с последующей инкубацией в течение 30 минут при 85°C с получением характеристического продукта - олеиновой кислоты. По окончании инкубации к образцу дополнительно добавляют 0,1 мл 5М раствора KOH и 0,4 мл ацетонитрила. Смесь тщательно перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 минут на скорости 9300g. Затем отбирают 0,1 мл жидкости из верхнего слоя, добавляют к 0,0235 мл воды и перемешивают. Экстракт используют свежеприготовленным.
Хроматографический анализ проб
Анализ проводят с использованием хроматографической колонки с сорбентом на основе бутилсилана, пентилсилана, октилсилана или октодецилсилана, оптимально - октодецилсилана; размером пор от 1,7 до 5,0 мкм, предпочтительно от 1,7 до 3,5 мкм, оптимально - 1,8 мкм; внутренним диаметром 0,5-5,0 мм, предпочтительно - 1,0-3,0 мм, оптимально - 2,1 мм; длиной 30-300 мм, предпочтительно 30-75 мм, оптимально - 50 мм; с использованием водно-ацетонитрильной подвижной фазы с объемным соотношением компонентов в диапазоне от 30/70 до 15/95, соответственно, предпочтительно - 25/74-20/80, оптимально - 19/81; с добавкой объемной доли ион-парного реагента (дифторуксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, муравьиной кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты; предпочтительно - дифторуксусной или трифторуксусной кислоты, оптимально - трифторуксусной кислоты) в диапазоне 0,01-2%, предпочтительно - 0,05-0,5%, оптимально - 0,1% при скорости потока фазы 0,02-5,0 мл/мин; предпочтительно - 0,2-1,0 мл/мин, оптимально - 0,5 мл/мин; температуре термостата колонок от +15 до +50°C, предпочтительно - от +25 до +35°C, оптимально - при +30°C; временем регистрации хроматограммы от 1,0 до 20 минут, предпочтительно - 3,0-10,0 минут, оптимально - 5,0 минут на детекторе УФ/видимой области или диодной матрице в диапазоне длин волн 190-240 нм, предпочтительно - 195-205 нм, оптимально - 200 нм.
Идентификация целевого компонента (олеиновой кислоты).
Идентификация продукта реакции производится путем хроматографирования аналитического стандарта олеиновой кислоты с регистрацией времени удерживания ее пика и последующим сравнением его с временами удерживания хроматографических пиков в испытуемых образцах. Установление концентрации полисорбата-80 в исследуемом образце производят по методу внешней калибровки. Для этого вводят в хроматограф различные количества гидролизата полисорбата-80 того же производителя, что и в исследуемом образце, и строят линейную зависимость площади пика олеиновой кислоты от количества введенного гидролизата. Затем вводят значение площади пика олеиновой кислоты хроматограммы анализируемого образца в полученное уравнение зависимости и получают массовую концентрацию полисорбата-80 в пробе.
По результатам валидации методики была установлена следующая характеристика способа:
Нижний предел детектирования составляет 25 нг полисорбата-80 (125 ppb); нижний предел количественного определения - 100 нг полисорбата-80 (500 ppb).
Аналитический диапазон методики находится в границах 0,025-1,5 мг/мл полисорбата-80.
Степень извлечения находится в диапазоне 92,1-107,5%.
Максимальное значение коэффициента вариации (CV) 18 повторных определений, выполненных в течение 3 дней двумя различными операторами, характеризующего воспроизводимость методики, составляет 2,69%.
Пример 1. Количественное определение полисорбата-80 в образцах с различным содержанием модифицированного антигемофильного глобулина.
Оборудование: Система ВЭЖХ Alliance е2695, с детектором UV/Visible Detector 2489
Колонка: Zorbax Extend-C18 RRHT 2.1×50 mm 1.8 micron №USHBD05592
Параметры: Vкол=0.17 мл, Рmax=8700 psi; рН=2.0-11.5
Условия: Скорость потока: 0,5 мл/мин
Время и параметры регистрации хроматограммы: 5 мин
температура колонки = 30°C; температура образца = 25°C; □=200 нм
Подвижная фаза: 0,1% ТФУ в 81% ацетонитриле
Реагенты: 5М раствор KOH, исходный раствор полисорбата-80 с концентрацией 200,0 мг/мл, стандартный раствор полисорбата-80 с концентрацией 1,0 мг/мл.
Приготовление подвижной фазы: Смешать 202.5 мл ацетонитрила, 250 мкл трифторуксусной кислоты и довести до 250 мл водой очищенной.
Раствор олеиновой кислоты с концентрацией 1 мг/мл: 0,1 г олеиновой кислоты растворить в 90 мл смеси ацетонитрил : вода в соотношении 1:1, довести объем раствора до 100 мл смесью ацетонитрил : вода в соотношении 1:1
Испытуемый раствор / Стандартный раствор полисорбата-80. 0,2 мл испытуемого образца / стандартного раствора полисорбата-80 с концентрацией 1,0 мг/мл поместить в центрифужную микропробирку вместимостью 1,5 мл, добавить 0,2 мл 5 М раствора гидроксида калия, перемешать и инкубировать в течение 30±2 мин в термошейкере при температуре (85±0,2)°C.
По окончании инкубации к полученному раствору добавить 100 мкл 5 М раствора гидроксида калия, 400 мкл ацетонитрила, тщательно (в течение 20 секунд) перемешать на Вортекс V-1 plus и центрифугировать полученный раствор в течение 5 мин со скоростью 9300 g при температуре (22±0,1)°C. Далее, из приготовленных растворов перенести 100 мкл жидкости из верхнего слоя в пробирку вместимостью 1,5 мл, добавить 23,5 мкл воды и перемешать. Полученные таким образом холостой раствор / испытуемый раствор / Калибровочный раствор полисорбата-80 перенести в соответствующим образом промаркированные флаконы.
Процесс построения калибровочной линии проиллюстрирован на Фиг. 1. Определение концентрации полисорбата-80 в опытных образцах проиллюстрировано на Фиг. 2.
Пример 2. Определение предела количественного определения пика олеиновой кислоты
Анализировались разведения 1 серии лекарственного препарата (далее ЛП) Экулизумаб и 1 серии ЛП Адалимумаб по 6 инжекций каждого, начиная от 2 мкг/мл до рабочей концентрации ЛП.
Критерий оценки:
- Соотношение уровня сигнала к уровню шума для пика олеиновой кислоты должно быть ≥10:1 по крайней мере 5 раз из 6 повторов.
- RSD шести определений для ЛП Экулизумаб должно быть меньше или равно 7,5%, для ЛП Адалимумаб - меньше или равно 10,7%.
Результат:
Предел количественного определения пика олеиновой кислоты был определен как концентрации белков в ЛП Экулизумаб - 20 мкг/мл, что составляет 10% от рабочей концентрации, и в ЛП Адалимумаб - 10 мкг/мл, что составляет 1% от рабочей концентрации. Эти концентрации дают сигнал приблизительно в 10 раза больше, чем уровень шума.
Пример 3. Проверка линейности аналитического диапазона
Анализировались модельные образцы полисорбата-80 по 6 инжекций каждого, начиная от 0,025 до 1,5 мг/мл. По итогам эксперимента строили график зависимости заданной концентрации полисорбата-80 в модельных образцах от площади пика олеиновой кислоты и аппроксимировали его линейной функцией.
Критерий оценки:
Коэффициент детерминации (R2) линейной зависимости концентрации полисорбата-80 от площади пика олеиновой кислоты должен составлять ≥0,98 (что соответствует значениям модуля коэффициента корреляции r≥0,99).
Результаты представлены на Фиг. 5.
Полученное уравнение линейной функции: у=992428х-10538,
Коэффициент детерминации: 0.9998.
Вывод:
Зависимость заданной концентрации полисорбата-80 в модельных образцах от полученной площади пика олеиновой кислоты линейна, результаты соответствуют критериям оценки.
Пример 4. Проверка правильности метода.
Анализировались модельные образцы полисорбата-80 в диапазоне концентраций от 0,025 мг/мл до 1,5 мг/мл по 6 инжекций каждого. По полученным результатам рассчитывали коэффициент вариации (%R)
Анализировались модельные образцы полисорбата-80 по 6 инжекций каждого, начиная от 0,025 до 1,5 мг/мл. По калибровочной кривой, построенной с помощью стоковых растворов полисорбата-80 (0,2 мг/мл и 1,0 мг/мл) рассчитывали концентрацию полисорбата-80 в модельных образцах. По итогам определяли коэффициент вариации. Результаты представлены на Фиг. 5 и Таблице 6.
Для расчета концентрации полисорбата-80 в образце использовались калибровочные кривые, построенные с использованием стоковых растворов полисорбата-80 (0,2 и 1,0 мг/мл).
Степень извлечения, характеризующую способ, вычисляли по формуле
где R (Recovery) - выход, А - измеренное содержание, В - заданный (фактический) уровень.
Claims (11)
1. Способ определения концентрации полисорбата-80 в образце, содержащем белок или гликопротеин, включающий проведение щелочного гидролиза проб, отличающийся тем, что после проведения щелочного гидролиза проводят анализ образца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме в течение 13-30 минут, при скорости потока фазы 0,02-5,0 мл/мин, с объемным соотношением компонентов водно-ацетонитрильной подвижной фазы в диапазоне от 30/70 до 15/95, длина колонки составляет от 30 до 300 мм, размер пор сорбента составляет от 1,7 до 5,0 мкм, детектирование аналита ведется в УФ-области спектра в диапазоне длин волн 190-220 нм, и идентификация продукта реакции производится путем хроматографирования аналитического стандарта олеиновой кислоты с регистрацией времени удерживания ее пика.
2. Способ по п. 1, где используемый сорбент выбран из бутилсилана, пентилсилана, октилсилана или октодецилсилана, предпочтительно октодецилсилана.
3. Способ по любому из пп. 1, 2, где размер пор сорбента составляет предпочтительно от 1,7 до 3,5 мкм, оптимально 1,8 мкм.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где внутренний диаметр колонки составляет от 0,5 до 5,0 мм, предпочтительно от 1,0 до 3,0 мм, оптимально до 2,1 мм.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где длина колонки составляет предпочтительно от 30 до 75 мм, оптимально 50 мм.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где используют водно-ацетонитрильную подвижную фазу с объемным соотношением компонентов предпочтительно в диапазоне от 25/74 до 20/80, оптимально 19/81.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где к подвижной фазе добавляют ион-парный реагент, выбранный из дифторуксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, муравьиной кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты в объемной доле 0,01-2%, предпочтительно 0,05-0,5%, оптимально 0,1%.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где хроматография ведется при скорости потока фазы предпочтительно 0,2-1,0 мл/мин, оптимально 0,5 мл/мин.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где температура термостата колонок составляет от +15 до +50°С, предпочтительно от +25 до +35°С, оптимально при +30°С.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где время регистрации хроматограммы составляет от 1 до 20 минут, предпочтительно от 3 до 10 минут, оптимально 5 минут.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где детектирование проводят на детекторе УФ видимой области или диодной матрице предпочтительно в диапазоне волн 195-205 нм, оптимально 200 нм.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017143908A RU2670965C9 (ru) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | Способ измерения количества полисорбата-80 с применением щелочного гидролиза образца с последующей вэжх |
| PCT/RU2018/000602 WO2019117750A1 (ru) | 2017-12-14 | 2018-09-13 | Способ измерения количества полисорбата-80 с применением щелочного гидролиза образца с последующей вэжх |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017143908A RU2670965C9 (ru) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | Способ измерения количества полисорбата-80 с применением щелочного гидролиза образца с последующей вэжх |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2670965C1 RU2670965C1 (ru) | 2018-10-26 |
| RU2670965C9 true RU2670965C9 (ru) | 2018-11-21 |
Family
ID=63923623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017143908A RU2670965C9 (ru) | 2017-12-14 | 2017-12-14 | Способ измерения количества полисорбата-80 с применением щелочного гидролиза образца с последующей вэжх |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2670965C9 (ru) |
| WO (1) | WO2019117750A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2812788C1 (ru) * | 2023-07-05 | 2024-02-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России) | Определение полисорбата 80 в биологических лекарственных препаратах |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW202045927A (zh) * | 2019-02-27 | 2020-12-16 | 法商賽諾菲公司 | 以具內標之lc-ms於樣品中進行聚山梨醇酯定量之方法 |
| CN113049727B (zh) * | 2021-03-08 | 2024-04-26 | 哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司 | 一种聚山梨酯80含量的检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2583132C2 (ru) * | 2011-03-04 | 2016-05-10 | Бакстер Интернэшнл Инк. | Способ определения полисорбата |
-
2017
- 2017-12-14 RU RU2017143908A patent/RU2670965C9/ru active
-
2018
- 2018-09-13 WO PCT/RU2018/000602 patent/WO2019117750A1/ru active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2583132C2 (ru) * | 2011-03-04 | 2016-05-10 | Бакстер Интернэшнл Инк. | Способ определения полисорбата |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Vikram S. Nayak et al. Evaporative Light Scattering Detection Based HPLC Method for the Determination of Polysorbate 80 in Therapeutic Protein Formulations / Journal of Chromatographic Science, 2012; 50, pages 21-25. * |
| Vikram S. Nayak et al. Evaporative Light Scattering Detection Based HPLC Method for the Determination of Polysorbate 80 in Therapeutic Protein Formulations / Journal of Chromatographic Science, 2012; 50, pages 21-25. Ziping Wei et al. Universal method for the determination of nonionic surfactant content in the presence of protein / J. Sep. Sci., 2015; 38, pages 1318-1325. * |
| Ziping Wei et al. Universal method for the determination of nonionic surfactant content in the presence of protein / J. Sep. Sci., 2015; 38, pages 1318-1325. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2812788C1 (ru) * | 2023-07-05 | 2024-02-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России) | Определение полисорбата 80 в биологических лекарственных препаратах |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2670965C1 (ru) | 2018-10-26 |
| WO2019117750A1 (ru) | 2019-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zuo et al. | Simultaneous determination of creatinine and uric acid in human urine by high-performance liquid chromatography | |
| JPH09510792A (ja) | グリコシル化タンパク質の毛管電気泳動 | |
| Pilolli et al. | Rapid and label-free detection of egg allergen traces in wines by surface plasmon resonance biosensor | |
| RU2670965C9 (ru) | Способ измерения количества полисорбата-80 с применением щелочного гидролиза образца с последующей вэжх | |
| Lönnberg et al. | Rapid detection of erythropoiesis-stimulating agents in urine and serum | |
| CN104280503A (zh) | 同时测定烟草中黄曲霉毒素b1、b2、g1和g2的hplc-fld柱前衍生法 | |
| Zhang et al. | Evaluation of the oxidative deoxyribonucleic acid damage biomarker 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine in the urine of leukemic children by micellar electrokinetic capillary chromatography | |
| Wan et al. | Rapid method for monitoring galactosylation levels during recombinant antibody production by electrospray mass spectrometry with selective-ion monitoring | |
| CN106153785A (zh) | 一种黄曲霉毒素在线进样分析方法 | |
| Luo et al. | Rapid determination of Δ9-Tetrahydrocannabinol in saliva by polymer monolith microextraction combined with gas chromatography–mass spectrometry | |
| Ogunkunle et al. | Small molecules released from islets of Langerhans determined by liquid chromatography–mass spectrometry | |
| Lönnberg et al. | Lab-on-a-chip technology for determination of protein isoform profiles | |
| CN107505459A (zh) | 定量检测人h‑fabp的时间分辨荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法 | |
| CA2431201A1 (en) | Standard diluent for multiplex assays | |
| Lamprecht et al. | Determination of carvedilol in human plasma by high-performance liquid chromatography applying on-line deproteination and column switching | |
| KR102489233B1 (ko) | 크로마토그래피용 질량 제어 시스템 | |
| EP0839068A1 (en) | On line detection of a desired solute in an effluent stream using fluorescence spectroscopy | |
| Bhinge et al. | Simultaneous estimation of atorvastatin calcium and fenofibrate in rabbit plasma by RP-HPLC | |
| Emara et al. | On-line solid-phase enrichment coupled to packed reactor flow injection analysis in a green analytical procedure to determine low levels of folic acid using fluorescence detection | |
| Theodoridis et al. | Reversed-phase high-performance liquid chromatography-photodiode-array analysis of alkaloid drugs of forensic interest | |
| Llorent-Martínez et al. | Sequential injection multi-optosensor based on a dual-luminescence system using two sensing zones: application to multivitamin determination | |
| Yamamoto et al. | 2-Amino-3-phenylpyrazine, a sensitive fluorescence prelabeling reagent for the chromatographic or electrophoretic determination of saccharides | |
| JP3413654B2 (ja) | アルミニウム測定方法 | |
| CN111323492A (zh) | 一种复合色谱柱以及一种二维液相色谱系统 | |
| RU2162599C1 (ru) | Способ идентификации и определения массовой концентрации ацетальдегида в спиртосодержащих растворах |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TH4A | Reissue of patent specification | ||
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20220228 |