ES2641618T3 - Método para la determinación de polisorbato - Google Patents

Abstract

Método para la determinación de polisorbato en una muestra que contiene proteínas, que comprende las etapas de: (a) someter la muestra a hidrólisis alcalina con al menos NaOH 3 N a una temperatura de 95 ºC a 100 ºC durante al menos 45 minutos; (b) neutralizar la muestra tras la hidrólisis alcalina; (c) retirar opcionalmente precipitado desnaturalizado de la muestra neutralizada mediante filtración; (d) añadir una mezcla acuosa de un complejo de tiocianatometal a la muestra opcionalmente filtrada para formar un complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal; (e) extraer dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal formado en la etapa (d) en un disolvente orgánico inmiscible con agua; (f) medir la absorbancia del extracto obtenido en la etapa (e) para cuantificar la cantidad de dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal formado en la etapa (d); y (g) calcular la cantidad del polisorbato contenido en la muestra a partir de la cantidad de dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal determinado en la etapa (f).

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la determinacion de polisorbato

La presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion de polisorbato en una muestra que contiene protemas. El metodo de la presente invencion implica las etapas de someter la muestra a hidrolisis alcalina con al menos NaOH 3 N a una temperatura de 95 °C a 100 °C durante al menos 45 minutos, neutralizar la muestra tras la hidrolisis alcalina, retirar opcionalmente precipitado desnaturalizado de la muestra neutralizada mediante filtracion, anadir una mezcla acuosa de un complejo de tiocianatometal a la muestra opcionalmente filtrada para formar un complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal, extraer dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal en un disolvente organico inmiscible con agua, medir la absorbancia del extracto para cuantificar la cantidad de dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal formada, y calcular la cantidad del polisorbato contenido en la muestra a partir de la cantidad de dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal.

La seguridad vmca es un requisito basico para protemas terapeuticas, especialmente para farmacos derivados de plasma. En los ultimos anos, se ha realizado un progreso importante en la seguridad vmca eliminando practicamente el riesgo de transmision vmca. Se desarrollaron, validaron e introdujeron etapas espedficas disenadas para eliminar o inactivar virus en el procedimiento de fabricacion de protemas plasmaticas usadas terapeuticamente. Los procedimientos de fabricacion de factores de coagulacion como el factor VIII o el factor IX, inhibidores de proteinasas plasmaticas tales como antitrombina, antitripsina o inhibidor de C1, y de albumina e inmunoglobulinas deben tener al menos una etapa de inactivacion eficaz frente a virus con envoltura lipfdica para satisfacer el requisito de seguridad, y autoridades reguladoras nacionales e internacionales han establecido un marco amplio de regulaciones para garantizar el mantenimiento y la mejora adicional de la seguridad vmca. Por ejemplo, el Comite cientffico de Especialidades Farmaceuticas (CPMP) como organo de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) emitio directrices que cubren la seguridad vmca de productos biologicos. Para minimizar el riesgo de transmision vmca por farmacos derivados de plasma, las directrices del CPMP, ademas de otras acciones preventivas a nivel de plasma como material de partida, recomiendan encarecidamente la incorporacion de dos procedimientos de inactivacion vmca que actuan independientemente en el procedimiento de fabricacion.

El conocimiento de la utilidad de detergentes para la inactivacion vmca junto con la disponibilidad de metodos cromatograficos de purificacion de protemas ha mostrado el modo de inactivacion vmca por detergentes en el procesamiento de protemas plasmaticas. Los virus diana primarios VIH, VHB y VHC tienen todos envoltura lipfdica. Por tanto, una estrategia de inactivacion vmca eficaz se beneficia de manera racional de la sensibilidad vmca al detergente solo o al procedimiento bien establecido de disolvente-detergente (S/D). El efecto de todos estos procedimientos radica en la destruccion espedfica de la envoltura lipfdica vmca, mientras que tiene un impacto relativamente bajo en la integridad de protemas terapeuticas con la excepcion de lipoprotemas.

El detergente no ionico monooleato de polioxietilensorbitano (polisorbato 80, Tween™ 80) es el detergente viricida mas frecuentemente usado de los polisorbatos. Tras la etapa de inactivacion vmca, el procedimiento de fabricacion tiene que comprender una etapa de purificacion eficaz para eliminar los agentes de inactivacion, tal como adsorcion cromatografica de la protema. Sin embargo, con el fin de monitorizar la eficacia del procedimiento de eliminacion de detergente y tambien para comprobar el cumplimiento con los lfmites especificados y validados de concentracion de detergente durante la inactivacion vmca, la determinacion del detergente ha de realizarse en presencia de concentraciones variables y ocasionalmente altas de protemas, por ejemplo protemas plasmaticas. La composicion qrnmica y la diversidad estructural de los polisorbatos como el polisorbato 80, la baja reactividad de estos compuestos, la matriz de protema/tampon asf como la posible presencia de otros detergentes fisicoqmmicos relacionados tales como, por ejemplo, eteres de alquilfenol como Triton™ X-100 con numeros variables de residuos de oxido de etileno hacen que la determinacion sea diffcil. Las preocupaciones sobre los riesgos asociados con encefalopatfa espongiforme bovina (BSE) han llevado a la introduccion de una forma de polisorbato 80 derivada de vegetales fabricada a partir de grasas vegetales en lugar de sebo bovino. A pesar de su igual eficacia viricida, estos polisorbatos con un perfil de acidos grasos presuntamente diferente pueden divergir en sensibilidad analftica.

Se ha adaptado un ensayo colorimetrico temprano basado en la formacion de un complejo entre polisorbato 80 y almidon y la medicion del almidon libre en exceso mediante su reaccion con yodo para medios de cultivo tisulares y vacunas que contienen aminoacidos, azucares y protemas. Se ha desarrollado originalmente otro ensayo colorimetrico basado en la formacion de complejos de cadenas de polioxietileno con tiocianatocobaltato (II) y la extraccion del complejo en cloroformo para determinar la concentracion de esteres de acidos grasos de polietilenglicol en disoluciones acuosas. Desde entonces, se ha extendido su uso a otros tensioactivos no ionicos polietoxilados tales como, por ejemplo, eteres de polioxietileno con p-isooctilfenol (disponibles de diversos fabricantes con los nombres comerciales Triton™ X-100, Igepal™ CA-630, Nonidet™ P40, o Tergitol™ TM NP40), con dietil eter, cloruro de metileno o cloroformo como extractor.

Sin embargo, la aplicacion de este metodo para productos biologicos esta limitada por la presencia de protemas, que interfieren fuertemente y, por tanto, han de eliminarse antes de realizar el analisis. Para superar efectos de la matriz relacionados con protemas, se introdujeron tecnicas de separacion tal como una etapa de precipitacion con etanol en fno para la eliminacion de protemas mediante centrifugacion antes de colorimetna con tiocianatocobaltato (II),

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cromatograffa de exclusion molecular con derivatizacion colorimetrica tras la columna, cromatograffa de exclusion molecular con concentracion de base de polisorbato 80 por encima de la concentracion micelar cntica para evitar la agregacion micelar y la deteccion UV a 235 nm, cromatograffa de agotamiento de protemas de polisorbato no unido con captura de protemas en una columna de HPLC de intercambio ionico, extraccion en fase solida con deslipidacion, derivatizacion colorimetrica y separacion del complejo de tiocianatocobaltato (II) mediante cromatograffa de permeacion de gel, hidrolisis acida con HPLC o determinacion mediante CG del acido graso, o saponificacion suave con determinacion por HPLC del acido graso liberado, cromatograffa en capa fina, o extraccion ffquida con separacion por HPLC y deteccion por espectrometffa de masas. Los ultimos enfoques, que se basan en el resto de acido graso del polisorbato, se ven obstaculizados por las composiciones de acido graso variables del analito. Otro enfoque reciente mide la polarizacion de fluorescencia de 5-dodecanoilaminofluorescema incorporada en micelas de polisorbato. Sin embargo, estos metodos o bien llevan mucho tiempo, adolecen de un rendimiento limitado de muestras, o bien requieren instrumentacion compleja y validacion por separado de cada etapa.

En este contexto, el documento CN 101 639 439 A describe un metodo para la determinacion de polisorbato en una muestra que contiene protemas, que comprende la etapa de anadir un reactivo de tiocianato y extraer en disolvente de cloroformo.

Por tanto, existe una fuerte necesidad de proporcionar un metodo para la determinacion de polisorbato en muestras que contienen protemas mediante un ensayo colorimetrico, en el que la interferencia de protemas puede eliminarse de manera rapida y sencilla. Dicho metodo debe permitir la determinacion de la concentracion real de detergente durante, por ejemplo, inactivacion vmca, asf como en los concentrados finales de protemas purificadas.

Esta necesidad se satisface proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

La presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion de polisorbato en una muestra que contiene protemas, que comprende las etapas de:

(a) someter la muestra a hidrolisis alcalina con al menos NaOH 3 N a una temperatura de 95 °C a 100 °C durante al menos 45 minutos;

(b) neutralizar la muestra tras la hidrolisis alcalina;

(c) retirar opcionalmente precipitado desnaturalizado de la muestra neutralizada mediante filtracion;

(d) anadir una mezcla acuosa de un complejo de tiocianatometal a la muestra opcionalmente filtrada para formar un complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal;

(e) extraer dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal formado en la etapa (d) en un disolvente organico inmiscible con agua;

(f) medir la absorbancia del extracto obtenido en la etapa (e) para cuantificar la cantidad de dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal formado en la etapa (d); y

(g) calcular la cantidad del polisorbato contenido en la muestra a partir de la cantidad de dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal determinado en la etapa (f).

El termino “polisorbato” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier ester de acido graso de polioxietilensorbitano (polisorbatos). Los polisorbatos preferidos incluyen polisorbato 20, 40, 60 y 80. Se prefiere particularmente polisorbato 80. Dicho polisorbato 80 puede ser de origen animal o vegetal.

El termino “muestra que contiene protemas” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier muestra que contiene al menos una protema. La muestra puede, por ejemplo, derivarse de un procedimiento para la produccion de protemas recombinantes, en el que la muestra puede tomarse en cualquier punto de dicho procedimiento, o puede ser el producto final de dicho procedimiento. Ademas, la muestra puede, por ejemplo, derivarse de un procedimiento para la produccion de protemas derivadas de plasma sangumeo, en el que la muestra puede tomarse en cualquier punto del procedimiento, o puede ser el producto final de dicho procedimiento. Preferiblemente, la muestra se toma tras una etapa de inactivacion vmca en un procedimiento para la produccion de protemas derivadas de plasma sangumeo. Por consiguiente, la(s) protema(s) contenida(s) en la muestra puede(n) ser una o mas protema(s) de plasma sangumeo. Ademas, la muestra que contiene protemas puede ser plasma sangumeo. Ademas, la muestra que contiene protemas puede ser una muestra que contiene vacunas y/o peptidos.

La muestra que contiene protemas puede contener ademas iso-octilfenol polioxietilen eter (Triton™ X-100) y/o fosfato de tri-n-butilo (TNBP), que pueden haberse anadido, por ejemplo, en una etapa de inactivacion vmca en un procedimiento para la produccion de protemas derivadas de plasma sangumeo.

Puesto que moleculas grandes como las protemas pueden contener entidades estructurales, formadas por un

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conjunto de aminoacidos hidrofobos e hidrofilos, que pueden imitar caractensticas de detergente, tambien pueden interferir en tales ensayos de determinacion. La union de detergente a estructuras de protemas tambien puede influir en la determinacion impidiendo la formacion de complejos lo que da como resultado una recuperacion menor del analito. Por tanto, antes de la determinacion colorimetrica, las protemas concomitantes han de ser destruidas con el fin de proporcionar resultados no sesgados para evitar esta interferencia. La precipitacion de protemas usando un disolvente como etanol es una posibilidad para eliminar la protema antes de realizar el ensayo. Sin embargo, dado el hecho de que mezclas de protemas complejas tambien pueden contener protemas de bajo peso molecular tales como apolipoprotema A1 o protemas como la arglicoprotema acida que apenas precipitan a concentraciones utiles de etanol, la aplicacion de esta etapa de preparacion de muestras esta bastante limitada. En su lugar, la presente invencion adopta un pretratamiento de la muestra que se basa en la hidrolisis alcalina, particularmente a temperaturas elevadas. En esas condiciones, como se ejemplifica mas tarde adicionalmente, las protemas se destruiran hasta un grado en el que ya no pueden ejercer su influencia de interferencia en el ensayo. Aunque la hidrolisis aplicada no dara como resultado una descomposicion total de la protema para dar aminoacidos, fue de manera sorprendente lo suficientemente rigurosa como para eliminar reacciones de falsos positivos asf como union del detergente.

Etapa (a) del metodo de la presente invencion, es decir someter la muestra a hidrolisis alcalina, comprende tratar la muestra con al menos NaOH 3 N a una temperatura de 95 °C a 100 °C durante al menos 45 minutos. El agente alcalino es al menos NaOH 3 N, mas preferiblemente aproximadamente NaOH 10 N. La duracion del tratamiento alcalino es preferiblemente como mucho de 120 minutos, mas preferiblemente como mucho de 90 minutos. En una realizacion particularmente preferida, la duracion del tratamiento alcalino es de entre 45 y 90 minutos, mas preferiblemente de entre 45 minutos y 75 minutos, mas preferiblemente de entre 50 minutos y 70 minutos, y lo mas preferiblemente de 60 minutos.

Etapa (b) del metodo de la presente invencion, es decir neutralizar la muestra tras la hidrolisis alcalina, comprende preferiblemente neutralizar la muestra con un acido, por ejemplo acido acetico, a un pH de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8. Otros acidos que pueden usarse en este contexto incluyen acido formico, acido propionico, acido butmico, acido lactico, acido hidroxibutmco, acido alcanomonocarboxflico y cicloalcanomonocarboxflico, acidos dicarboxflicos y acidos tricarboxflicos.

Segun la presente invencion, la etapa (c) del metodo de la presente invencion, es decir retirar precipitado desnaturalizado de la muestra neutralizada, se realiza mediante filtracion, si realmente se realiza puesto que depende de la disolucion de protemas, y comprende filtrar la muestra con un filtro que no se une a polioxietilensorbitano. En una realizacion preferida, el filtro es un filtro hidrofilo, por ejemplo un filtro compuesto por acetato de celulosa. El tamano de poro del filtro no esta particularmente limitado, siempre que el precipitado se retenga suficientemente, y puede ser, por ejemplo, de 0,22 |im.

El complejo de tiocianatometal anadido en la etapa (d) es preferiblemente una mezcla acuosa de Co(NO3)2 ■ 6 H2O y NH4SCN y el complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal formado es un complejo de sorbitano- polioxietilentiocianatocobaltato (II).

La mezcla acuosa de Co(NO3)2 ■ 6 H2O y NH4SCN anadida preferiblemente a la muestra filtrada en la etapa (d) del metodo de la presente invencion contiene preferiblemente del 1 % (p/v) al 4 % (p/v), preferiblemente del 1,5 % (p/v) al 4 % (p/v), mas preferiblemente del 2 % (p/v) al 4 % (p/v), y lo mas preferiblemente el 3 % (p/v) de Co(NO3)2 ■ 6 H2O y del 10 % (p/v) al 30 % (p/v), preferiblemente del 15 % (p/v) al 25 % (p/v), mas preferiblemente el 20 % (p/v) de NH4SCN en agua destilada.

Preferiblemente, el disolvente organico inmiscible con agua usado en la etapa (e) del metodo de la presente invencion para la extraccion del complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal formado en la etapa (d) se selecciona del grupo que consiste en cloroformo, cloruro de metileno, o-diclorobenceno, bromoformo y tricloroetileno, en el que se prefiere particularmente cloruro de metileno.

Ademas, la absorbancia del extracto obtenido en la etapa (e) del metodo de la presente invencion se mide preferiblemente en la etapa (f) en un intervalo de entre 300 nm y 340 nm, mas preferiblemente de entre 310 nm y 330 nm, lo mas preferiblemente a 324 nm. Un experto en la tecnica conoce metodos para medir la absorbancia de una muestra a una o mas longitudes de onda particulares e incluyen, por ejemplo, el uso un espectrofotometro UV/VIS convencional.

Ademas, un experto en la tecnica conoce metodos para realizar la etapa (g) del metodo de la presente invencion, es decir calcular la cantidad del polisorbato contenido en la muestra a partir de la cantidad de dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal determinado en la etapa (f).

En una realizacion preferida, el metodo de la presente invencion comprende ademas tras la etapa (a) y antes de la etapa (b) una etapa de enfriar la muestra tras la hidrolisis alcalina, preferiblemente hasta temperatura ambiente. Ademas, el metodo de la presente invencion puede comprender tras la etapa (b) y antes de la etapa (c) una etapa de mantener la muestra a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos, preferiblemente al menos 30 minutos,

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para permitir la formacion completa de un posible precipitado desnaturalizado.

Con el fin de evitar perdidas de analito debido a la adsorcion inespedfica de cualquier polisorbato a la superficie del envase de muestra, por ejemplo a una superficie de plastico, el metodo de la presente invencion puede comprender una etapa de mezclar la muestra con una disolucion de protemas, por ejemplo una disolucion de albumina, antes de la hidrolisis alcalina. Tal adsorcion puede producirse particularmente con muestras que tienen un bajo contenido en protemas, por ejemplo un contenido en protemas por debajo de 1 mg/ml.

Ademas, el metodo de la presente invencion puede comprender una etapa de establecer una curva patron usando muestras que tienen concentraciones conocidas de polisorbato y una o mas protemas para la calibracion de las mediciones de absorbancia. Un experto en la tecnica conoce metodos para establecer una curva patron respectiva.

Las figuras muestran:

La figura 1 muestra los resultados de la medicion colorimetrica de polisorbato tras tiempos de hidrolisis de entre 15 y 120 min a 100 °C. Los puntos de datos son la media de dos mezclas de hidrolisis independientes que se diferenciaron en menos del 4 % cuando se realizo la hidrolisis alcalina durante al menos 60 minutos.

La figura 2 muestra los resultados de 21 determinaciones de una muestra de control que contiene 100 ppm de polisorbato 80 para determinar la precision y linealidad del ensayo. Se indica el intervalo de dos desviaciones estandar de la media.

La figura 3 muestra graficas de calibracion de muestras con adiciones conocidas de polisorbato 80 derivado de fuentes bovinas y vegetales, respectivamente, con (B) o sin ningun pretratamiento de la muestra (A).

La figura 4 muestra las curvas de calibracion de polisorbato 80 y Triton™ X-100 sin pretratamiento de la muestra (A), asf como de polisorbato 80 y una mezcla de polisorbato 80, fosfato de tri-n-butilo (TNBP) y Triton™ X-100 tras la hidrolisis alcalina (B).

La presente invencion se ilustrara adicionalmente en los siguientes ejemplos que no suponen ninguna limitacion de la misma.

Ejemplos

Materiales:

Todos los productos qmmicos usados fueron de calidad analttica a menos que se indique lo contrario. Se adquirio NaOH, acido acetico al 96 %, nitrato de cobalto hexahidratado (Co(NO3)2 ■ 6 H2O), cloruro de metileno (Lichrosolv™), Triton™ X-100, fosfato de tri-n-butilo (TNBP) y tiocianato de amonio (NH4SCN) de Merck (Alemania). Se adquirieron dos lotes de polisorbato 80 (Tween™ 80) de fuente bovina asf como de fuente vegetal de ICI (EE.UU.). Se prepararon disoluciones acuosas del detergente con un contenido del 1 % (p/v) y se usaron posteriormente para el analisis.

Se investigo la influencia de diversas protemas plasmaticas en la exactitud del ensayo usando concentrados y productos intermedios de fraccionamiento de protemas plasmaticas de Baxter BioScience (Viena, Austria). Brevemente, se usaron los siguientes concentrados de protema plasmatica humana para investigar la idoneidad del pretratamiento de la muestra mediante hidrolisis alcalina: albumina, inmunoglobulina, antitrombina, protema C, concentrado de complejo de protrombina activado y no activado de desarrollo (aPCC y PCC), concentrado de factor IX de alta pureza, y orosomucoide (a-i-glicoprotema acida). Finalmente, tambien se realizo el metodo en plasma completo, usando plasma humano liofilizado de referencia suministrado por Baxter (Baxter BioScience Diagnostics Division, Viena, Austria).

La hidrolisis alcalina en sf se llevo a cabo en tubos de polipropileno de 100 x 15 mm con tapones de rosca (Greiner, Austria), y la posterior determinacion colorimetrica en tubos de vidrio con tapones de rosca. Se usaron filtros de 0,22 |im MINISART (Sartorius, Alemania). La medicion colorimetrica se realizo en un espectrofotometro LKB Ultrospec K4053 usando cubetas de cuarzo Suprasil de 1 cm con tapones de rosca (Hellma, Alemania). Se mantuvo la temperatura ambiente (20-25 °C) durante todas las etapas del procedimiento excepto en la hidrolisis.

Ejemplo 1: Hidrolisis alcalina

A un tubo de polipropileno que contema 1 ml de muestra, se le anadio patron o control con un contenido en polisorbato de menos de 400 mg/l = 400 ppm, 0,5 ml de NaOH 10 M. Se mantuvo la disolucion en un bano de agua hirviendo durante 60 + 10 min. Tras enfriar hasta temperatura ambiente, se neutralizaron los hidrolizados alcalinos a pH ~ 7 a 8 con 0,5 ml de acido acetico 10 M comprobando el pH con tiras indicadoras (Merck, Alemania). Tras la neutralizacion, se mantuvieron las muestras a temperatura ambiente durante al menos 30 min. Segun la disolucion

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de protemas, se produjo un precipitado, que se retiro mediante filtracion usando un filtro Minisart de 0,22 |im antes del procedimiento de la determinacion colorimetrica. Se mezclaron muestras con un contenido en protemas de menos de 1 mg/ml con una disolucion de albumina antes de la hidrolisis con el fin de evitar perdidas de analito debido a adsorcion inespedfica a superficies de plastico, que puede producirse durante el procedimiento. La adicion de 0,1 ml de una disolucion de albumina humana con una concentracion de 200 mg/ml a 1 ml de la respectiva muestra demostro ser eficaz para la prevencion de perdidas inespedficas de polisorbato 80. Esta dilucion de la muestra se ha tenido en cuenta tras el calculo de la concentracion de polisorbato de la muestra.

Ejemplo 2: Medicion colorimetrica

Se realizo la determinacion colorimetrica tal como sigue a continuacion. Brevemente, se mezclo 1 ml de un hidrolizado de protema neutralizada o una disolucion acuosa de polisorbato, que practicamente no contema protemas, con 3 ml de reactivo de tiocianatocobaltato. Este reactivo contema el 3 % (p/v) de Co(NO3)2 ■ 6 H2O y el 20 % (p/v) de NH4SCN disueltos en agua destilada, y se preparo nuevo cada dfa. Entonces, se anadieron 2 ml de cloruro de metileno. Tras agitacion vigorosa, se permitio que las fases se separaran durante al menos 30 min a 2025 °C. Finalmente, se midio espectrofotometricamente la fase de cloruro de metileno en cubetas con tapones de rosca frente a un blanco de cloruro de metileno a 320 nm.

Ejemplo 3: Calibracion del ensayo

Se calibro el ensayo analizando diluciones patron que cubnan un intervalo de desde 10 hasta 400 ppm de polisorbato 80. Se prepararon estas disoluciones patron mediante adiciones conocidas de una disolucion de protemas con disoluciones acuosas de polisorbato. Puesto que las condiciones de hidrolisis aqu descritas destruyen practicamente la influencia de cualquier disolucion de protemas sometida a prueba hasta ahora, debena ser adecuada cualquier disolucion de protemas, incluyendo plasma completo. Sin embargo, siguiendo el principio de comparar similares entre sf, se selecciono una disolucion de protemas plasmaticas, que era lo mas similar posible a la disolucion de interes. Por tanto, se construyo una curva patron que cubna un intervalo de 10 a 400 ppm de polisorbato 80 que contema las concentraciones 5, 10, 20, 50, 100, 200 y 400 ppm usando PCC de desarrollo y se analizo por duplicado caza vez que se realizo el ensayo.

Ejemplo 4: Optimizacion del tiempo de hidrolisis

Con el fin de establecer un tiempo de hidrolisis apropiado, se selecciono aPCC de desarrollo (concentrado de complejo de protrombina activado) como matriz de protema que ya se conoce que interfiere sustancialmente con la determinacion colorimetrica de polisorbato 80. Aunque esta matriz practicamente no contema detergente, se observo una reaccion de falso positivo tras el analisis de esta disolucion despues de intentar la retirada de protemas mediante precipitacion con etanol. Con una concentracion de protemas de aproximadamente 25 mg/ml, a esta matriz, que contiene un amplio espectro de diferentes protemas plasmaticas, tales como protrombina, inhibidor de inter-a-tripsina, complemento y vitronectina, se anadieron 100 ppm de polisorbato 80. Se realizo hidrolisis alcalina tal como se describio, manteniendo las muestras entre 15 y 120 min en el bano de agua hirviendo. Se realizo el procesamiento adicional tal como se describio anteriormente.

Los resultados de la medicion colorimetrica de polisorbato tras tiempos de hidrolisis de entre 15 y 120 min a 100 °C se muestran en la figura 1. La matriz de protema seleccionada, que ya se sabfa que contema componentes que produdan una reaccion de falso positivo tras la determinacion despues de la precipitacion de protemas con etanol, no mostro reaccion de falso positivo incluso despues de un periodo de tiempo muy corto de hidrolisis. Tras una hidrolisis de 15 minutos a 100 °C, no fue posible recuperar completamente los 100 ppm de polisorbato 80 anadidos, y solamente se encontro el 79 % de la cantidad anadida. Este nivel de recuperacion fue el mas bajo encontrado en el estudio, y mostro adicionalmente una desviacion estandar mas alta en comparacion con las otras recuperaciones obtenidas tras la hidrolisis prolongada. Por tanto, la hidrolisis alcalina corta no fue suficiente para eliminar completamente la interferencia de protemas en el ensayo, y se observo una menor recuperacion, lo que indicaba que probablemente una asociacion relativamente estrecha entre protema y detergente podfa evitar la participacion del detergente en la determinacion colorimetrica. Sin embargo, la hidrolisis alcalina realizada a lo largo de 30 min produjo una recuperacion del 90 %, y las siguientes muestras analizadas tras 45, 60, 90 y 120 min, respectivamente, mostraron recuperaciones del 100 %, el 99 %, el 99 % y el 97 %, respectivamente, cada valor caracterizado por un coeficiente de variacion por debajo del 2,5 %. Segun estos hallazgos, se eligio un tiempo de hidrolisis de 60 + 10 min para los demas experimentos.

Ejemplo 5: Exactitud del ensayo en diferentes matrices de protema plasmatica

Las directrices oficiales para el metodo de validacion definen que la exactitud de un procedimiento analttico expresa el grado de aproximacion entre un valor verdadero y el valor rencontrado. Hay varios enfoques para valorar la exactitud de un metodo analttico. Puesto que no hay material de referencia certificado para polisorbato 80 en presencia de protemas plasmaticas, se siguio el enfoque de realizar adiciones conocidas de una muestra de referencia de blanco con una concentracion conocida de analito. Se eligio este enfoque de realizar adiciones conocidas de disoluciones de protema relevantes por la influencia ya conocida de protemas en el ensayo. Debido a

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las diferencias en la estructura primaria, secundaria y terciaria, la resistencia de protemas frente a tratamiento con alcali puede diferir considerablemente, siendo el procedimiento aplicado para la determinacion de polisorbato 80 menos vigoroso que la hidrolisis alcalina total que comprende calentar durante 15 horas a 120 °C.

Con el fin de investigar si las condiciones de hidrolisis alcalina usadas en este caso eran suficientes para permitir el analisis exacto de polisorbato 80 en matrices de protema muy diferentes, se emplearon disoluciones de protema plasmatica incluyendo albumina, inmunoglobulina, orosomucoide, antitrombina, protema C y factores de coagulacion asf como plasma completo para comprobar la recuperacion de polisorbato 80. La concentracion de protema de las muestras investigadas oscilo entre 1 y 50 mg/ml. La tabla 1 contiene los resultados de los experimentos de adiciones conocidas, en los que se anadieron 10 ppm, 50 ppm, 100 ppm o 200 ppm de polisorbato 80 a las matrices de blanco.

Tabla 1: Recuperacion de polisorbato 80 (p80) en diferentes disoluciones de protema plasmatica

Recuperacion de polisorbato 80 [% de cantidad anadida]

Protema plasmatica

concentracion [mg/mll 10 ppm de p80 50 ppm de p80 100 ppm de p80 200 ppm de p80

plasma

30 -*) - 106 104

PCC activado

30 94 - 104 -

PCC activado

10 100 - 106 -

albumina

20 - - 102 100

IgG

20 - - 90 93

PCC

30 - - 98 96

antitrombina

20 - 99 98 -

protema C

6 - 99 - -

orosomucoide

50 - 99 - -

factor IX conc.

1 - 102 - -

*) -: no determinado

En todas las disoluciones de protema investigadas, se encontraron recuperaciones de entre el 90 % y el 106 % de la cantidad anadida de polisorbato 80. Con estos resultados, todas las muestras sometidas a prueba cumplieron los criterios para los datos de recuperacion en funcion de la concentracion de analito publicados por la AOAC (American Association of Official Analytical Chemists). Segun estas especificaciones, deben recuperarse 100 ppm de analito con del 90 % al 107 %, mientras que los lfmites para la recuperacion de 10 ppm son del 80 % al 110 % con el fin de garantizar un resultado fiable. Los resultados demuestran que las condiciones de hidrolisis aplicadas son adecuadas para eliminar la influencia perturbadora de la protema, independientemente del tipo de protema, al menos en las concentraciones de protema investigadas. Esto se mostro incluso en la matriz de plasma, conocida por ser muy compleja y que contema varios cientos de protemas diferentes, pero tambien componentes de bajo peso molecular. Las cantidades anadidas de 100 ppm asf como 200 ppm de polisorbato 80 podfan recuperarse con desviaciones de menos del 6 %. Ademas, ninguna de las protemas purificadas con adiciones conocidas de polisorbato impidio una recuperacion satisfactoria, aunque se sometieron a prueba protemas no relacionadas estructuralmente a diferentes concentraciones. Por tanto, por ejemplo la protema altamente glicosilada orosomucoide, una protema muy acida con un punto isoelectrico por encima de 3 conocida por unirse a diversos farmacos, asf como albumina, que puede unirse a acidos grasos, no inhibieron la determinacion, ni siquiera a las altas concentraciones empleadas. Incluso a una concentracion de adiciones conocidas de 10 ppm de polisorbato 80, que es el lfmite de la cuantificacion, el ensayo dio resultados exactos independientes de la concentracion de protema presente. Se realizaron adiciones conocidas de aPCC de desarrollo en concentraciones de 10 y 30 mg de protema/ml con 10 ppm de polisorbato, e independientemente de la concentracion de protema en el ensayo, se obtuvieron recuperaciones del 94 % y el 100 %, cumpliendo por tanto de nuevo las recomendaciones de la AOAC dadas anteriormente.

Ejemplo 6: Linealidad y precision del ensayo

Segun directrices oficiales para la validacion de metodos analtticos, la precision de un metodo es el grado de concordancia de los resultados de pruebas individuales de multiples determinaciones de series de muestras, mientras que la linealidad de un procedimiento analttico describe su capacidad para obtener resultados de prueba que son directamente proporcionales a la concentracion del analito en la muestra. Con el fin de describir estos parametros de rendimiento esenciales del ensayo, se uso una muestra de control con 100 ppm de polisorbato 80 en PCC de desarrollo. Los resultados del analisis se muestran en la figura 2. Usando 21 determinaciones de la muestra de control, el promedio de la muestra tema una desviacion estandar (DE) relativa del 4,0 % y el 3,7 % para la precision en el ensayo y entre ensayos, respectivamente. Ambas desviaciones cumplen la recomendacion dada por la AOAC, que es del 5,3 % para la precision dentro de o entre dfas de medicion de 100 ppm de analito. Solo una de 21 determinaciones produjo un valor fuera del intervalo definido por la desviacion estandar doble, pero se incluyo en el intervalo de la media + 3 DE. La grafica tambien muestra las variaciones en el ensayo marcadas por barras de

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error. La precision del ensayo se investigo adicionalmente a una concentracion de 20 ppm, en la que se encontro un valor del 3,0 %. Se analizo el analisis de una muestra ex^da durante el procedimiento de inactivacion con la alta concentracion de 150 g de polisorbato 80/l con una desviacion estandar promedio del 2,9 % (n = 6), confirmando por tanto que el metodo tambien es adecuado para medir altas concentraciones que se producen durante el procedimiento de inactivacion vmca.

Las graficas de calibracion del ensayo que cubren un intervalo de 5 a 400 ppm de polisorbato 80 mostraron una buena linealidad, produciendo un coeficiente de correlacion medio r = 0,999 (n = 21) entre la concentracion y la extincion medida a 320 nm. La pendiente de la recta se caracterizo mediante una variacion entre ensayos del 7,7 % (n = 21) y se encontro que el lfmite de la cuantificacion (LC) era de 10 ppm + 0,4 ppm calculado segun las recomendaciones de la ICH.

Ejemplo 7: Comparacion de polisorbato de diferente origen

Para evaluar si el origen de polisorbato 80 tiene un impacto en el rendimiento del analisis, se compararon lotes de fuentes vegetales y bovinas. Se analizaron ambas formas en presencia de la disolucion de protemas descrita anteriormente siguiendo el mismo procedimiento de hidrolisis alcalina. Adicionalmente, se realizo la determinacion colorimetrica con el reactivo de tiocianatocobaltato sin pretratamiento de la muestra en ausencia de protemas, imitando por tanto las condiciones presentes tras el intento de precipitacion con etanol para retirar protema.

Las preparaciones de polisorbato 80 usadas inicialmente para la inactivacion vmca se habfan producido a partir de sebo bovino. Con la aparicion de la encefalitis espongiforme bovina (BSE), se volvio esencial evitar material bovino en la fabricacion de protemas terapeuticas y cambiar a detergente de origen vegetal. Desde entonces, el polisorbato 80 ha estado disponible en ambas formas, y ya se usa Tween 80 de origen vegetal en los procedimientos de inactivacion vmca en la fabricacion biofarmaceutica.

Con el fin de valorar el impacto de este cambio a grasas vegetales como material de fuente, que se diferencian del sebo en la composicion de acidos grasos constituyentes y pueden presentar un perfil de acidos grasos presuntamente diferente de la fraccion rica en acido oleico, se comparo la reactividad de ambas preparaciones de polisorbato usando un ensayo sin ningun pretratamiento adicional de la muestra. Los resultados se muestran en la figura 3A, en la que se muestran ambas graficas de calibracion. Las graficas obtenidas difieren en sus pendientes: el polisorbato de origen vegetal muestra una respuesta obviamente mas alta comparando cantidades iguales de material, produciendo una pendiente de 0,0025 en comparacion con 0,0023 de detergente de origen animal. Ademas, tras el analisis de varios lotes de ambos polisorbatos, podfa confirmarse que esta observacion no estaba relacionada con los lotes. Estos hallazgos se respaldaron adicionalmente mediante los resultados mostrados en la figura 3B, en la que se muestra que ambas graficas de calibracion obtenidas tras la hidrolisis alcalina son indistinguibles.

La sensibilidad del ensayo expresada en terminos de la pendiente de la grafica de calibracion es algo mas baja que sin hidrolisis alcalina. Por tanto, se encontro una pendiente promedio de 0,0021 tras la hidrolisis alcalina, que es mas baja que el valor obtenido sin hidrolisis. Esto sugiere que la parte de acidos grasos sin hidrolizar del detergente tambien puede estar implicada en la formacion o influir en la capacidad de extraccion del complejo.

Ejemplo 8: Evaluacion de la selectividad del ensayo con respecto a Triton™ X-100

Se investigo la selectividad del ensayo con respecto al detergente estrechamente relacionado iso-octilfenol polioxietilen eter (Triton™ X-100) asf como al disolvente fosfato de tri-n-butilo (TNBP), estando ambos incluidos en el procedimiento de disolvente-detergente establecido para la inactivacion vmca. Por tanto, se analizaron disoluciones acuosas que conteman Triton™ X-100 y polisorbato 80 sin hidrolisis alcalina con el fin de evaluar la selectividad de la determinacion colorimetrica. Ademas, se comparo la respuesta de una mezcla de inactivacion de disolvente- detergente ternaria que contema Triton™ X-100, polisorbato 80 y TNBP en la razon de 1:0,3:0,3 % (p/v) con una disolucion de polisorbato 80 tras la hidrolisis alcalina. De nuevo, el aPCC de desarrollo en una concentracion de protemas de aproximadamente 25 mg/ml sirvio como matriz de protema. Finalmente, se evaluo la influencia de concentraciones muy altas de Triton X-100 en el ensayo tras el pretratamiento de la muestra con hidrolisis alcalina tanto en presencia como en ausencia de protema. Para estos experimentos, se aplicaron concentraciones de Triton™ X-100 de 100, 300, 1000, 2000, 5000 y 10.000 ppm.

Una mezcla de inactivacion vmca de disolvente-detergente (SD, solvent-detergent) muy frecuentemente usada consiste en una formula ternaria de TNBP y los dos detergentes estrechamente relacionados Triton™ X-100 y polisorbato 80. Por tanto, se quiso conocer si el ensayo es capaz de distinguir entre estos detergentes estructuralmente relacionados. Ambos contienen grupos polietoxi, que participan en la determinacion colorimetrica, de manera que no es extrano que Triton™ X-100 pueda detectarse tambien en el ensayo original. La figura 4A compara la respuesta de ambos detergentes en el ensayo sin ningun pretratamiento de la muestra. La reactividad de ambos detergentes medida en el intervalo de 12 a 200 ppm difirio marcadamente. Triton™ X-100 dio solo aproximadamente el 70 % de la respuesta de polisorbato 80 a lo largo de todo el intervalo de concentraciones.

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Debido a estos hallazgos, y particularmente al hecho de que ambos detergentes tienen diferentes factores de respuesta, no puede usarse el ensayo original si ambos detergentes estan presentes. Se observa un efecto totalmente diferente si se incluye el pretratamiento de la muestra mediante hidrolisis alcalina en el ensayo. La figura 4B presenta la grafica de calibracion de la mezcla de SD ya descrita anteriormente que consiste en Triton™ X 100, polisorbato 80 y TNBP en la razon del 1,0:0,3:0,3% (p/v) en comparacion con polisorbato 80 solo. Practicamente no pueden observase diferencias al comparar los parametros relevantes, pendiente y ordenada en el origen de las graficas de calibracion. Tal como se muestra en la tabla 2, no difieren ni la pendiente, que es en ambos casos de 0,0023, ni la ordenada en el origen, siendo que es de -0,005 para polisorbato y de -0,007 para la mezcla de SD.

Tabla 2: Reactividad de Triton™ X-100 con y sin hidrolisis alcalina

sin hidrolisis con hidrolisis

polisorbato 80 Triton™ X-100 polisorbato 80 disolucion de SD

pendiente

0,0048 0,0035 0,0023 0,0023

ordenada en el origen

-0,0309 -0,0358 -0,005 -0,007

Estos resultados muestran que a pesar de la concentracion tres veces mas alta de Triton™ X-100, el ensayo puede aplicarse para analizar la concentracion de polisorbato 80 en la mezcla de SD sin ninguna interferencia detectable por el detergente estrechamente relacionado Triton™ X-100. De manera sorprendente, la hidrolisis alcalina es capaz de potenciar la selectividad de la determinacion colorimetrica. Se realizaron experimentos adicionales para aclarar si la reactividad de Triton™ X-100 se destruye completamente o hasta cierto grado unicamente. Tal como se resume en la tabla 4, las disoluciones que conteman menos de 300 |ig/ml de Triton™ X-100 no mostraron ninguna respuesta medible y, por consiguiente, no teman impacto sobre los valores medidos. Por tanto, la hidrolisis alcalina condujo a un aumento sustancial en la selectividad del ensayo tal como se muestra en el experimento, en el que un exceso de 30 veces de Triton™ X-100 no mostro ningun impacto medible ni siquiera en la senal de solamente 10 ppm de polisorbato 80. Incluso las concentraciones de Triton™ X-100 de entre 1000 y 10.000 ppm, que excedfan con mucho el intervalo de concentracion calibrado de polisorbato 80, se encontro que reaccionaban unicamente de manera moderada, demostrando que se elimino casi el 99% de la reactividad de Triton™ X-100 mediante la hidrolisis alcalina realizada antes de la determinacion colorimetrica.

Tabla 3: Reactividad de Triton™ X-100 tras la hidrolisis alcalina

Triton™ X-100 en ppm

100 300 1000 2000 5000 10.000

% de recuperacion

<5 <1,7 1,5 1,3 1,5 1,4

Conclusiones

Los resultados de los experimentos anteriores con diferentes tiempos de hidrolisis (vease el ejemplo 4) mostraron que un tratamiento con alcali de tan solo 15 min ya era suficiente para reducir la influencia de una disolucion de protemas dada, que se habfa mostrado previamente que provoca una clara sobrestimacion de la concentracion de polisorbato aplicando precipitacion de protemas con etanol. Pudo demostrarse que con numerosas protemas diferentes en carga y tamano, el polisorbato 80 podfa analizarse sin interferencia sustancial de la matriz de protema (vease el ejemplo 5). En particular, pudieron determinarse 50 |ig de polisorbato 80/ml con una recuperacion del 99 % en orosomucoide (a-i-glicoprotema acida) a una concentracion de protemas de aproximadamente 50 mg/ml. El hecho de que esta protema muy acida pudiera analizarse sin ninguna interferencia demuestra la idoneidad del pretratamiento de la muestra mediante hidrolisis alcalina. Ademas, no ha sido diffcil determinar el polisorbato 80 en albumina, una protema que se conoce bien que se une a acidos grasos. Puesto que el polisorbato 80 contiene un promedio de un unico residuo de acido graso por molecula, puede producirse una union del resto lipofilo a albumina. No obstante, las recuperaciones en albumina no dieron a lugar a preocupaciones en este aspecto.

Una interferencia por compuestos biologicos de bajo peso molecular tal como estan presentes en plasma (tal como por ejemplo aminoacidos, azucares, peptidos, urea, creatinina) tambien puede evitarse ventajosamente mediante hidrolisis alcalina. El plasma completo contiene por ejemplo algunos componentes no especificados adicionalmente que no precipitaran con etanol. La idoneidad del metodo de la presente invencion se demostro satisfactoriamente con plasma diluido aproximadamente a la mitad hasta un contenido en protemas de 30 mg/ml. Por tanto, pudo demostrarse la idoneidad de la hidrolisis alcalina en disoluciones de protema muy diferentes. Al mismo tiempo, los resultados de todos los experimentos de recuperacion realizados cumplieron los criterios recomendados por la AOAC para metodos verificados por homologos y la precision hallada permite la introduccion de este sistema como parte de programas de control de calidad.

La aparicion de BSE condujo a una comprobacion cuidadosamente realizada de todos los materiales auxiliares usados en la industria de fraccionamiento de plasma. Las grasas vegetales sustituyeron al sebo bovino como material de partida para el acido oleico en polisorbato 80. Al comparar los materiales de diferentes fuentes usados para la smtesis con respecto al procedimiento de fraccionamiento mas bien en bruto para el enriquecimiento de acido oleico, se hace obvio que la composicion de acidos grasos de polisorbatos obtenidas a partir de o bien grasa

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bovina o bien vegetal puede diferir al menos ligeramente. La mayona de grasas vegetales comunes se caracterizan por un contenido mayor de acidos grasos C18 poliinsaturados en comparacion con sebo bovino. Se observo que los polisorbatos Tween™ 20 (ester de acido laurico), Tween™ 40 (ester de acido palmttico) y Tween™ 80 (ester de acido oleico) teman diferentes propiedades de formacion de complejos para tiocianatocobaltato lo que da como resultado una menor extincion del complejo acuoso a 620 nm para Tween™ 80 que para Tween™ 20 y 40. Mientras que el perfil de acidos grasos de Tween™ 80 que contema ~ el 80 % de acido oleico es el mas homogeneo y significativamente diferente de los de Tween™ 20, 40 y 60 (ester de acido estearico), las pequenas diferencias en la composicion de acidos grasos entre el polisorbato 80 de origen vegetal y animal pueden explicar, lo mas probablemente, la diferencia medida observada como la mayor reactividad del material de origen vegetal sin preparacion de muestra. Esta explicacion esta apoyada adicionalmente por el hecho de que una diferencia de este tipo entre polisorbatos de ambas fuentes podna eliminarse totalmente mediante hidrolisis alcalina (vease el ejemplo 7). Este tratamiento de muestra no solamente dara como resultado una descomposicion de protemas, sino que tambien provocara saponificacion del polisorbato que da como resultado escision del resto de acido graso del detergente, que entonces no puede ni sesgar la determinacion colorimetrica ni la capacidad de extraccion del complejo formado. Cualquier variacion del resto de acido graso del detergente ya no influira en la determinacion, y la robustez del metodo podna potenciarse significativamente. Explicando y eliminando esta diferencia inesperada entre ambas variantes de polisorbato 80, el principio basico de comparar similares entre sf parece perder importancia en este caso, y la calibracion del ensayo puede realizarse usando polisorbato 80 independientemente de la fuente.

Con los hallazgos iniciales de un lfmite de cuantificacion de 30 ppm de polisorbato 80 a 620 nm obtenido con un metodo colorimetrico desarrollado para protemas recombinantes y no caracterizado adicionalmente, el LC de 10 ppm de polisorbato 80 a 320 nm determinado en estos experimentos concuerda bien, puesto que el coeficiente de extincion a 8320 nm es aproximadamente seis veces mayor que a 8620 nm. Un descubrimiento incluso mas importante es la potenciacion ventajosa de la selectividad mediante hidrolisis alcalina hacia polisorbato. La respuesta colorimetrica del iso-octilfenol polioxietilen eter Triton™ X-100, ya que a menudo se aplica en combinacion con polisorbato, puede eliminarse hasta que se hace posible la cuantificacion de ambos detergentes polioxietilados (sin hidrolisis para polisorbato y Triton™ X-100 en resumen, y para Triton™ X-100 tras hidrolisis mediante sustraccion de la concentracion de polisorbato residual) (vease el ejemplo 8). Puesto que el puente de polioxietilen,-fenol eter puede ser propenso lo mas probablemente a hidrolisis alcalina de manera similar a los p-hidroxilalquilfenol eteres de la lignina de madera, tras las escision del eter, se liberaba una cadena de polietilenglicol corta libre (nav ~ 9), de la que no se extrae presuntamente el complejo de tiocianatocobaltato de manera cuantitativa en la fase organica, sino aparentemente solo hasta como mucho el 1,5 %. Por tanto, incluso a una concentracion de 300 |ig/ml de Triton X- 100 no muestra interferencia medible.

Resumiendo todos los resultados, con la introduccion del pretratamiento de la muestra es posible realizar un metodo muy sencillo y versatil para la determinacion de polisorbato tal como polisorbato 80 en presencia de protemas plasmaticas y ademas tambien en presencia de Triton™ X-100. El metodo puede realizarse con una precision y exactitud apropiadas, permitiendo por tanto una determinacion de la concentracion de, por ejemplo, polisorbato 80 durante el procedimiento de inactivacion vmca asf como en el envase final. Ademas, la etapa de hidrolisis alcalina disenada principalmente para permitir el rendimiento del ensayo en presencia de protemas independientemente de la naturaleza de la disolucion de protemas resulto potenciar la selectividad del ensayo respecto a la interferencia por el detergente aplicado a menudo Triton™ X-100. Finalmente, el metodo tambien se hizo robusto frente a alteraciones del resto de acido graso de polisorbato, cuya saponificacion evito cualquier contribucion a la determinacion colorimetrica.

Claims (10)

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REIVINDICACIONES

Metodo para la determinacion de polisorbato en una muestra que contiene protemas, que comprende las etapas de:

(a) someter la muestra a hidrolisis alcalina con al menos NaOH 3 N a una temperatura de 95 °C a 100 °C durante al menos 45 minutos;

(b) neutralizar la muestra tras la hidrolisis alcalina;

(c) retirar opcionalmente precipitado desnaturalizado de la muestra neutralizada mediante filtracion;

(d) anadir una mezcla acuosa de un complejo de tiocianatometal a la muestra opcionalmente filtrada para formar un complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal;

(e) extraer dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal formado en la etapa (d) en un disolvente organico inmiscible con agua;

(f) medir la absorbancia del extracto obtenido en la etapa (e) para cuantificar la cantidad de dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal formado en la etapa (d); y

(g) calcular la cantidad del polisorbato contenido en la muestra a partir de la cantidad de dicho complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatometal determinado en la etapa (f).

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el polisorbato es monooleato de polioxietilensorbitano (polisorbato 80).

Metodo segun la reivindicacion 2, en el que el polisorbato 80 es de origen animal.

Metodo segun la reivindicacion 2, en el que el polisorbato 80 es de origen vegetal.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el complejo de tiocianatometal

anadido en la etapa (d) es una mezcla acuosa de Co(NO3)2 ■ 6 H2O y NH4SCN y el complejo de sorbitano-

polioxietilentiocianatometal formado es un complejo de sorbitano-polioxietilentiocianatocobaltato (II).

Metodo segun la reivindicacion 5, en el que dicha mezcla acuosa contiene aproximadamente el 3 % (p/v) de Co(NO3)2 ■ 6 H2O y aproximadamente el 20 % (p/v) de NH4SCN.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra contiene ademas iso- octilfenol polioxietilen eter.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 de tri-n-butilo (TNBP).

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 une a polioxietilensorbitano.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el disolvente organico inmiscible con agua usado en la etapa (e) se selecciona del grupo que consiste en cloruro de metileno, cloroformo, o- diclorobenceno, bromoformo y tricloroetileno.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el disolvente organico inmiscible con agua es cloruro de metileno.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la absorbancia del extracto obtenido en la etapa (e) se mide en la etapa (f) a aproximadamente 324 nm.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende ademas tras la etapa (a) y antes de la etapa (b) la etapa de:

(a2) enfriar la muestra tras la hidrolisis alcalina.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende ademas tras la etapa (b) y antes de la etapa (c) la etapa de:

(b2) mantener la muestra a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para permitir la formacion

a 7, en el que la muestra contiene ademas fosfato a 8, en el que el filtro usado en la etapa (c) no se

de precipitado desnaturalizado.