JP5273766B2 - タンパク質加水分解方法および装置、ならびに、タンパク質分析方法および装置 - Google Patents
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Description
更に本発明は、タンパク質の分析方法および装置に関するものであり、より詳しくは、タンパク質のアミノ酸分析を簡便に行うことができる汎用性に優れた方法および装置に関するものである。
本発明の更なる目的は、簡便にタンパク質のアミノ酸分析を行うことができる汎用性に優れた手段を提供することにある。
[1]固体酸触媒とタンパク質とを水存在下かつ加熱下で接触させることにより、該タンパク質を加水分解することを含み、前記固体酸触媒はスルホン酸基を有する多孔質体であることを特徴とするタンパク質加水分解方法。
[2]固体酸触媒は、スルホン酸型陽イオン交換体である[1]に記載のタンパク質加水分解方法。
[3]スルホン酸型陽イオン交換体は、親水性ビニルポリマーを基材として含むスルホン酸型陽イオン交換樹脂である[2]に記載のタンパク質加水分解方法。
[4]前記加熱は、100〜160℃の範囲の温度で行われる[1]〜[3]のいずれかに記載のタンパク質加水分解方法。
[5]固体酸触媒を含む容器、カラムおよび膜からなる群から選ばれる少なくとも一種の加水分解手段を含み、前記固体酸触媒はスルホン酸基を有する多孔質体であることを特徴とするタンパク質加水分解装置。
[6]固体酸触媒は、スルホン酸型陽イオン交換体である[5]に記載のタンパク質加水分解装置。
[7]前記加水分解手段を加熱するための加熱手段を更に含む[5]または[6]に記載のタンパク質加水分解装置。
[8]前記加水分解手段へ溶液を送液するための送液手段を更に含む[5]〜[7]のいずれかに記載のタンパク質加水分解装置。
[9]スルホン酸型陽イオン交換体は、親水性ビニルポリマーを基材として含むスルホン酸型陽イオン交換樹脂である[5]〜[8]のいずれかに記載のタンパク質加水分解装置。
[10][1]〜[4]のいずれかに記載のタンパク質加水分解方法または[5]〜[9]のいずれかに記載のタンパク質加水分解装置を使用することによりタンパク質加水分解物を得ること、および、
上記タンパク質加水分解物を分析すること、
を特徴とするタンパク質分析方法。
[11]前記分析は、アミノ酸分析を含む[10]に記載のタンパク質分析方法。
[12][5]〜[9]のいずれかに記載のタンパク質加水分解装置と、加水分解物分析手段と、を含むことを特徴とするタンパク質分析装置。
[13]前記加水分解物分析手段は、アミノ酸分析手段を含む[12]に記載のタンパク質分析装置。
さらに、オートサンプラーから順次試料を導入してロータリーバルブで切り替えて複数のカラムをセットすることで多検体試料を一度に加熱して加水分解することができ、得られたアミノ酸混合液をポンプから供給された溶出液(例えばホウ酸緩衝液)によりカラムから溶出させ、これをフラクションコレクターを利用して順次回収することができる。従来使用されていた酸加水分解法では、タンパク質試料を脱塩後乾燥して液体の酸を加えていたため、酸を入れる操作は自動化できなかったり、自動化の際に液体の酸が流路を通過するため、耐薬品性が十分でなく故障の原因になることがあった。また、塩などの夾雑物は酸加水分解に影響を与えるため予め除く必要があった。本発明によれば、これら従来法における課題を解決することができるため、タンパク質の加水分解およびタンパク質分析の自動化が可能になる。
本発明のタンパク質加水分解方法は、固体酸触媒とタンパク質とを水存在下かつ加熱下で接触させることにより、該タンパク質を加水分解する。固体酸触媒を利用することにより、カラム等の利用が可能となるため、タンパク質加水分解を容易に自動化することができる。従来、微量アミノ酸分析法を利用し、翻訳後修飾の解析や微量タンパク質の絶対定量等のタンパク質分析を行う際、加水分解がボトルネックとなり熟練者の操作が不可欠となって、簡便かつ迅速な分析の妨げとなっていた。したがって、本発明によりタンパク質の加水分解の自動化が可能となることは、タンパク質の簡便かつ迅速な分析に大きく寄与するものである。更に固体酸触媒は回収が容易であるため、固体酸触媒の利用により、環境負荷が少ないタンパク質加水分解方法を提供することができる。
以下、本発明のタンパク質加水分解方法について、更に詳細に説明する。
更に本発明は、固体酸触媒を含む容器、カラムおよび膜からなる群から選ばれる少なくとも一種の加水分解手段を含むことを特徴とするタンパク質加水分解装置に関する。
更に本発明は、本発明のタンパク質加水分解方法または本発明のタンパク質加水分解装置を使用することによりタンパク質加水分解物を得ること、および、上記タンパク質加水分解物を分析すること、を特徴とするタンパク質分析方法に関する。
更に本発明は、本発明のタンパク質加水分解装置と、加水分解物分析手段と、を含むことを特徴とするタンパク質分析装置に関する。前記加水分解装置の詳細は、先に説明した通りである。また、前記加水分解物分析手段は、アミノ酸分析手段を含むことが好ましい。アミノ酸分析手段としては、前述のポストカラムラベル法、プレカラムラベル法等のアミノ酸分析を行い得る装置を用いることができる。特に、カラムに固体酸触媒を保持した加水分解装置とポストカラムアミノ酸自動分析装置を直接結合して一体化し、タンパク質の加水分解からアミノ酸分析までを全自動化した装置を構成することができる。
東ソー株式会社製陽イオン交換樹脂TOYOPEARL SP 550-CおよびTOYOPEARL SP 650-Cを用い、これらをそれぞれ1N塩酸中に懸濁させプロトン型に置換した後に、上清が中性になるまで水洗した。上記プロトン型陽イオン交換樹脂TOYOPEARL SP 550-CおよびTOYOPEARL SP 650-Cについて、それぞれ50%(V/V)懸濁水溶液10μlをガラスチューブ(6 X 32 mm, CHROMACOL製03-CVG)に入れ、牛血清アルブミン(BSA,Sigma製A7638)水溶液5μl(3.3マイクログラム)を加えた。このガラスチューブをガラスバイアル(WHEATON製225289)に入れ、25μlのMilliQを加えたうえで密栓した。バイアルは110℃のアルミブロックヒーターに入れ、20時間加熱した。バイアルを放冷後、ガラスチューブをとりだし、ガラスチューブに0.2Mホウ酸緩衝液(pH 8.8)を30μl加え、その半量を下記2.において蛍光誘導体化し、アミノ酸を定量した。
6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート(AQC)の合成、およびAQCを用いたアミノ酸の蛍光誘導体化(プレラベル化)を、"Synthesis of a Fluorescent Derivatizing Reagent, 6-Aminoquinolyl-N-Hydroxysuccinimidyl Carbamate, and Its Application for the Analysis of Hydrolysate Amino Acids via High-Performance Liquid Chromatography" S. A. Cohen and D. P. Michaud. Anal. Biochem.211. 279-287 (1993)に記載の方法に従って行った。このように調製したアミノ酸蛍光誘導体をHPLCにより分離した。HPLCによる分離は、逆相カラムを用い、イオンペア試薬を含む緩衝溶液系を用いた濃度勾配溶出法により実施した。下記条件を用いて、AQCにより蛍光誘導体化した17種のアミノ酸およびアンモニウムを含有する標準アミノ酸混合物またはタンパク質加水分解物を分離した。
a)HPLC装置:Agilent社の1100シリーズ(真空デガッサーG1379A、バイナリーポンプG1312A、オートサンプラーG1367A、カラム恒温槽G1330B/G1316A、ダイオードアレイ検出器G1315B、蛍光検出器G1321Aを含む)
b)カラム: InertsilODS-3(4.6×150mm, 3μm)、GLサイエンス社製
c)移動相:A:95 % 5mM テトラブチルアンモニウムブロミド、30mM リン酸緩衝液(pH 7.3), 5 % アセトニトリル;B : 50 % アセトニトリル / 移動相 A
d)濃度勾配: 0−3−40分の間に移動相B濃度を2−7.3−72.3 %に変えた。
e)流速:0.5ml 毎分
f)温度:40度
g)蛍光励起波長(Ex)、およびモニター波長(Em):Ex=250nm、Em=395nm
標準アミノ酸溶液としては、ピアス社製のAmino Acid Standard H(2.5μmol/ml)より10pmol/μlの溶液を調製し用いた。その標準溶液5μl(50pmol)をAQC誘導体化し、1/10量を注入した時の分離結果を図1に示す。また、この標準溶液の分析値をもとにタンパク質加水分解物の定量を行った結果を表1に示す。表1には、BSAに含まれるアミノ酸の総量に対する割合も併せて示した。なお、" Automated sample preparation using vapor-phase hydrolysis for amino acid analysis", Analytical Biochemistry 318 (2003) 155-188に記載の気相法によりBSA1マイクログラムあたりのBSAの含有量は6.9pmol(0.46マイクログラム)であり、重量の46%に相当することが明らかになった。以下、計り取った重量と実質のBSAモル数の換算には、この定量値を用いる。
(i)電気泳動による評価
固体酸触媒となり得る下記7種類の試薬について加水分解実験を行った。固体酸触媒はナフィオン(登録商標)以外は、メノウ乳鉢で微粉化した。ナフィオン(登録商標)は棒状の合成ポリマーのため0.1mm程度にスライスした。ガラスチューブ(6 X 32 mm,CHROMACOL製03-CVG)の底から5mm程度、固体酸触媒を詰め、牛血清アルブミン(BSA,Sigma製A7638)水溶液5μl(3.3マイクログラム)を加えた。このガラスチューブをガラスバイアル(WHEATON製225289)に入れ、25μlのMilliQを加えたうえで密栓したものを2本用意し、1本は110℃で20時間加熱し、1本は室温で20時間放置した。その後、固体酸触媒の入ったチューブに電気泳動用の試料緩衝液を加え,沸騰水で5分間加熱した。これらの試料をポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。
[使用固体酸触媒]
(A)デュポン製Nafion(登録商標)NR50、7-9mesh通過(粒子サイズ3mm×4mm)
(B)ゼオライト球状(東ソー株式会社製ゼオラム(登録商標)F-9、直径1.40-2.36mm、8〜12 mesh通過)
(C)ゼオライト粉末:東ソー株式会社製ゼオラム(登録商標)A-3、直径75μm (200mesh通過)
(D)珪藻土(和光純薬工業株式会社製けいそう土、顆粒状)
(E)アルミナ(MP Biochemicals社製MP Alumina, Activated, Acidic, Activity: I, 粒子サイズ50〜200μm)
(F)フロリジール(Wako chemicals USA製フロリジール(Florisil(登録商標)))
(G)ハイドロキシアパタイト(和光純薬工業株式会社製アパタイトHAP、単斜晶)
これに対し、上記(E)〜(G)の固体酸触媒を使用した場合、加熱処理前、加熱処理後、室温放置後のいずれにおいても、固体酸触媒に吸着したBSAをSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)で溶出できずBSAのバンドは観察されなかった。
上記と同様に微粉化またはスライスした固体酸触媒(A)〜(G)を、それぞれをガラスチューブ(6 X 32 mm,CHROMACOL製03-CVG)の底から5mm程度詰め、牛血清アルブミン(BSA,Sigma製A7638)水溶液5μl(3.3マイクログラム)を加えた。このガラスチューブをガラスバイアル(WHEATON製225289)に入れ、25μlのMilliQを加えたうえで密栓し、110℃で20時間加熱した。加熱後、固体酸触媒の入ったチューブに0.2Mホウ酸緩衝液(pH8.8)を80μl加え、その半量を前述の2.と同様の方法で蛍光誘導体化し、アミノ酸を定量した。前述の1.で得られた定量結果とともに、結果を表2に示す。
これに対し、上記(E)〜(G)使用時には、上記(i)において加熱処理前にBSAのバンドが観察されなかったため、電気泳動の結果からは加水分解の有無を判断することは困難であったが、表2に示すようにアミノ酸が検出されたことから、上記(A)〜(D)使用時と比べて反応効率は低いものの加水分解を行うことができたと考えられる。
以下の方法により図3に示す自動加水分解装置を作製した。
プロトン型陽イオン交換樹脂TOYOPEARL SP 550-Cをφ1mm(20mmのカラム(Upcharch C-128、フリットUpcharch A-701を装着)1〜5に詰めた。このカラムを図3に示すように、電動切換バルブに接続し、オートサンプラーによるサンプルの自動インジェクションと同期し、注入カラムが切り替わるようにした。また、カラムはそれぞれ電気炉(反応炉)のアルミブロック内に設置した。これらのカラムの平衡化、サンプル注入、溶出、回収はすべて制御用PCのプログラムによって全自動で行った。高速液体クロマトグラフィーのポンプ、検出器、溶媒のデガッサー装置制御、データ分析用ソフトウエア(ケミステーション)はAgilent社の1100シリーズを用いた。オートサンプラーはGilson社の231XLサンプルインジェクターおよび402シリンジポンプ、フラクションコレクターはGilson社の221XLリキッドハンドラー、電動切換バルブはValco Instrument社ECST6UW、電気炉はPierce社のReacti-Therm heating moduleを使用した。装置の制御はAgilentのケミステーションを用いた。制御プログラムにより電動切換バルブおよびフラクションコレクターを制御し注入および溶出を行った。さらに注入用制御プログラムと溶出用制御プログラムの間に20時間反応を行うための制御プログラムを入れた。
溶液AのビンにMilliQ水を入れ、流速0.05ml/minでカラム1、カラム2を平衡化した後、カラム1にはMilliQ水を、カラム2には2mg/mlの牛血清アルブミン(BSA)/ 0.1% 酢酸水溶液を3μl注入した。この重量6マイクログラムのBSAはモル数にして41pmol(アミノ酸総量24nmol)相当である。注入後15分間流速0.05ml/minでカラムを水洗後、通液を止め、カラムを電気炉で110℃に加熱した。20時間後加熱を止め、放冷後、溶液Bのビンに入れた0.2Mホウ酸緩衝液を通液し、各カラムから溶出物をフラクションコレクターにより全自動で回収した。別途、比較のため、同量のBSAを5.7N定沸点塩酸(気相法)、110℃で20時間加水分解したサンプルとともに、回収したアミノ酸の絶対量を、前述の蛍光誘導体化によるアミノ酸分析で定量した。結果を表3に示す。
上記3.と同様にカラム1〜5を用意した。溶液AのビンにMilliQ水を入れ、すべてのカラムを流速0.05ml/minで平衡化した後、2〜5のカラムに2mg/mlの牛血清アルブミン(BSA)/ 0.1% 酢酸水溶液をそれぞれ1,2,3,5μl注入した。注入後15分間カラムを流速0.05ml/minで水洗後、通液を止め、カラムを電気炉で110℃に加熱した。20時間後加熱を止め、放冷後、溶液Bのビンに入れた0.2Mホウ酸緩衝液を通液し、各カラムから加水分解物をフラクションコレクターにより全自動で回収した。別途、比較のため、同量のBSAを5.7N定沸点塩酸(気相法)、110℃で20時間加水分解したサンプルとともに、回収したアミノ酸をHPLCで分析し、BSAに含まれるアミノ酸の総量に対する割合を求めた。結果を表4に示す。表4に示す文献値は、NCBI(National Center for Biotechnology Information) protein database、 AAI42273に記載の値である。
前述と同様の装置により、牛血清アルブミン(BSA)2mg/ml 溶液を5μl注入し、加水分解したサンプルを0.2Mホウ酸緩衝液を通液することにより回収した。回収したアミノ酸混合物45μlに2.1 N HClを5μlと希釈用バッファー(pH 2.2)を50μl加え、全量を100 μlにした後、80μlを採取し、自動アミノ酸分析計によって構成アミノ酸分析を行った。このアミノ酸分析には日立社製高速アミノ酸分析計L−8500Aを用いた。上記アミノ酸分析計付属マニュアルに記載の特殊アミノ酸分析法にて加水分解物中のアミノ酸をイオン交換カラムを用いて5種類の緩衝液で分離させた。分離したアミノ酸はポストカラム法によりニンヒドリンで反応させて2波長の可視光で検出した。通常のアミノ酸は570nmのクロマトグラムより、また、プロリンは440nmのクロマトグラムより標準アミノ酸混合物を2ナノモル分析した値をもとに定量した。表6にBSAに含まれるアミノ酸の総量に対する割合を求めた結果を示す。表6に示す文献値は、前述のNCBIデータベースAAI42273に記載の値である。表6に示すように、プロトン型陽イオン交換樹脂TOYOPEARL SP-550Cの使用により、文献値に近似するアミノ酸組成分析を行うことができた。アミノ酸分析計を加水分解装置の近隣に設置することで、加水分解からアミノ酸分析までを全自動オンラインで行うことができる。
Claims (13)
- 固体酸触媒とタンパク質とを水存在下かつ加熱下で接触させることにより、該タンパク質を加水分解することを含み、前記固体酸触媒はスルホン酸基を有する多孔質体であることを特徴とするタンパク質加水分解方法。
- 固体酸触媒は、スルホン酸型陽イオン交換体である請求項1に記載のタンパク質加水分解方法。
- スルホン酸型陽イオン交換体は、親水性ビニルポリマーを基材として含むスルホン酸型陽イオン交換樹脂である請求項2に記載のタンパク質加水分解方法。
- 前記加熱は、100〜160℃の範囲の温度で行われる請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質加水分解方法。
- 固体酸触媒を含む容器、カラムおよび膜からなる群から選ばれる少なくとも一種の加水分解手段を含み、前記固体酸触媒はスルホン酸基を有する多孔質体であることを特徴とするタンパク質加水分解装置。
- 固体酸触媒は、スルホン酸型陽イオン交換体である請求項5に記載のタンパク質加水分解装置。
- 前記加水分解手段を加熱するための加熱手段を更に含む請求項5または6に記載のタンパク質加水分解装置。
- 前記加水分解手段へ溶液を送液するための送液手段を更に含む請求項5〜7のいずれか1項に記載のタンパク質加水分解装置。
- スルホン酸型陽イオン交換体は、親水性ビニルポリマーを基材として含むスルホン酸型陽イオン交換樹脂である請求項5〜8のいずれか1項に記載のタンパク質加水分解装置。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質加水分解方法または請求項5〜9のいずれか1項に記載のタンパク質加水分解装置を使用することによりタンパク質加水分解物を得ること、および、
上記タンパク質加水分解物を分析すること、
を特徴とするタンパク質分析方法。 - 前記分析は、アミノ酸分析を含む請求項10に記載のタンパク質分析方法。
- 請求項5〜9のいずれか1項に記載のタンパク質加水分解装置と、加水分解物分析手段と、を含むことを特徴とするタンパク質分析装置。
- 前記加水分解物分析手段は、アミノ酸分析手段を含む請求項12に記載のタンパク質分析装置。
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