KR101910217B1 - 폴리소르베이트의 측정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질-함유 샘플 내의 폴리소르베이트의 측정 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은, 알칼리 가수분해를 통해 샘플을 전처리하고, 이어서 분석물과 티오시아네이트 시약의 금속 착물을 형성하고 상기 착물을 비혼화성 유기 용매 내로 추출함에 기반을 둔 비색 측정을 포함한다. 알칼리 가수분해는 간섭하는 단백질의 제거를 설명하고, 분석물과 유사한 계면활성제에 대한 선택성, 예를 들어 트리톤 X-100에 대한 트윈 80의 선택성을 향상시킨다.

Description

폴리소르베이트의 측정 방법{METHOD FOR THE DETERMINATION OF POLYSORBATE}

본 발명은 단백질-함유 샘플 내의 폴리소르베이트의 측정 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 알칼리 가수분해에 의한 샘플의 전처리 및 후속되는 비색 측정을 포함한다.

바이러스 안전성은 치료용 단백질, 특히 혈장-유래된 약물에 대한 기본 요건이다. 최근 몇 년 동안, 바이러스 전염 위험을 거의 없앰으로써, 바이러스 안전성에 있어서 상당한 발전을 달성하였다. 바이러스를 제거 또는 불활성화시키도록 고안된 특수한 단계들이 개발되고, 검증되고, 치료용으로 사용되는 혈장 단백질의 제조 공정에 도입되었다. 응고 인자, 예컨대 인자 VIII 또는 인자 IX, 혈장 단백질분해효소 억제제, 예컨대 안티트롬빈, 안티트립신 또는 C1-억제제, 및 알부민 및 면역글로불린의 제조 공정은 안전성의 요건을 충족시키도록 지질-외피 바이러스를 저해하기에 효과적인 하나 이상의 불활성화 단계를 가져야 하고, 국내 및 국제 규제 기구는 바이러스 안전성의 유지 및 추가의 개선을 보장하는 규제의 포괄적인 기틀을 마련하였다. 예를 들어, 유럽의약품청(European Medicines Agency(EMA))의 한 기관인 전매의약품 과학위원회(scientific Committee for Proprietary Medicinal Products(CPMP))는 생물학적 약제의 바이러스 안전성을 망라하는 지침을 발표하였다. 혈장-유래된 약물에 의한 바이러스 감염 위험을 최소화하기 위해서, CPMP 지침에서는, 출발 물질로서의 혈장의 수준에 대한 기타 예방적 조치 외에도, 두 개의 독립적으로 작용하는 바이러스 불활성화 공정을 제조 공정에 도입할 것이 강하게 권장된다.

바이러스 불활성화를 위한 세제의 유용성과 함께 크로마토그래피 단백질 정제 방법의 이용가능성을 인식하게 됨으로써 혈장 단백질 처리에서 세제를 사용하여 바이러스를 불활성화하는 방법을 알게 되었다. 주요 표적 바이러스 HIV, HBV 및 HCV는 모두 지질-외피를 갖는다. 따라서, 효과적인 바이러스 불활성화 전략은 바이러스가 세제 단독에 대해 또는 잘 알려진 용매-세제(S/D) 공정에 대해 취약하다는 점을 합리적으로 이용한다. 이러한 모든 공정의 효과는 바이러스 지질 외피를 특이적으로 파괴하고 지질단백질을 제외한 치료용 단백질의 온전성(integrity)에 비교적 적은 영향을 미친다는 데 있다.

비이온성 세제인 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(폴리소르베이트 80, 트윈(Tween)™ 80)는 가장 통상적으로 사용되는 폴리소르베이트의 살바이러스성 세제이다. 제조 공정은 바이러스 불활성화 단계 후에, 단백질의 크로마토그래피적 흡착과 같은, 불활성화제를 제거하기에 효과적인 정제 단계를 포함해야 한다. 그러나, 세제 제거 공정의 효율을 모니터링하고 또한 바이러스 불활성화 동안에 명시되고 검증된 세제 농도 한계를 준수하고 있는지를 검사하기 위해서, 다양하고 때때로 높은 농도의 단백질, 예를 들어 혈장 단백질의 존재 하에서 세제의 측정을 수행해야 한다. 폴리소르베이트 80과 같은 폴리소르베이트의 화학적 조성 및 구조적 다양성, 이들 화합물의 낮은 반응성, 단백질/완충제 매트릭스 뿐만 아니라 기타 물리화학적으로 관련된 세제, 예컨대, 예를 들어 다양한 개수의 에틸렌 옥시드 잔기를 갖는 트리톤(Triton)™ X-100과 같은 알킬페놀 에테르의 존재 가능성 때문에 측정이 어려워진다. 소해면상뇌병증(BSE)과 연관된 위험에 대한 우려 때문에 우지 대신에 식물 지방으로부터 제조된 식물-유래된 형태의 폴리소르베이트 80이 도입되었다. 상이한 지방산 프로필을 가질 것이라고 추정되는 이들 폴리소르베이트들은 동일한 살바이러스성 효과를 가짐에도 불구하고 분석 감도는 상이할 수 있다.

아미노산, 당 및 단백질을 함유하는 조직배양배지 및 백신의 경우에, 폴리소르베이트 80과 전분 사이의 착물 형성 및 전분과 요오드의 반응을 통한 과량의 유리 전분의 측정에 기반을 둔 초기의 비색 검정이 채택되었다. 폴리옥시에틸렌쇄와 티오시아네이토코발테이트(II)의 착물 형성 및 이러한 착물의 클로로포름 내로의 추출에 기반을 둔 또 다른 비색 검정은 원래는 수용액 내의 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르의 농도를 측정하기 위해 개발되었다. 그 이후로 그의 용도는, 추출제로서 디에틸 에테르, 메틸렌 클로라이드 또는 클로로포름을 사용하여, 기타 폴리에톡실화 비이온성 계면활성제, 예컨대 예를 들어 p-이소옥틸페놀 폴리옥시에틸렌 에테르(다양한 제조사로부터 트리톤™ X-100, 이게팔(Igepal)™ CA-630, 노니데트(Nonidet)™ P40, 또는 테르지톨(Tergitol)™ NP40이라는 상표명으로서 입수가능함)로 확장되었다.

그러나 이러한 방법을 생물학적 약제에 적용하는 일은 단백질의 존재에 의해 제한되는데, 이러한 단백질은 분석을 강하게 간섭하므로 분석 수행 전에 제거되어야 한다. 단백질-관련 매트릭스 효과를 극복하기 위해서, 티오시아네이토코발테이트(II) 비색법의 수행 전에 원심분리하여 단백질을 제거하기 위한 저온 에탄올 침전 단계, 후-칼럼 비색 유도체화하는 크기 배제 크로마토그래피, 미셀 응집을 방지하기 위해서 임계 미셀 농도를 초과하는 폴리소르베이트 80의 기저 농도를 사용하고 235 ㎚에서 자외선 검출하는 크기 배제 크로마토그래피, 이온-교환 HPLC 칼럼 상에서의 단백질의 포획을 수반하는 미결합 폴리소르베이트의 단백질-감손 크로마토그래피, 탈지질(delipidation)을 수반하는 고체상 추출, 비색 유도체화 및 겔 투과 크로마토그래피에 의한 티오시아네이토코발테이트(II) 착물의 분리, 지방산의 HPLC 또는 GC 측정을 수반하는 산 가수분해, 또는 유리된 지방산의 HPLC 측정을 수반하는 온화한 비누화, 박층 크로마토그래피, 또는 HPLC 분리 및 질량분석적 검출을 수반하는 액체 추출과 같은 분리 기법이 도입되었다. 후자의 접근법은, 폴리소르베이트의 지방산 잔기에 의존하는데, 분석물의 지방산 조성이 변함으로써 방해 받는다. 또 다른 최근의 접근법은 폴리소르베이트 미셀 내로 도입된 5-도데카노일아미노플루오레세인의 형광 편광을 측정하는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되고 제한된 샘플 처리량 때문에 불리하거나, 복잡한 기기가 요구되고 각각의 단계의 개별적인 검증이 요구된다.

따라서, 단백질의 간섭을 빠르고 간단하게 없앨 수 있는, 비색 검정을 통해 단백질-함유 샘플 내의 폴리소르베이트를 측정하는 방법을 제공하는 것에 대한 강한 요구가 존재한다. 이러한 방법은 예를 들어 바이러스 불활성화 동안에 뿐만 아니라 정제된 단백질의 최종 농축물 내의 실제 세제 농도를 측정하는 것을 허용할 것이다.

이러한 요구는 특허청구범위에서 특징지워진 실시양태를 제공함으로써 충족된다.

<발명의 요약>

본 발명은 알칼리 가수분해에 의한 샘플의 전처리 및 후속되는 비색 측정에 기반을 둔, 단백질-함유 샘플 내의 폴리소르베이트의 측정 방법에 관한 것이다.

본 발명은

(a) 샘플을 알칼리 가수분해하는 단계;

(b) 알칼리 가수분해 후 샘플을 중화시키는 단계;

(c) 임의로, 중화된 샘플로부터 변성된 침전물을 제거하는 단계;

(d) 임의로 여과된 샘플에 티오시아네이토금속 착물의 수성 혼합물을 첨가하여 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토금속 착물을 형성하는 단계;

(e) 단계 (d)에서 형성된 상기 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토금속 착물을 비-수혼화성 유기 용매 내로 추출하는 단계;

(f) 단계 (e)에서 수득된 추출물의 흡광도를 측정하여 단계 (d)에서 형성된 상기 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토금속 착물의 양을 정량하는 단계; 및

(g) 단계 (f)에서 측정된 상기 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토금속 착물의 양으로부터 샘플 내에 함유된 폴리소르베이트의 양을 계산하는 단계

를 포함하는, 단백질-함유 샘플 내의 폴리소르베이트의 측정 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용된 "폴리소르베이트"라는 용어는 임의의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(폴리소르베이트)에 관한 것이다. 바람직한 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20, 40, 60 및 80을 포함한다. 폴리소르베이트 80이 특히 바람직하다. 상기 폴리소르베이트 80은 동물 또는 식물로부터 유래될 수 있다.

본원에서 사용된 "단백질-함유 샘플"이라는 용어는 1종 이상의 단백질을 함유하는 임의의 샘플에 관한 것이다. 샘플은 예를 들어 재조합 단백질의 제조 공정으로부터 유래될 수 있고, 여기서 샘플은 상기 공정의 임의의 단계에서 채취될 수 있거나 상기 공정의 최종 생성물일 수 있다. 또한, 샘플은 예를 들어 혈장-유래된 단백질의 제조 공정으로부터 유래될 수 있고, 여기서 샘플은 상기 공정의 임의의 단계에서 채취될 수 있거나 상기 공정의 최종 생성물일 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 혈장-유래된 단백질의 제조 공정에서 바이러스 불활성화 단계 후 채취된다. 따라서, 샘플 내에 함유된 단백질(들)은 하나 이상의 혈장 단백질(들)일 수 있다. 또한, 단백질-함유 샘플은 혈장일 수 있다. 또한, 단백질-함유 샘플은 백신 및/또는 펩티드를 함유하는 샘플일 수 있다.

단백질-함유 샘플은 이소옥틸페놀 폴리옥시에틸렌 에테르(트리톤™ X-100) 및/또는 트리-n-부틸 포스페이트(TNBP)를 추가로 함유할 수 있고, 이들은 예를 들어 혈장-유래된 단백질의 제조 공정에서 바이러스 불활성화 단계에서 첨가될 수 있다.

단백질과 같은 큰 분자는 세제의 특징을 모방할 수 있는 한 셋트의 소수성 아미노산과 친수성 아미노산으로 이루어진 구조체를 함유할 수 있기 때문에, 이들은 이러한 측정 검정을 간섭할 수도 있다. 세제가 단백질 구조에 결합되면 착물 형성이 방지됨으로써 분석물의 회수율이 보다 낮아짐으로써 측정에 영향이 미쳐질 수 있다. 따라서, 비색 측정 전에, 이러한 간섭을 방지하는 편향 없는 결과를 제공하기 위해서 부수적인 단백질을 파괴해야 한다. 에탄올과 같은 용매를 사용하는 단백질 침전은 검정을 수행하기 전에 단백질을 제거하는 한 방법일 수 있다. 그러나, 복잡한 단백질 혼합물은 에탄올의 유용한 농도에서 좀처럼 침전되지 않는 아포지질단백질 A1과 같은 저분자량 단백질 또는 α1-산 당단백질과 같은 단백질도 함유할 수 있다는 사실로부터 판단할 때, 이러한 샘플 제조 단계의 적용은 상당히 제한된다. 그 대신에, 본 발명은 알칼리 가수분해, 특히 승온에서의 알칼리 가수분해에 의존하는 샘플 전처리를 채택한다. 이후에 추가로 예시되는 바와 같은 조건에서, 단백질은 이들이 검정을 더 이상 간섭할 수 없을 정도로 파괴될 것이다. 적용된 가수분해는 아미노산으로의 단백질의 완전한 분해를 초래하지는 않겠지만, 가수분해는, 놀랍게도, 가양성 반응을 없앨 뿐만 아니라 세제의 결합을 없앨 정도로 충분히 강했다.

바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계 (a), 즉 샘플을 알칼리 가수분해하는 단계는, 샘플을 승온에서 특정한 시간 동안 알칼리성 약품으로써 처리하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 알칼리성 약품은 NaOH, KOH, LiOH, Ba(OH)₂, Sr(OH)₂, Ca(OH)₂, 테트라메틸암모늄 히드록시드, 테트라에틸암모늄 히드록시드, 테트라프로필암모늄 히드록시드, 테트라부틸암모늄 히드록시드, 및 동종성 또는 이종성으로 치환된 4차 알킬암모늄 히드록시드 및 시클로알킬암모늄 히드록시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 알칼리성 약품은 NaOH, 바람직하게는 3 N 이상의 NaOH, 더욱 바람직하게는 약 10 N NaOH이다. 승온은 바람직하게는 100 ℃ 이하 및 약 80 ℃ 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 ℃ 이상, 가장 바람직하게는 약 95 ℃ 이상이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 알칼리 가수분해를 약 95 ℃ 내지 약 100 ℃에서 수행한다. 알칼리 가수분해의 수행 시간은 바람직하게는 약 15 분 이상, 더욱 바람직하게는 약 30 분 이상, 가장 바람직하게는 약 45 분 이상이다. 또한, 알칼리 처리의 수행 시간은 바람직하게는 120 분 이하, 더욱 바람직하게는 90 분 이하이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 알칼리 처리의 수행 시간은 약 45 내지 약 90 분, 더욱 바람직하게는 약 45 분 내지 75 분, 더욱 바람직하게는 약 50 분 내지 70 분, 가장 바람직하게는 60 분이다.

본 발명의 방법의 단계 (b), 즉 알칼리 가수분해 후 샘플을 중화시키는 단계는 바람직하게는 산, 예를 들어 아세트산을 사용하여 샘플을 약 7 내지 약 8의 pH로 중화시키는 것을 포함한다. 이러한 맥락에서 사용될 수 있는 추가의 산은 포름산, 프로피온산, 부티르산, 락트산, 히드록시부티르산, 알칸- 및 시클로알칸 모노카르복실산, 디카르복실산 및 트리카르복실산을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계 (c), 즉 중화된 샘플로부터 변성된 침전물을 제거하는 단계를 여과 또는 원심분리를 통해 수행할 수 있고, 이는 단백질 용액에 의존하기 때문에, 실제로 수행된다면, 이는 샘플을 원심분리하거나 폴리옥시에틸렌 소르비탄과 결합하지 않는 여과기를 사용하여 샘플을 여과함을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 여과기는 친수성 여과기, 예를 들어 셀룰로스 아세테이트로 만들어진 여과기이다. 여과기의 공극 크기는, 침전물을 충분히 보류시키는 한, 특별히 제한되지는 않고, 예를 들어 0.22 ㎛일 수 있다.

단계 (d)에서 첨가되는 티오시아네이토금속 착물은 바람직하게는 Co(NO₃)₂·6H₂O와 NH₄SCN의 수성 혼합물이고, 형성된 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토금속 착물은 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토코발테이트(II) 착물이다.

본 발명의 방법의 단계 (d)에서 여과된 샘플에 바람직하게 첨가되는 Co(NO₃)₂·6H₂O와 NH₄SCN의 수성 혼합물은 바람직하게는 증류수 중 약 1 %(w/v) 내지 약 4 %(w/v), 바람직하게는 약 1.5 %(w/v) 내지 약 4 %(w/v), 더욱 바람직하게는 약 2 %(w/v) 내지 약 4 %(w/v), 가장 바람직하게는 3 %(w/v)의 Co(NO₃)₂·6H₂O 및 약 10 %(w/v) 내지 약 30 %(w/v), 바람직하게는 15 %(w/v) 내지 약 25 %(w/v), 더욱 바람직하게는 약 20 %(w/v)의 NH₄SCN을 함유한다.

바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계 (e)에서, 단계 (d)에서 형성된 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토금속 착물의 추출에 사용되는 비-수혼화성 유기 용매는 클로로포름, 메틸렌 클로라이드, o-디클로로벤젠, 브로모포름, 및 트리클로로에틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 메틸렌 클로라이드가 특히 바람직하다.

또한, 본 발명의 방법의 단계 (e)에서 수득된 추출물의 흡광도를 바람직하게는 단계 (f)에서 약 300 ㎚ 내지 약 340 ㎚, 더욱 바람직하게는 약 310 ㎚ 내지 약 330 ㎚, 가장 바람직하게는 약 324 ㎚의 범위에서 측정한다. 하나 이상의 특정 파장(들)에서 샘플의 흡광도를 측정하는 방법은 해당 분야의 숙련자에게 공지되어 있고, 예를 들어 표준 UV/VIS-분광광도계를 사용하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 방법의 단계 (g)를 수행하는 방법, 즉 단계 (f)에서 측정된 상기 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토금속 착물의 양으로부터 샘플 내에 함유된 폴리소르베이트의 양을 계산하는 단계는 해당 분야의 숙련자에게 공지되어 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단계 (a) 후 및 단계 (b) 전에 알칼리 가수분해 후 샘플을 바람직하게는 실온으로 냉각시키는 단계를 추가로 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 단계 (b) 후 및 단계 (c) 전에, 가능한 변성된 침전물의 완전한 형성을 허용하기 위해서, 샘플을 15 분 이상, 바람직하게는 30 분 이상 동안 실온에서 유지하는 단계를 포함할 수 있다.

샘플 용기의 표면, 예를 들어 플라스틱 표면에의 임의의 폴리소르베이트의 비특이적인 흡착으로 인한 분석물의 손실을 피하기 위해서, 본 발명의 방법은, 샘플을, 알칼리 가수분해 전에, 단백질 용액, 예를 들어 알부민 용액과 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 흡착을 특히 낮은 단백질 함량, 예를 들어 1 ㎎/㎖ 미만의 단백질 함량을 갖는 샘플을 사용하여 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 폴리소르베이트 농도가 알려진 샘플 및 흡광도 측정값의 보정을 위한 하나 이상의 단백질을 사용하여 표준 곡선을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 표준 곡선을 생성하는 방법은 해당 분야의 숙련자에게 공지되어 있다.

도면은 하기를 보여준다:

도 1은 100 ℃에서 15 내지 120 분의 가수분해 시간 후의 비색 폴리소르베이트 측정 결과를 보여준다. 데이터 포인트는 알칼리 가수분해를 60 분 이상 동안 수행했을 때 4 % 미만 만큼 상이한 두 독립적인 가수분해 혼합물들의 평균이다.

도 2는 검정의 정밀성 및 직선성을 측정하기 위해서 100 ppm 폴리소르베이트 80을 함유하는 대조용 샘플의 21 개의 측정 결과를 보여준다. 평균의 두 표준편차의 범위가 제시되어 있다.

도 3는, 각각 샘플 전처리를 수행한 경우(B) 또는 임의의 샘플 전처리를 수행하지 않은 경우(A)의, 소 및 식물 원료물질로부터 유래된 폴리소르베이트 80가 첨가된(spiked) 샘플의 보정 곡선을 보여준다.

도 4는 샘플 전처리를 수행하지 않은 경우(A)의 폴리소르베이트 80 및 트리톤™ X-100의 보정 곡선 뿐만 아니라, 알칼리 가수분해를 수행한 후(B)의 폴리소르베이트 80 및 폴리소르베이트 80과 트리-n-부틸 포스페이트(TNBP)와 트리톤™ X-100의 혼합물의 보정 곡선을 보여준다.

본 발명은 임의의 제한을 받지 않고서 하기 실시예에서 보다 상세히 예시될 것이다.

<실시예>

물질:

사용된 모든 화학약품은 달리 언급이 없는 한 분석용 등급이었다. NaOH, 96 % 아세트산, 질산코발트 6수화물(Co(NO₃)₂·6H₂O), 메틸렌 클로라이드(리크로솔브(Lichrosolv)™), 트리톤™ X-100, 트리-n-부틸 포스페이트(TNBP) 및 암모늄 티오시아네이트(NH₄SCN)를 머크(Merck)(독일)로부터 구입하였다. 소 뿐만 아니라 식물 원료물질로부터 유래된 두 로트(lot)의 폴리소르베이트 80(트윈™ 80)을 ICI(미국)로부터 구입하였다. 1 %(w/v)의 함량을 갖는 세제의 수용액을 제조하였고 이후에 분석에 사용하였다.

검정의 정확성에 미치는 여러 혈장 단백질의 영향을 백스터 바이오사이언스(Baxter BioScience)(오스트리아 비엔나)로부터의 혈장 단백질 분획화 중간체 및 농축물을 사용하여 규명하였다. 간단히 말해서, 하기 인간 혈장 단백질 농축물을 사용하여 알칼리 가수분해에 의한 샘플 전처리의 적합성을 규명하였다: 알부민, 면역글로불린, 안티트롬빈, 단백질 C, 발달성 활성화 및 비-활성화 프로트롬빈 착물 농축물(aPCC 및 PCC), 고순도 인자 IX 농축물, 및 오로소무코이드(α₁-산 당단백질). 끝으로, 이 방법을 또한 백스터(오스트리아 비엔나의 백스터 바이오사이언스 디아그노스틱스 디비젼(Baxter BioScience Diagnostics Division))에 의해 공급된 동결건조된 인간 표준 혈장을 사용하여 전혈장에서 수행하였다.

알칼리 가수분해 그 자체를, 돌려 따는 마개를 갖는 100 × 15 ㎜ 폴리프로필렌 튜브(오스트리아의 그라이너(Greiner))에서 수행하였고, 이후에 돌려 따는 마개를 갖는 유리 튜브에서 비색 측정을 수행하였다. 사용된 여과기는 0.22 ㎛ 미니사르트(MINISART)(독일의 사르토리우스(Sartorius))였다. 돌려 따는 마개를 갖는 1 ㎝ 수프라실(Suprasil) 석영 셀(독일의 헬마(Hellma))을 사용하여 LKB 울트로스펙(Ultrospec) K4053 분광광도계 상에서 비색 측정을 수행하였다. 가수분해를 제외한 모든 공정 단계 동안에 실온(20 내지 25 ℃)을 유지하였다.

실시예 1: 알칼리 가수분해

샘플 1 ㎖를 함유하는 폴리프로필렌 튜브에, 400 ㎎/ℓ(= 400 ppm) 미만의 폴리소르베이트 함량을 갖는 표준물 또는 대조물, 10 M NaOH 0.5 ㎖를 첨가하였다. 용액을 끓는 물 수조에 60 ± 10 분 동안 두었다. 실온으로 냉각시킨 후에, 알칼리 가수분해물을 지시 스트립(독일의 머크)를 사용하여 pH를 검사함으로써 10 M 아세트산 0.5 ㎖를 사용하여 pH 약 7 내지 8로 중화시켰다. 중화 후에, 샘플을 실온에서 30 분 이상 동안 유지하였다. 단백질 용액에 따라, 침전물이 생성되고, 이것을 비색 측정 공정 전에 미니사르트 0.22 ㎛ 여과기를 사용하여 여과 제거하였다. 공정 동안에 일어날 수 있는 플라스틱 표면에 대한 비특이적인 흡착으로 인한 분석물의 손실을 피하기 위해서, 가수분해 전에, 1 ㎎/㎖ 미만의 단백질 함량을 갖는 샘플을 알부민 용액과 혼합하였다. 200 ㎎/㎖의 농도를 갖는 인간 알부민 용액 0.1 ㎖을 각각의 샘플 1 ㎖에 첨가하는 것은 폴리소르베이트 80의 비특이적 손실을 방지하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 샘플의 이러한 희석은 샘플의 폴리소르베이트 농도의 계산 시에 고려되어야 한다.

실시예 2: 비색 측정

비색 측정을 하기와 같이 수행하였다. 간단히 말하면, 단백질을 본질적으로 함유하지 않는, 중화된 단백질 가수분해물 또는 폴리소르베이트 수용액 1 ㎖를 티오시아네이토코발테이트 시약 3 ㎖와 혼합하였다. 이러한 시약은 증류수에 용해된 3 %(w/v) Co(NO₃)₂·6H₂O 및 20 %(w/v) NH₄SCN을 함유하였고, 이것을 매일 새로이 제조하였다. 이어서, 메틸렌 클로라이드 2 ㎖를 첨가하였다. 격렬하게 진탕한 후에, 20 내지 25 ℃에서 30 분 이상 동안 상들이 분리되도록 두었다. 끝으로, 메틸렌 클로라이드 상을, 돌려 따는 마개를 갖는 큐벳에서 320 ㎚에서 메틸렌 클로라이드 블랭크에 대해 분광광도법으로 측정하였다.

실시예 3: 검정의 보정

10 내지 400 ppm 폴리소르베이트 80의 범위를 망라하는 표준 희석물을 분석함으로써 검정을 보정하였다. 단백질 용액에 폴리소르베이트 수용액을 첨가함으로써 이러한 표준 용액을 제조하였다. 본원에서 기술된 가수분해 조건은 지금까지 시험된 임의의 단백질 용액의 영향을 사실상 없애기 때문에, 전혈장을 포함하여, 임의의 단백질 용액이 적합해야 한다. 그러나, 비슷한 것끼리 비교하는 원칙에 따라, 관심 대상인 용액과 가능한 한 유사한 혈장 단백질 용액을 선택하였다. 따라서, 5, 10, 20, 50, 100, 200 및 400 ppm의 농도를 함유하는 10 내지 400 ppm 폴리소르베이트 80의 범위를 망라하는 표준 곡선을 발달성 PCC를 사용하여 생성하고 검정을 수행할 때마다 두 벌씩 만들어서 분석하였다.

실시예 4: 가수분해 시간의 최적화

적당한 가수분해 시간을 정하기 위해서, 발달성 aPCC(활성화 프로트롬빈 착물 농축물)를, 폴리소르베이트 80의 비색 측정을 상당히 간섭한다고 이미 알려진 단백질 매트릭스로서 선택하였다. 이러한 매트릭스는 세제를 본질적으로 함유하지 않았지만, 에탄올을 사용한 침전에 의해 시도된 단백질 제거 후 이러한 용액의 분석 시에는 가양성 반응이 관찰되었다. 약 25 ㎎/㎖의 단백질 농도에서, 넓은 범위의 상이한 혈장 단백질, 예컨대 프로트롬빈, 인터-α-트립신 억제제, 보체 및 비트로넥틴을 함유하는 이러한 매트릭스에 100 ppm 폴리소르베이트 80을 첨가하였다. 샘플을 15 내지 120 분 동안 끓는 물 수조에 두면서, 알칼리 가수분해를 기술된 바와 같이 수행하였다. 추가의 처리를 상기에서 기술된 바와 같이 수행하였다.

100 ℃에서 15 내지 120 분 동안의 가수분해 시간 후의 비색 폴리소르베이트 측정 결과가 도 1에 나타나 있다. 에탄올을 사용하는 단백질 침전 후 측정 시 가양성 반응을 초래하는 성분을 함유한다고 이미 알려진, 선택된 단백질 매트릭스는 심지어는 매우 짧은 가수분해 시간 후에도 가양성 반응을 보이지 않았다. 100 ℃에서 15 분의 가수분해 후에, 첨가된 100 ppm 폴리소르베이트 80은 완전히 회수되지 않았고, 첨가된 양의 79 % 만이 관측되었다. 이러한 수준의 회수율은 본 연구에서 관측되는 최저값이었고, 또한 오랜 시간 동안의 가수분해 후 수득된 모든 기타 회수율에 비해 보다 높은 표준편차를 나타내었다. 따라서, 짧은 시간 동안의 알칼리 가수분해는 검정에 대한 단백질의 간섭을 완전히 없애기에 충분하지 았았고, 보다 낮은 회수율이 관찰되었고, 이는 아마도 단백질과 세제 사이의 비교적 강한 결합이 세제가 비색 측정에 참여하는 것을 막을 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 30 분 동안 수행된 알칼리 가수분해는 90 %의 회복률을 달성하였고, 각각 45, 60, 90 및 120 분 후 분석된 이후의 샘플은 각각 100 %, 99 %, 99 % 및 97 %의 회수율을 보였고, 각각의 값은 2.5 % 미만의 변동 계수에 의해 특징지워졌다. 이러한 관측에 따라, 60 ± 10 분의 가수분해 시간이 모든 추가의 실험에 대해 선택되었다.

실시예 5: 상이한 혈장 단백질 매트릭스에서의 검정 정확성

방법의 검증을 위한 공식 지침에서는 분석 공정의 정확성은 실제값과 관측값 이 얼마나 많이 일치하는지를 표현하는 것이라고 정의된다. 분석 방법의 정확성을 평가하는 여러 방법이 존재한다. 혈장 단백질의 존재 하에서의 폴리소르베이트 80에 대한 공인된 표준 물질이 존재하지 않기 때문에, 분석물 농도가 알려진 블랭크 표준 샘플을 첨가하는 방법을 사용하였다. 관련 단백질 용액을 첨가하는 이러한 방법은, 검정에 대해 미치는 단백질의 영향이 이미 알려져 있기 때문에, 선택되었다. 1차, 2차 및 3차 구조에서의 차이로 인해, 알칼리 처리에 대한 단백질의 내성은 상당히 상이할 수 있으며, 폴리소르베이트 80 측정을 위해 적용된 공정은 120 ℃에서 15 시간 동안 가열함을 포함하는 완전 알칼리 가수분해보다 덜 격렬하다.

본원에서 사용된 알칼리 가수분해 조건이, 매우 상이한 단백질 매트릭스에서의 폴리소르베이트 80의 정확한 분석을 허용하기에 충분한지를 규명하기 위해서, 알부민, 면역글로불린, 오로소무코이드, 안티트롬빈, 단백질 C 및 응고 인자 뿐만 아니라 전혈장을 포함하는 혈장 단백질 용액을 사용하여 폴리소르베이트 80의 회수율을 검사하였다. 규명된 샘플의 단백질 농도는 1 내지 50 ㎎/㎖의 범위였다. 표 1에는 첨가 실험의 결과가 수록되어 있고, 이러한 실험에서는 10 ppm, 50 ppm, 100 ppm 또는 200 ppm 폴리소르베이트 80이 블랭크 매트릭스에 첨가되었다.

규명된 모든 단백질 농도에서, 폴리소르베이트 80의 첨가량의 90 % 내지 106 %의 회수율이 관측되었다. 이러한 결과를 볼 때, 시험된 모든 샘플은, AOAC(American Association of Official Analytical Chemists)에 의해 발표된 분석물 농도의 함수로서의 회수율 데이터에 대한 기준을 충족시켰다. 이러한 명세 사항에 따르면, 100 ppm의 분석물은 90 % 내지 107 %로 회수되어야 하는 반면에, 10 ppm의 회수율에 대한 한계는, 신뢰성 있는 결과를 보장하기 위해서, 80 내지 110 %이다. 이러한 결과는, 적용된 가수분해 조건은, 적어도 규명되는 단백질 농도에 있어서, 단백질의 종류에 상관없이, 단백질의 방해 영향을 없애는데 적합하다는 것을 입증한다. 이는, 심지어는 매우 복잡하고 수백 가지의 상이한 단백질 뿐만 아니라 저분자량 성분을 함유한다고 알려진 혈장 매트릭스에서도 그러했다. 100 ppm 뿐만 아니라 200 ppm 폴리소르베이트 80의 첨가량은 6 % 미만의 표준편차로 회수될 수 있었다. 더욱이, 구조적으로 관련없는 단백질들이 상이한 농도에서 시험되었지만, 폴리소르베이트가 첨가된 정제된 단백질 중 어떤 것도 성공적인 회수를 방해하지 않았다. 따라서, 예를 들어 다양한 약물과 결합한다고 알려진, 3을 초과하는 등전점을 갖는 매우 산성인 단백질인 고도로 당화된 단백질 오로소무코이드 뿐만 아니라, 지방산과 결합할 수 있는 알부민은, 심지어는 사용된 높은 농도에서도 측정을 저해하지 않았다. 심지어는 정량 한계인 10 ppm 폴리소르베이트 80의 첨가 농도에서도, 검정은 존재하는 단백질 농도와 상관없이 정확한 결과를 제공하였다. 10 내지 30 단백질 ㎎/㎖의 농도의 발달성 aPCC에 10 ppm 폴리소르베이트를 첨가하였고, 검정에서의 단백질 농도와 상관없이, 94 % 및 100 %의 회수율이 수득되었고, 따라서 역시 상기에서 주어진 AOAC의 권장사항을 충족시킨다.

실시예 6: 검정 정밀성 및 직선성

분석 방법의 검증에 대한 공식 지침에 따르면, 방법의 정밀성은 일련의 샘플의 다중 측정의 개별 시험 결과들이 일치하는 정도인 반면에, 분석 공정의 직선성은 샘플 내의 분석물의 농도에 정비례하는 시험 결과를 제공하는 능력이다. 검정의 이러한 필수 성능 변수를 기술하기 위해서, 발달성 PCC 중 100 ppm 폴리소르베이트 80을 갖는 대조용 샘플을 사용하였다. 분석 결과는 도 2에 나타나 있다. 대조용 샘플의 21 개의 측정값을 사용할 때, 샘플의 평균값은 검정간(inter-assay) 정밀성 및 검정내(intra-assay) 정밀성에 대해 각각 4.0 % 및 3.7 %의 상대 표준편차(sd)를 가졌다. 두 편차 모두는, 100 ppm 분석물을 측정하는 측정일 이내 및 측정일들 사이의 정밀성에 대해 5.3 %인, AOAC에 의해 주어진 권장사항을 준수한다. 21 개의 측정값 중에서 단 하나만이 이중 표준편차에 의해 정의된 범위를 벗어나는 값을 달성하였지만, 이는 평균 ± 3 sd 범위 내에 포함되었다. 다이아그램은 또한 오차막대(error bar)에 의해 표시된 검정내 분산을 나타낸다. 검정의 정밀성을 또한 20 ppm의 농도에서 규명하였고, 여기서 3.0 %의 값이 관측되었다. 150 g 폴리소르베이트 80/ℓ의 높은 농도를 갖는, 불활성화 공정 동안에 채취된 샘플의 분석을 2.9 %의 평균 표준편차(n = 6)을 사용하여 수행하여, 이 방법이 바이러스 불활성화 공정 동안에 일어나는 높은 농도를 측정하는데에도 적합하다는 것을 확인하였다.

5 내지 400 ppm 폴리소르베이트 80의 범위를 망라하는 검정의 보정 곡선은 우수한 직선성을 나타내어, 농도와 320 ㎚에서 측정된 흡광도 사이에 평균상관계수 r = 0.999(n = 21)를 달성하였다. 이 선의 기울기는 7.7 %(n = 21)의 검정간 분산에 의해 특징지워졌고, 정량 한계(LOQ)는 ICH 권장사항에 따라 계산된 바와 같이 10 ppm ± 0.4 ppm인 것으로 관측되었다.

실시예 7: 상이한 기원의 폴리소르베이트의 비교

폴리소르베이트 80의 기원이 분석 성능에 영향을 주는지를 평가하기 위해서, 식물 및 소 원료물질로부터 유래된 배치들을 비교하였다. 두 형태 모두를 상기에서 기술된 단백질 용액의 존재 하에서 동일한 알칼리 가수분해 공정 후 분석하였다. 또한, 단백질의 부재 하에서 샘플 전처리 없이 티오시아네이토코발테이트 시약을 사용하는 비색 측정을 수행하여, 단백질을 제거하는 에탄올 침전 후 존재하는 조건을 모방하였다.

초기에 바이러스 불활성화에 사용된 폴리소르베이트 80 제제는 우지로부터 제조되었다. 소해면상뇌병증(BSE)의 출현으로, 치료용 단백질의 제조에 있어서 소 물질을 피하고 식물-유래된 세제로 바꾸는 것이 필수적이 되었다. 그 이후로 폴리소르베이트 80은 두 형태 모두로 이용되어 왔으며, 식물-유래된 트윈 80이 생물의약품 제조에서 바이러스 불활성화 공정에서 이미 사용되고 있다.

구성하는 지방산의 조성에 있어서 우지와 상이하고 올레산-농후 분획의 지방산 프로필에 있어서 상이할 수 있는 것으로 추정되는 식물 지방을 원료 물질로서 사용하는 것으로의 이러한 변화의 영향을 평가하기 위해서, 두 폴리소르베이트 제제의 반응성을 임의의 추가의 샘플 전처리 없는 검정을 사용하여 비교하였다. 그 결과가 도 3a에 나타나 있고, 여기서는 두 보정 곡선이 나타나 있다. 수득된 곡선들은 그의 기울기에 있어서 상이한데, 식물-유래된 폴리소르베이트는 동량의 물질에 비해 명백하게 더 높은 응답률을 나타내어, 0.0025의 기울기를 나타내고, 이에 비해 동물-유래된 세제는 0.0023의 기울기를 나타낸다. 더욱이, 여러 부류의 두 폴리소르베이트를 분석 시, 이러한 관찰은 배치와 상관이 없다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 발견은, 알칼리 가수분해 후 수득된 두 보정 곡선들이 구별불가능한 것으로 나타난 도 3b에 나타내어진 결과에 의해 추가로 뒷받침된다.

보정 곡선의 기울기의 측면에서 표현된 검정의 감도는 알칼리 가수분해가 없는 경우보다 다소 더 낮았다. 따라서, 알칼리 가수분해 후에는 0.0021의 평균 기울기가 관측되었고, 이는 가수분해가 없는 경우에 수득된 값보다 더 낮다. 이는 세제의 가수분해되지 않은 지방산 부분은 착물의 형성에 포함되거나 착물의 추출성에 영향을 줄 수도 있다는 것을 암시한다.

실시예 8: 트리톤™ X-100에 대한 검정 선택성의 평가

잘 알려진, 바이러스 불활성화를 위한 용매-세제 공정과 연관된, 밀접하게 관련있는 세제인 이소옥틸페놀 폴리옥시에틸렌 에테르(트리톤™ X-100) 뿐만 아니라 용매인 트리-n-부틸 포스페이트(TNBP)에 대한 분석의 선택성을 규명하였다. 따라서, 비색 측정의 선택성을 평가하기 위해서, 알칼리 가수분해 없이, 트리톤™ X-100 및 폴리소르베이트 80을 함유하는 수용액을 분석하였다. 또한, 트리톤™ X-100, 폴리소르베이트 80 및 TNBP를 1:0.3:0.3 %(w/v)의 비로 함유하는 3성분 용매-세제 불활성화 혼합물의 응답률을 알칼리 가수분해 후 폴리소르베이트 80 용액과 비교하였다. 역시, 약 25 ㎎/㎖의 단백질 농도를 갖는 발달성 aPCC를 단백질 매트릭스로서 사용하였다. 끝으로, 매우 높은 농도의 트리톤 X-100이, 알칼리 가수분해에 의한 샘플의 전처리 후에, 검정에 미치는 영향을, 단백질의 존재 하에서 및 단백질의 부재 하에서 평가하였다. 이러한 실험의 경우, 100, 300, 1000, 2000, 5000 및 10000 ppm의 트리톤™ X-100 농도를 적용하였다.

매우 통상적으로 사용되는 용매-세제(SD) 바이러스 불활성화 혼합물은, TNBP 와, 밀접하게 관련있는 두 세제인 트리톤™ X-100과 폴리소르베이트 80의 3성분 혼합물로 이루어진다. 따라서, 이러한 검정이 이러한 구조적으로 관련된 세제들을 식별할 수 있는지가 중요해진다.

둘 다는 비색 측정과 연관된 폴리에톡시기를 함유하므로, 트리톤™ X-100은 당연히 원래의 분석에 의해 측정될 수 있다. 도 4a에서는 임의의 샘플 전처리 없는 검정에서 두 세제의 응답률이 비교되어 있다. 12 내지 200 ppm의 범위에서 측정된 두 세제의 반응성은 현저하게 상이하였다. 트리톤™ X-100은 전체 농도 범위에 걸쳐 폴리소르베이트 80 응답률의 단지 약 70 %를 제공하였다.

이러한 발견, 및 특히 두 세제가 상이한 응답 인자를 갖는다는 사실로 인해, 두 세제가 존재하면, 원래의 검정을 사용할 수 없다. 이러한 검정에서 알칼리 가수분해에 의한 샘플 전처리를 포함시키면 완전히 상이한 효과가 관찰된다. 도 4b에는, 폴리소르베이트 80 단독의 곡선과 비교된, 1.0:0.3:0.3 %(w/v)의 비의 트리톤™ X-100, 폴리소르베이트 80 및 TNBP로 이루어진 이미 상기에서 기술된 SD 혼합물의 보정 곡선이 나타나 있다. 보정 곡선들의 관련 변수들인 기울기 및 절편을 비교해보면 본질적으로 차이를 알 수 없다. 표 2에 나타난 바와 같이, 두 경우 모두에서 0.0023인 기울기와, 폴리소르베이트의 경우에 -0.005이고 SD-혼합물에서 -0.007인 절편 중 어떤 것도 상이하지 않다.

이러한 결과는, 3배 더 높은 트리톤™ X-100 농도에도 불구하고, 검정을, 밀접하게 관련있는 세제인 트리톤™ X-100에 의한 임의의 검출가능한 간섭 없이 SD-혼합물 내의 폴리소르베이트 80 농도를 분석하는데에 적용할 수 있다는 것을 보여준다. 놀랍게도, 알칼리 가수분해는 비색 측정의 선택성을 향상시킬 수 있다. 트리톤™ X-100의 반응성이 완전히 없어졌는지 아니면 약간만 없어졌는지를 밝히기 위한 추가의 실험을 수행하였다. 표 4에 요약된 바와 같이, 300 ㎍/㎖ 미만의 트리톤™ X-100을 함유하는 용액은 임의의 측정가능한 응답률을 나타내지 않고, 따라서 측정값에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 알칼리 가수분해는 실험에 의해 드러난 바와 같이 검정의 선택성을 상당히 증가시키며, 여기서 30 배 과량의 트리톤™ X-100는 심지어는 단지 10 ppm인 폴리소르베이트 80의 신호에 미치는 임의의 측정가능한 영향을 나타내지 않았다. 심지어는, 폴리소르베이트 80의 보정된 농도 범위를 훨씬 초과하는 1000 내지 10000 ppm의 농도의 트리톤™ X-100도 약간만 반응하는 것으로 관측되었는데, 트리톤™ X-100의 반응성의 약 99 %가 비색 측정 전에 수행된 알칼리 가수분해에 의해 없어졌다.

결론

상이한 가수분해 시간을 사용한 상기 실험의 결과(실시예 4 참조)는 15 분 정도로 짧은 시간 동안의 알칼리 처리도 이미 주어진 단백질 용액의 영향을 감소시키기에 충분하다는 것을 보여주며, 이는 지금까지 에탄올에 의한 단백질 침전에 의해 폴리소르베이트 농도의 명백한 과대추정이 초래되었음을 보여준다. 전하 및 크기가 상이한 수많은 단백질을 사용하여, 단백질 매트릭스의 상당한 간섭 없이 폴리소르베이트 80을 분석할 수 있다는 것을 입증할 수 있었다(실시예 5 참조). 특히, 50 ㎍ 폴리소르베이트 80/㎖를 약 50 ㎎/㎖의 단백질 농도에서 오로소무코이드(α₁-산 당단백질)에서 99 %의 회수율로 측정할 수 있었다. 이러한 매우 산성인 단백질을 임의의 간섭 없이 분석할 수 있다는 사실은 알칼리 가수분해에 의한 샘플 전처리의 적합성을 입증한다. 더욱이, 지방산과 결합한다고 잘 알려진 단백질인 알부민 내의 폴리소르베이트 80을 어려움 없이 측정하였다. 폴리소르베이트 80은 분자당 평균적으로 하나의 지방산 잔기를 함유하기 때문에, 친유성 잔기가 알부민과 결합할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 알부민에서의 회수율은 이러한 측면에서 어떤 우려도 일으키지 않았다.

혈장 내에 존재하는 저분자량 생물학적 화합물(예컨대, 예를 들어, 아미노산, 당, 펩티드, 우레아, 크레아티닌)에 의한 간섭도 알칼리 가수분해에 의해 유리하게 회피될 수 있다. 전혈장은 예를 들어, 에탄올에 의해 침전되지 않는, 더 이상 명시되지 않는 몇몇 성분을 함유한다. 본 발명의 방법의 적합성을, 30 ㎎/㎖의 단백질 함량으로 대략 절반으로 희석된 혈장을 사용하여, 성공적으로 입증하였다. 따라서, 알칼리 가수분해의 적합성을 매우 상이한 단백질 용액에서 판명할 수 있었다. 이와 동시에, 모든 수행된 회수율 실험의 결과는 동료전문가에 의해 검증된(peer-verified) 방법에 대한 AOAC에 의해 권장된 기준을 준수하였고, 관측된 정밀성은 이러한 시스템을 품질 관리 프로그램의 일부로서 사용할 수 있게 한다.

BSE의 출현으로 인해, 혈장 분획화 산업에서 사용되는 모든 보조 물질을 신중하게 검사하게 되었다. 폴리소르베이트 80 내의 올레산을 위한 원료물질로서 식물 지방이 우지를 대체하였다. 올레산의 농후화를 위한 다소 조질 분획화 공정에 있어서 합성에 사용되는 상이한 원료물질들을 비교해보면, 소 또는 식물 지방으로부터 수득된 폴리소르베이트의 지방산 조성은 적어도 약간 상이할 수 있다는 것이 명백해진다. 가장 통상적인 식물 지방은 우지에 비해 보다 높은 다중불포화 C₁₈ 지방산 함량에 의해 특징지워진다. 폴리소르베이트 트윈™ 20(라우르산 에스테르), 트윈™ 40(팔미트산 에스테르) 및 트윈™ 80(올레산 에스테르)는 티오이소시아네이토코발테이트에 대해 상이한 착물화 성질을 갖고, 620 ㎚에서 트윈™ 20 및 40 보다 트윈™ 80이 더 낮은 수성 착물 흡광도를 가짐이 관찰되었다. 약 80 % 올레산을 함유하는 트윈™ 80의 지방산 프로필이 가장 균일하고 트윈™ 20, 40 및 60(스테아르산 에스테르)의 것과 상당히 상이한 반면, 지방산 조성에 있어서 식물-유래된 폴리소르베이트 80과 동물-유래된 폴리소르베이트 80 사이의 차이가 미미하다는 것은, 샘플의 제조 없이, 식물-유래된 물질의 보다 높은 반응성으로서 관찰된 측정 차이를 가장 그럴듯하게 설명해준다. 이러한 설명은, 두 원료 물질로부터 유래된 폴리소르베이트 사이의 이러한 차이는 알칼리 가수분해에 의해 완전히 없어질 수 있다는 사실(실시예 7 참조)에 의해 추가로 뒷받침된다. 이러한 샘플 처리는 단백질 분해를 초래할 뿐만 아니라, 폴리소르베이트의 비누화를 초래하여 세제로부터의 지방산 잔기의 절단을 유발하고, 이로써 이들은 비색 측정 또는 형성된 착물의 추출성을 방해할 수 없다. 세제의 지방산 잔기의 임의의 변동은 더 이상 측정에 영향을 미치지 못하고, 방법의 완건성(robustness)은 상당히 향상될 수 있다. 두 폴리소르베이트 80 변형물들 사이의 이러한 예측하지 못한 차이를 설명하고 없앰으로써, 비슷한 것끼리 비교하는 기본 원칙은 이 경우에는 중요성을 잃은 것처럼 보이며, 검정의 보정을 원료 물질에 상관없이 폴리소르베이트 80을 사용하여 수행할 수 있다.

재조합 단백질을 위해 개발되고 더 이상 특징지워지지 않은 비색 방법을 사용하여 수득된, 이전에 관측된, 620 ㎚에서의 30 ppm 폴리소르베이트 80의 정량 한계와, 이러한 실험에서 측정된 320 ㎚에서의 10 ppm 폴리소르베이트 80의 LOQ는 잘 일치하였는데, 왜냐하면 흡광계수 ε_{320 nm}는 ε_{620 nm}보다 약 6 배 더 높기 때문이다. 보다 더 중요한 발견은 폴리소르베이트에 대한 알칼리 가수분해의 선택성이 유리하게 향상되었다는 것이다. 종종 폴리소르베이트와 함께 적용되는 이소옥틸페놀 폴리옥시에틸렌 에테르 트리톤™ X-100의 비색 응답률을, 두 폴리옥시에틸화 세제의 정량(가수분해를 수행하지 않을 때 폴리소르베이트와 트리톤™ X-100의 합, 및 가수분해를 수행한 후 잔여 폴리소르베이트 농도를 뺀 트리톤™ X-100)이 실현가능해질 정도로 많이 없앨 수 있다(실시예 8 참조). 폴리옥시에틸렌 페놀 에테르 가교는 가장 그럴듯하게는 목재 리그닌 내의 β-히드록시 알킬페놀 에테르와 유사한 이유로 알칼리 가수분해에 취약할 수 있기 때문에, 에테르 절단 시 유리 단쇄 폴리에틸렌 글리콜(n_av ~ 9) 쇄가 유리될 것이고, 이것의 티오시아네이토코발테이트 착물은 유기상 내로 정량적으로 추출되지 않고 분명히 1.5 % 이하로만 추출될 것이라고 추정된다. 따라서, 심지어는 300 ㎍/㎖의 농도에서도, 트리톤 X-100은 측정가능한 간섭을 나타내지 않는다.

모든 결과를 취합해 볼 때, 샘플 전처리를 도입하면, 혈장 단백질의 존재 하에서 및 또한 트리톤™ X-100의 존재 하에서의 폴리소르베이트 80과 같은 폴리소르베이트의 측정을 위한 매우 간단하고 융통성 있는 방법을 수행할 수 있다. 이 방법을 적당한 정확성 및 정밀성을 갖고서 수행할 수 있고, 따라서 이 방법은 바이러스 불활성화 공정 동안 뿐만 아니라 최종 용기 내에서 예를 들어 폴리소르베이트 80의 농도를 측정하는 것을 허용한다. 더욱이, 주로 단백질 용액의 본질과 상관없이 단백질의 존재 하에서 검정을 수행할 수 있도록 고안된 알칼리 가수분해 단계는 흔히 적용되는 세제인 트리톤™ X-100에 의한 간섭과 관련하여 검정의 선택성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 끝으로, 이 방법은, 비누화되면 비색 측정을 방해하는 폴리소르베이트의 지방산 잔기의 변동에 대해 완건성을 갖게 되었다.

Claims (17)

1. (a) 샘플을 알칼리 가수분해하는 단계;
   (b) 알칼리 가수분해 후 샘플을 중화시키는 단계;
   (c) 임의로, 중화된 샘플로부터 변성된 침전물을 제거하는 단계;
   (d) 임의로 여과된 샘플에 티오시아네이토금속 착물의 수성 혼합물을 첨가하여 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토금속 착물을 형성하는 단계;
   (e) 단계 (d)에서 형성된 상기 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토금속 착물을 비-수혼화성 유기 용매 내로 추출하는 단계;
   (f) 단계 (e)에서 수득된 추출물의 흡광도를 측정하여 단계 (d)에서 형성된 상기 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토금속 착물의 양을 정량하는 단계; 및
   (g) 단계 (f)에서 측정된 상기 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토금속 착물의 양으로부터 샘플 내에 함유된 폴리소르베이트의 양을 계산하는 단계
   를 포함하는, 단백질-함유 샘플 내의 폴리소르베이트의 측정 방법.
2. 제1항에 있어서, 폴리소르베이트가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(폴리소르베이트 80)인 방법.
3. 제2항에 있어서, 폴리소르베이트 80이 동물로부터 유래된 것인 방법.
4. 제2항에 있어서, 폴리소르베이트 80이 식물로부터 유래된 것인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서 첨가되는 티오시아네이토금속 착물이 Co(NO₃)₂·6H₂O와 NH₄SCN의 수성 혼합물이고, 형성된 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토금속 착물이 소르비탄 폴리옥시에틸렌티오시아네이토코발테이트(II) 착물인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 수성 혼합물이 3 %(w/v)의 Co(NO₃)₂·6H₂O 및 20 %(w/v)의 NH₄SCN을 함유하는 방법.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 이소옥틸페놀 폴리옥시에틸렌 에테르를 추가로 함유하는 방법.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 트리-n-부틸 포스페이트(TNBP)를 추가로 함유하는 방법.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 알칼리 가수분해가, NaOH, KOH, LiOH, Ba(OH)₂, Sr(OH)₂, Ca(OH)₂, 테트라메틸암모늄 히드록시드, 테트라에틸암모늄 히드록시드, 테트라프로필암모늄 히드록시드, 테트라부틸암모늄 히드록시드, 및 동종성 또는 이종성으로 치환된 4차 알킬암모늄 히드록시드 및 시클로알킬암모늄 히드록시드로 이루어진 군으로부터 선택된 알칼리성 약품을 사용하는 가수분해를 포함하는 방법.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 알칼리 가수분해를 80 ℃ 내지 100 ℃의 범위의 온도에서 15 분 이상 수행하는 방법.
11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 알칼리 가수분해가, 3 N 이상의 NaOH를 사용하는 95 ℃ 내지 100 ℃의 온도에서 45 분 이상의 가수분해를 포함하는 방법.
12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 사용되는 여과기가 폴리옥시에틸렌 소르비탄과 결합하지 않는 것인 방법.
13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)에서 사용되는 비-수혼화성 유기 용매가 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, o-디클로로벤젠, 브로모포름 및 트리클로로에틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 비-수혼화성 유기 용매가 메틸렌 클로라이드인 방법.
15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)에서 수득된 추출물의 흡광도를 단계 (f)에서 324 ㎚에서 측정하는 방법.
16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 후 및 단계 (b) 전에,
    (a2) 알칼리 가수분해 후 샘플을 냉각시키는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 후 및 단계 (c) 전에,
    (b2) 샘플을 실온에서 30 분 이상 유지하여 변성된 침전물을 형성시키는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.

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