KR20200020853A - 폴리소르베이트 정량 어세이 - Google Patents

Abstract

본발명은 다음 단계를 포함하는 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 방법에 관한 것이다:
a) 적어도 하나의 폴리소르베이트를 포함하는 샘플을 제공하는 것;
b) 샘플을 카보시아닌 염료와 조합시키는 것;
c) 상기 혼합물의 형광을 측정하는 것; 및
d) 상기 형광을 폴리소르베이트의 양과 상호비교하는 것.

Description

폴리소르베이트 정량 어세이

폴리소르베이트는 약제학적 제품 및 식품 산업에서 부형제로서 널리 사용되는 비-이온성 계면활성제의 패밀리이다.

폴리소르베이트 20 (PS20) 및 폴리소르베이트 80 (PS80) - 또한 Tween® 20 및 Tween® 80 로서 공지된 -는 인터페이스에의 흡착 및 관련된 불안정성에 대해 치료적 단백질 보호하기 위해 사용되는 가장 통상의 계면활성제이다. 생물약제학적 제품 내 단백질 안정화에 대한 PS20 및 PS80의 기여는 널리 인정되고, 둘 다 규제 당국에 의해 허가된 비경구 투여용 부형제이다. 펩티드, 단백질, 항체 및 백신을 함유하는 생물약제학적 제품의 대부분은 폴리소르베이트로 제제화된다. 예를 들어, 약 80%의 상업적 모노클로날 항체 (MAbs)은 PS20 또는 PS80를 함유한다. 그의 높은 친수성-친유성 균형 (HLB) 값 및 낮은 임계 미셀 농도 (CMC)는 심지어 낮은 농도에서도 그의 높은 표면 활성을 설명한다. 생물약제 내 대표적 폴리소르베이트 농도는 0.001 및 0.1% (w/v) 사이이고, 0.01 및 1 mg/ml에 상응한다.

비록 안정화의 분자 상세사항은 여전히 완전히 이해되지 않지만, 폴리소르베이트가 두 개의 상이한 메카니즘, 즉, (i) 소수성 인터페이스에 대한 경쟁적 흡착 및/또는 (ii) 단백질에 대한 직접 결합를 통해 단백질 안정성에 기여한다고 공지되어 있다. 첫번째 경우, 폴리소르베이트는 단백질보다 유닛 면적 당 더 높은 흡착 에너지를 나타내고, 이에 의해 단백질과 효과적으로 경쟁하고 그리고 소수성 인터페이스에 대해 흡착에 대해 보호한다. 또한, 폴리소르베이트는 단백질과 직접 상호작용하여 노출된 소수성 영역에 결합하고 보호함에 의해 용액 내 그의 안정성을 증가시킬 수 있다. 이는 단백질-단백질 상호작용을 감소시킴에 의해 응집을 방지한다. 특정의 단백질의 안정화 내 이들 두 개의 메카니즘 중 어느 것이 단백질- 및 폴리소르베이트-의존적이다.

폴리소르베이트는 양친성 구조이다. 그의 친수성 분획은 소르비탄 헤드 기를 포함하고 각각의 히드록실 기는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (PEG/ 폴리에틸렌 옥사이드 사슬/ POE)에 결합된다. 소수성 분획은 그의 히드록실 기 내 에스테르화된 지방산 (FA)을 특징으로 한다. 이론적으로, 상이한 폴리소르베이트는 그러한 지방산에 의해 차별활될 수 있다. 사실, 상업적으로 이용가능한 폴리소르베이트는 구조적으로 관련된 분자를 함유하고 그리고 총 폴리소르베이트 재료의 단지 대략 20 % (w/w)가 이론 분자 구조에 따른다.

합성 동안 형성된 부산물 외에, 분해 반응 (산화 및 가수분해)은 또한 폴리소르베이트 용액의 이질성에 기여할 수 있다. 폴리소르베이트 분해 생성물의 형성은 제제 이내 계면활성제 농도의 손실을 유발할 수 있다. 이와 별개로, 그의 계면활성제 특성은 소실될 수 있다. 이는 잠재적으로 단백질 안정성에 영향을 미치고 그리고 또한 단백질 응집물 및 입자의 형성을 유발할 수 있다. 따라서, 분해 반응는 방지되어야만 한다. 폴리소르베이트 분해의 일반적 개요 및 그의 분해의 분석은 Martos, A. et. al.; Journal of Pharmaceutical Sciences; 2017; doi: 10.1016/j.xphs.2017.03.001에서 찾을 수 있다.

치료적 단백질 제제 내 폴리소르베이트 농도 그리고 폴리소르베이트 분해를 모니터링하는 것이 중요하기 때문에, 샘플의 폴리소르베이트 함량, 그리고 그의 분해 생성물의 함량을 분석하는 몇몇 기술이 개발되었다. 일반적으로, 단백질을 제거 (예를 들어 유기 용매에 의한 단백질 또는 고체 상 추출에 의해)하기 위해 샘플 제조 후, 상기 샘플은 상기 샘플 성분 (폴리소르베이트 종)을 분리하고 질량 분광계, ELSD 또는 CAD 검출의 적용에 의한 추가 분석을 위해 제조하기 위해 역상 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 처리된다. 또한, 폴리소르베이트 80에 대한 올레산의 가수분해 및 방출 후 UV/Vis 검출이 적용될 수 있다. 대부분의 이들 방법은 복잡하고 그리고 시간 소모적이고 단백질에 의한 간섭에 민감하다. 이후 정량 목적을 위해 이 형광 염료가 적용된다. 가장 흔한 어세이는 N-페닐-1-나프틸 아민 (NPN)에 기초한 형광 미셀 어세이 (FMA)로서, 이는 형광 염료와, 특히 CMC 위에서 미셀 내 존재하는 소수성 환경과의 상호작용에 기초한다. 이 어세이의 단점은 PS에 대한 특이성이 없고 (즉 NPN는 단백질, 실리콘 오일과 상호작용하고 용액 점도에 영향받을 수 있다), PS 정량은 단지 CMC 위의 농도에서만 가능하다는 것이다.

이와 같이 본발명의 목적은 폴리소르베이트의 신속한 및 이상적으로는 자동화 또는 반-자동화 검출 및 정량을 가능하게 하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본발명자는 샘플 내 폴리소르베이트의 양은 카보시아닌 염료, 특히 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸-인도카보시아닌 퍼콜레이트 (DiI) 또는 그의 유도체 DiD (1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카보시아닌 4-클로로벤젠설포네이트,) 및 DiO (3,3′-디옥타데실옥사카보시아닌 퍼콜레이트) 로부터 선택되는 카보시아닌 염료를 사용하여 정확히 정량될 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하였다.

따라서, 제 1 양상에서 본발명은 다음 단계를 포함하는 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 방법에 관한 것이다:

a) 적어도 하나의 폴리소르베이트를 포함하는 샘플을 제공하는 것;

b) 샘플을 카보시아닌 염료와 조합시키는 것;

c) 상기 혼합물의 형광을 측정하는 것; 및

d) 상기 형광을 폴리소르베이트의 양과 상호비교하는 것.

추가 양상에서, 본발명은 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 카보시아닌 염료의 용도에 관한 것이다.

본발명은 또한 웰-플레이트, 가령 96-웰 플레이트에 관한 것이고, 여기서 적어도 일부 웰 또는 심지어 각각의 웰은 카보시아닌 염료의 정의된 양을 포함한다.

부가적 양상에서, 본발명은 다음을 포함하는 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 키트에 관한 것이다:

a) 카보시아닌 염료;

b) 희석 완충제;

c) 임의로 보정 샘플.

특정의 구체예에서, 상기 키트는 각각의 웰 내에 카보시아닌 염료의 정의된 양을 포함하는 웰 플레이트를 포함한다.

도 1: 바람직한 염료 1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카보시아닌 퍼콜레이트 (DiI) (A), 3,3'-디옥타데실옥사카보시아닌 퍼콜레이트 (DiO) (B), 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카보시아닌 4-클로로벤젠설포네이트 염 (DiD) (C)의 구조.
도 2: DiI의 존재 하에서 폴리소르베이트 20 (PS20)의 형광 방출 특성:
(A) PS20-DiI-형광 방출 스펙트럼 (550 nm에서의 여기 (Exc.)). DiI (357 nM)의 부가 후 상이한 PS20 농도 (0.0002-0.0025 % (w/v))의 형광 스펙트럼 (방출 (EM.) 560-620 nm). 큐벳-기초 분광형광계 내에서 측정을 수행하였다: 0 % (w/v) PS20 -..-..-, 0.0002 % (w/v) PS20 -.-.-.-, 0.0003 % (w/v) PS20...., 0.0005 % (w/v) PS20 - - - -, 0.0009 % (w/v) PS20 - - - -, 0.0015 % (w/v) PS20 -------, 0.0025 % (w/v) PS20 -------.
(B) (A)의 낮은 강도 범위의 확대.
(C) 615 nm에서의 PS20-DiI-보정 곡선 (0.0008-0.0021 % (w/v)). 상응하는 PS20 농도에 대해 플로팅된 관찰된 최대 형광 강도.
도 3: DiD의 존재하 PS20의 형광 방출 특성.
(A) PS20-DiD-형광 방출 스펙트럼 (Exc. 646 nm). DiD (357 nM)의 부가 후 상이한 PS20 농도 (0.0002-0.0025 % (w/v))의 형광 스펙트럼 (656-800 nm). 큐벳-기초 분광형광계 내에서 측정을 수행하였다: 0 % (w/v) PS20 -..-..-, 0.0002 % (w/v) PS20 -.-.-.-, 0.0003 % (w/v) PS20...., 0.0005 % (w/v) PS20 - - - -, 0.0009 % (w/v) PS20 - - - -, 0.0015 % (w/v) PS20 -------, 0.0025 % (w/v) PS20 -------.
(B) (A)의 낮은 강도 범위의 확대.
(C) 665 nm에서의 PS20-DiD-보정 곡선 (0.0008-0.0021 % (w/v)). 상응하는 PS20 농도에 대해 플로팅된 관찰된 최대 형광 강도.
도 4: DiI의 존재 하에서 폴리소르베이트 80 (PS80)의 형광 방출 특성.
(A) PS80-DiI-형광 방출 스펙트럼 (Exc. 550 nm). DiI (357 nM)의 부가 후 상이한 PS80 농도 (0.0002-0.0025 % (w/v))의 형광 스펙트럼 (560-620 nm). 큐벳-기초 분광형광계 내에서 측정을 수행하였다: 0 % (w/v) PS80 -..-..-, 0.0004 % (w/v) PS80 -.-.-., 0.0006 % (w/v) PS80..., 0.0010 % (w/v) PS80 - - - -, 0.0016 % (w/v) PS80 - - -, 0.0027 % (w/v) PS80 -----, 0.0045 % (w/v) PS80 ------.
(B) (A)의 낮은 강도 범위의 확대.
(C) 615 nm에서의 PS80-DiI-보정 곡선 (0.0007-0.0018 % (w/v)). 최대 형광 강도에 대해 플로팅된 관찰된 상응하는 PS80 농도. 플레이트-리더에서 측정을 수행하였다.
도 5: DiD의 존재하 PS80의 형광 방출 특성.
(A) PS80-DiD-형광 방출 스펙트럼 (Exc. 646 nm). 형광 스펙트럼 (656-800 nm)의 상이한 PS80 농도 (0.0002-0.0045 % (w/v))의 부가 후 DiD (357 nM). 큐벳-기초 분광형광계 내에서 측정을 수행하였다: 0 % (w/v) PS80 -..-..-, 0.0004 % (w/v) PS80 -.-.-.-, 0.0006 % (w/v) PS80...., 0.0010 % (w/v) PS80 - - - -, 0.0016 % (w/v) PS80 - - - -, 0.0027 % (w/v) PS80 -------, 0.0045 % (w/v) PS80 -------
(B) (A)의 낮은 강도 범위의 확대.
(C) 665 nm에서의 PS80-DiD-보정 곡선 (-●- 0.0011-0.0026 % (w/v) 및 --△-- 0.0014-0.0026 % (w/v), 각각). 상응하는 PS80 농도에 대해 플로팅된 관찰된 최대 형광 강도. 플레이트 리더에서 측정을 수행하였다.
도 6: 실리콘 오일 액적의 영향. 물 (----), 0.002 % (w/v) (- - -) 및 0.03 % (w/v) (….)의 농도에서 실리콘 오일의 수성 용액에 대해 큐벳 형광계 내 측정된550 nm에서의 여기 후 DiI (357 nM)의 형광 방출 스펙트럼 (560-620 nm).
도 7: 플레이트-리더에서 646 nm에서 여기 후, 665에서 DiD (357 nM)의 형광 방출 강도를 나타내는 보정 곡선 (단백질 --●-- 없이 제조됨). □로서 나타낸 0.00175 % (w/v)의 이론 농도를 갖는 샘플 내 PS20의 정량을 위한 보정 곡선을 사용하였다.
도 8: 플레이트-리더에서 550 nm에서의 여기 후 665에서 DiI (357 nM)의 형광 방출 강도를 나타내는 보정 곡선 (단백질 --●-- 없이 제조됨). □로서 나타낸 0.0007 % (w/v)의 이론 농도를 갖는 샘플 내 PS80의 정량을 위한 보정 곡선을 사용하였다.
도 9: 플레이트-리더에서 550 nm에서의 여기 후615 nm에서의 DiI (357 nM)의 형광 방출 강도를 나타내는 보정 곡선 (단백질 없이 --●-- 및 15 mg/mL IgG1와 함께 --□-- 제조됨). 0.002 % (w/v) PS20의 이론 농도를 갖는 샘플 1 내지 5 내 PS20의 정량을 위한 보정 곡선을 사용하였다.
도 10: 직접 37℃에서 96-웰 플레이트 내 교반 (40 rpm)을 포함하는 357 nM DiI와 PS20 샘플의 배양 후 DiI 형광 강도 (Exc. 550 nm).
(A) 15 min (●) 후 및 30 min 배양 (△) 후 0 min (□)에서 DiI의 부가 직후 측정된 565 nm에서의 방출을 사용하는 PS20-DiI-보정 곡선 (0.0004-0.0015 % (w/v)).
(B) 15 min (●) 후 및 30 min 배양 (△) 후 0 min (□)에서 DiI의 부가 직후 측정된 615 nm에서의 방출을 사용하는 PS20-DiI-보정 곡선 (0.0004-0.0015 % (w/v)).
도 11: 직접 96-웰 플레이트 내 357 nM DiI을 갖는 PS20 샘플의 배양 후 DiI 형광 강도 (Exc. 550 nm). 40 rpm에서 37℃에서 교반하면서 배양 (□). 37℃에서 교반 없이 배양 (■). 교반 없이 실온에서 보텍싱 (●) 및 배양 (△).
(A) 565 nm에서의 방출을 사용하는 PS20-DiI-보정 곡선 (0.0004-0.0015 % (w/v)).
(B) 615 nm에서의 방출을 사용하는 PS20-DiI-보정 곡선 (0.0004-0.0015 % (w/v)).
도 12: DiI의 세 개의 로트 (로트 1 □, 로트 2 ● 및 로트 3 △)에 대한 PS20-DiI-보정 곡선 (0.0004-0.0030 % (w/v)). 40 rpm에서 교반하면서 37℃에서15 분 동안 96 웰 플레이트 내에서 357 nM DiI을 갖는 PS20 의 배양 후 DiI 형광 강도 (Exc. 550 nm; Em. 565 nm).
도 13: 세 개의 상이한 다-공정서(multicompendial) PS20 (□ 타입 1, ● 타입 2 및 △ 타입 3)에 대한 PS20-DiI-보정 곡선 (0.0004-0.0020% (w/v)). 40 rpm에서 37℃에서 교반하면서 37℃에서 15 분 동안96 웰 플레이트 내에서 357 nM DiI을 갖는 PS20 샘플의 배양 후 DiI 형광 강도 (Exc. 550 nm; Em. 565 nm).
도 14: 세 개의 상이한 다-공정서(multicompendial) PS80 (□ 타입 1, ● 타입 2 및 △ 타입 3)에 대한 PS80-DiI-보정 곡선 (0.0004-0.0020% (w/v)). 40 rpm에서 교반하면서37℃에서 15 분 동안96 웰 플레이트 내에서357 nM DiI을 갖는 PS80 샘플의 배양 후 DiI 형광 강도 (Exc. 550 nm; Em. 565 nm).
도 15: 1-15 mg/ml IgG1 (흑색 막대), 1-10 mg/mL Fc-융합 단백질 (줄무늬 막대) 및 1-5 mg/ml IgG 3 (백색 막대)의 상이한 농도의 존재 하에서 ~ 0.006% (w/v) PS20 (A) 및 PS80 (B)를 갖는 350 nM DiI의 형광 강도 (Exc: 550 nm, Em: 615 nm).
도 16: 동결건조 이전 (흑색 막대), 및 96-웰 플레이트 내 동결건조 및 재구성 후 (백색 막대) 350 nM DiI의 형광 강도 (Exc: 550 nm, Em: 615 nm).
1: MilliQ 물 내350 nM DiI.
2: MilliQ 물 내 350 nM DiI + 0.002% (w/v) PS20.
3: 10 mM 포스페이트 완충제, pH 6.0 + 1% (w/v) 만니톨 내 350 nM DiI.
4: 10 mM 포스페이트 완충제, pH 6.0 + 1% (w/v) 만니톨 내 350 nM DiI + 0.002% (w/v) PS20.
5: 10 mM 포스페이트 완충제, pH 6.0 내 350 nM DiI.
6: 10 mM 포스페이트 완충제, pH 6.0 내 350 nM DiI + 0.002% (w/v) PS20.
[발명의 내용]
본발명은 형광 카보시아닌 염료를 사용하여 샘플 내 폴리소르베이트를 정량하는 새로운 방법에 관한 것이다.
이와 같이, 본발명은 제 1 양상에서, 다음 단계를 포함하는 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 방법에 관한 것이다:
a) 적어도 하나의 폴리소르베이트를 포함하는 샘플을 제공하는 것;
b) 샘플을 카보시아닌 염료와 조합시키는 것;
c) 상기 혼합물의 형광을 측정하는 것; 및
d) 상기 형광을 폴리소르베이트의 양과 상호비교하는 것.
임의로, 상기 샘플은 액체 샘플이고 그대로, 또는 적절한 희석 후 상기 방법에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 샘플은 고체 재료 가령 동결건조된 조성물을 나타낼 수 있다. 이 경우, 상기 샘플은 단계 c) 수행 이전, 또는 심지어 단계 b) 수행 이전 재구성된다. 바람직하게는 적어도 하나의 폴리소르베이트를 포함하는 상기 샘플은 수성 샘플 또는, 고체 재료로서 제공된다면, 단계 c) 또는 b) 이전 수성 샘플 내로 수성 액체 용매와 함께 재구성된다. 그러나, 형광 측정을 허용하는 어떠한 샘플도 적절하다. 일부 구체예에서, 상기 샘플은 비-수성 용매 내 액체 샘플이다.
많은 경우, 상기 샘플은 하나 이상의 단백질, 펩티드, 작은 분자 및/또는 다른 화합물을 부가적으로 포함한다. 바람직하게는 상기 샘플은 수성 완충제를 포함한다. 따라서, 바람직한 구체예에서 상기 샘플은 완충제를 포함한다.
적절한 완충제는 본업계에서의 숙련가에게 공지되어 있다. 단백질 또는 펩티드를 포함하는 샘플에 대해 사용된 일부 통상의 완충제는 TRIS, HEPES, 아세테이트, 히스티딘, 시트레이트, 숙시네이트, 글리신 및 포스페이트를 포함하다.
가장 바람직한 구체예에서 상기 샘플은 적어도 하나의 폴리소르베이트를 포함하는 수성 완충된 용액이다.
대안적으로, 상기 샘플은 액체 비-수성 샘플이다. 상기 샘플의 용매는 적절한 용매일 수 있다. 적절한 용매는, 비제한적으로 메탄올, 에탄올 또는 DMSO을 포함하다. 임의로, 상기 샘플은 물 및 유기 용매 가령 메탄올, 에탄올, 또는 DMSO를 둘 다 함유할 수 있다.
상기 샘플은 임의로 하나 이상의 추가로 화합물를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 샘플은 하나 이상의 약제학적으로 또는 화장품적으로 활성인 화합물을 부가적으로 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 샘플은 약제학적으로 활성인 화합물을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 샘플은 단백질, 항체, 펩티드, 핵산, 바이러스 유사 입자, 세포, 박테리아, 바이러스 및 작은 분자를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 약제학적으로 활성인 화합물을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서 상기 샘플은 단백질을 포함한다.
상기 방법은 폴리소르베이트 20 또는 80, 비제한적으로 이들 폴리소르베이트를 정량하기에 특히 적절하다. 상기 방법은 다른 폴리소르베이트, 및 가능하게는 다른 계면활성제에 적절하다. 바람직한 구체예에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20이다.
카보시아닌 염료는 바람직하게는 친유성 카보시아닌 염료이다. 현재 가장 바람직한 카보시아닌 염료는 소위 DiI-패밀리의 염료, 특히 DiI (1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카보시아닌 퍼콜레이트), DiO (3,3'-디옥타데실옥사카보시아닌 퍼콜레이트) 및 DiD (1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카보시아닌 4-클로로벤젠설포네이트 염)이다. 이들 염료의 구조는 도 1 A, B 및 C에서 나타낸다. 추가로 적절한 카보시아닌 염료는 CM-DiI이다.
따라서, 본발명의 바람직한 구체예에서 카보시아닌 염료는 DiI, DiO, DiD 및 CM-DiI를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 염료이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 카보시아닌 염료는 DiI이다.
본발명의 방법는 형광 검출이 종래의 방법보다 빠르고 저렴하고 쉽게 자동화 또는 반-자동화할 수 있다는 장점을 가진다. 본발명의 방법은 또한 통상의 NPM 어세이보다 더욱 특이적이다.
상기 방법은 적절한 형광 검출기, 바람직하게는 형광계를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 이는 큐벳 기초 형광계일 수 있다. 대안적 구체예에서, 상기 방법은 플레이트 리더 기초 형광 분광계 상에서 수행된다. 대안적으로, 형광 검출기 사용될 수 있고 상기 샘플은 칼럼과 함께 또는 없이 HPLC/UPLC 시스템에 의해 검출기 내로 도입될 수 있다.
일반적으로, 정의된 파장에서의 형광 강도가 측정되는 것이 바람직하다. 본발명자는 폴리소르베이트의 정량을 허용하는 상이한 카보시아닌 염료에 대한 적절한 파장을 확인할 수 있었다.
카보시아닌 염료 및 폴리소르베이트에 따라서 여기 파장 그리고 검출된 방출 파장이 적응되어야 한다. 예를 들어, 본발명자는 DiI 형광은 폴리소르베이트 20의 존재 하에서 블루 시프트를 나타내고, 반면 형광 스펙트럼은 폴리소르베이트 80의 존재 하에서 안정하게 보임을 발견하였다.
본발명의 바람직한 구체예에서, 카보시아닌 염료는 DiI이고, 폴리소르베이트는 PS 20 또는 PS 80이고, 여기 파장은 약 550 nm이고, 검출 파장은 약 615 nm 또는 대안적으로 565 nm이다.
추가로 바람직한 구체예에서 카보시아닌 염료은 DiD이고, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이고, 여기 파장은 약 644 nm이고 그리고 검출 파장은 약 665 nm이다.
추가로 바람직한 구체예에서 카보시아닌 염료는 DiD이고, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이고, 여기 파장은 약 490 nm이고 그리고 검출 파장은 약 504 nm이다. 대안적 구체예에서, 카보시아닌 염료는 DiD이고, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이고, 여기 파장은 약 490 nm이고 그리고 검출 파장은 약 540 nm이다.
본발명자는 분해 생성물의 존재와 무관하게 카보시아닌 염료를 사용하는 폴리소르베이트 함량의 결정은 폴리소르베이트의 신속하고 신뢰성있는 정량를 허용한다는 것을 발견하였다. 본발명자는 본 방법은 단백질, 다른 부형제 및/또는 실리콘 오일을 추가로 포함하는 샘플에서 신뢰성있는 결과를 제공한다는 것을 또한 발견하였다. 따라서, 상기 방법은 저장된 샘플, 예를 들어 관련 약제학적 포장 재료 가령 바이알 또는 예비-충전 시린지 내 생물약제학적 의약 제품의 신속하고 빠른 품질 제어를 허용한다.
본발명의 방법의 추가 장점은 상기 방법이 상이한 온도에서 작동한다는 것이다. 그러나 단계 c), 즉 형광 측정 수행, 및 실제 측정 수행 이전 단계 b) 동안 또는 후 상기 샘플을 유지하기 위해 특정의 온도 범위가 선택되는 것이 바람직하다. 특히, 온도는 바람직하게는 일련의 측정 이내 상대적으로 일정하게 유지되어야 한다.
단계 c)에 대해, 형광 측정은 바람직하게는 약 10 및 약 40℃ 사이의, 바람직하게는 약 15 및 약 37 ℃ 사이의, 더욱 바람직하게는 약 15 및 약 35 ℃ 사이의, 가령 약 17 및 약 30 ℃ 사이의, 또는 약 20 및 약 30 ℃ 사이의, 특히 약 22 및 약 27 ℃ 사이의 온도에서, 각각 수행된다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 약 15, 18, 20, 22, 25, 27 또는 30 ℃에서 수행된다. 또다른 특히 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 약 20, 25 또는 30 ℃에서 수행된다.
측정 이전, 상기 샘플은 바람직하게는 상기 염료와 함께 배양되고, 이는 단계 b) 및 단계 c) 사이의 부가적 단계로서 이해될 수 있다. 상기 샘플은 측정 이전 적어도 약 1 분 동안 배양하는 것이 바람직하다. 배양 시간은 배양이 일어나는 온도에 따라서 선택되어야 한다. 바람직하게는, 상기 샘플은 측정 이전 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20 또는 30 분 배양된다. 대안적 바람직한 구체예에서, 상기 샘플은 약 10 내지 60 분, 가령 약 10, 20, 30, 40, 50 또는 60 분 배양된다. 물론, 특히 상기 샘플이 선택되는 배양 온도에서 물리적으로 및 화학적으로 상대적으로 안정하다면 더 긴 배양 시간도 또한 선택될 수 있다.
하나의 구체예에서, 배양 온도는 약 20 내지 45 ℃ 범위에서 선택된다. 또다른 바람직한 구체예에서, 배양 온도는 약 25 내지 40 ℃ 범위, 또는 약 30 내지 40 ℃ 범위, 가령 약 30, 35, 37, 또는 40 ℃이다. 특히 상기 샘플이 선택되는 배양 온도에서 물리적으로 및 화학적으로 상대적으로 안정하다면 또는 짧은 배양 시간이 선택된다면 더 높은 배양 온도가 또한 선택될 수 있다.
배양 시간, 배양 온도 및 형광 측정 수행 온도에 대해 위에서 제공된 선호성은 그의 조합으로서 이해되어야 한다. 예를 들어, 바람직한 구체예 중 하나에서, 본발명의 방법은 약 20 내지 45 ℃의 범위의 배양 온도, 약 10 내지 60 min의 범위의 배양 시간, 및 약 10 내지 40 ℃의 범위의 측정 온도을 사용하여 수행된다. 또다른 특정의 구체예에서, 배양 온도는 약 37 ℃이고, 배양 시간은 약 30 min이고, 측정 온도는 약 실온 또는 약 23 ℃이다. 본업계에서의 숙련가는 특정의 샘플에 대해 추가측정 조건을 쉽게 확인할 수 있다.
상기 방법 외에, 본발명은 추가로 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 카보시아닌 염료의 용도에 관한 것이다. 특히, 본발명은 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 DiI, DiO, DiD 또는 CM-DiI의 사용에 관한 것이다. 특정의 구체예에서, 본발명은 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 카보시아닌 염료의 사용에 관한 것이다. 또다른 구체예에서, 본발명은 샘플 내 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 20 또는 80의 정량을 위한 DiI 또는 DiD의 사용에 관한 것이다.
추가 구체예에서, 본발명은 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 DiI의 사용에 관한 것이다. 가장 특정의 구체예에서 본발명은 샘플 내 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80의 정량을 위한 DiI의 사용에 관한 것이다.
본발명자는 상기 방법은 형광 분석를 허용하는96-웰 플레이트 및 96-웰 플레이트 리더의 사용에 의해 쉽게 비교될 수 있음을 발견하였다. 이와 같이, 본발명은 샘플 내 폴리소르베이트의 신속하고 대량 비교된 정량을 위한 방법을 제공한다. 따라서, 상기 방법은 예를 들어 품질 확인 실험실에서 큰 향상를 제공한다.
따라서, 본발명은 또한 카보시아닌 염료를 포함하는 웰 플레이트에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본발명은 웰-플레이트에 관한 것이고, 여기서 웰 중 적어도 하나는 카보시아닌 염료의 정의된 양을 포함한다. 하나의 구체예에서, 본발명은 웰 플레이트에 관한 것이고, 여기서 다수의 웰은 카보시아닌 염료의 정의된 양을 포함하고 그리고 여기서 적어도 하나의 웰은 폴리소르베이트의 정의된 양을 부가적으로 포함한다.
바람직한 구체예에서, 플레이트는 96 웰 플레이트이다. 그러나, 다른 타입의 웰-플레이트도 웰로서 적절하다. 웰 플레이트의 웰 중 적어도 일부는 카보시아닌 염료의 양을 포함한다. 플레이트의 모든 웰은 동일 양의 카보시아닌 염료를 포함하는 것이 또한 바람직하다. 본발명의 일부 구체예에서, 플레이트는 폴리소르베이트의 정의된 양을 부가적으로 포함하는 일부 웰을 포함한다. 이 문맥에서, 본발명에 따르는 방법에 대해 위에서 기술된 바와 같이 카보시아닌 염료 선택에 대해 동일한 선호도가 적용된다.
바람직하게는, 상기 웰 내 염료 및 임의적 추가 성분 가령 폴리소르베이트가 웰 내에 동결건조된 형태로 제공된다. 본발명의 대안적 구체예에서, 상기 웰은 상기 염료 및 임의로 일부 웰에서 또한 폴리소르베이트의 정의된 양을 포함하는 액체 용액을 포함한다. 동결건조와 별도로, 건조를 위한 다른 방법도 사용될 수 있다. 숙련가는 적절한 방법을 알고 있다.
특정의 바람직한 구체예에서, 본발명은 다음을 포함하는 웰 플레이트에 관한 것이다:
a) 세트의 각각의 웰이 정의된 양의 카보시아닌 염료를 포함하는 웰의 세트; 및
b) 세트의 각각의 웰이 정의된 양의 카보시아닌 염료 및 정의된 양의 폴리소르베이트를 포함하는 웰의 세트.
여기서 사용된, 웰의 세트 (또는 서브세트)는 웰 플레이트의 웰의 서브세트이고; 세트 (또는 서브세트)은 적어도 두 개의 웰을 포함한다. 바람직하게는, 카보시아닌 염료 및 폴리소르베이트의 정의된 양을 포함하는 상기 웰은 상이한 양의 폴리소르베이트를 포함하고; 더욱 바람직하게는, 웰의 상기 세트는 폴리소르베이트 보정 곡선의 생성를 허용한다.
일부 구체예에서, 상기 웰 플레이트는 블랭크로서 작용할 수 있는 빈 웰 또는 카보시아닌 염료가 없는 웰을 부가적으로 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 플레이트는 카보시아닌 염료 및 위에서 정의된 바와 같은 폴리소르베이트의 정의된 양을 포함하는 웰의 하나 이상의 세트를 포함한다. 이들 경우, 웰의 각각의 세트는 동일 또는 상이한 폴리소르베이트를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 웰은 동결건조된 조성물을 포함한다. 이들 경우, 플레이트는 웰 내 또는 웰 내 조성물 내에 완충 및/또는 안정화 화합물을 부가적으로 포함하는 것이 바람직하다.
본발명자는 카보시아닌 염료를 갖는 웰, 부가적으로 폴리소르베이트를 포함하는 일부 웰을 포함하는 웰 플레이트를 제공하기 위한 조성물은, 수성 조성물로서 제조될 수 있고, 이 수성 조성물은 웰 내 충전되고 이후 동결건조될 수 있다는 것을 발견하였다.
최종 사용자는 자신의 샘플을 웰의 정의된 세트에 부가하고 남을 웰을 물의 정의된 양으로 충전한는 것이 필요할 뿐이다.
상기 수성 조성물은 웰의 세트에 따라서 단지 카보시아닌 염료의 정의된 양 및 임의적 폴리소르베이트를 포함할 수 있다. 이는 조성물의 재구성 후 형광 신호의 충분한 회수를 허용한다.
본발명자는 조성물이 완충제 및 임의로 안정화제, 바람직하게는 당류, 더욱 바람직하게는 만니톨을 추가로 포함한다면, 동결건조된 조성물의 재구성 후 형광 신호의 최적 회수가 수득될 수 있음을 발견하였다.
바람직한 구체예에서, 상기 안정화제는 10 % (w/v) 까지의 농도로 존재한다. 특정의 구체예에서, 상기 안정화제는 존재하는 0.1 % 내지 10% (w/v) 사이의 농도로 존재한다. 바람직하게는, 상기 안정화제는 5 % (w/v) 까지의 농도, 특히 0.5 내지 5% (w/v)로 존재한다. 특정의 바람직한 구체예에서, 안정화제는 약 1% (w/v)의 농도로 존재한다.
어떠한 완충제도일 수 있다 적절할 수 있고, 통상적 적용을 위한 완충제는 숙련가에게 공지되어 있다. 바람직하게는, 상기 완충제는 DiI 외의 형광 신호를 제공하지 않는다. 하나의 적절한 완충제는 포스페이트 완충제다.
추가 양상에서, 본발명은 다음을 포함하는 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 키트에 관한 것이다:
a) 카보시아닌 염료;
b) 희석제 완충제;
c) 임의로, 폴리소르베이트의 정의된 양을 각각 포함하는 표준 용액의 세트.
본발명의 일부 구체예에서, 카보시아닌 염료는 큐벳 내에 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 키트는 카보시아닌 염료의 정의된 양을 포함하는 적어도 하나의 큐벳을 포함한다. 특정의 구체예에서, 상기 큐벳은 마이크로큐벳이다.
상기 키트는 임의로 또한 추가 화합물, 특히 사용설명서를 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 상기 키트는 DiI, DiD, DiO, CM-DiI 로부터 선택되는 카보시아닌 염료를 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 키트는 DiI을 포함한다. 일부 구체예에서, 희석제 완충제는 농축된 완충제이다.
표준 용액은 즉시사용가능한 용액, 또는 희석용 용액일 수 있다. 바람직하게는, 표준 용액은 농축된 용액이다. 일부 구체예에서, 상기 키트는 상이한 용매 내 상이한 표준 용액을 포함한다.
표준 용액은 상이한 기본 용도로 적응될 수 있다. 특히 표준 용액은 정의된 양의 상이한 폴리소르베이트를 포함한다. 바람직하게는 표준 용액은 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 그의 혼합물을 포함한다.
본발명의 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 위에서 정의된 웰-플레이트를 포함한다.

실시예

방법

PS-보정 곡선의 제조

PS20 및 PS80 스톡 용액 (물 내 제조한 1.0 % (w/v))를 1 mL 분취액 내 -20 ℃에서 제조 및 저장하였다. 이들 스톡을 보고된 모든 실험에 대해 사용하였다. PS 보정 곡선을 대략 0.0002 내지 0.007 % (w/v) 이내 범위의 일련의 희석 - 물 또는 완충제 내 - 을 수행함에 의해 제조하였다. 대조구로서, 단지 물 또는 상응하는 완충제를 함유하는 샘플을 사용하였다.

형광-어세이

DiI-Vybrant™ 스톡 용액은 에탄올 내 DiI의 1 mM 용액이다. 2 μL의 초기 염료 용액을 98 μL의 Milli-Q 물에 부가하여 물 내 중간체 스톡 용액 (20 μM의 농도)을 제조하였다. 상기 샘플에 부가 이전 이 DiI-작업 용액 (DiI-WS)을 새로 제조하였다. DiI을 PS 보정 곡선을 위해 상이한 샘플에 부가하였다.

분석된 샘플 내 DiI의 최종 농도는 357 nM였다. 상기 샘플에의 상기 염료의 부가 후, 즉시 보텍싱하고 그리고 37 ℃에서 30 min 동안 배양하고 광으로부터 보호하였다. 유사하게 DiD-Vybrant™ (에탄올 내 DiD의 1 mM 용액) 샘플을 제조하고 취급하였다.

DiI에 대한 형광 측정 큐벳 시스템

측정을 위해 FP-8500 형광계 (Jasco, Germany) 및 10x2 mm 석영 큐벳을 사용하였다. 여기 파장을 550 nm (밴드폭 2.5 nm)로 설정하고, 560-620 nm (밴드폭: 2.5 nm, 간격: 1 nm, 속도: 낮음, 감도: 높음, 축적수: 1)의 범위에서 방출을 기록하였다. 물을 항상 참조로서 사용하였다. 모든 실험을 21 ℃에서 수행하였다 (항온 장비).

형광 측정 플레이트 리더 시스템

상기 웰-플레이트 기초 측정을 위해, 플레이트 리더 (Tecan Safire²; Tecan Group AG , Switzerland)을 사용하였다. DiI에 대한 여기 파장을 550 nm (밴드폭: 5 nm)로 고정하고 560-620 nm (밴드폭: 5 nm; 방출 파장 단계 크기: 1 nm)의 범위 방출을 수집하였다. 판독수를 20으로 설정하였다. 증가량 및 z-위치를 상기 최고 농도 PS을 함유하는 웰에 기초하여 상기 장치로 결정하였다. 증가량을 최종 내지 120으로 고정하고 z-위치를 8100 μm로 조정하였다. 평평한 바닥을 갖는 흑색 96-웰 플레이트를 사용하여 측정을 이중으로 수행하였다. 웰 당 최종 부피는 200 μL였다. 규칙적 그리고 낮은-결합-플레이트를 시험하였다. 모든 실험을 대략 23 ℃에서 수행하였다 (비-항온 장비).

UV/Vis-측정

Safire 2 Multimode Reader를 사용하여 UV/Vis 측정을 수행하였다. 희석 시리즈를 수행하여 제공된 용액 및 추가 샘플을, 상응하는 용매 (물 / 완충제)를 블랭크로서 사용하여 연구하였다. 2 축적으로부터 얻은 흡수 스펙트럼을 270 - 999 nm의 범위 이내에서 기록하였다. 이 실험을 위해, 웰 당 150 μL의 최종 부피를 갖는 96-웰 플레이트를 사용하였다.

DiI 또는 DiD의 존재 하에서 PS20의 형광 프로파일링

PS20의 형광 특성를 큐벳 기초 형광계를 사용하여 DiI의 존재 하에서 평가하였다. 이 목적을 위해, 0.0002 내지 0.0025 % (w/v)의 농도 범위를 포함하는 샘플을 제조하였다. 도 2A, 2B 및 2C에 결과가 예시된다. 최대 형광 강도를 대략 590 nm에서 수득하였다. 형광 강도는 0.0005 % (w/v) 초과의 PS20 농도에서 더 낮은 파장 (~565 nm)으로 시프트되었다.

반복 측정을 수행시 615 nm에서의 형광 신호는 일관적인 결과를 나타냈다. 이와 별도로, 상기 파장에서의 강도는 시험된 농도에 비례하였다 - 도 1C에 나타낸 바와 같이.

이들 결과에 기초하여, PS20 정량용 방출 파장을 615 nm로 고정하였다. 내부 필터 효과를 확인하기 위해, 상기 방출 및 여기 파장에서의 흡수를 추가 실험에서 측정하였다. 실험에 기초하여 형광 분석 동안 내부 필터 효과를 회피하도록 DiI 및 PS의 농도를 선택하였다.

DiD 및 PS20로 동일 실험을 수행하였고 유사한 결과를 얻었다, 도 3A, 3B 및 3C 참조. DiD에 대한 방출 파장은 665 nm로 선택되었다.

DiI 및 DiD의 존재 하에서 PS80의 형광 프로파일링

PS20 정량에 적용가능하다고 나타난 형광 어세이를 또한 PS80에 대해 시험하였다. 제 1, 상응하는 형광 프로파일을 형광계 내에서 측정하였고 파라미터는 DiI 및 DiD에 대한 PS20에 대해 나타낸 바와 같이 설정되었다.

제공된 데이터에 기초하여 상이한 그래프를 플로팅하였다. 도 4A, 4B, 5A 및 5B는 측정 된 모든 샘플의 615 nm (DiI) 또는 665 nm (DiD)에서 수득된 형광 강도의 개요를 나타낸다. 0.00045 내지 0.00114 % (w/v) PS80에 대한 샘플 보정 곡선은 도 4C 및 5C에서 볼 수 있다.

DiI 형광에 대한 실리콘 오일의 영향

추가 실험에서 DiI 형광에 대한 조성물 내 다른 화합물의 영향을 측정하였다. 형광계 내 제 1 측정에서 상기 샘플 내 실리콘 오일 액적의 영향을 분석하였다.

이 실험을 위해, 수성 용액 내 DiI의 형광을 측정하고 0.002 % (w/v) 및 0.03 % (w/v) 실리콘 오일을 갖는 수성 용액 내 DiI의 형광과 비교하였고 시험하였다. 결과를 도 6에서 알 수 있다.

결과는 실리콘 오일 액적이 DiI 형광을 상당히 변화시키지 않음을 나타낸다.

플레이트 리더에서 DiD/DiI 형광 측정 및 샘플 분석

상기 방법을 비교할 가능성을 시험하기 위해, DiD 및 PS20, 그리고 DiI 및 PS80을 사용한 형광 측정을 플레이트 리더 (Tecan Safire²; Tecan Group AG , Switzerland)에서 수행하였다.

PS20 및 DiD에 대한 보정 곡선을 측정하고 그리고 플레이트 리더를 사용하여 0.00175 % (w/v) PS20를 포함하는 샘플을 측정하였다. 결과를 도 7에서 나타내고 그리고 표 1에 요약되어 있다.

PS80 및 DiI에 대한 추가 보정 곡선을 측정하고 그리고 0.0007 % (w/v) PS20를 포함하는 샘플을 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. 결과는 도 8에서 나타내고 그리고 표 2에 요약되어 있다.

DiI에 의한 PS 정량에 대한 단백질의 영향

추가 실험에서 DiI에 의한 PS20 정량에 대한 샘플 내 대표적 단백질로서의 두 개의 상이한 모노클로날 항체 (IgG1 및 IgG2)의 존재의 영향을 시험하였다. 보정 곡선, 그리고 일부 PS20를 함유하는 샘플을 플레이트-리더 상에서 측정하였다. 결과는 도 9 및 표 3에서 알 수 있다.

DiI 형광에 대한 배양 시간의 영향

추가 실험에서 예비-측정 배양 시간이 PS 함유 샘플 내 DiI 형광 강도에 대해 영향을 가지는지를 분석하였다. 상기한 바와 같이 샘플을 제조하고 배양 직후 또는 15 또는 30 분 후 측정하였다. 결과를 도 10에서 나타낸다. 도면이 나타낸 바와 같이, 얻어진 DiI 형광 및 PS20 보정 곡선에 대한 배양 시간의 영향은 무시가능하다.

DiI 형광에 대한 플레이트 교반 및 배양 동안 온도의 영향

부가적 실험에서, 96웰 플레이트 내에서 수행된 어세이를 위한 특정의 조건을 결정하기 위해 배양 동안 형광 측정 및 플레이트 교반에 대한 배양 온도의 영향을 분석하였다.

샘플의 한 세트 (PS20 보정 곡선)을 제조하였고, 그의 분취액을 37 ℃에서 (i) 교반과 함께 또는 (ii) 교반 없이 및 (iii) 교반 없이 실온에서 15 분 동안 배양하였다.

이 실험의 결과를 도 11에서 나타낸다. 이 실험의 결과는 배양 동안의 교반도 온도도 보정 곡선에 영향이 없음을 명백히 나타낸다.

상이한 염료 배치(batch)의 영향

추가 실험에서 DiI 염료의 상이한 배치를 사용하여 결과의 재현성을 분석하였다. 이 실험에서 세 개의 샘플 (PS20 보정 곡선)를 동일 공급자로부터의 상이한 배치의 DiI를 사용하여 분석하였다. 모든 샘플을 37 ℃에서 15 min 배양 후 분석하였다.

그 결과는 도 12에서 나타낸다. 결과는 이들이 필적하고, 상기 염료 배치와 독립적임을 나타낸다.

상이한 공급자로부터의 PS20 및 PS80에 대한 DiI 어세이의 적용가능성

상이한 공급자로부터의 PS20 또는 PS80을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 세 개의 상이한 공급자의 폴리소르베이트를 이전 DiI과 동일한 방식으로 분석하였다. 결과를 도 13 및 14에서 나타낸다. 결과는 이들이 필적하고, PS20 또는 PS80 공급자와 독립적임이 다시 명백하다. 이와 같이, 단일 PS 보정 곡선은 최초 공급자와 독립적인 샘플 내 PS를 정량하기 위해 사용될 수 있다

DiI 형광에 대한 상이한 단백질의 영향

추가 실험에서, 0.006 % w/v 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 및 다양한 농도의 상이한 단백질 (IgG1, Fc 융합 단백질 또는 IgG)를 포함하는 샘플을 측정하였다. 그 결과는 도 15에서 나타내고 시험된 단백질의 존재는 형광 측정에 대한 영향이 없음을 나타내다.

DiI 형광에 대한 동결건조의 영향

하나의 실험에서 몇 개의 샘플을 제조하였고, 96-웰 플레이트 내로 충전하고 그리고 DiI 형광 강도를 측정하였다. 이후, 상기 샘플을 96-웰 플레이트 내 동결건조하고, 이후 재구성하고 그리고 재구성 후 형광 강도를 측정하였다. 다음 샘플을 제조 및 측정하였다:

1: MilliQ 물 내350 nM DiI.

2: MilliQ 물 내 350 nM DiI + 0.002% (w/v) PS20.

3: 10 mM 포스페이트 완충제 내 350 nM DiI, pH 6.0 + 1% (w/v) 만니톨.

4: 10 mM 포스페이트 완충제 내 350 nM DiI + 0.002% (w/v) PS20, pH 6.0 + 1% (w/v) 만니톨.

5: 10 mM 포스페이트 완충제 내 350 nM DiI, pH 6.0.

6: 10 mM 포스페이트 완충제 내 350 nM DiI + 0.002% (w/v) PS20, pH 6.0.

그 결과는 도 16에서 나타낸다. 결과는 동결건조 및 재구성 후 DiI 형광 특성을 유지하기 위해, 이 어세이를 위한 동결건조된 조성물을 갖는 플레이트를 제조하는 것이 가능함을 나타낸다. 결과는 안정화제 가령 만니톨을 포함하는 완충된 조성물의 사용은 결과를 향상시킴을 나타낸다.

Claims (22)

1. 다음 단계를 포함하는 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 방법:
   a) 적어도 하나의 폴리소르베이트를 포함하는 샘플을 제공하는 것;
   b) 샘플을 카보시아닌 염료와 조합시키는 것;
   c) 상기 혼합물의 형광을 측정하는 것; 및
   d) 상기 형광을 폴리소르베이트의 양과 상호비교하는 것.
2. 제 1항에 있어서, 카보시아닌 염료는 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카보시아닌 퍼콜레이트 (DiI), 3,3'-디옥타데실옥사카보시아닌 퍼콜레이트 (DiO), 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카보시아닌 4-클로로벤젠설포네이트 염 (DiD) 및 CM-DiI로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 카보시아닌 염료는 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카보시아닌 퍼콜레이트 (DiI)인 방법.
4. 제 1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80로부터 선택되는 방법.
5. 제 1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 부가적으로 약제학적으로 활성인 화합물을 포함하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 약제학적으로 활성인 화합물은 단백질인 방법.
7. 제 1 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 부가적으로 화장품 화합물을 포함하는 방법.
8. 제 1 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 동결건조되고, 단계 c) 이전 용매 내에서 재구성되는 방법.
9. 다수의 웰이 카보시아닌 염료의 정의된 양을 포함하고 여기서 다수의 웰 중 적어도 하나의 웰은 폴리소르베이트의 정의된 양을 부가적으로 포함하는 웰 플레이트.
10. 제 9항에 있어서, 카보시아닌 염료는 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카보시아닌 퍼콜레이트 (DiI), 3,3'-디옥타데실옥사카보시아닌 퍼콜레이트 (DiO), 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카보시아닌 4-클로로벤젠설포네이트 염 (DiD) 및 CM-DiI로 구성된 그룹으로부터 선택되는 웰 플레이트.
11. 제 10항에 있어서, 카보시아닌 염료는 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카보시아닌 퍼콜레이트 (DiI)인 웰 플레이트.
12. 제 9 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 웰 플레이트는 웰의 서브세트를 포함하고, 여기서 서브세트의 각각의 웰은 폴리소르베이트의 정의된 양을 부가적으로 포함하는 웰 플레이트.
13. 제 9 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 웰은 완충제를 부가적으로 포함하는 웰 플레이트.
14. 제 13항에 있어서, 완충제는 포스페이트 완충제인 웰 플레이트.
15. 제 9 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 웰 중 적어도 하나는 부가적으로 안정화제를 포함하는 웰 플레이트.
16. 제 15항에 있어서, 안정화제는 당류인 웰 플레이트.
17. 제 16항에 있어서, 당류는 만니톨인 웰 플레이트.
18. 제 9 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 웰 플레이트는 웰의 적어도 두 개의 상이한 서브세트를 포함하고, 두 개의 세트 각각의 각각의 웰은 다음:
    a) 카보시아닌 염료의 정의된 양;
    을 포함하는 조성물을 포함하고 여기서 웰의 적어도 하나의 서브세트의 각각의 웰은 조성물 내에 다음:
    b) 완충제; 및
    c) 안정화제;
    d) 폴리소르베이트의 정의된 양을 부가적으로 포함하는 웰 플레이트.
19. 제 18항에 있어서, 조성물은 동결건조된 조성물인 웰 플레이트.
20. 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 카보시아닌 염료의 용도.
21. 다음을 포함하는 샘플 내 폴리소르베이트의 정량을 위한 키트:
    a) 카보시아닌 염료;
    b) 샘플용 표준 희석 완충제; 및
    c) 임의로 보정 샘플.
22. 제 21항에 있어서, 카보시아닌 염료는 큐벳 또는 제 9 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서의 웰 플레이트 내에 제공되는 키트.

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