CN101446592A - 人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括：试剂A：鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体∶浓度为1％的BSA(牛血清白蛋白)的体积百分比为1∶50～20000的溶液1ml；试剂B：含吐温－20的磷酸缓冲液(PBST)100ml；试剂C：FITC标记羊抗鼠IgG抗体∶试剂B的体积百分比为1∶10～1000的溶液1ml；试剂D：浓度为0.01％Evens blue(伊文思蓝)染液1ml。本发明的有益效果：它能用于早期人类偏肺病毒感染的检测，其灵敏度高、特异性好、速度快，而且重复性好、经济实用，能为早期诊断和治疗提供可靠的依据。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种检测试剂盒，具体涉及人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒。
背景技术
人类偏肺病毒(Human Metapneumovirus，hMPV)为荷兰学者于2001年首次在儿童呼吸道感染标本中分离得到的一种新的呼吸道病原体。该病毒可导致人的上下呼吸道感染，其临床特征类似于RSV(呼吸道合胞病毒)，主要症状包括咳嗽、咽痛、呼吸困难、缺氧、喘息等。有报道hMPV是老人、儿童、免疫缺陷者严重呼吸道感染疾病的常见病原体。
人类偏肺病毒已发现了七年，亚洲、北美洲、欧洲、南美洲、非洲、大洋洲均有其感染的流行病学报告，呈现全球流行趋势。在我国重庆和北京也有关于hMPV感染的报道。血清学研究表明hMPV已经在人群流行50年以上，大多数人在5岁时均已感染过hMPV。其感染的临床特征类似于RSV，症状主要包括咳嗽、咽痛、发热、呼吸困难、缺氧、喘息等。4～10.8％的呼吸道感染住院患儿同hMPV有关。hMPV还是引起老人和免疫缺陷患者严重呼吸道感染疾病的常见病原体，并可同其他一些病原体合并感染，如RSV，SARS-CoV(严重急性呼吸综合征冠状病毒)。由此可见，hMPV是一种常见的呼吸道病原体，建立快速准确的检测手段对于其早期诊断治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，它能用于早期感染人类偏肺病毒的检测，操作简便、快速准确，而且重复性好、通用性好、经济实用。
本发明所述的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括分别包装的
试剂A：鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体：浓度为1％的BSA(牛血清白蛋白)的体积百分比为1:50～20000的溶液1ml；试剂A的作用在于与人类偏肺病毒的抗原结合。
试剂B：含吐温-20的磷酸缓冲液(PBST)100ml；试剂B为洗液，作用在于洗去未结合的抗体。
试剂C：FITC标记羊抗鼠IgG抗体：试剂B的体积百分比为1:10～1000的溶液1ml；试剂C的作用在于形成抗原—特异性抗体—荧光抗体的复合物；
试剂D：浓度为0.01％ Evens blue(伊文思蓝)染液1ml。试剂D的作用是将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，便于分析和观察。
所述的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，其所述的含吐温-20的磷酸缓冲液，为0.8g NaCl；0.02g KCl；0.144g Na2HPO4；0.024g KH2PO4；0.2mlTween-20(吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到6～8，最后加蒸馏水定容到100ml。
本试剂盒的特异性实验：检测Light Diagnostics Respiratory panel 1 DFA免疫荧光试剂盒(购自美国D3公司)中七种常见呼吸道病毒：腺病毒，A型流感病毒，B型流感病毒，副流感病毒1型，副流感病毒2型，副流感病毒3型，呼吸道合胞病抗原玻片。
特异性实验显示：检测腺病毒，A型流感病毒，B型流感病毒，副流感病毒1型，副流感病毒2型，副流感病毒3型，呼吸道合胞病毒抗原玻片，未见阳性细胞，无交叉反应。提示该试剂盒特异性很高。
本试剂盒的灵敏度实验：在二十四孔板中培养Vero-E6细胞(非洲绿猴肾细胞)，用DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基)培养基将病毒液按十倍梯度稀释，设101～107倍稀释七个梯度，设未接种病毒的细胞为阴性对照，病毒原液接种细胞为阳性对照。待稀释105倍病毒接种的细胞孔出现细胞病变后，刮下细胞，制作抗原玻片，进行免疫荧光检测。同时吸取各孔上清用TCID50(半数致死法)法进行病毒滴度测定。
灵敏度实验显示：分别检测经梯度稀释接种到细胞中的病毒抗原，可见101到104倍稀释孔中阳性细胞逐渐减少，105倍稀释孔中未见阳性细胞。重复检测五次，结果相同。测定104倍稀释孔病毒滴度为102.2TCID50/ml。提示该试剂盒的灵敏度很高。
实验速度：应用本试剂盒进行人类偏肺病毒的检测，非常迅速。其他的一些病毒检测经典方法，如病毒分离培养，需要1～2周时间，核酸扩增法需要4～6小时，而本试剂盒只需要大约2小时。
本发明的有益效果：它能用于早期人类偏肺病毒感染的检测，其灵敏度高、特异性好、速度快，而且重复性好、经济实用，能为早期诊断和治疗提供可靠的依据。
附图说明
图1是人类偏肺病毒感染检测用玻片示意图。
图2是人类偏肺病毒感染阴性结果示意图。
图3是人类偏肺病毒感染阳性结果示意图(放大200倍)。
图4是人类偏肺病毒感染阳性结果示意图(放大400倍)。
具体实施方式
本发明所述的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括分别包装的
试剂A：鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体：浓度为1％的BSA(牛血清白蛋白)的体积百分比为1:50～20000的溶液1ml；其中的鼠抗人偏肺病毒单克隆抗体购自美国CHEMICON公司。
试剂B：含吐温-20的磷酸缓冲液(PBST)100ml；试剂B为洗液；
试剂C：FITC标记羊抗鼠IgG抗体：试剂B的体积百分比为1:10～1000的溶液1ml；其中的FITC(异硫氰酸荧光素)标记羊抗鼠IgG(免疫球蛋白G)抗体，购自美国CHEMICON公司；
试剂D：浓度为0.01％ Evens blue(伊文思蓝)染液1ml。
所述的含吐温-20的磷酸缓冲液为0.8g NaCl；0.02g KCl；0.144g Na2HPO4；0.024g KH2PO4；0.2ml Tween-20(吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到6～8，最后加蒸馏水定容到100ml。
实施例一：临床标本的检测，所用的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括分别包装的
试剂A：鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体：浓度为1％的BSA(牛血清白蛋白)的体积百分比为1:50的溶液1ml；其中的鼠抗人偏肺病毒单克隆抗体购自美国CHEMICON公司；
试剂B：含吐温-20的磷酸缓冲液(PBST)100ml；该含吐温-20的磷酸缓冲液为0.8g NaCl；0.02g KCl；0.144g Na2HPO4；0.024g KH2PO4；0.2ml Tween-20(吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到6，最后加蒸馏水定容到100ml。
试剂C：FITC(异硫氰荧光素)标记羊抗鼠IgG(免疫球蛋白G)抗体：试剂B的体积百分比为1:10的溶液1ml；
试剂D：浓度为0.01％ Evens blue(伊文思蓝)染液1ml。
参见图1、图2、图3和图4，使用以上试剂盒进行检测的步骤如下：
(1)取病人鼻咽分泌物，存标本转移液中，置于冰上，迅速转移至实验室；充分吹打临床标本，1000rpm，4℃离心10分钟，弃去上清，PBS(硫酸缓冲液)重悬；
(2)滴加待检测的细胞悬液至玻片孔中。室温自然干燥后，将玻片置于4℃丙酮固定10分钟。取出自然干燥；
(3)每孔滴加4微升试剂A覆盖抗原玻片孔，置湿盒，37℃ 30分钟；试剂B洗涤3次，每次5min；
(4)干燥后滴加试剂C，置湿盒内37℃ 30分钟；
(5)试剂B洗涤3次，每次10min；
(6)干燥后试剂D染色5分钟；
(7)蒸馏水洗净，自然干燥，甘油封片后置荧光显微镜下观察；
(8)设置未感染hMPV的Vero-E6细胞为阴性对照，在荧光显微镜×100视野下至少可见100个细胞为有效玻片。细胞完整，形态结构清晰，胞浆内有明亮的绿色荧光颗粒者为阳性细胞。检验临床标本时以hMPV感染的Vero-E6细胞作为阳性对照，每份标本中可见至少两个阳性细胞，阴性对照无特异性荧光，阳性对照阳性着判为阳性。
实施例二：临床标本的检测，所用的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括分别包装的
试剂A：鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体：浓度为1％的BSA的体积百分比为1:2000的溶液1ml；
试剂B：含吐温-20的磷酸缓冲液(PBST)100ml；该含吐温-20的磷酸缓冲液为0.8g NaCl；0.02g KCl；0.144g Na2HPO4；0.024g KH2PO4；0.2ml Tween-20(吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到7，最后加蒸馏水定容到100ml。
试剂C：FITC标记羊抗鼠IgG抗体：试剂B的体积百分比为1:500的溶液1ml；
试剂D：浓度为0.01％ Evens blue(伊文思蓝)染液1ml。
参见图1、图2、图3和图4，使用以上试剂盒进行检测的步骤如下：
(1)取病人鼻咽分泌物，存标本转移液中，置于冰上，迅速转移至实验室；
(2)充分吹打临床标本，1000rpm，4℃离心10分钟，弃去上清，PBS重悬；
(3)滴加待检测的细胞悬液至玻片孔中。室温自然干燥后，将玻片置于4℃丙酮固定10分钟。取出自然干燥；
(4)每孔滴加4微升试剂A覆盖抗原玻片孔，置湿盒，37℃ 30分钟；
(5)试剂B洗涤3次，每次5min；
(6)干燥后滴加试剂C，置湿盒内37℃ 30分钟；
(7)试剂B洗涤3次，每次10min；
(8)干燥后试剂D染色5分钟；
(9)蒸馏水洗净，自然干燥，甘油封片后置荧光显微镜下观察；
(10)设置未感染hMPV的Vero-E6细胞为阴性对照，×100视野下至少可见100个细胞为有效玻片。细胞完整，形态结构清晰，胞浆内有明亮的绿色荧光颗粒者为阳性细胞。检验临床标本时以hMPV感染的Vero-E6细胞作为阳性对照，每份标本中可见至少两个阳性细胞，阴性对照无特异性荧光，阳性对照阳性着判为阳性。
实施例三：临床标本的检测，所用的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括分别包装的
试剂A：鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体：浓度为1％的BSA(牛血清白蛋白)的体积百分比为1:20000的溶液1ml；
试剂B：含吐温-20的磷酸缓冲液(PBST)100ml；该含吐温-20的磷酸缓冲液为0.8g NaCl；0.02g KCl；0.144g Na2HPO4；0.024g KH2PO4；0.2ml Tween-20(吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到8，最后加蒸馏水定容到100ml。
试剂C：FITC(异硫氰荧光素)标记羊抗鼠IgG(免疫球蛋白G)抗体：试剂B的体积百分比为1:1000的溶液1ml；
试剂D：浓度为0.01％ Evens blue(伊文思蓝)染液1ml。
参见图1、图2、图3和图4，使用以上试剂盒进行检测的步骤如下：
(1)取病人鼻咽分泌物，存标本转移液中，置于冰上，迅速转移至实验室；
(2)充分吹打临床标本，1000rpm，4℃离心10分钟，弃去上清，PBS重悬；
(3)滴加待检测的细胞悬液至玻片孔中。室温自然干燥后，将玻片置于4℃丙酮固定10分钟。取出自然干燥；
(4)每孔滴加4微升试剂A覆盖抗原玻片孔，置湿盒，37℃ 30分钟；
(5)试剂B洗涤3次，每次5min；
(6)干燥后滴加试剂C，置湿盒内37℃ 30分钟；
(7)试剂B洗涤3次，每次10min；
(8)干燥后试剂D染色5分钟；
(9)蒸馏水洗净，自然干燥，甘油封片后置荧光显微镜下观察；
(10)设置未感染hMPV的Vero-E6细胞为阴性对照，×100视野下至少可见100个细胞为有效玻片。细胞完整，形态结构清晰，胞浆内有明亮的绿色荧光颗粒者为阳性细胞。检验临床标本时以hMPV感染的Vero-E6细胞作为阳性对照，每份标本中可见至少两个阳性细胞，阴性对照无特异性荧光，阳性对照阳性着判为阳性。
实施例四：培养病毒标本的检测，所用的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括分别包装的
试剂A：鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体：浓度为1％的BSA(牛血清白蛋白)的体积百分比为1:50的溶液1ml；
试剂B：含吐温-20的磷酸缓冲液(PBST)100ml；该含吐温-20的磷酸缓冲液为0.8g NaCl；0.02g KCl；0.144g Na2HPO4；0.024g KH2PO4；0.2ml Tween-20(吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到6，最后加蒸馏水定容到100ml。
试剂C：FITC(异硫氰荧光素)标记羊抗鼠IgG(免疫球蛋白G)抗体：试剂B的体积百分比为1:10的溶液1ml；
试剂D：浓度为0.01％ Evens blue(伊文思蓝)染液1ml。
参见图1、图2、图3和图4，使用以上试剂盒进行检测的步骤如下：
(1)病毒接种：培养Vero-E6细胞，待其长成单层平铺孔底约70～80％，弃去培养液，加入hMPV病毒液，置5％ CO2孵箱中37℃孵育1小时。弃去病毒液，加入病毒维持液，放入5％ CO2孵箱中37℃培养。约5～7天后，待感染细胞出现明显CPE后，刮下细胞。离心弃去病毒维持液，以PBS重悬；
(2)滴加待检测的细胞悬液至玻片孔中。室温自然干燥后，将玻片置于4℃丙酮固定10分钟。取出自然干燥；
(3)每孔滴加4微升试剂A覆盖抗原玻片孔，置湿盒，37℃ 30分钟；
(4)试剂B洗涤3次，每次5min；
(5)干燥后滴加试剂C，置湿盒内37℃ 30分钟；
(6)试剂B洗涤3次，每次10min；
(7)干燥后试剂D染色5分钟；
(8)蒸馏水洗净，自然干燥，甘油封片后置荧光显微镜下观察；
(9)设置未感染hMPV的Vero-E6细胞为阴性对照，×100视野下至少可见100个细胞为有效玻片。细胞完整，形态结构清晰，胞浆内有明亮的绿色荧光颗粒者为阳性细胞。检验临床标本时以hMPV感染的Vero-E6细胞作为阳性对照，每份标本中可见至少两个阳性细胞，阴性对照无特异性荧光，阳性对照阳性着判为阳性。
实施例五：培养病毒标本的检测，所用的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括分别包装的
试剂A：鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体：浓度为1％的BSA(牛血清白蛋白)的体积百分比为1:2000的溶液1ml；
试剂B：含吐温-20的磷酸缓冲液(PBST)100ml；该含吐温-20的磷酸缓冲液为0.8g NaCl；0.02g KCl；0.144g Na2HPO4；0.024g KH2PO4；0.2ml Tween-20(吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到7，最后加蒸馏水定容到100ml。
试剂C：FITC(异硫氰荧光素)标记羊抗鼠IgG(免疫球蛋白G)抗体：试剂B的体积百分比为1:500的溶液1ml；
试剂D：浓度为0.01％ Evens blue(伊文思蓝)染液1ml。
参见图1、图2、图3和图4，使用以上试剂盒进行检测的步骤如下：
(1)病毒接种：培养Vero-E6细胞，待其长成单层平铺孔底约70～80％，弃去培养液，加入hMPV病毒液，置5％ CO2孵箱中37℃孵育1小时。弃去病毒液，加入病毒维持液，放入5％ CO2孵箱中37℃培养。约5～7天后，待感染细胞出现明显CPE后，刮下细胞。离心弃去病毒维持液，以PBS重悬；
(2)滴加待检测的细胞悬液至玻片孔中。室温自然干燥后，将玻片置于4℃丙酮固定10分钟。取出自然干燥；
(3)每孔滴加4微升试剂A覆盖抗原玻片孔，置湿盒，37℃ 30分钟；
(4)试剂B洗涤3次，每次5min；
(5)干燥后滴加试剂C，置湿盒内37℃ 30分钟；
(6)试剂B洗涤3次，每次10min；
(7)干燥后试剂D染色5分钟；
(8)蒸馏水洗净，自然干燥，甘油封片后置荧光显微镜下观察；
(9)设置未感染hMPV的Vero-E6细胞为阴性对照，×100视野下至少可见100个细胞为有效玻片。细胞完整，形态结构清晰，胞浆内有明亮的绿色荧光颗粒者为阳性细胞。检验临床标本时以hMPV感染的Vero-E6细胞作为阳性对照，每份标本中可见至少两个阳性细胞，阴性对照无特异性荧光，阳性对照阳性着判为阳性。
实施例六：培养病毒标本的检测，所用的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括分别包装的
试剂A：鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体：浓度为1％的BSA(牛血清白蛋白)的体积百分比为1:20000的溶液1ml；
试剂B：含吐温-20的磷酸缓冲液(PBST)100ml；该含吐温-20的磷酸缓冲液为0.8g NaCl；0.02g KCl；0.144g Na2HPO4；0.024g KH2PO4；0.2ml Tween-20(吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到8，最后加蒸馏水定容到100ml。
试剂C：FITC(异硫氰荧光素)标记羊抗鼠IgG(免疫球蛋白G)抗体：试剂B的体积百分比为1:1000的溶液1ml；
试剂D：浓度为0.01％ Evens blue(伊文思蓝)染液1ml。
参见图1、图2、图3和图4，使用以上试剂盒进行检测的步骤如下：
(1)病毒接种：培养Vero-E6细胞，待其长成单层平铺孔底约70～80％，弃去培养液，加入hMPV病毒液，置5％ CO2孵箱中37℃孵育1小时。弃去病毒液，加入病毒维持液，放入5％ CO2孵箱中37℃培养。约5～7天后，待感染细胞出现明显CPE后，刮下细胞。离心弃去病毒维持液，以PBS重悬；
(2)滴加待检测的细胞悬液至玻片孔中。室温自然干燥后，将玻片置于4℃丙酮固定10分钟。取出自然干燥；
(3)每孔滴加4微升试剂A覆盖抗原玻片孔，置湿盒，37℃ 30分钟；
(4)试剂B洗涤3次，每次5min；
(5)干燥后滴加试剂C，置湿盒内37℃ 30分钟；
(6)试剂B洗涤3次，每次10min；
(7)干燥后试剂D染色5分钟；
(8)蒸馏水洗净，自然干燥，甘油封片后置荧光显微镜下观察；设置未感染。
(9)hMPV的Vero-E6细胞为阴性对照，×100视野下至少可见100个细胞为有效玻片。细胞完整，形态结构清晰，胞浆内有明亮的绿色荧光颗粒者为阳性细胞。检验临床标本时以hMPV感染的Vero-E6细胞作为阳性对照，每份标本中可见至少两个阳性细胞，阴性对照无特异性荧光，阳性对照阳性着判为阳性。
Claims (2)
1、人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括：
试剂A：鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体：浓度为1％的BSA(牛血清白蛋白)的体积百分比为1:50～20000的溶液1ml；
试剂B：含吐温-20的磷酸缓冲液(PBST)100ml；
试剂C：FITC标记羊抗鼠IgG抗体：试剂B的体积百分比为1:10～1000的溶液1ml；
试剂D：浓度为0.01％Evensblue(伊文思蓝)染液1ml。
2、根据权利要求1所述的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，其特征是：所述的含吐温-20的磷酸缓冲液，为0.8g NaCl；0.02g KCl；0.144g Na2HPO4；0.024g KH2PO4；0.2ml Tween-20(吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到6～8，最后加蒸馏水定容到100ml。
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| CNA2008102370205A CN101446592A (zh) | 2008-12-31 | 2008-12-31 | 人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒 |
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Cited By (2)
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| CN104407136A (zh) * | 2014-12-07 | 2015-03-11 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 一种鸡传染性脑脊髓炎活疫苗中病毒含量测定方法 |
| CN111033261A (zh) * | 2017-06-27 | 2020-04-17 | 科里奥利医药研究有限责任公司 | 聚山梨醇酯的定量分析 |
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2008
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| CN104407136A (zh) * | 2014-12-07 | 2015-03-11 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 一种鸡传染性脑脊髓炎活疫苗中病毒含量测定方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20090603 |