CN107202889A - 四病原体同步检测试剂盒及其应用和制备 - Google Patents

四病原体同步检测试剂盒及其应用和制备 Download PDF

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Abstract

本发明提供了同时检测样品中HBV、HCV、HIV以及TP等四种病原体的免疫检测试剂盒，其包括：用各病原体的抗原或抗体标记的磁微粒、与各病原体的抗原或抗体偶联的吖啶酯、阴性对照和各阳性对照。本发明还提供了该试剂盒的应用和制备方法等。

Description

四病原体同步检测试剂盒及其应用和制备
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体而言，本发明涉及乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和梅毒螺旋体(TP)等四种病原体的检测试剂盒及其应用和制备方法等。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和梅毒螺旋体(TP)均为国家规定的重大传染性疾病，流行的范围广，严重影响人民的身体健康。其中，尤其是HIV，国际医学界至今尚无防治艾滋病的有效疫苗、药物和疗法，自1985年在中国境内首次发现艾滋病病例报告数以来，我国艾滋病病例报告数平均以每年30％-40％的速度增加。
除了传统的细胞学检查外，早期对这四种病原体的免疫学联合检测方法操作较为繁琐，过程不容易标准化，检测灵敏度低，尤其是特别容易出现假阴性结果。所以近年来，对这四种病原体的检测逐渐倾向于用基于核酸的PCR法来检测，例如，中国专利申请CN101487062A公开了一种同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒，其采用一步法单管单酶多项联合检测的TaqMan PCR扩增体系；又如，中国专利申请CN102230032A公开了一种病原体核酸的等温链置换多重检测卡，可以多重检测HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA和TP DNA，其采用等温链置换来进行多重检测。
然而，本发明人发现，由于PCR的灵敏度太高，而检测实验室难免不受各种检测样品的污染，即使进行消毒，也很难完全去除各病原体的病毒核酸片段，因此造成不少假阳性结果，容易引起纠纷。
近年来，对这四种病原体的免疫学联合检测方法也有所发展，但是主要使得过程标准化，然而检测灵敏度，尤其是结果准确性方面，改进不大。例如，中国专利申请CN102023216A公开了一种对乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原体进行共检的悬浮芯片，可快捷地同时检测待检样品中的乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原体，然而本发明人发现，其检测准确性还有待进一步提高，尤其是其容易造成 HIV检测假阴性结果，而这样的结果是比假阳性结果危害大得多的，因此至今未推广使用。而中国专利申请CN101373187A公开了一种通过单次实验即可实现艾滋、乙肝、丙肝、梅毒这四种重大传染病中的三到四项同时筛查的免疫层析试剂盒，其基于胶体金，所以这种试剂盒检测灵敏度不高，而且混合划线时也无法避免HIV检测的假阴性结果。
为此，本发明人凭借长期在本领域深耕的经验，在经历大量实验失败的基础上，发现要开发乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和梅毒螺旋体同时适用的高灵敏度、高精确度、高可靠性并且检测方便迅速的免疫分析方法，需用多方面的协同改进，包括抗原或抗体的设计或选择，抗原或抗体载体的选择，显示(发光)标记物的制备，以及阴性对照和阳性对照等。本发明人最终开发出了同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和梅毒螺旋体的检测试剂盒，其不但灵敏度高、可靠性好，不易受人为操作因素影响，尤其是能够避免HIV的假阴性检测结果的出现，而且操作方便迅速，操作便于标准化，可用于急诊检测等。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种HBV、HCV、HIV和TP同时适用的高灵敏度、高精确度、高可靠性并且检测方便迅速的同步检测试剂盒及其免疫分析HBV抗原、HCV抗体、HIV抗原和抗体以及TP抗体中的应用和其中试剂的制备方法等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了同时检测样品中HBV抗原、HCV抗体、HIV抗原和抗体以及TP抗体的免疫检测试剂盒，其包括：
(1.1)第1.1容器，其中容纳用HBsAg抗体标记的磁微粒；
(1.2)第1.2容器，其中容纳用HCV抗原标记的磁微粒；
(1.3)第1.3容器，其中容纳用HIV抗原标记的磁微粒；
(1.4)第1.4容器，其中容纳用HIV p24抗体标记的磁微粒；
(1.5)第1.5容器，其中容纳用TP抗原标记的磁微粒；
(2.1)第2.1容器，其中容纳与HBsAg抗体偶联的吖啶酯；
(2.2)第2.2容器，其中容纳与HCV抗原偶联的吖啶酯；
(2.3)第2.3容器，其中容纳与HIV抗原偶联的吖啶酯；
(2.4)第2.4容器，其中容纳与HIV p24抗体偶联的吖啶酯；
(2.5)第2.5容器，其中容纳与TP抗原偶联的吖啶酯；
(3)第三容器，其中容纳HBsAg阳性对照；
(4)第四容器，其中容纳HCV阳性对照；
(5)第五容器，其中容纳HIV阳性对照；
(6)第六容器，其中容纳TP阳性对照；和，
(7)第七容器，其中容纳阴性对照。
在本文中，样品是潜在可能含有HBV抗原、HCV抗体、HIV抗原和/或抗体和/或TP抗体的离体样品，如血液、血液制品、体液等。本发明的检测方法所针对的目标——病原体抗原和/或抗体，其中，病原体抗原是病原体的蛋白质或片段，病原体抗体是人体免疫系统应对相应病原体自然产生的(多克隆)抗体。在本发明的具体实施方式中，可以同时检测HBV抗原、HCV抗体、HIV抗原和抗体以及TP抗体。这些抗原和抗体能够在一定程度上表征HBV、HCV、HIV和 TP的存在性。
需要指出的是，本发明的检测用于对离体样品的检测，检测的直接结果是抗体的存在性与否，而并非诊断结果。即使对于利用本发明的检测方法检测人血液样品中病原体抗原和抗体，也只能直接得出抗原和抗体的存在与否，还需要有经验的医生根据相应人的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出检测出的相应抗原的量是否能致病、相应抗体已经遏制了病毒或不足以抵抗病毒的诊断结果或健康状况。因此无法根据抗原、抗体的存在而直接判断其携带者是否患有由这四种病原体带来的疾病，所以本发明直接目的不是诊断。所以，本发明的试剂盒的应用不属于诊断方法。
在本文中，如无特别说明，“第1.1”、“第2.3”、“第三”、“第五”等序数词仅仅是对具有相同或相似用途的物品或物质的区分，并不对物品或物质的结构、组成、性质和形状等构成限定。例如，第四容器和第五容器可以是材料、形状完全相同的容器，但是是不同的容器，分别容纳HCV阳性对照和HIV阳性对照。容器可以是瓶、管或杯，使得其中的容纳物被分隔保存。
优选在本发明第一方面的试剂盒中，用各抗体或抗原标记的磁微粒可以混合容纳于同一容器中，这样不影响也便于四种病原体的同步检测，即第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器是同一容器，如，第一容器。当然，为了便于对同步检测的阳性结果进行病原体区分，第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器可以是不同的容器。
也优选在本发明第一方面的试剂盒中，与各抗体或抗原偶联的吖啶酯可以混合容纳于同一容器中，这样不影响也便于四种病原体的同步检测，即第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器是同一容器，如，第二容器。当然，为了便于对同步检测的阳性结果进行病原体区分，第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器可以是不同的容器。
优选在本发明第一方面的试剂盒中，HIV抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示。本发明人设计的该抗原能方便地连接于发光标记物和磁微粒上，仍旧保持效价高、特异性好的优势，并且涵盖了HIV-I型和II型的测定。该抗原能够通过本领域技术人员所熟知的重组方法生产，当前已经有商业渠道提供重组生产蛋白(抗原)的服务。
优选在本发明第一方面的试剂盒中，磁微粒是粒径0.90-1.10μm的含有羧基基团的磁微粒。本发明人研究发现这样的磁微粒对本发明的抗原的标记率高，施加磁力后聚集迅速，并且吸附一致性好。在本发明的具体实施方式中，磁微粒是 EM1-40/100型号的磁微粒。更优选在本发明第一方面的试剂盒中，用各病原体的抗原或抗体标记的磁微粒的制备方法包括：将EDC和NHS混合溶于MES中，加入磁微粒，震荡，弃上清液，清洗后加入各病原体的抗原或抗体进行标记反应，然后加入赖氨酸封闭，再洗涤。
优选在本发明第一方面的试剂盒中，吖啶酯是吖啶琥珀酰亚胺酯。本发明人研究发现该吖啶酯基本不影响本发明的抗原效价，而且发光好。更优选在本发明第一方面的试剂盒中，与各病原体的抗原或抗体偶联吖啶酯的制备方法包括：将吖啶琥珀酰亚胺酯的DMF溶液与各病原体的抗原或抗体的PB溶液混合，搅拌后加入赖氨酸封闭，再透析。
优选在本发明第一方面的试剂盒中，阴性对照是HBsAg、HCV、HIV和TP 检测确认均呈阴性的人血清；HBsAg阳性对照是HBsAg检测确认呈阳性的人血清，优选是HBsAg检测确认呈阳性但HCV、HIV和TP检测确认均呈阴性的人血清；HCV阳性对照是HCV检测确认呈阳性的人血清，优选是HCV检测确认呈阳性但HBsAg、HIV和TP检测确认呈阴性的人血清；HIV阳性对照是HIV 检测确认呈阳性的人血清，优选是HIV检测确认呈阳性但HBsAg、HCV和TP 检测确认呈阴性的人血清；以及，TP阳性对照是TP检测确认呈阳性的人血清，优选是TP检测确认呈阳性但HBsAg、HCV和HIV检测确认呈阴性的人血清。本发明人发现，由于操作人员水平的参差不齐，所以会出现带有倾向性的检测结果，通过设置这些对照，并且配合阈值判读，可以有效避免检测结果受人为操作因素的影响。在本发明的具体实施方式中，人血清是在60℃保温1小时后过滤除菌而制备得到的。各人血清可在知情同意下由相应人员捐赠，也可购自疾控中心。
在本文中，“任选”具有辞典意义，即涵盖选或不选两种情况的范围。本发明第一方面的试剂盒任选还包括分别容纳洗液、第一激发液、第二激发液、磁微粒稀释液和/或吖啶酯偶联物稀释液的容器，即可以包括这些容器，也可以不包括这些容器。在本发明的具体实施方式中，本发明第一方面的试剂盒还包括分别容纳洗液、第一激发液、第二激发液、磁微粒稀释液和/或吖啶酯偶联物稀释液的容器。
更优选在本发明第一方面的试剂盒中，洗液包含吐温20；第一激发液包含硝酸和H2O2；第二激发液包含NaOH；磁微粒稀释液包含牛血清白蛋白和吐温20；和/或，吖啶酯偶联物稀释液包含牛血清白蛋白和吐温20。其中，磁微粒稀释液和吖啶酯偶联物稀释液的配方可以是相同的。
另外，本发明第一方面的试剂盒还可以包括记载其应用(如本发明第二方面的应用)的说明书。又如，本发明第一方面的试剂盒可以同磁板、微孔板和/或闪光发光仪等仪器搭配出售，因此本发明还提供包括本发明第一方面的试剂盒以及任选仪器的产品。
在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的试剂盒在同时检测样品中HBV 抗原、HCV抗体、HIV抗原和抗体以及TP抗体的方法中的应用；相应地，本发明也提供了本发明第一方面的试剂盒在制备用于同时检测样品中HBV抗原、HCV抗体、HIV抗原和抗体以及TP抗体的方法的产品中的应用。
优选在本发明第二方面的应用中，同时检测样品中HBV抗原、HCV抗体、 HIV抗原和抗体以及TP抗体的方法依次包括：
(1)将第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器中的磁微粒混合后(如果第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器是同一容器，则直接取样)，上样于微孔板的各孔中并洗涤；
(2)向各孔中分别加入样品、阴性对照、HBsAg阳性对照、HCV阳性对照、HIV 阳性对照和TP阳性对照并温育；
(3)将第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器中吖啶酯混合后(如果第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器是同一容器，则直接取样)，加入各孔中并温育；
(4)微孔板施加磁力以吸住磁微粒，弃去孔中液体并洗涤；
(5)向各孔中同时滴加第一激发液和第二激发液，用闪光发光仪检测各孔的相对发光单位；和，
(6)以所测得的阴性对照的相对发光单位乘以2.1倍，作为阈值，样品检测值高于或等于阈值者为阳性，低于阈值者为阴性，任一阳性对照的检测值低于阈值，则从步骤(1)开始重新检测。
本发明人发现，以相对发光单位乘以2.1倍作为阈值，并且对阳性对照的检测进行严格要求，可以有效避免不同操作人员引入的操作误差。
在第三方面，本发明提供了本发明第一方面的试剂盒的制备方法，其包括用HBsAg抗体标记磁微粒的制备，用HCV抗原标记磁微粒的制备，用HIV抗原标记磁微粒的制备，用HIV p24抗体标记磁微粒的制备，用TP抗原标记磁微粒的制备，与HBsAg抗体偶联吖啶酯的制备，与HCV抗原偶联吖啶酯的制备，与HIV抗原偶联吖啶酯的制备，与HIV p24抗体偶联吖啶酯的制备，与TP抗原偶联吖啶酯的制备，和阴性对照、HBsAg阳性对照、HCV阳性对照、HIV阳性对照和TP阳性对照的制备，任选还包括洗液、第一激发液、第二激发液、磁微粒稀释液和/或吖啶酯偶联物稀释液的配制。
本发明的有益效果在于，本发明的试剂盒不但灵敏度高、精确度高、可靠性好，不易受人为操作因素影响，尤其是能够有效避免HIV检测的假阴性结果，而且操作方便迅速，操作便于标准化，可用于急诊检测等。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA 实验技术手册》(科学出版社,北京,中国,2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社, 北京,中国,1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施；其中的试剂均可通过商业渠道获得，经测试，磁微粒选用可购自默克(Merck)公司的EM1-40/100型号的磁微粒，吖啶酯选用可购自Sigma-Aldrich的吖啶琥珀酰亚胺酯。
实施例1乙型肝炎病毒(HBV)检测试剂的确定
经本发明人研究，如果要同时检测四种病原体，其中的HBV检测不适合使用HBV抗原，否则很容易造成假阳性结果，故而使用抗HBV抗原的抗体。经测试，使用多克隆抗体将导致同时检测结果很不稳定，最终选择了针对HBsAg 不同位点的单抗组合HBsAb-1和HBsAb-2(可购自菲鹏生物股份有限公司,货号 HBsAb-1、HBsAb-2)，尽管不是所测试中效价最高的单抗，但是在同时检测中准确性最好，故使用不同位点的HBsAg单抗制备标记的磁微粒和吖啶酯偶联物。
1.1标记的磁微粒的制备
将碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别用0.05M pH5.0的 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)分别溶解定容至20mg/ml，各取200μl的EDC和NHS溶液混合，加入1mg磁微粒，于室温(25℃)震荡混匀40分钟，然后弃上清液，用0.1M PBS(pH7.4)清洗三次，最后一次清洗液不弃置，然后加入HBsAg-1 单抗25μg，在25℃进行标记，标记时间1小时，标记后加入赖氨酸，使之浓度达到25mM，反应30分钟，以封闭多余的位点，再用0.1M PBS(pH7.4)洗涤三次，获得的标记的磁微粒置于含1％(w/v，g/mL)牛血清白蛋白的0.01M PBS (pH7.4)中，于2-8℃保存。
1.2吖啶酯偶联物的制备
将吖啶琥珀酰亚胺酯用无水二甲基亚酰胺(DMF)溶解定容至0.2mg/ml,取 100μgHBsAg-2单抗26μl(蛋白浓度2.8mg/ml)，用0.1MPB(PH8.0)透析，加入0.2mg/ml的吖啶琥珀酰亚胺酯25μl，在室温(25℃)下搅拌20分钟，加入含1％赖氨酸的0.1MPB(PH8.0)，使赖氨酸的终浓度达到0.25％，室温(25℃) 封闭30分钟，用0.01MPBS(pH6.3)进行透析，透析后加入甘油-20℃存放。
1.3阳性对照的制备
取HBsAg检测确认呈阳性且HCV、HIV和TP检测确认均呈阴性的人血清，在60℃保温1小时后，过滤除菌即得，于2～8℃保存。
1.4阴性对照的制备
取HBsAg、HCV、HIV和TP检测确认均呈阴性的人血清，在60℃保温1 小时后，过滤除菌，即得，于2～8℃保存。实施例2-5的阴性对照均与该阴性对照相同，下文略。
实施例2丙型肝炎病毒(HCV)检测试剂的确定
经本发明人研究，如果要同时检测四种病原体，其中的HCV检测不适合使用HCV抗体，否则很容易造成假阳性结果，故而使用HCV抗原HCV12和HCV13 (可购自厦门同仁心医药有限公司,货号分别是HCV12、HCV13)，包含HCV的 Core、NS3、NS4、NS5抗原片段。经测试，这些HCV抗原与HIV、TP抗原无交叉反应，使用它制备标记的磁微粒和吖啶酯偶联物。
2.1标记的磁微粒的制备
将碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别用0.05M pH5.0的 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)分别溶解定容至20mg/ml，各取100μl的EDC和 NHS溶液混合，加入1mg磁微粒，于室温(25℃)震荡混匀40分钟，然后弃上清液，用0.1M PBS(pH7.4)清洗三次，最后一次清洗液不弃置，然后加入上述 HCV12抗原10μg，在25℃进行标记，标记时间1小时，标记后加入赖氨酸，使之浓度达到25mM，反应30分钟，以封闭多余的位点，再用0.1M PBS(pH7.4) 洗涤三次，获得的标记磁微粒置于含1％(w/v)牛血清白蛋白的0.01M PBS (pH7.4)中，于2-8℃保存。
2.2吖啶酯偶联物的制备
将吖啶琥珀酰亚胺酯用无水二甲基亚酰胺(DMF)溶解定容至0.2mg/ml,取 100μg上述HCV13抗原100μl(蛋白浓度1mg/ml)，用0.1M PB(pH8.0)透析，与吖啶琥珀酰亚胺酯溶液20μl混合，在室温(25℃)下搅拌20分钟，然后加入含1％(w/v)赖氨酸的0.1M PB(pH8.0)，使赖氨酸的终浓度达到0.25％(w/v)，于室温(25℃)封闭30分钟，然后用0.01M PBS(pH6.3)进行透析，透析后加入甘油于-20℃保存。
2.3阳性对照的制备
取HCV检测确认呈阳性且HBsAg、HIV和TP检测确认均呈阴性的人血清，在60℃保温1小时后，过滤除菌即得，于2～8℃保存。
实施例3人免疫缺陷病毒(HIV)检测试剂1的确定
经本发明人研究，如果要同时检测四种病原体，其中的HIV检测相当复杂，故而在其检测试剂1中使用HIV抗原。经研究，委托合成了氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的HIV重组抗原，其可涵盖HIV-1和HIV-II型病毒的检测，并与 HCV、TP抗原无交叉反应，使用它制备标记的磁微粒和吖啶酯偶联物。
3.1标记的磁微粒的制备
将碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别用0.05M pH5.0的 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)分别溶解定容至20mg/ml，各取100μl的EDC和 NHS溶液混合，加入1mg磁微粒，于室温(25℃)震荡混匀40分钟，然后弃上清液，用0.1M PBS(pH7.4)清洗三次，最后一次清洗液不弃置，然后加入上述抗原10μg，在25℃进行标记，标记时间1小时，标记后加入赖氨酸，使之浓度达到25mM，反应30分钟，以封闭多余的位点，再用0.1M PBS(pH7.4)洗涤三次，获得的标记磁微粒置于含1％(w/v)牛血清白蛋白的0.01M PBS(pH7.4) 中，于2-8℃保存。
3.2吖啶酯偶联物的制备
将吖啶琥珀酰亚胺酯用无水二甲基亚酰胺(DMF)溶解定容至0.2mg/ml,取 100μg上述抗原71μl(蛋白浓度1.4mg/ml),用0.1M PB(pH8.0)透析，与吖啶琥珀酰亚胺酯溶液20μl混合，在室温(25℃)下搅拌20分钟，然后加入含1％(w/v) 赖氨酸的0.1M PB(pH8.0)，使赖氨酸的终浓度达到0.25％(w/v)，于室温(25℃) 封闭30分钟，然后用0.01M PBS(pH6.3)进行透析，透析后加入甘油于-20℃保存。
3.3阳性对照的制备
取HIV检测确认呈阳性且HCV、HBsAg和TP检测确认均呈阴性的人血清，在60℃保温1小时后，过滤除菌即得，于2～8℃保存。实施例4的阳性对照与该阳性对照相同，下文略。
实施例4人免疫缺陷病毒(HIV)p24抗体检测试剂2的确定
经本发明人研究，HIV四代不仅检测HIV I型和II型抗体，同时检测HIV p24 抗原，其中的HIV检测相当复杂，同时检测中假阳性和假阴性结果的消除很难用一种试剂完成，经测试，HIV p24抗体采用单克隆抗体p24-Ab(可购自菲鹏生物股份有限公司,货号p24-Ab)，其与HIV抗原、HCV抗原、TP抗原以及HBsAg 单抗均无交叉反应，对HIV检测试剂1的缺点进行了有效弥补，故使用它制备标记的磁微粒和吖啶酯偶联物。
4.1标记磁微粒的制备
将碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别用0.05M pH5.0的 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)分别溶解定容至20mg/ml，各取200μl的EDC和 NHS溶液混合，加入1mg磁微粒，于室温(25℃)震荡混匀40分钟，然后弃上清液，用0.1M PBS(pH7.4)清洗三次，最后一次清洗液不弃置，然后加入p24-Ab 单抗25μg，在25℃进行标记，标记时间1小时，标记后加入赖氨酸，使之浓度达到25mM，反应30分钟，以封闭多余的位点，再用0.1M PBS(pH7.4)洗涤三次，获得的标记的磁微粒置于含1％(w/v)牛血清白蛋白的0.01M PBS(pH7.4) 中，于2-8℃保存。
4.2吖啶酯偶联物的制备
将吖啶琥珀酰亚胺酯用无水二甲基亚酰胺(DMF)溶解定容至0.2mg/ml,取100μgp24单抗62.5μl(蛋白浓度1.6mg/ml)，用0.1M PB(PH8.0)透析，加入 0.2mg/ml的吖啶琥珀酰亚胺酯25μl，在室温(25℃)下搅拌20分钟，加入含 1％赖氨酸的0.1M PB(PH8.0)，使赖氨酸的终浓度达到0.25％，室温(25℃)封闭30分钟，用0.01M PBS(pH6.3)进行透析，透析后加入甘油-20℃存放。
实施例5梅毒螺旋体(TP)检测试剂的确定
经本发明人研究，如果要同时检测四种病原体，其中的TP检测不适合使用 TP抗体，否则很容易造成假阳性结果，故而使用TP抗原。经测试，采用TP重组抗原(购自杭州弘距生物技术有限公司，货号TP)，其包含TP的15KD、17K、 47KD抗原片段，与HIV、HCV抗原无交叉反应，故使用它制备标记的磁微粒和吖啶酯偶联物。
5.1标记磁微粒的制备
将碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别用0.05M pH5.0的 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)分别溶解定容至20mg/ml，各取100μl的EDC和NHS溶液混合，加入1mg磁微粒，于室温(25℃)震荡混匀40分钟，然后弃上清液，用0.1M PBS(pH7.4)清洗三次，最后一次清洗液不弃置，然后加入上述抗原30μg，在25℃进行标记，标记时间1小时，标记后加入赖氨酸，使之浓度达到25mM，反应30分钟，以封闭多余的位点，再用0.1M PBS(pH7.4)洗涤三次，获得的标记的磁微粒置于含1％(w/v)牛血清白蛋白的0.01M PBS(pH7.4) 中，于2-8℃保存。
5.2吖啶酯偶联物的制备
将吖啶琥珀酰亚胺酯用无水二甲基亚酰胺(DMF)溶解定容至0.2mg/ml,取 100μgTP抗原66.7μl(蛋白浓度1.5mg/ml)，用0.1MPB(PH8.0)透析，加入0.2 mg/ml的吖啶琥珀酰亚胺酯30μl，在室温(25℃)下搅拌20分钟，加入含1％赖氨酸的0.1M PB(PH8.0)，使赖氨酸的终浓度达到0.25％，室温(25℃)封闭 30分钟，用0.01M PBS(pH6.3)进行透析，透析后加入甘油-20℃存放。
5.3阳性对照的制备
取TP检测确认呈阳性且HCV、HIV和HBsAg检测确认均呈阴性的人血清，在60℃保温1小时后，过滤除菌即得，于2～8℃保存。
实施例6同步检测试剂盒
本发明的同步检测试剂盒可以包括15个容器，分别装有实施例1-5各自制备的标记的磁微粒、实施例1-5各自制备的吖啶酯偶联物、阴性对照、实施例1-3、 5各自制备的阳性对照。该同步检测试剂盒不但可以进行四种病原体的同步检测，而且可以在同步检测结果呈阳性后，使用其中的部分试剂检测确认具体的病原体。
当然，如果仅为了同步检测，实施例1-5各自制备的标记的磁微粒可以混合装在一个容器中，实施例1-5各自制备的吖啶酯偶联物也可以混合装在一个容器中，这样的同步检测试剂盒可以仅包括7个容器。
另外，本发明的检测试剂盒还可以包括分别装有以下试剂的容器：洗液(其配方为：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4、0.05％(v/v)吐温20)、激发液A(其配方为：含0.05M硝酸溶液、0.15％(v/v)H2O2)和激发液B(其配方为：0.2M NaOH溶液)，另外还可以包括磁微粒稀释液(其配方为：0.02M磷酸缓冲液pH7.4， 1％(w/v，g/ml)牛血清白蛋白，0.1％(v/v)吐温20)和吖啶酯偶联物稀释液 (其配方为：0.02M磷酸缓冲液pH7.4、1％(w/v，g/ml)牛血清白蛋白，0.1％ (v/v)吐温20)。
实施例7四种病原体的同步检测
同步检测的具体过程如下：
(1)将实施例1-5制备的5种标记的磁微粒(用磁微粒稀释液将磁微粒浓度稀释至0.5μg/μl)混合后，加入微孔板的孔中，每孔各种标记的磁微粒各10μl，底部施加磁力以吸住磁微粒，弃去孔中液体；
(2)进行洗涤，每孔加300μl洗液，撤去磁力振荡混匀后，静置20秒，施加磁力，弃去孔中液体，如此共洗涤5次；
(3)向每孔中分别加入样品、阴性对照、各种阳性对照50μl，37℃温育20 分钟；
(4)将实施例1-5制备的5种吖啶酯偶联物(用吖啶酯偶联物稀释液将吖啶酯浓度稀释至0.05μM)混合后，加入微孔板的孔中，每孔各种吖啶酯偶联物各 10μl，置37℃温育20分钟，然后底部施加磁力以吸住磁微粒，弃去孔中液体；
(5)进行洗涤，其与步骤(2)相同，共洗涤5次；
(6)每孔同时滴加激发液A和激发液B各100μl，在滴加得同时用闪光发光仪(可购自promage公司)进行检测各孔的相对发光单位(RLU)。
以所测得的阴性对照发光值的平均值乘以2.1倍，作为阈值，样品发光值除以阴性对照发光平均值，高于或等于阈值者为阳性，低于阈值者为阴性。
对于检测阳性的样品，再单独使用实施例1-5制备的标记的磁微粒和吖啶酯偶联物确认具体的病原体，检测步骤基本与上述步骤相同，所不同的是仅加10μl 标记的磁微粒并用磁微粒稀释液补足至50μl，以及仅加10μl吖啶酯偶联物并用吖啶酯偶联物稀释液补足至50μl。
使用上述方法对不同来源的曾经被误诊的人血清样品进行检测，阳性对照和阴性对照之任一检测出现异常的微孔板重新检测(该板结果弃用)，检测结果如下表所示，同步检测仅在HCV和HIV样品中出现微量假阳性结果，其中HIV 样品的假阳性结果可以用本发明的试剂盒本身进一步检测排除，未出现假阴性结果，该检测结果的准确性已经超过现有的四种病原体的同步免疫检测产品了；重复10孔检测，变异系数(CV)介于4.24～12.71％，均≤15％，说明该方法精密性好。
序列表
<110> 苏州华益美生物科技有限公司
<120> 四病原体同步检测试剂盒及其应用和制备
<130> CN
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 275
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIV抗原
<400> 1
Gln Gln Val Arg Ala Pro Ile Pro Met Val Pro Val Gly Gly Ile Gln
1 5 10 15
Met Val His Ser Ile Pro Pro Ala Leu Ala Gly Val His Pro Pro Pro
20 25 30
Thr Leu Pro Leu Pro Met Glu Gly Ser Glu Glu Lys Arg Gly Ala Ser
35 40 45
Gly Asp Ser Phe Ala Lys Asp Pro His Ala Gly Ser Lys Pro Pro Gly
50 55 60
Lys Arg Ser Pro His Ala Pro Gln Ser Ser Gly Pro Pro Ser Thr Pro
65 70 75 80
Ser Ser Pro Arg Leu Leu Met Lys Gln Ser Thr Ser Glu Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Ala Thr Glu Arg Glu Gln Glu Glu Asn Ile Gln Thr Cys Thr Lys
100 105 110
Ala Ile Ala Ser Leu Arg Ile Ala Thr Glu Glu Ala Ala Leu Leu Gly
115 120 125
Ala Asp Gln Ser Ala Arg Gly Gln Ala Pro His Gln Lys Pro Leu Glu
130 135 140
Ser Ala Gln Ala Ser Ile Arg His Phe Ser Gly Pro Glu Pro Gly Gln
145 150 155 160
Pro Cys Thr Ser Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
Pro Gln Phe Ser Leu Trp Lys Arg Pro Val Val Thr Ala Tyr Ile Glu
180 185 190
Gly Gln Pro Val Glu Val Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Ser Ile
195 200 205
Val Ala Gly Ile Glu Leu Gly Asn Asn Tyr Ser Pro Lys Ile Val Gly
210 215 220
Gly Ile Gly Gly Phe Ile Asn Thr Lys Glu Tyr Lys Asn Val Glu Ile
225 230 235 240
Glu Val Leu Asn Lys Lys Val Arg Ala Thr Ile Met Thr Gly Asp Thr
245 250 255
Pro Ile Asn Ile Phe Gly Arg Asn Ile Leu Thr Ala Leu Gly Met Ser
260 265 270
Leu Asn Leu
275

Claims (10)

1.同时检测样品中HBV抗原、HCV抗体、HIV抗原和抗体以及TP抗体的免疫检测试剂盒，其包括：
(1.1)第1.1容器，其中容纳用HBsAg抗体(优选是单抗)标记的磁微粒；
(1.2)第1.2容器，其中容纳用HCV抗原标记的磁微粒；
(1.3)第1.3容器，其中容纳用HIV抗原(优选是氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的HIV重组抗原)标记的磁微粒；
(1.4)第1.4容器，其中容纳用HIV p24抗体(优选是单抗)标记的磁微粒；
(1.5)第1.5容器，其中容纳用TP抗原标记的磁微粒；
(2.1)第2.1容器，其中容纳与HBsAg抗体(优选是单抗)偶联的吖啶酯(优选为吖啶琥珀酰亚胺酯)；
(2.2)第2.2容器，其中容纳与HCV抗原偶联的吖啶酯(优选为吖啶琥珀酰亚胺酯)；
(2.3)第2.3容器，其中容纳与HIV抗原(优选是氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的HIV重组抗原)偶联的吖啶酯(优选为吖啶琥珀酰亚胺酯)；
(2.4)第2.4容器，其中容纳与HIV p24抗体(优选是单抗)偶联的吖啶酯(优选为吖啶琥珀酰亚胺酯)；
(2.5)第2.5容器，其中容纳与TP抗原偶联的吖啶酯(优选为吖啶琥珀酰亚胺酯)；
(3)第三容器，其中容纳HBsAg阳性对照，优选HBsAg阳性对照是HBsAg检测确认呈阳性的人血清；
(4)第四容器，其中容纳HCV阳性对照，优选HCV阳性对照是HCV检测确认呈阳性的人血清；
(5)第五容器，其中容纳HIV阳性对照，优选HIV阳性对照是HIV检测确认呈阳性的人血清；
(6)第六容器，其中容纳TP阳性对照，优选TP阳性对照是TP检测确认呈阳性的人血清；和，
(7)第七容器，其中容纳阴性对照，优选阴性对照是HBsAg、HCV、HIV和TP检测确认均呈阴性的人血清；
还任选包括分别容纳洗液、第一激发液、第二激发液、磁微粒稀释液和/或吖啶酯偶联物稀释液的容器。
2.权利要求1所述的试剂盒，其中，磁微粒是粒径0.90-1.10μm的含有羧基基团的磁微粒。
3.权利要求1所述的试剂盒，其中，用抗原或抗体标记的磁微粒的制备方法包括：将EDC和NHS混合溶于MES中，加入磁微粒，震荡，弃上清液，清洗后加入抗原或抗体进行标记反应，然后加入赖氨酸封闭，再洗涤。
4.权利要求1所述的试剂盒，其中，抗原或抗体偶联的吖啶酯的制备方法包括：将吖啶琥珀酰亚胺酯的DMF溶液与抗原或抗体的PB溶液混合，搅拌后加入赖氨酸封闭，再透析。
5.权利要求1所述的试剂盒，其中，人血清是在60℃保温1小时后过滤除菌而得的。
6.权利要求1所述的试剂盒，其中，洗液包含吐温20；第一激发液包含硝酸和H2O2；第二激发液包含NaOH；磁微粒稀释液包含牛血清白蛋白和吐温20；和/或，吖啶酯偶联物稀释液包含牛血清白蛋白和吐温20。
7.权利要求1所述的试剂盒，其中，第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器是同一容器(如，第一容器)；和/或，第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器是同一容器(如，第二容器)。
8.权利要求1-7之一所述的试剂盒在同时检测样品中HBV抗原、HCV抗体、HIV抗原和抗体以及TP抗体的方法中或在制备用于同时检测样品中HBV抗原、HCV抗体、HIV抗原和抗体以及TP抗体的方法的产品中应用。
9.权利要求8所述的应用，其中同时检测样品中HBV抗原、HCV抗体、HIV抗原和抗体以及TP抗体的方法依次包括：
(1)将第1.1容器、第1.2容器、第1.3容器、第1.4容器和第1.5容器中的磁微粒混合后，上样于微孔板的各孔中并洗涤；
(2)向各孔中分别加入样品、阴性对照、HBsAg阳性对照、HCV阳性对照、HIV阳性对照和TP阳性对照并温育；
(3)将第2.1容器、第2.2容器、第2.3容器、第2.4容器和第2.5容器中吖啶酯混合后，加入各孔中并温育；
(4)微孔板施加磁力以吸住磁微粒，弃去孔中液体并洗涤；
(5)向各孔中同时滴加第一激发液和第二激发液，用闪光发光仪检测各孔的相对发光单位；和，
(6)以所测得的阴性对照的相对发光单位乘以2.1倍，作为阈值，样品检测值高于或等于阈值者为阳性，低于阈值者为阴性，任一阳性对照的检测值低于阈值，则从步骤(1)开始重新检测。
10.权利要求1-7之一所述试剂盒的制备方法，其包括重组生产HIV抗原，用HBsAg抗体标记磁微粒的制备，用HCV抗原标记磁微粒的制备，用HIV抗原标记磁微粒的制备，用HIVp24抗体标记磁微粒的制备，用TP抗原标记磁微粒的制备，与HBsAg抗体偶联吖啶酯的制备，与HCV抗原偶联吖啶酯的制备，与HIV抗原偶联吖啶酯的制备，与HIV p24抗体偶联吖啶酯的制备，与TP抗原偶联吖啶酯的制备，和阴性对照、HBsAg阳性对照、HCV阳性对照、HIV阳性对照和TP阳性对照的制备，任选还包括洗液、第一激发液、第二激发液、磁微粒稀释液和/或吖啶酯偶联物稀释液的配制。
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