CN101097216A - 人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，该诊断试剂采用基因工程重组HIV-I型特异性蛋白gp160、gp120、gp41、p66、p24以及HIV-II型特异性蛋白gp36独立包被的混合纤维素膜、酶结合物及其他组份组成，应用间接法的原理供HIV-I型和HIV-II型抗体确认用。
Description
技术领域：
本发明涉及一种医药诊断试剂，特别是一种人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，该诊断试剂采用基因工程重组HIV-I型特异性蛋白gp160、gp120、gp41、p66、p24以及HIV-II型特异性蛋白gp36独立包被的混合纤维素膜、酶结合物及其他组份组成，应用间接法的原理供HIV-I型和HIV-II型抗体确认用。
背景技术：
人类获得性免疫缺陷综合症(AIDS，艾滋病)传播的广泛性和危害性已成为全球关注的公共卫生和社会热点问题。艾滋病的传播在我国已经进入了快速增长期，除了在沿海经济发达的地区HIV感染的人较多外，在一些经济不发达、医疗卫生较差的部分地区尤其农村地区，由于劳务输出流动人口不断增加以及部分由采浆感染HIV的人群，给我国的HIV预防和控制增加了不少的压力。提高HIV诊断试剂水平显得尤为重要。目前国内对艾滋病的诊断方法主要采用ELISA方法检测，该方法有较高的灵敏度和特异性，但其操作方法复杂，测定时间较长，并且需要一定的操作经验和仪器设备，在一些医疗条件差的部分地区尤其是在边远的农村地区限制了该方法的使用，因此开发一种快速简便的检测试剂十分必要。本发明提供一种快速，简便的人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂。
发明内容：
本发明提供一种人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，该试剂由一组产品组成一个试剂盒，其中主要组成成分如下：
HIV抗体确认条，反应液，洗液，碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物，BCIP/NBT显色底物，阳性参考血清，阴性参考血清，另外还有，反应板，对比卡片，结果报告单，产品说明书等。
每一试剂盒中包括以下组成：
1、HIV抗体确认条 (避光，防潮) 20条
2、反应液 (配置完成后为乳白色) 1瓶(20毫升)
3、洗液 (蓝色) 1瓶(200毫升)
4、碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物 (红色) 1瓶(20毫升)
5、BCIP/NBT显色底物 (淡黄色) 1瓶(20毫升)
6、阳性参考血清 (生物危险品) 1瓶(50微)
7、阴性参考血清 1瓶(100微升)
8、反应板 (每板10个反应槽) 2个
9、对比卡片 1个
10、结果报告单 1张
11、说明书 1份
其中的各组成说明如下：
HIV抗体确认条，组成为混合纤维素膜以及包被在该膜上的重组抗原，其制备方法如下：
A.使用包被缓冲液(0.01MTris-HCl，pH 7.4)将重组抗原以及兔抗人IgG和人源IgG稀释到合适的浓度(gp160、gp120、P66、gp41、P24、gp36的包被浓度分别为80μg/ml、80μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、80μg/ml和5μg/ml；兔抗人IgG的浓度分别为4.5μg/ml和100μg/ml；人源IgG的浓度为50μg/ml)；
B.使用流式划线仪以划膜速度为20mm/s，喷量为0.2μl/mm将各蛋白均匀包被于混合纤维素膜上；
C.包被完成的混合膜采用室温(16-25℃)吹干2小时的方法进行干燥；
D.干燥后真空包装，放在寒冷干燥处(2-8℃，相对湿度不高于45％)备用。反应液，组成为0.8％NaCl、0.02％KCl和0.05％吐温-20的0.01M Tris-HCl，其制备方法如下：
A.按照上诉配方配制；
B.使用NaOH颗粒将PH值调到7.4；
C.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
D.密封贮存于2-8℃环境中。
洗液，组成为10mM CB缓冲液添加200PPM PEG，500PPM Tween-20，500PPM甘油，100PPM Proclin300，其制备方法如下：
A.按照上诉配方配制；
B.使用NaOH颗粒将PH值调到9.8-10.0；
C.加入100PPM(质量体积比)的指示剂(溴百里酚蓝)，使其在正常状态下(2-30℃，PH＝9.9)呈蓝色
D.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
E.密封贮存于2-8℃环境中。
碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物，组成为碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物(1：4000)，10mM Tris-cl，20％胎牛血清，100PPM PEG，500PPM甘油和100PPMProclin300其制备方法如下：
A.按照上诉配方配制；
B.使用HCl将PH值调到6.4-6.7；
C.加入100PPM(质量体积比)的指示剂(氯酚红)，使其在正常状态下(2-30℃，PH＝6-7)呈红色
D.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
E.密封贮存于2-8℃环境中。
BCIP/NBT显色底物，BCIP/NBT PURPLE LIQUID SUBSTRATE FORMEMBRANES)购自Sigma公司(125K1189)。
阳性参考血清，其制备方法如下：
A.选用ELISA测定效价不低于1∶200，HIV抗体全病毒确认试剂检测结果为全条带阳性的血清10份；
B.混合血清，采用60℃处理1小时；
C.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
D.除菌过滤后密封贮存于2-8℃环境中。
阴性参考血清，其制备方法如下：
A.选用经两种ELISA试剂测定、一种确认试剂检测、一种核酸检测试剂同时检测结果为HIV抗体阴性血清10份；
B.混合血清，采用60℃处理1小时；
C.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
D.除菌过滤后密封贮存于2-8℃环境中。
本发明的试剂盒配套包装，配套使用，使用方法如下：
样品：
从测试者身上获得的血清或血浆。
仪器：
微量加样器，摇床，37℃烘箱。，37℃水浴箱。
试剂准备：
第一次使用时将脱脂奶粉加入到反应液中，温柔震荡使其混合均匀。
所有试剂在使用前在室温(16-25℃)平衡半个小时或37℃水浴10分钟。(显色底物请取所需量分装入配液瓶中水浴)
所有试剂在使用前温柔震荡使其混合均匀。使用后尽快将所用试剂放入2-8℃环境中。
操作方法：
快速反应模式：
(1)将待测样本及反应液在室温(16-25℃)平衡半个小时，或放入37℃水浴箱中水浴10分钟
(2)从管中取出所需数量的HIV抗体确认试纸条，放在反应槽中，有数字标记的一面朝上；
(3)向每个槽内加入1毫升反应液(乳白色)，置于摇床上室温摇动5-10分钟，然后在反应槽的上方加入10微升待检样本；
(4)盖上反应槽，置于摇床上，室温(16-25℃)孵育45分钟；
(51)完全去除槽中反应液，用1毫升洗液(蓝色)洗膜，共进行4次，每次5分钟；
(6)完全去除槽中洗液，向每个槽内加入酶结合物，(红色)1毫升，盖上反应槽，置于摇床上，室温摇动孵育30分钟；
(7)完全去除槽中酶结合物，用1毫升洗液(蓝色)将洗膜，共进行4次，每次5分钟；
(8)完全去除槽中洗液，向每个槽内加入1毫升显色剂(淡黄色)，盖上反应槽，室温摇动反应10分钟；
(9)完全去除槽中显色剂，用蒸馏水冲2次，之后用蒸馏水浸泡1分钟终止反应；
(10)取出确认条，置于吸水纸上，放入烘箱中，37℃烘烤15分钟彻底干燥；
(11)使用对比卡片读取结果，在室温避光条件下，结果可以长期保存。
过夜反应模式：
步骤(4)的反应时间为过夜反应，其他步骤与快速反应一致。
对实验结果的解释：
(1)图1为膜上相应固相化蛋白的位置。使用对比卡片读取确认条的实验结果信息。
(2)参照以下2个表格计算总得分。
表1符号及其对应含义
| 符号 | 含义 |
| REnvGagPol | Env，Gag，Polenv基因编码蛋白(gpl60，gpl20，gp41，gp36)gag基因编码蛋白(p24)pol基因编码蛋白(p66) |
表2确认条总得分计算方法
| 检测线的显色强度 | 得分 | |
| R＜±Env＝± | 条带显色弱或无法与背景明显区分或显色强度未达到质控线±env基因编码蛋白的显色强度与质控线±基本相同 | 00.25 |
| ±＜Env＜+±＜Gag＜+±＜pol＜+ | env基因编码蛋白的显色强度介于质控线±与质控线+之间gag基因编码蛋白的显色强度介于质控线±与质控线+之间pol基因编码蛋白的显色强度介于质控线±与质控线+之间 | 0.50.250.25 |
| Env＝+Gag＝+Pol＝+ | env基因编码蛋白的显色强度与质控线+基本相同gag基因编码蛋白的显色强度与质控线+基本相同pol基因编码蛋白的显色强度与质控线+基本相同 | 10.50.5 |
| +＜R＜3+R≥3+ | 条带显色强度介于质控线+与质控线3+之间条带显色强度不弱于质控线3+ | 23 |
(3)请参照下表判断实验结果：
表3试结果判读表
| 结果判断 | 总得分 |
| 阴性结果不确认结果阳性结果 | A≤0.5 (总得分不超过0.5)0.75≤A≤1.25 (总得分介于0.75至1.25之间)A≥1.5 (总得分不少于1.5) |
(4)确认条失效：(在确认所有组份均合理使用的情况下，出现下列任意一种情况判定为失效)
无任何可辨认的条带出现。
显色20min后，质控线3+的显色仍然没有达到明显可见的强度。
(5)特殊情况及可能原因：(质控线±的显色结果强于质控线+)
当样本使用量比较大以及样本中抗体含量比较大时有可能出现这种情况。这种情况下以质控线±作为阳性条带的平均显色标准，质控线+作为条带是否存在的判定标准。
(6)HIV-2型：(满足以下3个条件可以初步判断为HIV-2型抗体阳性)
满足阳性判定的条件；
gp36的显色结果强于质控线+；
gp41的显色结果不强于gp36的显色结果。
(异常检测结果及可能原因)
| 质控线3+未显色 | 未加入酶结合物未加入显色底物显色底物PH值过低酶结合物活性完全丧失 |
| 质控线+未显色显色底物温度过低 | 未加入人类血清显色时间过短显色底物PH值过低 |
| 背景太高，所有条带显色结果均达到质控线3+的水平 | 显色时间过长未用蒸馏水终止反应未烤干试纸条使用回收的显色底物 |
| 背景较脏 | 用手/手套直接拉触确认条表面确认条潮湿确认条表面被污染 |
(该试验方法的局限性)
本确认试剂盒专供HIV-I型和HIV-II型抗体确认用。
(产品性能指标)
试验完成后质控线+，质控线3+的显色结果必须明显可辨认；背景颜色不超过质控线±的颜色；否则实验不成立。
本发明的试剂，其反应原理如下：
固定在混合纤维素膜上的基因工程重组HIV-I/HIV-II特异性蛋白将与待测人类血清中的相应抗体特异结合，兔抗人IgG多克隆抗体将与人类血清中的IgG结合：之后加入羊抗人IgG-碱性磷酸酶结合物，其将与重组抗原结合的HIV特异抗体、与兔抗人IgG结合的抗体以及包被在膜上的人源IgG相结合，加入底物后发生反应导致显色。如果待测样本中含有HIV-I/HIV-II特异性抗体，在固定有相应重组蛋白的地方将出现特异性显色的条带，反之将不出现。无论待测样本中是否含有HIV-I/HIV-II特异性抗体，固定兔抗人IgG、人源IgG的条带均将显色。
本HIV抗体确认条的检测线共包括6条，从上至下依次为gp160、gp120、p66、gp41、p24和gp36，用于检测人类血清中的HIV特异抗体；其质控线共包括3条，从上至下依次为质控线±、质控线+和质控线3+。质控线±(兔抗人IgG)用于指示样品中免疫球蛋白IgG的含量；质控线+(兔抗人IgG)用于指示阳性条带的平均显色强度；质控线3+(人源IgG)用于指示碱性磷酸酶的活性。质控线±和质控线+为动态质控线，不同待测样本中的人源IgG含量的差别将导致这两条质控线显色强度的差别；质控线3+为标准质控线，其显色强度与待测样本无关。
用于本试剂盒的抗原均为通过基因工程制备的、体外表达获取的重组蛋白，这些重组蛋白均不具有生物危险性。
反应模式
本确认试剂盒的反应模式共有三种：间接法、夹心法以及免疫反应。HIV-I/HIV-II特异性抗体的检测采用的是间接法。将gp160 gp120 p66gp41 p24和gp36重组抗原独立包被在混合膜上；加入待测样本，其中的相应抗体将与这些抗原发生特异性的免疫反应；之后加入的羊抗人IgG(碱性磷酸酶标记)将与这些HIV特异抗体相结合；加入显色底物，在碱性磷酸酶的催化下，结合特异抗体的条带将出现肉眼可见的显色。
人类血清中的免疫球蛋白IgG的含量检测采用的是夹心法。将兔抗人IgG 多克隆抗体分别以不同的浓度包被在混合膜上作为质控线±和质控线+，加入待测样本，其中的人类血清免疫球蛋白IgG将与兔抗人IgG多克隆抗体发生免疫反应；之后加入的羊抗人IgG(碱性磷酸酶标记)将与人源IgG相结合；加入显色底物，在碱性磷酯酶的催化下，结合人源IgG的条带将出现肉眼可见的显色。在同一待测样本中，包被浓度的不同将此两条质控线导致显色深度的不同；在不同待检测样本中，人源IgG含量的差别将同时导致这两条质控线显色强度的差别。
碱性磷酸酶活性的检测采用的是特异性免疫反应。将人源IgG包被在混合膜上作为质控线3+，羊抗人IgG(碱性磷酸酶标记)将与其相结合；加入显色底物，在碱性磷酸酶的催化下，该位置将出现肉眼可见的显色。其显色强度与待测样本无关，仅用于指示碱性磷酸酶的活性。
重组抗原的选择
目前在世界范围内广泛应用于诊断HIV感染的确认试验一般都要求检测三类抗原(即env基因编码的外膜蛋白抗原、po1基因编码的聚合酶抗原和gag基因编码的核心抗原)。根据广东省卫生防疫站艾滋病监测检测中心HIV确认实验室对1991至1995年间HIV初筛阳性和可疑的103份样本进行确认试验的结果以及湖北省疾病预防控制中心对1995至2001年间289例HIV-1确认阳性样本带型分析的结果；同时在参照了美国CDC，美国FDA，WHO以及中国卫生部标准的基础上，确定用于本HIV确认试剂盒的抗原分别为env基因编码产物gp160，gp120，gp41和HIV-2型特异抗原gp36；pol基因编码产物p66；gag基因编码产物p24。
重组抗原的生产
序列的获得和引物的构建
通过信息检索获得HIV病毒gp160，gp120，gp41和gp36(HIV-II)的核酸编码序列；p66的核酸编码序列以及p24的核酸编码序列。在广泛查阅国内外相关文献报道以及与同行业厂家交流的基础上，选取了各个蛋白的多个免疫优势表位的核酸编码序列。根据其序列设计引物(引物含有接头，正向引物含有EcoIRI位点；反向引物含有Bam.HI位点)用于体外克隆。
序列扩增以及检定
以裂解的HIV(病毒为模板，用上述引物通过聚合酶链式反应(PCR)技术在体外克隆获得目的片段。使用0.8％TBE-琼脂糖凝胶电泳检测目的片段的长度。
连接转化
经检测确认为正确的克隆子，用E.coIR I，Bam.HI双酶切处理之。使用T4连接酶，将其分别连接到PUC表达载体中。之后转化基因工程用大肠杆菌JM109。用含有氨苄青霉素的培养基初筛含有表达载体的工程菌株，用双酶切检测出含有目的基因片段的工程菌株，用测序确认含有目的基因片段的菌株。
重组蛋白的表达和纯化
培养至对数生长期，使用IM的IPTG诱导其表达重组蛋白。采用溶菌酶结合超声波方法破碎菌体，经离心回收后，使用TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白，用盐酸胍(6mol/l)溶解包涵体蛋白。然后先后使用离子交换层析纯化和Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白。用SDS-PAGE的方法检测重组蛋白的纯度(图2)，应用Western Blot原理检测重组蛋白的特异性以及抗原性。
附图说明：
图1为测试结果比较使用的对比图，为膜上相应固相化蛋白的位置
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
(1)确认试纸条的制备及检测
用包被缓冲液。按一定的浓度用流试划膜仪将检测线和质控线均匀，整齐的固定于混合纤维素膜上。
确认试纸条的干燥
包被完成后置于超净工作台上室温吹风干燥2小时。保存于室温干燥环境中(16-25℃，相对温度不高于45％)。
半成品检定
用HIV抗体确认试剂国家参考品进行检定。
HIV抗体阳性参考品符合率 10份，要求阳性符合率为10/10。
HIV抗体阴性参考品符合率 12份，要求阴性符合率为12/12。
HIV抗体不确定型样品符合率 5份，检测结果不能为阴性。
无菌试验
液体组分按照<中国生物制品规程>中<生物制品无菌试验规程>第A3.2.3项进行。
稳定性试验
试剂各组分37℃放置6天，检定结果应达到标准。
分装
半成品检定合格后及时分装，分装后保存于2-8℃。(相对湿度不高于45％)。
(2)其他组分的制备：
HIV抗体确认条，组成为混合纤维素膜以及包被在该膜上的重组抗原，其制备方法如下：
A.使用包被缓冲液(0.01MTris-HCl，pH 7.4)将重组抗原以及兔抗人IgG和人源IgG稀释到合适的浓度(gp160、gp120、P66、gp41、P24、gp36的包被浓度分别为80μg/ml、80μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、80μg/ml和5μg/ml；兔抗人IgG的浓度分别为4.5μg/ml和100μg/ml；人源IgG的浓度为50μg/ml)；
B.使用流式划线仪以划膜速度为20mm/s，喷量为0.2μl/mm将各蛋白均匀包被于混合纤维素膜上；
C.包被完成的混合膜采用室温(16-25℃)吹干2小时的方法进行干燥；
D.干燥后真空包装，放在寒冷干燥处(2-8℃，相对湿度不高于45％)备用。反应液，组成为0.8％NaCl、0.02％KCl和0.05％吐温-20的0.01M Tris-HCl，其制备方法如下：
A.按照上诉配方配制；
B.使用NaOH颗粒将PH值调到7.4；
C.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
D.密封贮存于2-8℃环境中。
洗液，组成为10mM CB缓冲液添加200PPM PEG，500PPM Tween-20，500PPM甘油，100PPM Proclin300，其制备方法如下：
A.按照上诉配方配制；
B.使用NaOH颗粒将PH值调到9.8-10.0；
C.加入100PPM(质量体积比)的指示剂(溴百里酚蓝)，使其在正常状态下(2-30℃，PH＝9.9)呈蓝色
D.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
E.密封贮存于2-8℃环境中。
碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物，组成为碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物(1∶4000)，10mM Tris-cl，20％胎牛血清，100PPM PEG，500PPM甘油和100PPMProclin300其制备方法如下：
A.按照上诉配方配制；
B.使用HCl将PH值调到6.4-6.7；
C.加入100PPM(质量体积比)的指示剂(氯酚红)，使其在正常状态下(2-30℃，PH＝6-7)呈红色
D.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
F.密封贮存于2-8℃环境中。
BCIP/NBT显色底物，BCIP/NBT PURPLE LIQUID SUBSTRATE FORMEMBRANES)购自Sigma公司(125K1189)。
阳性参考血清，其制备方法如下：
A.选用ELISA测定效价不低于1∶200，HIV抗体全病毒确认试剂检测结果为全条带阳性的血清10份；
B.混合血清，采用60℃处理1小时；
C.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
D.除菌过滤后密封贮存于2-8℃环境中。
阴性参考血清，其制备方法如下：
A.选用经两种ELISA试剂测定、一种确认试剂检测、一种核酸检测试剂同时检测结果为HIV抗体阴性血清10份；
B.混合血清，采用60℃处理1小时；
C.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
D.除菌过滤后密封贮存于2-8℃环境中。
分装：
半成品检定合格后及时分装。分装后保存于2-8℃。(相对湿度不高于45％)。
组装
按试剂盒组成成份进行组装。
每一试剂盒中包括以下组成：
1、HIV抗体确认条 (避光，防潮) 20条
2、反应液 (配置完成后为乳白色) 1瓶(20毫升)
3、洗液 (蓝色) 1瓶(200毫升)
4、碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物 (红色) 1瓶(20毫升)
5、BCIP/NBT显色底物 (淡黄色) 1瓶(20毫升)
6、阳性参考血清 (生物危险品) 1瓶(50微)
7、阴性参考血清 1瓶(100微升)
8、反应板 (每板10个反应槽) 2个
9、对比卡片 1个
10、结果报告单 1张
11、说明书 1份
最后进行成品检定。
Claims (6)
1、一种人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂，其特征在于，包括HIV抗体确认条，反应液，洗液，碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物，BCIP/NBT显色底物，阳性参考血清，阴性参考血清，所述试剂采用HIV-I型特异性蛋白gp160、gp120、gp41、p66、p24以及HIV-II型特异性蛋白gp36与待测人类血清中的相应抗体特异结合，兔抗人IgG多克隆抗体与人类血清中的IgG结合，之后加入羊抗人IgG-碱性磷酸酶结合物，其将与重组抗原结合的HIV特异抗体、与兔抗人IgG结合的抗体以及包被在膜上的人源IgG相结合，加入底物后发生反应导致显色反应的原理制备而成。
2、权利要求1的确认试剂，所述试剂由一组产品组成一个试剂盒，其中主要组成成分如下：
HIV抗体确认条，反应液，洗液，碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物，BCIP/NBT显色底物，阳性参考血清，阴性参考血清，另外还有，反应板，对比卡片，结果报告单，产品说明书。
3、权利要求2的确认试剂，每一试剂盒中包括以下组成：
1、HIV抗体确认条 20条
2、反应液 1瓶
3、洗液 1瓶
4、碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物 1瓶
5、BCIP/NBT显色底物 1瓶
6、阳性参考血清 1瓶
7、阴性参考血清 1瓶
8、反应板 2个
9、对比卡片 1个
10、结果报告单 1张
11、说明书 1份。
4、权利要求3的确认试剂，其中
HIV抗体确认条，组成为混合纤维素膜以及包被在该膜上的重组抗原，其制备方法如下：
A.使用包被缓冲液将重组抗原以及兔抗人IgG和人源IgG稀释到合适的浓度；
B.使用流式划线仪以划膜速度为20mm/s，喷量为0.2μl/mm将各蛋白均匀包被于混合纤维素膜上；
C.包被完成的混合膜采用室温吹干2小时的方法进行干燥；
D.干燥后真空包装，放在寒冷干燥处备用；
反应液，组成为0.8％NaCl、0.02％KCl和0.05％吐温-20的0.01M Tris-HCl，其制备方法如下：
A.按照上述配方配制；
B.使用NaOH颗粒将PH值调到7.4；
C.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
D.密封贮存于2-8℃环境中，
洗液，组成为10mM CB缓冲液添加200PPM PEG，500PPM Tween-20，500PPM甘油，100PPM Proclin300，其制备方法如下：
A.按照上述配方配制；
B.使用NaOH颗粒将PH值调到9.8-10.0；
C.加入100PPM的指示剂，使其在正常状态下呈蓝色
D.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
E.密封贮存于2-8℃环境中，
碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物，组成为碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物，10mMTris-cl，20％胎牛血清，100PPM PEG，500PPM甘油和100PPM Proclin300其制备方法如下：
A.按照上诉配方配制；
B.使用HCl将PH值调到6.4-6.7；
C.加入100PPM的指示剂，使其在正常状态下呈红色
D.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
E.密封贮存于2-8℃环境中，
BCIP/NBT显色底物，
阳性参考血清，其制备方法如下：
A.选用ELISA测定效价不低于1∶200，HIV抗体全病毒确认试剂检测结果为全条带阳性的血清10份；
B.混合血清，采用60℃处理1小时；
C.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
D.除菌过滤后密封贮存于2-8℃环境中，
阴性参考血清，其制备方法如下：
A.选用经两种ELISA试剂测定、一种确认试剂检测、一种核酸检测试剂同时检测结果为HIV抗体阴性血清10份；
B.混合血清，采用60℃处理1小时；
C.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
D.除菌过滤后密封贮存于2-8℃环境中。
5、权利要求3的确认试剂的使用方法，包括以下步骤：
样品：
从测试者身上获得的血清或血浆，
仪器：
微量加样器，摇床，37℃烘箱，，37℃水浴箱，
试剂准备：
第一次使用时将脱脂奶粉加入到反应液中，温柔震荡使其混合均匀，
所有试剂在使用前在室温平衡半个小时或37℃水浴10分钟，
所有试剂在使用前温柔震荡使其混合均匀，使用后尽快将所用试剂放入2-8℃环境中，
操作方法：
快速反应模式：
(1)将待测样本及反应液在室温平衡半个小时，或放入37℃水浴箱中水浴10分钟
(2)从管中取出所需数量的HIV抗体确认试纸条，放在反应槽中，有数字标记的一面朝上；
(3)向每个槽内加入1毫升反应液，置于摇床上室温摇动5-10分钟，然后在反应槽的上方加入10微升待检样本；
(4)盖上反应槽，置于摇床上，室温孵育45分钟；
(5)完全去除槽中反应液，用1毫升洗液洗膜，共进行4次，每次5分钟；
(6)完全去除槽中洗液，向每个槽内加入酶结合物，1毫升，盖上反应槽，置于摇床上，室温摇动孵育30分钟；
(7)完全去除槽中酶结合物，用1毫升洗液将洗膜，共进行4次，每次5分钟；
(8)完全去除槽中洗液，向每个槽内加入1毫升显色剂，盖上反应槽，室温摇动反应10分钟；
(9)完全去除槽中显色剂，用蒸馏水冲2次，之后用蒸馏水浸泡1分钟终止反应；
(10)取出确认条，置于吸水纸上，放入烘箱中，37℃烘烤15分钟彻底干燥；
(11)使用对比卡片读取结果，在室温避光条件下，结果可以长期保存，
过夜反应模式：
步骤(4)的反应时间为过夜反应，其他步骤与快速反应一致，
对实验结果的解释：
(1)右图为膜上相应固相化蛋白的位置，使用对比卡片读取确认条的实验结果信息，
(2)计算总得分，
HIV-2型：满足以下3个条件可以初步判断为HIV-2型抗体阳性
满足阳性判定的条件；
gp36的显色结果强于质控线+；
gp41的显色结果不强于gp36的显色结果。
6、权利要求3的确认试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)重组抗原的生产
序列的获得和引物的构建
通过信息检索获得HIV病毒gp160，gp120，gp41和gp36的核酸编码序列；p66的核酸编码序列以及p24的核酸编码序列，在广泛查阅国内外相关文献报道以及与同行业厂家交流的基础上，选取了各个蛋白的多个免疫优势表位的核酸编码序列，根据其序列设计引物用于体外克隆，
序列扩增以及检定
以裂解的HIV病毒为模板，用上述引物通过聚合酶链式反应技术在体外克隆获得目的片段，使用0.8％TBE-琼脂糖凝胶电泳检测目的片段的长度，
连接转化
经检测确认为正确的克隆子，用E.coIR I，Bam.H I双酶切处理之，使用T4连接酶，将其分别连接到PUC表达载体中，之后转化基因工程用大肠杆菌JM109，用含有氨苄青霉素的培养基初筛含有表达载体的工程菌株，用双酶切检测出含有目的基因片段的工程菌株，用测序确认含有目的基因片段的菌株，
重组蛋白的表达和纯化
培养至对数生长期，使用IM的IPTG诱导其表达重组蛋白，采用溶菌酶结合超声波方法破碎菌体，经离心回收后，使用TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白，用盐酸胍溶解包涵体蛋白，然后先后使用离子交换层析纯化和Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白，用SDS-PAGE的方法检测重组蛋白的纯度，应用Western Blot原理检测重组蛋白的特异性以及抗原性，
(2)其他组分的制备：
HIV抗体确认条，组成为混合纤维素膜以及包被在该膜上的重组抗原，其制备方法如下：
A.使用包被缓冲液将重组抗原以及兔抗人IgG和人源IgG稀释到合适的浓度；
B.使用流式划线仪以划膜速度为20mm/s，喷量为0.2μl/mm将各蛋白均匀包被于混合纤维素膜上；
C.包被完成的混合膜采用室温吹干2小时的方法进行干燥；
D.干燥后真空包装，放在寒冷干燥处备用，
反应液，组成为0.8％NaCl、0.02％KCl和0.05％吐温-20的0.01M Tris-HCl，其制备方法如下：
A.按照上诉配方配制；
B.使用NaOH颗粒将PH值调到7.4；
C.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
D.密封贮存于2-8℃环境中，
洗液，组成为10mM CB缓冲液添加200PPM PEG，500PPM Tween-20，500PPM甘油，100PPM Proclin300，其制备方法如下：
A.按照上诉配方配制；
B.使用NaOH颗粒将PH值调到9.8-10.0；
C.加入100PPM的指示剂，使其在正常状态下呈蓝色
D.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
E.密封贮存于2-8℃环境中，
碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物，组成为碱性磷酸酶-羊抗人IgG结合物，10mMTris-cl，20％胎牛血清，100PPM PEG，500PPM甘油和100PPM Proclin300其制备方法如下：
A.按照上诉配方配制；
B.使用HCl将PH值调到6.4-6.7；
C.加入100PPM的指示剂，使其在正常状态下呈红色
D.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
F.密封贮存于2-8℃环境中，
BCIP/NBT显色底物，
阳性参考血清，其制备方法如下：
A.选用ELISA测定效价不低于1∶200，HIV抗体全病毒确认试剂检测结果为全条带阳性的血清10份；
B.混合血清，采用60℃处理1小时；
C.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
D.除菌过滤后密封贮存于2-8℃环境中，
阴性参考血清，其制备方法如下：
A.选用经两种ELISA试剂测定、一种确认试剂检测、一种核酸检测试剂同时检测结果为HIV抗体阴性血清10份；
B.混合血清，采用60℃处理1小时；
C.使用0.45μm滤膜过滤除菌；
D.除菌过滤后密封贮存于2-8℃环境中，
分装：半成品检定合格后及时分装，分装后保存于2-8℃，
组装：按试剂盒组成成份进行组装。
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