CN101082625B

CN101082625B - 一种测定人类免疫缺陷病毒（1＋2型）不同抗原表位产生的特异性hiv抗体的方法及抗原条

Info

Publication number: CN101082625B
Application number: CN2007100547653A
Authority: CN
Inventors: 付光宇; 李桂林; 刘功成; 李彬; 项立红; 陆莹; 马建军; 吴学炜
Original assignee: ZHENGZHOU AUTOBIO DIAGNOSTICS CO Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2007-07-12
Filing date: 2007-07-12
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2027-07-12
Also published as: CN101082625A

Abstract

本发明涉及测定人类免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位产生的特异性HIV抗体的方法，并根据其测定结果确证被测者是否感染HIV以及感染哪个亚型的HIV。用特异性HIV基因重组抗原包被于硝酸纤维素膜上制备HIV抗体特异性抗原条带；用胶体金标记羊抗—人IgG作为信号示踪系统；待测样本中的HIV特异性抗体可与胶体金标记羊抗—人IgG反应，然后与其对应的特异性抗原反应，形成特异性HIV抗原—特异性HIV抗体—胶体金标记羊抗人IgG抗体夹心复合物，并通过胶体金颗粒特有的颜色示踪而判断特异性抗体的有无。本发明特异性高，信号示踪系统性能稳定，结果判断直观，且避免了由于引入底物系统而出现的非特异性以及漏检的可能。

Description

一种测定人类免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位产生的特异性HIV抗体的方法及抗原条

技术领域

本产品涉及体外免疫诊断领域，特别涉及一种测定人类免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位产生的特异性HIV抗体的方法，并根据其测定结果判断被测者是否感染HIV以及感染哪个亚型的HIV。

背景技术

艾滋病(AIDS)，又名获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmuno-deficiency syndrome)，是由人类免疫缺陷病毒(Human ImmuneDeficiency Virus，HIV)引起的一种严重传染病。通过性接触和体液传播，能破坏人的免疫系统，特别是细胞免疫系统，以机会性感染和恶性肿瘤为特征的慢性传染病。艾滋病是一种目前尚无有效治愈办法、病死率极高的传染病，它在全世界的广泛流行已成为严重的公共卫生问题和社会问题。

目前美国杜邦公司、伯乐公司，法国生物梅里埃(原“阿克苏”)等公司先后推出了艾滋病确证试剂。这些进口试剂价格昂贵，而国内绝大多数感染者集中在农村或不发达地区，无法承担昂贵的检测费用。这种状况极大地限制了确认试剂在我国艾滋病检测工作的应用。国内只有极少数研究机构进行了艾滋病免疫印迹确诊试剂的研制工作，仅有的一种国产确认试剂由于采用全病毒作为抗原，其特异性受到限制，同时复杂的工艺也使得试剂的成本很高，价格与进口产品相差不大，无法在国内推广使用。确认试剂的国产化，尤其是是研制工艺简单、价格低廉的确认试剂已经迫在眉睫。

发明内容

本发明目的在于提供一种成本低、效果好的测定人类免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位产生的特异性HIV抗体的方法及抗原条，根据其测定结果可确证被测者是否感染HIV以及感染哪个亚型的HIV。

为达上述目的，本发明采用如下技术方案：一种测定人类免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位产生的特异性HIV抗体的方法，包括以下步骤：

(1)用特异性HIV基因重组抗原包被于抗原条上的硝酸纤维素膜上制备HIV抗体特异性WB抗原条带；

(2)用胶体金标记羊抗—人IgG作为信号示踪系统；

(3)利用待测样本中的HIV特异性抗体先与胶体金标记羊抗—人IgG反应，然后与其对应的特异性抗原反应，形成特异性HIV抗原—特异性HIV抗体—胶体金标记羊抗人IgG抗体夹心复合物，通过胶体金颗粒特有的颜色示踪而判断特异性抗体的有无。

所述的特异性HIV基因重组抗原包括：

HIV-1Env带的gp41、gp120和gp160基因重组抗原片段，Gag带的p55和p24基因重组抗原片段，Pol带的p51和p31基因重组抗原片段，和HIV-2的gp36基因重组抗原片段。

测定人类免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位产生的特异性HIV抗体的抗原条，包括PVC材质的底板，底板上面中间部位设有包被HIV特异抗原的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜下部上面叠合包被羊抗—人IgG胶体金标记抗体的聚酯膜材质的胶体金垫，胶体金垫上面叠合有玻璃纤维材质的样品垫，硝酸纤维素膜上部上面贴合吸引样品的棉浆板。

所述的特异性HIV基因重组抗原包括：

所述的胶体金由橘橼酸钠还原氯金酸制备，胶体金颗粒大小为20—60nm；胶体金标记羊抗—人IgG用碳酸钾调PH值6.0—9.0，单抗标记浓度为3—20μg/ml；抗原包被浓度为1.0mg/ml。

本发明使用基因重组抗原，避免了病毒全裂解抗原的随意性和不可控性，极大的减少了非特异性反应，可以选择优势抗原的优势表位表达，提高检测的灵敏度和敏感性，同时大大提高了试剂的稳定性；使用金标记技术显色，避免了因为酶标记引入底物和显色剂等相对性质不稳定试剂所引入的非特异性反应以及试剂变性所引发的漏检的危险，操作更加简单。成本低，不需要任何检测设备。

附图说明

图1为本发明抗原条模式图，其中a为HIV-1型阳性，b为HIV-2型阳性，c为阴性；

图2为本发明结构示意图。

具体实施方式

测定人类免疫缺陷病毒(1+2型)不同抗原表位产生的特异性HIV抗体的抗原条，包括PVC材质的底板1，底板1上面中间部位设有包被HIV特异抗原的硝酸纤维素膜2，硝酸纤维素膜2下部上面叠合包被羊抗—人IgG胶体金标记抗体的聚酯膜材质的胶体金垫3，胶体金垫3上面叠合有玻璃纤维材质的样品垫4，硝酸纤维素膜2上部上面贴合吸引样品的棉浆板5。

所述的特异性HIV基因重组抗原包括：

所述的胶体金由橘橼酸钠还原氯金酸制备，胶体金颗粒大小在不同实施例中分别取20、40、60nm；胶体金标记羊抗—人IgG用碳酸钾调PH值，在不同实施例中分别取6.0、7.5、9.0，单抗标记浓度在不同实施例中分别取3、12、20μg/ml；抗原包被浓度为1.0mg/ml。

抗原条制备主要步骤包括：

(1)、胶体金的制备：用洁净烧杯取100ml三蒸水，加入1％的氯金酸，搅拌煮沸，加入1ml1％柠檬酸钠继续搅拌煮沸5—10min，冷却。

(2)、金标记羊抗—人IgG的制备：将冷却之后的胶体金用0.2M碳酸钾和0.1M的盐酸调整PH至8.0左右，搅拌十分钟，加入1％BSA继续搅拌20—30分钟，离心弃上清备用。

(3)、金标记羊抗—人IgG工作液的制备：0.01M PH7.6的磷酸盐缓冲液中加入1％BSA，5％蔗糖，0.01％PEG6000，充分混匀制成标记物稀释液。将已经离心的金标记羊抗—人IgG以合适的比例加入到上述稀释液中，即制成金标记羊抗—人IgG作液。

(4)、抗原条测试线的制备：配制0.05M的碳酸盐缓冲液(PH9.5)，分别加入1.0mg/ml的特异性抗原，以1.0ml/cm自动喷膜机点喷于硝酸纤维膜上，冻干。包被的特异性抗原包括以下片段：

a)Env带的gp41、gp120、gp160基因重组抗原片段；

b)Gag带的p55、p24基因重组抗原片段；

c)Pol带的p51、p31基因重组抗原片段；

d)HIV-2的p36基因重组抗原片段；

(5)、抗原条质控线的包被：配制0.01M的磷酸盐缓冲液(PH8.0)，加入0.5mg/ml的IgG抗体，以1.0ml/cm自动喷膜机点喷于硝酸纤维膜上，冻干。

(6)、抗原条上的测试线及质控线的排列顺序：从抗原条编号端至另一端依次为HIV2gp36、质控线、gp17、gp24、gp34、gp41、p51、p55、p66、gp120、gp160。

利用该抗原条与辅料配合可组成人类免疫缺陷病毒(HIV)1+2型抗体免疫印迹试剂盒：

【试剂盒组成】

HIV1/2抗原条 20条 (塑料瓶装)

印迹缓冲液(10×) 12ml (塑料瓶装)

清洗缓冲液(10×) 60ml (塑料瓶装)

印迹粉 1g×8 (袋装)

结合物 70ul (离心管装)

HIV阴性对照品 70ul (离心管装)

HIV-1弱阳性对照品 70ul (离心管装)

HIV-1强阳性对照品 70ul (离心管装)

HIV-2阳性对照品

反应槽 1块

使用说明书 1份

【原理】

以硝酸纤维素膜为载体的抗原条，组合了HIV-1全病毒抗原和HIV-2gp36重组蛋白抗原。当抗原条与被检血清及对照品接触时，如血清标本有HIV-1/HIV-2特异性抗体，将会与抗原条上的HIV-1/HIV-2gp36抗原结合。结合的抗体再与结合物(羊抗人IgG标记胶体金)结合，清洗后观察并判断结果。

【适应范围】

用于初筛试剂判断为HIV阳性(如ELISA法)基础上的血清或血浆样本，进行确证是否为HIV-1阳性及诊断是否感染了HIV-2。

【使用方法】

1实验室必备器材

1.1摇床：速度为60-90转/分种

1.2移液管

1.3贮水瓶

1.4镊子或钳子

2溶液的配制(请按需要量现用现配)

2.1清洗缓冲液配制

取适量清洗缓冲液(10倍)，用蒸馏水按1：10稀释，混匀待用。实验所需数量参考下表配制。

2.2印迹缓冲液配制

A、取适量印迹缓冲液(10倍)，用蒸馏水按1：10稀释；

B、1g印迹粉加入20ml印迹缓冲液中充分溶解待用。实验所需数量参考下表配制。

2.3结合物稀释液

现用现配，按2ul结合物2ml印迹缓冲液的比例配制，并混匀待用。

不同抗原条数量所需的各种试剂量

3操作程序

3.1取出反应槽，每一槽内加2ml清洗缓冲液。

3.2用镊子小心地夹住抗原条编号的一端放入已有清洗缓冲液的反应槽中，有编号的一面朝上，每槽一条，让溶液覆盖住抗原条。

3.3将反应草放在摇床上，旋摇5-10分钟，然后吸弃清洗缓冲液。

3.4每槽加入印迹缓冲液2ml。

3.5用微量移液器在每一槽中分别加入20ul待检血清或血浆(注意：凡溶血、脂血或混浊样品均不能获得可靠结果)，并用本试剂盒中的对照品作平行对照。每一槽加一个样品，每加一个样品，换一个吸头，以免造成交叉污染。

3.6在室温下将反应槽在摇床上旋摇60分钟，注意控制旋摇速度，以免溶液从槽内溅入临近槽中，造成实验结果误差。

3.7旋摇完毕后，吸弃印迹缓冲液。(注：废弃夜应放如预先加入1％次卤酸钠的贮水瓶中。)

3.8每槽加入2ml清洗缓冲液，旋摇5分钟后，吸弃清洗缓冲液，共清洗3次，每次5分钟。

3.9在每槽加入2ml结合物稀释液，旋摇45分钟。(注意时间太长抗原条本底变深，会使结果判断困难；如果强阳性血清色带增深时可先行终止反应；若弱阳性血清色带较浅可以适当延长反应时间，但不得超过30分钟。)

3.10从槽中吸弃结合物稀释液，每槽用2ml清洗缓冲液清洗三次，每次5分钟，吸尽余液。

3.11将抗原条放于二张滤纸间吸干水分后观察结果。

【结果判断】

1、对照品检测结果判定要求

1.1HIV-1强阳性对照品必须出现gp160/gp120和gp41、p24带型，以及p66、p55/51、p34、p17带型判定为阳性。HIV-2gp36为阴性(见模式图)。

1.2HIV-l弱阳性对照品，在gp160、gp120和gp41、p24带型中至少出现二条，判定为阳性。其他位置也可能出现弱带，但对分析并非必需。HIV-2gp36为阴性。

1.3HIV-2阳性对照品必需出现gp36重组蛋白带型，判定为阳性。

1.4HIV-1阴性对照品应无上述的特异型带型出现，判定为阴性。

2被检血清/血浆的判定标准

2.1有下列情况之一者判定为HIV抗体阳性。

a)至少一条env带和一条pol带；

b)至少一条env带和一条gag带；

c)至少二条env带；

(注：env带有gp160、gp120、gp41；gag带有p55、p24、p17；pol带有p66、p51、p34。)

2.2有HIV-2gp36重组蛋白带型出现者判定为HIV-2抗体阳性，需用HIV-2确认试剂进一步检测。

2.3无HIV特异性抗体带型出现者判定为HIV阴性。

2.4出现HIV特异性抗体带型，但带型不足以确认阳性者，判定为HIV抗体可疑。

【注意事项】

1.只有按此手册的操作程序操作才能获得可信的结果，任何不按此程序操作均可能造成错误的结论。不论待测样品多少，HIV-1强阳性、HIV-1弱阳性和HIV阴性对照均必须同时进行。

2.所有操作均应在室温下进行。试剂盒在检测前从冰箱中取出，放于室温下，平衡30分钟后，方可使用。

3.任何变质的抗原条，如变色或出现霉斑，不得使用。清洗缓冲液和印迹液呈现云状物或白色颗粒，仍可使用，不能过滤。任何变质的抗原或试剂都可能产生错误的结果。

4.整个操作过程均应戴手套，穿工作服，操作结束后及时洗手，配制溶液时严禁用嘴吸吸管。

5.所有待测样品，硝酸纤维膜抗原条和对照品均应做可传染的病原体处理。

6.实验中有液体溅出时，及时用1％次氯酸钠处理，污染了的材料均应消毒处理。

7.试验中所用到的样品和材料均应作为可传染物处理。可用121℃高压灭菌1小时，也可焚烧处理，液体废物可用1％次氯酸钠处理。

8.使用时，本试剂盒中提供的对照品和试剂不可与另一套试剂盒混用，也不要交换瓶盖，否则会造成交叉污染。

9.如果一次测试样品不足20条，剩余抗原条仍放回原抗原条管中，密封好后于2-8℃保存。

10.如果抗原条和血清样品作用时间过长，阴性样品也可能出现弱带。

11.HIV-1阳血清，据资料介绍，有少数病例可与HIV-2gp36成交叉反应。

12本试剂盒开启后，尽可能在1个月内使用完毕。

使用上述抗原条检测HIV抗体国家参考品(20050101)，检测结果如下：

Claims

1.测定人类免疫缺陷病毒1+2型不同抗原表位产生的特异性HIV抗体的抗原条，其特征在于，包括PVC材质的底板，底板上面中间部位设有包被HIV特异抗原的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜下部上面叠合包被羊抗-人工IgG胶体金标记抗体的聚酯膜材质的胶体金垫，胶体金垫上面叠合有玻璃纤维材质的样品垫，硝酸纤维素膜上部上面贴合吸引样品的棉浆板；所述的HIV特异抗原包括：

Env带的gp41、gp120和gp160基因重组抗原片段，Gag带的p55和p24基因重组抗原片段，Po1带的p51和p31基因重组抗原片段，和HIV-2的gp36基因重组抗原片段。

2.根据权利要求1所述的测定人类免疫缺陷病毒1+2型不同抗原表位产生的特异性HIV抗体的抗原条，其特征在于，所述的胶体金由橘橼酸钠还原氯金酸制备，胶体金颗粒大小为20-60nm；胶体金标记羊抗-人IgG用碳酸钾调PH值6.0-9.0，单抗标记浓度为3-20ug/ml；抗原包被浓度为1.0mg/ml。