CN101738473A

CN101738473A - 梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN101738473A
Application number: CN200810160026A
Authority: CN
Inventors: 蒙红胜; 贾向阳; 贾毅; 周雷; 赵海英
Original assignee: Weihai Weigao Biotech Co Ltd
Current assignee: Weihai Weigao Biotech Co Ltd
Priority date: 2008-11-13
Filing date: 2008-11-13
Publication date: 2010-06-16
Anticipated expiration: 2028-11-13
Also published as: CN101738473B

Abstract

本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及了一种化学发光法梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法。试剂盒由测抗-TP反应板、测抗-TP酶结合物、化学发光底物液、浓缩洗液、阴性对照和阳性对照组成，本发明还公开了该诊断试剂盒的制备方法，其采用的是化学反光免疫分析技术，比ELISA具有更高的灵敏度和特异性，适合于临床梅毒的辅助诊断和献血员筛查，填补了国内化学发光法检测梅毒螺旋体抗体诊断试剂生产的空白。

Description

梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种免疫诊断技术，具体地说是一种梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术

我们知道，梅毒(Syphilis)是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum)引起的一种慢性系统性传染病，是经典的性病之一，性接触传染占95％，梅毒与结核、麻风并列为世界三大慢性传染病，目前在我国属十大传染病之一。本病临床表现复杂，病程较长，几乎可以侵犯全身各组织和器官。我国于1959年已经基本消除了梅毒，但是自70年代以来、改革开放以后，随着社会的发展、与国外交流的增多，性病又在我国死而复生，特别是梅毒发病人数大大增加，发病人数急剧上升，虽然我国政府采取了大量措施控制梅毒的流行，但最近几年发病率增长的势头仍未减缓，梅毒的发展在我国已经不能再轻视了。梅毒在其他国家也在泛滥，根据世界卫生组织(WHO)的资料，在1999年全球估计有1200万成人梅毒感染者，其中90％的是在发展中国家，但在最近几年美国和西欧国家梅毒感染人数也在不断增加。

至今人们对该病原体的了解是非常有限的，仍未了解梅毒螺旋体的致病机理，还没有研制成功可以预防梅毒的疫苗，只有远离传染源才能有效避免感染梅毒。梅毒只有早期进行诊断，才能在早期进行治疗并且彻底治疗，否则将会传染给他人和使自身病情加重、影响身体健康和传给后代。因此有必要开发出一种性能较好的诊断方法，能有效地在早期就将该疾病诊断出来，及时治疗，减少因梅毒带来的健康和财产的损失。

目前诊断梅毒的实验室方法技术主要包括非梅毒螺旋体抗原血清试验(如性病研究实验室玻片试验、快速血浆反应素试验、梅毒甲苯胺红不加热血清反应素玻片试验)和梅毒螺旋体抗原血清试验(如荧光梅毒螺旋抗体吸收试验、梅毒螺旋体血凝试验、梅毒螺旋体明胶凝集试验)，这些方法都不是最令人满意的，另外检测梅毒螺旋体特异性抗体的还有酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金法，ELISA检测梅毒抗体的方法已得到了大量的推广，该方法具有很多优点，但在检测的灵敏度方面还有待进一步提高。化学发光免疫分析在酶免疫分析基础上结合了化学发光技术使得检测的灵敏度和特异性得到大幅度提高，它是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项免疫分析技术，根据大量的实验结果以及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及其发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位，代表了当今世界的发展方向和潮流，它不仅有免疫反应的特异性，而且有化学发光反应的高灵敏性。化学发光免疫分析技术具有高灵敏度、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射性免疫分析和酶免疫分析的首选。但是目前国内尚无生产用于梅毒螺旋体抗体检测的化学发光法诊断试剂，目前急需灵敏度和特异性较高的化学发光诊断试剂，可以作为ELISA试剂和其他试剂的替代品，用于梅毒的诊断。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种具有高灵敏度和特异性，适合于临床梅毒螺旋体的辅助诊断和献血员筛查的化学发光法梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒，其包括测抗-TP反应板、测抗-TP酶结合物、化学发光底物液、浓缩洗液、阴性对照和阳性对照，其特征是：所述测抗-TP反应板为48孔或96孔，载有梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15、TP47；测抗-TP酶结合物1瓶，含有重组抗原TP15、TP47与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成的酶标记物；化学发光底物液2瓶，其是化学发光底物液A液：0.2M pH7.8Tris-Hcl、2.0g/L鲁米诺、0.5g/L四苯硼钠，化学发光底物液B液：0.2M pH7.8Tris-Hcl、1.0ml/LH₂O₂；浓缩洗液1瓶，其配方为磷酸氢二钠28.6g/L、磷酸二氢钠3.9g/L、氯化钠160.0g/L、Tween-2010.0ml/L；阴性对照和阳性对照各1瓶，阴性对照为选用5份以上梅毒抗体检测为阴性的正常人血清混合；阳性对照为选用5份以上梅毒抗体检测为阳性的人血清混合。

本发明还提供了上述梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征是：其包括下述步骤：

(1)测抗-TP反应板的制备将梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15、TP47用0.05mol/L pH9.6的碳酸缓冲液进行稀释，稀释后的包被浓度为TP15(1∶4000)和TP47(1∶5000)，测抗-TP反应板为48孔或96孔，每孔加入100μl，置于2-8℃孵育18-24小时，洗板1次后每孔加入150μl封闭液，于2-8℃孵育18-24小时，吸干封闭液后置相对湿度≤30％的环境干燥5小时，铝箔袋密封包装，2-8℃保存；

(2)测抗-Tp酶结合物的制备重组抗原TP15、TP47与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成酶标记物，反应体系为：用5mg/ml的HRP溶液1ml与0.2ml的0.1M NaIO₄溶液混匀4℃避光1小时，加入0.2ml的乙二醇摇匀室温避光1小时，4℃透析过夜，用0.2ml 0.2M pH9.6的CB将透析后的醛化HRP溶液调pH值为9.2-9.5，按醛化HRP：抗原质量比为1∶2的最适比例，将溶于0.01M pH9.6的碳酸缓冲液中的抗原立即加入上述醛化HRP中于37℃反应1小时，加入0.1ml NaBH₄溶液(3.5毫克/毫升)，混匀于4℃放置2小时，用凝胶过滤层析进行纯化，得到辣根过氧化物酶标记的TP15和TP47；用稀释液将辣根过氧化物酶标记的TP15和TP47稀释到工作浓度HRP-TP15(1∶5000)、HRP-TP47(1∶6000)；

(3)化学发光底物液的制备化学发光底物液A液：0.2M pH7.8Tris-Hcl、2.0g/L鲁米诺、0.5g/L四苯硼钠，化学发光底物液B液：0.2M pH7.8Tris-Hcl、1.0ml/LH₂O₂；

(4)其他组分的制备①浓缩洗液的配方为磷酸氢二钠28.6g/L、磷酸二氢钠3.9g/L、氯化钠160.0g/L、Tween-2010.0ml/L；②阴性对照：选用5份以上梅毒抗体检测为阴性的正常人血清混合，经60℃处理1小时，除菌过滤保存于2-8℃；③阳性对照：选用5份以上梅毒抗体检测为阳性的人血清混合，经60℃处理1小时后，除菌过滤保存于2-8℃。

本发明上述梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒的制备方法，所述的配置测抗-Tp酶结合物的稀释液的配方为磷酸二氢钠0.39g/L、磷酸氢二钠2.68g/L、氯化钠15.0g/L、小牛血清100ml/L、硫柳汞1.0g/L。

本发明的原理是利用化学反光免疫分析技术，用特异性的梅毒螺旋体重组抗原TP15、TP47包被化学发光板、以辣根过氧化物酶(HRP)标记的相同蛋白作为标记抗原，与样本中的抗梅毒螺旋体抗体形成双抗原夹心复合物(包被抗原-抗梅毒螺旋体抗体-标记抗原)，标记抗原上的HRP催化化学发光底物产生光子，通过化学发光分析仪检测相对发光单位，发光值的高低与样本中抗梅毒螺旋体抗体的含量成正比，根据临界值可判断样本中是否含有梅毒螺旋体特异性抗体。

本发明试剂盒的优点是采用了化学反光免疫分析技术，比ELISA具有更高的灵敏度和更好的特异性，填补了国内梅毒螺旋体抗体检测的化学发光法诊断试剂生产的空白。

具体实施方式

本发明试剂盒采用化学发光免疫分析技术，检测血清中是否存在梅毒螺旋体抗体。本实施例具体描述了梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法。一种梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒，其包括测抗-TP反应板、测抗-TP酶结合物、化学发光底物液、浓缩洗液、阴性对照和阳性对照，所述测抗-TP反应板为48孔或96孔，载有梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15、TP47；测抗-TP酶结合物1瓶，含有重组抗原TP15、TP47与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成酶标记物；化学发光底物液2瓶，其是化学发光底物液A液：0.2M pH7.8Tris-Hcl、2.0g/L鲁米诺、0.5g/L四苯硼钠，化学发光底物液B液：0.2M pH7.8Tris-Hcl、1.0ml/LH₂O₂；浓缩洗液1瓶，其配方为磷酸氢二钠28.6g/L、磷酸二氢钠3.9g/L、氯化钠160.0g/L、Tween-2010.0ml/L；阴性对照和阳性对照各1瓶，阴性对照为选用5份以上梅毒抗体检测为阴性的正常人血清混合；阳性对照为选用5份以上梅毒抗体检测为阳性的人血清混合。

本发明还提供了上述梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒的制备方法，其中原材料的选择包括：

(1)抗原的选择抗原的选择依据是：具有天然抗原的主要免疫活性区、纯度高、效价高、特异性高等。经过详细的市场调查研究，在考察抗原质量的同时也考察了抗原生产、供应单位的资质，最后我们将上海金炬生物科技有限公司提供的梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15和TP 47作为抗原来源，这两种抗原为大肠杆菌表达的基因重组蛋白，包含梅毒螺旋体膜蛋白TpN15、TpN47的主要免疫活性区域，经纯化而得。首先就该公司提供的蛋白的外观、含量、纯度、分子量、效价进行验证，并将抗原进行辣根过氧化物酶(HRP)的标记，用梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家标准品进行检测，结果抗原溶液外观澄清、无肉眼可见异物、无摇不散的沉淀，纯度较高(均＞95％)，分子量分别为15KDa和47KDa左右，并具有较高的效价和很好的活性，特异性和灵敏度较好，研究结果表明上海金炬生物科技有限公司提供的重组抗原完全可用于本发明诊断试剂盒的制备。

(2)辣根过氧化物酶标记的TP15和TP47质量研究首先观察标记物的外观；用ELISA法检测效价，方法为将TP15和TP47分别按效价的一半稀释包被酶联反应板，将相应的HRP-TP15和HRP-TP47梯度稀释，按双抗原夹心一步法检测100倍稀释的国家标准品强阳性P10，同时做不含酶结合物的稀释液的对照，以含酶结合物A值＞不含酶结合物的A值的最大稀释度为效价；用紫外吸收法测定蛋白质含量，测量A_280nm和A_260nm，根据公式计算：蛋白含量(mg/mL)＝1.45A_280nm-0.74A_260nm。根据上述多次试验研究，本发明制备试剂盒所用HRP-TP15、HRP-TP47抗原的质量标准为外观微带棕色的澄清液体，无异物、浑浊或摇不散的沉淀；HRP-TP15应≥1∶10000，HRP-TP47应≥1∶12000；含量范围应为：1.0-2.0mg/ml之间。

(3)化学发光板在化学发光法诊断试剂盒中，作为固相载体的化学发光板对抗原、抗体的吸附性直接影响到试剂盒的质量。我们对发光板的物理性状、吸附一致性和背景发光值进行了检测，根据检测结果确定深圳市金灿华实业有限公司生产的化学发光板，作为生产该试剂盒的化学发光板，并且建立了该试剂盒用化学发光板的的质量标准如下：

本发明具体制备方法包括下述步骤：

(1)测抗-TP反应板的制备

将梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15、TP47用0.05mol/L pH9.6的碳酸缓冲液进行稀释，稀释后的包被浓度为TP15(1∶4000)和TP47(1∶5000)，测抗-TP反应板为48孔或96孔，每孔加入100μl，置于2-8℃孵育18-24小时，洗板1次后每孔加入150μl封闭液，于2-8℃孵育18-24小时，吸干封闭液后置相对湿度≤30％的环境干燥5小时，铝箔袋密封包装，2-8℃保存。

其中所需封闭液的配方为磷酸二氢钠o.39g/L、磷酸氢二钠2.68g/L、氯化钠8.50g/L、蔗糖40.0g/L、牛血清白蛋白10.0g/L、硫柳汞1.0g/L。

(2)测抗-Tp酶结合物的制备

重组抗原TP15、TP47与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成酶标记物，反应体系为：用5mg/ml的HRP溶液1ml与0.2ml的0.1M NaIO₄溶液混匀4℃避光1小时，加入0.2ml的乙二醇摇匀室温避光1小时，4℃透析过夜，用0.2ml 0.2M pH9.6的CB将透析后的醛化HRP溶液调pH值为9.2-9.5，按醛化HRP：抗原质量比为1∶2的最适比例，将溶于0.01M pH9.6的碳酸缓冲液中的抗原立即加入上述醛化HRP中于37℃反应1小时，加入0.1ml NaBH₄溶液(3.5毫克/毫升)，混匀于4℃放置2小时，用凝胶过滤层析进行纯化，得到辣根过氧化物酶标记的TP15和TP47；然后对辣根过氧化物酶标记的TP15和TP47质量进行研究，选择符合质量标准的抗-Tp酶结合物，用稀释液将辣根过氧化物酶标记的TP 15和TP47稀释到最适工作浓度HRP-TP 15(1∶5000)+HRP-TP47(1∶6000)，用于生产该试剂盒。

上述抗-Tp酶结合物的稀释液的配方为磷酸二氢钠0.39g/L、磷酸氢二钠2.68g/L、氯化钠15.0g/L、小牛血清100ml/L、硫柳汞1.0g/L，

(3)化学发光底物液的制备

化学发光底物A液：配置0.2M pH7.8的Tris-HCl缓冲液，在此缓冲液中加入2.0g/L鲁米诺和0.5g/L四苯硼钠，混合均匀；

化学发光底物B液：配置0.2M pH7.8的Tris-HCl缓冲液，在此缓冲液中加入1.0ml/L H₂O₂。

(4)浓缩洗液的配方

磷酸氢二钠28.6g/L、磷酸二氢钠3.9g/L、氯化钠160.0g/L、Tween-2010.0ml/L

(5)阴性对照

选用5份以上梅毒抗体检测为阴性的正常人血清混合，经60℃处理1小时，除菌过滤保存于2-8℃。

(6)阳性对照

选用5份以上梅毒抗体检测为阳性的人血清混合，经60℃处理1小时后，除菌过滤保存于2-8℃。

本发明梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒检测样品中梅毒螺旋体抗体的检测方法是：

(1)从冰箱中取出试剂盒，室温平衡30分钟以上。

(2)取浓缩洗液一瓶(25ml)，用蒸馏水或去离子水稀释至500ml，使成工作液，混匀备用。

(3)设空白对照1孔，其不加样本和测抗-TP酶结合物，其余步骤与其他孔相同；设阴性对照2孔、阳性对照2孔；除空白孔外每孔加入100μl测抗-TP酶结合物，然后在相应孔内分别加入阴性对照、阳性对照、待测样本各20μl，用封板膜密封，轻轻混匀后置37℃温箱温育60分钟。

(4)用洗液工作液洗板，将每孔内的液体吸净后注满洗液(每孔至少400μl)，浸泡10-60秒后，吸净每孔中洗液，如此反复5次，最后在吸水纸上拍干。

(5)每孔先后加入化学发光底物A液、B液各50μl，轻轻混匀后于室温(18-30℃)避光反应5分钟。

(6)避光反应结束后立即在化学发光分析仪上测量各孔的相对发光单位(RLU)，测量时间设定为0.1秒/孔。

(7)结果判定：根据待测样本的RLU值与临界值进行比较，样本RLU值≥临界值(Cutoff)者判为阳性，样本RLU值＜临界值(Cutoff)者判为阴性。临界值(Cutoff)计算：临界值(Cutoff)＝阴性对照RLU平均值×2.1，如阴性对照RLU＜100则按100计算，如阴性对照RLU≥100则按实际测量值计算。

本发明试剂盒经中国药品生物制品检定所提供的梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家标准品检定的结果显示：该试剂盒的阴阳参考品符合率、灵敏度、特异性、精密性、稳定性等各项质量指标均符合国家标准。

检测项目	检测结果
检测项目	检测结果	阴性符合率	20份阴性参比品符合率20/20
阳性符合率	10份阳性参比品符合率10/10	阴性符合率	20份阴性参比品符合率20/20

检测项目	检测结果
检测项目	检测结果	灵敏度检测	L1应检出阳性，L2应检出阳性，L3可检出阳性或阴性；L4应检出阴性。
精密性	10孔检测变异系数(CV)≤15％	灵敏度检测	L1应检出阳性，L2应检出阳性，L3可检出阳性或阴性；L4应检出阴性。
精密性	10孔检测变异系数(CV)≤15％	稳定性	试剂各组分于37℃放置6天，检定结果应达到标准

本发明试剂盒的临床考核结果：经北京大学第一医院、河北省血液中心、中国人民解放军第三军医大学第一附属医院三家医院临床考核，检测结果见下表：

结果表明：

(1)北京大学第一医院考核结果显示：该试剂盒阴性符合率为100％，阳性符合率为98.7％。

(2)河北省血液中心考核结果显示：该试剂盒阴性符合率为99.8％，阳性符合率为100％。

(3)中国人民解放军第三军医大学第一附属医院考核结果显示：该试剂盒阴性符合率为100％，阳性符合率为100％。

该诊断试剂盒总的灵敏度为98.8％，特异性为100％，诊断试剂盒(双抗原夹心化学发光法)灵敏度为98.8％，特异性为100％，适合于临床梅毒的辅助诊断和献血员筛查。

Claims

1.一种梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒，其包括测抗-TP反应板、测抗-TP酶结合物、化学发光底物液、浓缩洗液、阴性对照和阳性对照，其特征是：所述测抗-TP反应板为48孔或96孔，载有梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15、TP47；测抗-TP酶结合物1瓶，含有重组抗原TP15、TP47与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成的酶标记物；化学发光底物液2瓶，其是化学发光底物液A液：0.2M pH7.8 Tris-Hcl、2.0g/L鲁米诺、0.5g/L四苯硼钠，化学发光底物液B液：0.2M pH7.8 Tris-Hcl、1.0ml/LH₂O₂；浓缩洗液1瓶，其配方为磷酸氢二钠28.6g/L、磷酸二氢钠3.9g/L、氯化钠160.0g/L、Tween-2010.0ml/L；阴性对照和阳性对照各1瓶，阴性对照为选用5份以上梅毒抗体检测为阴性的正常人血清混合；阳性对照为选用5份以上梅毒抗体检测为阳性的人血清混合。

2.一种权利要求1所述梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征是：其包括下述步骤：

(1)测抗-TP反应板的制备按包被浓度为：TP15(1∶4000)和TP47(1∶5000)，将梅毒螺旋体特异性重组抗原TP15、TP47用0.05mol/L pH9.6的碳酸缓冲液进行稀释，测抗-TP反应板为48孔或96孔，每孔加入100μl，置于2-8℃孵育18-24小时，洗板1次后每孔加入150μl封闭液，于2-8℃孵育18-24小时，吸干封闭液后置相对湿度≤30％的环境干燥5小时，铝箔袋密封包装，2-8℃保存；

(2)测抗-Tp酶结合物的制备重组抗原TP15、TP47与辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法合成酶标记物，反应体系为：用5mg/ml的HRP溶液1ml与0.2ml的0.1M NaIO₄溶液混匀4℃避光1小时，加入0.2ml的乙二醇摇匀室温避光1小时，4℃透析过夜，用0.2ml 0.2M pH9.6的CB将透析后的醛化HRP溶液调pH值为9.2-9.5，按醛化HRP∶抗原质量比为1∶2的最适比例，将溶于0.01M pH9.6的碳酸缓冲液中的抗原立即加入上述醛化HRP中于37℃反应1小时，加入0.1ml NaBH₄溶液(3.5毫克/毫升)，混匀于4℃放置2小时，用凝胶过滤层析进行纯化，得到辣根过氧化物酶标记的TP15和TP47；用稀释液将辣根过氧化物酶标记的TP15和TP47稀释到工作浓度HRP-TP15(1∶5000)、HRP-TP47(1∶6000)；

(3)化学发光底物液的制备化学发光底物液A液：0.2M pH7.8 Tris-Hcl、2.0g/L鲁米诺、0.5g/L四苯硼钠，化学发光底物液B液：0.2M pH7.8 Tris-Hcl、1.0ml/LH₂O₂；

3.根据权利要求2所述梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征是：所说的封闭液的配方为磷酸二氢钠0.39g/L、磷酸氢二钠2.68g/L、氯化钠8.50g/L、蔗糖40.0g/L、牛血清白蛋白10.0g/L、硫柳汞1.0g/L。

4.根据权利要求2所述梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征是：所说的测抗-Tp酶结合物稀释液的配方为磷酸二氢钠0.39g/L、磷酸氢二钠2.68g/L、氯化钠15.0g/L、小牛血清100ml/L、硫柳汞1.0g/L。