CN110078822B - 抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3及其应用 - Google Patents

抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。本发明的优点在于提供了一种抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体。制备方法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如对临床和实验室的梅毒抗原诊断奠定了物质基础。

Description

抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。
背景技术
梅毒是由苍白密螺旋体引起的一种常见的性传播疾病，可以侵犯全身皮肤、黏膜和多种器官。梅毒患者可以出现一期梅毒、二期梅毒的典型临床表现，亦可以表现为潜伏梅毒，少数患者还可以出现三期梅毒。近年来，梅毒发病率有上升趋势，据我国疾控中心统计，2017年梅毒的发病率为34.48/10万，这可能与男性性行为者“爆发”相关，导致这类特殊群体梅毒高发病率与不安全性行为相关，亦可能与HIV感染相关。梅毒与HIV感染的密切关系，使得这一公共卫生问题再次引起了大家的广泛关注。
虽然I期梅毒硬下疳、II期扁平湿疣的皮疹形态极具诊断价值，但作为一个臭名昭著的“模仿者”，梅毒的临床表现往往错综复杂，另人琢磨不透。因此，实验室检测对于梅毒的诊断非常重要。一直以来，梅毒螺旋体暗视野检查是其诊断的金标准，但是此法对检验人员要求高，在大部分医院未能开展。其他的实验室检测包括：梅毒螺旋体特异性抗体及非特异性抗体的血清学检查，荧光定量聚合酶链反应法检测梅毒螺旋体DNA。目前血清学检测仍是梅毒诊断的最重要的方法，然而，梅毒血清学检测存在前带反应，血清固定，在感染初期尚未出现抗体导致未能及时诊断及特殊人群可能出现假阳性等问题。
发展一种快速、灵敏的梅毒诊断抗体非常有必要。基于以上背景，本项目选定目前公认的梅毒螺旋体膜蛋白Tp47为靶抗原，利用分子生物学技术，成功表达、纯化了梅毒螺旋体膜蛋白Tp47，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗Tp47蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，为建立新梅毒诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定物质基础。
本发明用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供了一种快速、灵敏的梅毒诊断抗体。
本发明的目的是提供一种抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示(重链DNA序列如SEQ ID No.1)，轻链氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示(轻链DNA序列如SEQ ID No.3)；该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，命名为ZJTP47-1B3，能特异性识别梅毒螺旋体膜蛋白Tp47。
抗体的重链序列
SEQ ID No.1
Heavy chain:DNA sequence(408bp)
Leader sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCCTCAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTACAGCAACCTGGGTCTGAGTTGGTGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTCGCCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTTATCCTGGTAGTGGTCGTACTAACTACGATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAACACACCCTACATACAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGTAACTTATATTCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID No.2
Heavy chain:Amino acids sequence(136aa)
Leader sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MGWSSIILFLVATASGVHSQVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFASYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSGRTNYDEKFKSKATLTVDTSSNTPYIQLSSLTSEDSAVYYCARGNLYSMDYWGQGTSVTVSS
抗体的轻链序列
SEQ ID No.3
Light chain:DNA sequence(393 bp)
Leader sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCGTCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAATACATCTAGCTATAGTTATTTGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCAAATATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCTCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATAGTGCAACATATTACTGTCAGCACACTTGGGAGATTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
SEQ ID No.4
Light chain:Amino acids sequence(131aa)
Leader sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATVSCRASQSVNTSSYSYLHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVSARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDSATYYCQHTWEIPYTFGGGTKLEIK
所述抗体由杂交瘤细胞产生。
所述杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系ZJTP47-1B3，能稳定分泌抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3。
本发明的第二个目的是提供抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体的制备方法，通过以下步骤和技术方案实现：
(1)动物的免疫：选择8周龄的BALB/C小鼠，以纯化的梅毒螺旋体膜蛋白Tp47进行免疫。梅毒螺旋体膜蛋白Tp47是由将梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的基因序列克隆至pET-23a(+)载体，经异丙基硫代半乳糖苷诱导在BL21(DE3)中表达、纯化获得，经Western Blot鉴定与目的蛋白符合。
(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长状态用于细胞融合。
(3)细胞融合：采用聚乙二醇融合法。以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％FBS的HAT培养基培养一天。将(1)中备好的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞。收集(2)中的小鼠骨髓瘤细胞。将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇(PEG5000)介导细胞融合。融合后的细胞适当稀释，接种至饲养细胞培养板，适当条件培养。
(4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在选择性培养基中培养。在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆。
(5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔板，尽量使每孔只有一个细胞生长。形成细胞集落的孔取培养上清液做酶联免疫吸附实验(ELISA)，鉴定阳性克隆。重复有限稀释克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养做抗体鉴定及理化性状分析。
(6)单抗腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油每只0.5ml，然后每只接种1-5×106阳性杂交瘤细胞，7-10天后收集腹水离心，测定抗体效价，并纯化单克隆抗体。
(7)单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。
本发明得到一个产生抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体杂交瘤系，命名为ZJTP47-1B3，ZJTP47-1B3杂交瘤细胞系经4次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。经单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞产生的抗体类型为IgG1。
本发明提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是由免疫的BALB/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的小鼠杂交瘤细胞系ZJTP47-1B3，能稳定分泌抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3。
本发明的另一个目的是提供该单克隆抗体ZJTP47-1B3在含有梅毒螺旋体Tp47蛋白的体液或培养液检测，通过下述途径实现：
①以单克隆抗体ZJTP47-1B3为探针，通过免疫印迹方法(Western Blot)。
②以单克隆抗体ZJTP47-1B3作为检测抗体，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)。
③金标单克隆抗体ZJTP47-1B3，通过制备胶体金免疫层析试纸条。
本发明还提供了一种检测探针，包括单克隆抗体ZJTP47-1B3，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，命名为ZJTP47-1B3，能特异性识别梅毒螺旋体膜蛋白Tp47。
一种胶体金免疫层析试纸条，包括单克隆抗体ZJTP47-1B3，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，命名为ZJTP47-1B3，能特异性识别梅毒螺旋体膜蛋白Tp47。
本发明的优点在于提供了一种抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体。制备方法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如对临床和实验室的梅毒抗原诊断奠定了物质基础，。
说明书附图
图1单克隆抗体ZJTP47-1B3的免疫球蛋白亚型分析。
图2单克隆抗体ZJTP47-1B3检测梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的免疫印迹图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体的制备方法
(1)小鼠的免疫：选择8周龄的雄性BALB/C小鼠进行免疫，首次免疫，将200ug重组Tp47蛋白溶于50ul磷酸盐缓冲液与佐剂按体积1:1混合均匀。每只BALB/c小鼠0.1mL，大腿内侧肌肉注射。第21天按同样方式在另一侧大腿内侧肌肉免疫一针(每次佐剂和抗原现配现用)。第35天采微量小鼠尾血，用间接ELISA测定小鼠抗体效价，选取免疫效价最高的小鼠，随即尾静脉注射加强免疫一次，于3天后进行细胞融合。
(2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把来自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞株在含10％FBS-DMEM培养基培养及传代，置细胞于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中培养。选择对数生长期、状态良好的细胞进行融合。
(3)细胞融合：以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％FBS的HAT培养基培养一天，次日取脾脏，采用压力注水法分离脾细胞，离心洗涤细胞1～2次后用培养液重悬。收集小鼠骨髓瘤SP2/0细胞，离心，洗涤2次后用培养液重悬，作为待融合的SP2/0细胞。将两种细胞悬液混合，使脾细胞与骨髓瘤细胞数量比约等于8：1，1000转/分钟，离心5分钟。弃去培养基，用手掌搓动离心管，使细胞块松动，在1分钟内，用融合管缓慢加入37℃预温的50％聚乙二醇(PEG5000)0.9mL，于60-90秒内逐滴加入细胞沉淀中，期间轻轻振摇离心管，将细胞吸入融合管，静置90秒后将细胞吹入离心管。然后按先慢后快的原则，于第1分钟内加完1mL无血清DMEM。于第2分钟内加完2mL无血清DMEM。于第3分钟内加完7mL无血清DMEM，此后1分钟内逐渐加入37℃预温的无血清DMEM 30-40mL。800转/分钟，低速离心5-10分钟。然后加入20％FBS的HAT培养基，用玻璃滴管分别接种到加有饲养细胞的96孔培养板，每孔约100-150μl，一般每次融合的细胞铺2-4块板，置37℃、5％CO2孵箱中培养。
(4)杂交瘤细胞的筛选：每隔4天换1/2培养液(HAT)一次，10天后改用含HT培养液。融合后的杂交瘤细胞在含HT的选择性培养液中大约持续培养两周。在细胞集落长到适当大小时(在10倍物镜下观察，细胞克隆大小以占满一个视野为宜)，吸取培养液上清，适当稀释后采用ELISA间接法筛选阳性杂交瘤克隆。主要步骤：①用抗原包被缓冲液稀释重组Tp47蛋白，浓度200ng/mL，分别于96孔酶标板加入0.1mL/孔包板，4℃过夜。②PBST洗板三次，扣干，加封闭缓冲液200ul/孔，封闭2小时。③PBST洗板三次，扣干，加入杂交瘤培养上清，0.1mL/孔，同时设阳性对照(免疫小鼠的血清)、阴性对照(SP2/0培养上清液)和空白对照，室温反应2小时。④PBST洗板三次，扣干。加1:6000稀释(用PBST稀释)的羊抗鼠Ig(G+M)-HRP二抗，0.1mL/孔，室温反应1小时。⑤PBST洗板五次，扣干。加TMB显色液100ul，室温避光反应5-10分钟。⑥加50ul终止液终止反应；450nm测定其OD值，以P/N≥2.1为阳性。
(5)杂交瘤细胞的克隆化：杂交瘤细胞的克隆化培养按有限稀释法进行，选择抗体检测阳性的杂交瘤孔细胞作适当增殖后，准确计数细胞。将稀释到一定密度的细胞接种至96孔板，尽量使每孔只有一个细胞生长。7-10天后观察细胞生长情况，并检测上清液中抗体水平，选择5个抗体滴度最高的，呈单个克隆细胞生长的培养孔，作再次克隆化培养。此方法可重复多次，直至单克隆孔抗体检测阳性率为100％。杂交瘤细胞系经4次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定，命名为ZJTP47-1B3。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
(6)诱生腹水：在接种杂交瘤细胞前7-10天，给BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL经高压灭菌过的液体石蜡，然后每只接种1-5×106个阳性杂交瘤细胞，7-10天后收集腹水测定抗体效价。
(7)单克隆抗体的纯化：使用Protein G Sepharose纯化小鼠腹水中单克隆抗体。①将腹水10000转/分钟，4-8℃，离心15分钟，收集上清，将其与3-4倍体积的BindingBuffer(结合缓冲液)混合，于4-8℃10000转/分钟，离心15分钟去除沉淀物。②将预装有Protein G Sepharose的亲和纯化柱用5倍柱床体积的Binding Buffer充分流洗。③将稀释的腹水上柱，控制流速8-10滴/分钟。将已经过柱的腹水重复上柱一次。④用5倍柱床体积的Binding Buffer充分洗柱。⑤用Elution Buffer(洗脱缓冲液)洗脱结合的单克隆抗体，控制流速8-10滴/分钟，收集洗脱液于预加有0.1mL的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(pH9.0，1M)的收集管中，每管收集约0.5mL含抗体的洗脱液，共收集20管以上。⑥于A280nm检测每管洗脱液的吸光度，并收集吸光值大于0.2的洗脱液，置于低温冰箱，用于后续脱盐。⑦使用50mL的Millipore超滤离心管，用磷酸盐缓冲液将Millipore超滤离心管的滤膜润湿，而后吸出磷酸盐缓冲液。向浓缩柱内加入抗体纯化液，4-8℃，7000转/分钟，离心10-20分钟至抗体终体积约为1mL。⑧加磷酸盐缓冲液至浓缩的抗体液中，4-8℃，7000转/分钟，离心10-20分钟，离心洗涤2次，最后一次离心浓缩抗体至终体积约200μl。⑨加200μl磷酸盐缓冲液，清洗内膜，用200μl移液枪沿超滤内管边缘轻轻吹吸抗体液，即为浓缩后的抗体。⑩于A280nm检测洗脱液的吸光度，将抗体分装，冻存于-80℃冰箱。取部分抗体稀释至1mg/mL，存于4℃冰箱备用。
(8)单克隆抗体的亚型鉴定:采用伯乐公司的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型试剂盒分析。待单抗细胞培养至生长状态良好，换用无血清的培养基培养3-5天。收集细胞培养上清，严格按照试剂盒说明书进行抗体亚型检测。试验结果为ZJTP47-1B3杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为IgG1、κ型。
结果见附图1
实施例2.单克隆抗体对梅毒螺旋体膜蛋白Tp47进行免疫印迹的定性检测
本发明制备的抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体可以用来鉴定(定性检测)梅毒螺旋体膜蛋白Tp47，鉴定方法可以通过下述方法实现：
免疫印迹法(Western Blot)：将纯化的Tp47蛋白0.5ug上样，用梅毒螺旋体TpF蛋白做对照，按比例加2x上样缓冲液，将样品在100℃加热10分钟。用该单抗进行WesternBlot检测，在相应位置呈现目的条带，表明检测到梅毒螺旋体膜蛋白Tp47。具体步骤：
(1)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳:配12％分离胶，5％浓缩胶，厚度1mm。80V电泳30分钟，然后增加电压至120V电泳，在蓝线即将靠近凝胶底部时，停止电泳。
(2)电转移：剪与page胶大小一致的PVDF膜，将其浸泡在甲醇中激活。将转膜夹的黑色板朝下置于转膜液，依次铺上海绵→滤纸→凝胶→PVDF膜→滤纸→海绵，夹紧，避免产生气泡。将夹好的板插入转膜槽中，红对红，黑对黑，转膜槽插入透明盒中，加入预先配置好的预冷转膜液，恒流400mA，冰浴，转膜90-120分钟。
(3)免疫印迹：电转膜结束后，膜在5％脱脂奶粉封闭液中室温封闭2小时后，用本发明制备的单抗ZJTP47-1B3(0.5ug/ml)作为一抗，4℃反应过夜，用TBST洗涤3次，每次10分钟。用TBST以1：5000稀释羊抗鼠HRP二抗，室温孵育1.5小时，用上述方法洗涤后在显色液中孵育1分钟，置于在Clinx成像仪上曝光。
结果见附图2。
实施例3.利用该抗体，通过ELISA法检测梅毒螺旋体膜蛋白Tp47
本发明制备的抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47单克隆抗体可以用来定量检测梅毒螺旋体膜蛋白Tp47，可以通过下述方法实现：
(1)将单克隆抗体以0.75ug/mL稀释于0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液包被液中，100ul/孔，4℃包被过夜。
(2)PBST洗板三次，扣干，加封闭缓冲液200ul/孔，封闭2小时。
(3)PBST洗板三次，扣干，备用。
(4)加样：将重组Tp47蛋白分别稀释至终浓度分别为0.25ug/mL、0.125ug/mL、0.06ug/mL、0.03ug/mL、0.015ug/mL、0.006ug/mL。各取100ul加至96孔酶标板中，室温下充分反应2小时。
(5)PBST洗板三次，扣干。加PBST 1:10000稀释的His-HRP抗体，0.1mL/孔，室温反应1小时。
(6)PBST洗板五次，扣干。加TMB显色液100ul，室温避光反应10分钟。
(7)加50ul终止液终止反应；450nm测定其OD值，以P/N≥2.1为阳性。
(8)确定单克隆抗体ZJTP47-1B3检测梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的灵敏度
结果见附表1。
表1单克隆抗体ZJTP47-1B3应用于ELISA法检测梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的灵敏度。
Figure BDA0002066001310000081
实施例4.本发明制备的抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47单克隆抗体，可以通过制备梅毒螺旋体膜蛋白Tp47免疫层析胶体金试纸条实现对梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的定性检测：
(1)胶体金溶液制备：取200mL玻璃瓶1个，加入超纯水49.5mL，而后加入1％氯金酸(HAuCl4·3H2O)0.5mL，配制成50mL 0.01％氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下一次性加入1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液1.8mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5分钟后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃避光保存备用；
(2)抗体的预处理：将纯化得到的ZJTP47-1B3抗体用0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释成1mg/mL和0.1mg/mL，过0.22μm滤膜；
(3)胶体金标记物条件优化：取9个EP管，每个EP管中加入步骤(1)中的胶体金溶液1mL，依次加入0ul、5ul、10ul、15ul、20ul、25ul、30ul、40ul、50ul的0.1mol/L K2CO3溶液，混匀，室温静置1小时；依次从每个EP管中取100ul液体置于96孔板中，再分别加入3ul的1mg/mL的ZJTP47-1B3的抗体，混匀，室温静置15分钟；每孔中加入20ul 10％的NaCl溶液，混匀，室温下静置2小时，观察胶体金颜色，保持红色的最低pH即为胶体金溶液的最佳pH。取最佳pH值胶体金溶液600ul，分别加至EP管，每管100ul；依次加2ul、4ul、6ul、8ul、10ul、12ul的0.1mg/mL抗体，混匀，静置15分钟；再加入20ul 10％的NaCl溶液，混匀，室温下静置2小时，观察胶体金颜色，保持红色的最小蛋白量为该抗体最低稳定蛋白量，将此基础上增加20％，即为金标抗体最适蛋白量。
(4)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液20mL，根据步骤(3)中选定的最优条件，电磁搅拌器250转/分钟搅拌，逐滴加入最适量的1mg/mL抗体，反应10分钟；逐滴加入2mL 10％BSA，继续搅拌反应10分钟；金标抗体溶液4℃，12000转/分钟离心30分钟，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至2mL，制备成ZJTP47-1B3抗体胶体金标记物；
(5)胶体金膜的制备：将载体聚酯纤维膜浸泡在步骤(4)中的胶体金标记物溶液中，室温自然晾干或者37℃烘干3小时，备用；
(6)包被膜的制备：将羊抗鼠IgG抗体、抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的另一株单抗稀释成1mg/mL，分别划在硝酸纤维素膜的C(质控)线和T(检测)线上，制备成包被膜，37℃包被2小时后，室温自然晾干或者37℃烘干；
(7)样品垫前处理：将亲水玻璃纤维膜放入0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(含3.5％蔗糖，1％BSA)，室温，摇床处理30分钟，干燥后待用；
(8)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，备用；
(9)确定胶体金试纸条检测梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的灵敏度：将梅毒螺旋体膜蛋白Tp47至10ug/mL、5ug/mL、2.5ug/mL、1.25ug/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL，将试纸条样品垫放入含80ul稀释至指定浓度的重组表达的梅毒螺旋体膜蛋白Tp47溶液EP管中，观察。
结果见附表2。
表2单克隆抗体ZJTP47-1B3应用于胶体金法检测梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的灵敏度。
Figure BDA0002066001310000091
应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 浙江大学医学院附属第一医院
<120> 抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3及其应用
<130> 21-2019-0804
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggatgga gctctatcat cctcttcttg gtagcaacag cctcaggtgt ccactcccag 60
gtccaactac agcaacctgg gtctgagttg gtgaggcctg gagcttcagt gaagctgtcc 120
tgcaaggctt ctggctacac attcgccagc tactggatgc actgggtgaa acagaggcct 180
ggacaaggcc ttgagtggat tggaaatatt tatcctggta gtggtcgtac taactacgat 240
gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacacat cctccaacac accctacata 300
caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aggtaactta 360
tattctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 408
<210> 2
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gly Trp Ser Ser Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ser Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ala Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asp
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Pro Tyr Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Leu Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 3
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120
gtctcatgca gggccagcca aagtgtcaat acatctagct atagttattt gcactggtac 180
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaaat atgcatccaa cctagaatct 240
ggggtctctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300
cctgtggagg aggaggatag tgcaacatat tactgtcagc acacttggga gattccgtac 360
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393
<210> 4
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Asn Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Ser Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Thr Trp Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130

Claims (5)

1.一种抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与梅毒螺旋体膜蛋白Tp47特异结合。
2.权利要求1所述的抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3在制备梅毒螺旋体膜蛋白Tp47检测产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征是：通过免疫印迹方法、酶联免疫吸附试验、胶体金试纸条检测各种样本中梅毒螺旋体膜蛋白Tp47。
4.一种检测探针，其特征在于：包括权利要求1所述的单克隆抗体ZJTP47-1B3。
5.一种胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：包括权利要求1所述的单克隆抗体ZJTP47-1B3。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1327885B1 (en) * 2001-08-17 2005-03-09 Shanghai Health Digit Limited A kit for the simultaneous diagnosis of a plurality of infectious diseases and a method for preparation of it
CN101738473A (zh) * 2008-11-13 2010-06-16 威海威高生物科技有限公司 梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法
RU2397178C1 (ru) * 2009-02-27 2010-08-20 Федеральное государственное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Диагностическая тест-система в формате иммуночипа и способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса
CN208255243U (zh) * 2018-03-30 2018-12-18 安徽德莱康生物医疗科技有限公司 一种多功能梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1327885B1 (en) * 2001-08-17 2005-03-09 Shanghai Health Digit Limited A kit for the simultaneous diagnosis of a plurality of infectious diseases and a method for preparation of it
CN101738473A (zh) * 2008-11-13 2010-06-16 威海威高生物科技有限公司 梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法
RU2397178C1 (ru) * 2009-02-27 2010-08-20 Федеральное государственное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Диагностическая тест-система в формате иммуночипа и способ серологической дифференциальной диагностики сифилиса
CN208255243U (zh) * 2018-03-30 2018-12-18 安徽德莱康生物医疗科技有限公司 一种多功能梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The tradition algorithm approach underestimates the prevalence of serodiagnosis of syphilis in HIV-infected individuals;Chen等;《Plos Neglected Tropical Diseases》;20170720;第1-10页 *
抗梅毒螺旋体主要抗体与RPR的关系探讨;王莉等;《中华医院感染学杂志》;20081231;第1642-1644页 *

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