DE69331970T2

DE69331970T2 - Teilchen mit gelatine-aminodextran-umhüllungen und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE69331970T2
Application number: DE69331970T
Authority: DE
Inventors: Alexander Burshteyn; K. Gupta; Olavi Siiman
Original assignee: Coulter International Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1992-10-15
Filing date: 1993-10-14
Publication date: 2002-12-19
Anticipated expiration: 2013-10-15
Also published as: JP3547437B2; WO1994009368A1; EP0665955A4; EP0665955A1; AU5360394A; DE69331970D1; CA2146964A1; EP0665955B1; JP2004003991A; CA2146964C; EP1213587A1; JPH08502443A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Teilchen kolloidaler Größe mit einer äußeren Aminodextranbeschichtung mit daran befindlichen, seitenständigen, funktionellen Gruppen. Die Erfindung betrifft insbesondere kolloidale Polymerteilchen mit einer Aminodextranbeschichtung, die so funktionalisiert ist, dass sie ein seitenständiges Protein, wie einen Antikörper, zu binden vermag, Verfahren zur Herstellung solcher Teilchen und die Verwendung solcher Teilchen bei biologischen Versuchen.

Stand der Technik

Die Verwendung von Polymerteilchen und magnetischen Teilchen zur Bindung einer Verbindung ist seit langem bekannt gewesen und wird bei Industrie- und Laborverfahren verwendet. Zum Beispiel gehören die Merrifield-Harze, vernetzte sphärische Beads aus Styrol-Divinylbenzol, zu den frühesten und am umfangreichsten verwendeten modernen Substratteilchen. Da die Merrifield-Harze ziemlich groß sind, können sie leicht durch Filtration abgetrennt werden. Auf einigen Gebieten ist es jedoch wünschenswert, Teilchen kolloidaler Größe zu verwenden, weil das zu bindende Material knapp oder teuer ist oder bei einem Verfahren verwendet wird, bei dem große Teilchen unerwünscht sind. Dies trifft insbesondere für das Gebiet der Biochemie zu.
Weisen die Teilchen jedoch eine kolloidale Größe auf, kann ihre Abtrennung aus dem flüssigen Medium durch Filtration langwierig und schwierig werden. Kolloidale Teilchen neigen dazu, die Filteroberfläche zu belegen und den Filtrationsvorgang zu verlangsamen. Die Verwendung von magnetischen Teilchen, insbesondere von magnetischen Teilchen mit einer Polymerbeschichtung, hat breite Anwendung gefunden, weil solche Teilchen auf einer Seite des Reaktors magnetisch gesammelt und die Masse des Reaktionsmediums einfach dekantiert werden kann. Das Wort "Teilchen", wie es hier verwendet wird, beinhaltet Kugeln, Sphäroide, Beads und auch andere Formen und wird für solche Ausdrücke wechselseitig verwendet, sofern nichts anderes angegeben ist.
Die Verwendung beschichteter magnetischer Teilchen hat sich bei biologischen Anwendungen als besonders nützlich erwiesen, wenn Antikörper an die Oberflächenbeschichtung der Teilchen gebunden werden. Die gebundenen Antikörper können dazu verwendet werden, spezifische biologische Substanzen aus einer Testprobe, die zahlreiche biologische Spezies enthält, einzufangen oder unerwünschte Spezies aus der Testprobe einzufangen und die erwünschten Spezies in der Probe zu belassen.
Die Kategorien von beschichteten magnetischen Teilchen, auch als magnetische Kugeln oder Beads bekannt, können in vier allgemeine Klassen unterteilt werden.
1. Kern- und Hülle-Beads mit einem magnetischen Kern und einer Hartschalebeschichtung als Hülle aus einem polymerisierten Monomer oder einem Silanisierungsmittel. Vergl. U.S. Patent Nr. 4,267,234 von Rembaum (Polyglutaraldehydhülle um ferrofluide Kernteilchen); Nr. 4,454,234 von Czerlinski (Suspensions- oder Emulsionspolymerisierte Beschichtung magnetischer submikroskopischer Teilchen); Nr. 4,554,088, Nr. 4,695,392 und 4,695,393 von Whitehead et al. (Silanisierte, magnetische Oxidteilchen von polydisperser Größe und Gestalt); Nr. 4,672,040 von Josephson (Polysilan-beschichtete magnetische Teilchen); Nr. 4,783,336 von Margel et al. (Suspensionpolymerisiertes Polyacrolein um ferrofluide Teilchen); Nr. 4,795,698 an Owen et al. (Rinderserumalbuminbeschichtung) und Nr. 4,964,007 von Yudelson (Gelatine-Gummi arabicum Detergensbeschichtung);
2. Kern- und Hülle-Beads mit einem magnetischen Kern und einer losen Hülle aus gekneueltem oder kugelförmigem Polymer, das vernetzt oder unvernetzt sein kann. Vergl. U.S. Patent Nr. 4,452,773 von Molday (Dextranbeschichtung um ferrofluide Teilchen) und Nr. 4,795,698 von Owen et al. (Protein, wie Rinderserumalbumin um ferrofluide Teilchen)
3. Magnetische Latexmaterialien, die durch einheitliche Einbettung ferrofluider Teilchen in Poylstyrollatex-Teilchen gebildet werden. Vergl. U.S. Patent Nr. 4,358,388 von Daniel et al.
4. Poröse Polymerteilchen, die mit magnetischen Materialien, wie Polymer- Ferrit- oder Polymer-Maghemit-Kompositsystemen gefüllt sind. Vergl. K. Nustad et al. "Monodisperse Polymer Particles In Immunoessay And Cell Separation" Microspheres: Medical and Biological Applications, A. Rembaum und Z. Tökes, eds. (Boca Raton, Fla.: CRC Press, 1988), S. 53-75; C. D. Platsoucas et al., "The Use of Magnetic Monosized Polymer Particles For The Removal Of T Cells From Human Bone Marrow Cell Suspensions", ibid. S. 89-99; und die Internationale Patentveröffentlichung WO 83/03920 von Ughelstad et al. (Polymerbeschichtete magnetische Teilchen, hergestellt durch Behandlung kompakter oder poröser Teilchen mit einer Lösung von Eisensalzen und die Verwendung solcher Teilchen für medizinische oder andere Zwecke).
Die Verwendbarkeit der meisten polymerbeschichteten magnetischen Beads für die medizinische und biologische Anwendung ist durch praktische Überlegungen, betreffend die Einheitlichkeit der Größe und Gestalt der Teilchen, die Notwendigkeit der starken Bindung des biologischen Reagenz an das Teilchen, dem Vorzug hydrophiler Polymerbeschichtungen gegenüber hydrophoben Beschichtungen, und ob die Beschichtung biologisch abbaubar ist oder nicht, eingeschränkt. Während die biologische Abbaubarkeit von besonderer Wichtigkeit ist, wenn ein biologisches Reagens in vivo verabreicht werden muss, ist sie auch bei verschiedenen Zellsortierungs-, Trennungs- und Versuchsverfahren wichtig. Die am meisten erwünschten, beschichteten magnetischen Teilchen würden die folgenden Merkmale aufweisen.
1. Die Teilchen sollten so klein wie möglich sein und eine möglichst große Oberfläche erzeugen, die mit dem biologischen Reagenz beschichtet wird, die Teilchen sollten jedoch mit einem kleinen Magneten trennbar sein. Eine kleine Größe und eine große Oberfläche sind erwünscht, um zur Entfernung der Zielsubstanz die kleinstmögliche Teilchenmenge zu verwenden, um z. B. damit in einem Schritt Zellen in der Größenordnung von 10&sup6; pro Probe in Wechselwirkung treten zu lassen und dadurch nachfolgende Zusätze und Aufarbeitungsschritte zu vermeiden.
2. Es sollte eine geringe, unspezifische Bindung der mit Antikörper beschichteten Teilchen an die Zelloberfläche vorliegen. Die Teilchenoberfläche sollte hydrophil sein oder mit einer Beschichtung aus einer hydrophilen Substanz bedeckt sein, an die der Antikörper gebunden ist.
3. Die Polymer- und die Antikörperschicht auf den Teilchen sollten kovalent miteinander gebunden sein, um Dissoziation und Konformationsänderungen zu verringern.
4. Die Beschichtung auf den magnetischen Teilchen und jedwede Molekülketten, die einen Antikörper an die Polymeroberfläche binden, sollten metabolisierbar ein.
5. Bei der positiven Selektion von Zellen sollte ein Verfahren zur schnellen und leichten Rückgewinnung lebender Zellen von den magnetischen Teilchen verfügbar sein, damit die wiedergewonnenen Zellen gezüchtet werden können.
6. Bei der negativen Selektion von Zellen sollten die mit dem Antikörper beschichteten Teilchen steril sein, so dass die verbleibenden Zellen gezüchtet werden können.
7. Zur magnetischen Trennung und Sortierung von Zellen und anderen biologischen Substanzen sind die bevorzugten magnetischen Teilchen "weiche" magnetische Teilchen, d. h. Teilchen, die im Gegensatz zu harten oder permanenten Magneten leicht magnetisiert und entmagnetisiert werden können. Die Teilchen können ferromagnetisch, ferrimagnetisch oder superparamagnetisch sein. Ferromagnetische und ferrimagnetische Teilchen sind bezüglich ihrer Größe nicht begrenzt, wohingegen superparamagnetische Teilchen auf einzelne Strukturbereiche mit Abmessungen von üblicherweise weniger als 40 Nanometer beschränkt sind. (C. Kittel et al., solid State Physics 3: 437464 (1956).
Bei Zelltrennverfahren gibt es bei der Verwendung mit jedem der magnetischen Kompositteilchen mit jeder der vorstehenden Klasse Probleme. Einige Beispiele für Probleme, auf die man stößt, sind:
1. Teilchen mit einem ferrofluiden Kern und der herkömmlichen äußeren Polymerhülle weisen ein zu kleines magnetisches Moment auf, als dass sie bei der Zelltrennung, bei der Handdauermagnete verwendet werden, verwenden werden könnten, um die magnetischen Teilchen zu sammeln und zu trennen. Solche Teilchen erfordern die Verwendung von großflächigen Trennverfahren, was das Materialvolumen, das verarbeitet werden kann, stark einschränkt und demzufolge die Übertragung in einen größeren Maßstab beschränkt.
2. Die Größe ferrofluider Polystyrolteilchen, die durch Emulsionspolymerisation hergestellt wurden, kann nicht eng eingestellt werden und reicht von etwa 0,1 bis 4 um im Durchmesser. Folgerichtig neigen bei Zelltrennungen unter Verwendung von Antikörpern, die an solche Beads gebunden sind, die sehr kleinen, kinetisch beweglichen, magnetischen Teilchen, die als solche das kleinste magnetische Moment besitzen, dazu, vorzugsweise die antigenen Stellen auf der Zelloberfläche zu besetzen. Dies führt dazu, dass die resultierenden Zell-Bead-Konjugationen kein ausreichendes magnetisches Moment besitzen, um leicht getrennt werden zu können.
Die Verwendung von Heparin-beschichteten magnetischen Teilchen ist in WO-A-9208134 beschrieben und überwindet diese Schwierigkeiten. Die WO-A-9208134 gibt speziell Teilchen mit einer vernetzten Gelatinebeschichtung an, an die biologische Substanzen oder Moleküle, beispielsweise monoklonale Antikörper, gebunden sind. Es wurde jedoch festgestellt, dass mit Gelatine beschichtete Teilchen einige Probleme aufweisen, was unspezifische Wechselwirkungen mit bestimmten Zellen betrifft, namlich Blutplättchen und Phagozyten, wie Monozyten. Das Problem tritt auf, da die Aminosäuresequenz von Gelatine (wie beispielsweise bei der α-1-Kette von Ratten- und Kalbshautkollagen) drei Bereiche mit der Tripeptidsequenz Arg-Gly-Asp (RGD) einschließt, was die RGD-Bindungssequenz von Fibronectin, einer Verbindung der extrazellulären Matrix, welche die Zellhaftung fördert, verdoppelt. Diejenigen biologischen Zellen mit Fibronectin exprimiert auf deren Oberfläche besitzen eine spezifische Affinität zu Kollagen, was mit vernetzter Gelatine gleichwertig ist. Zum Beispiel werden sich Antikörper, die mit Gelatine beschichtete Ferritteilchen enthalten, die bei der Trennung von Untergruppen weißer Blutkörperchen verwendet werden, auch an Fibronectin auf der Oberfläche von Blutplättchen und Monozyten anlagern. Das Ergebnis ist ein unspezifischer Zellabbau, da Monozyten und Blutplättchen genauso an die Teilchen gebunden werden, wie jene Zellen, die antikörperspezifische Antigene tragen. Der unspezifische Zellabbau kann durch Verwendung eines Aminodextrans als äußerste Schicht von beschichteten Teilchen vermieden werden. Die Verwendung von Dextranderivaten als Träger wurde von U. Manabe et al., J. Lab. Clin. Med. 104: 445454 (1984) (antibody-polyaldehyd dextranmethotrexate); L. B. Shin et al., Intl. J. Cancer 41: 832-839 (1988) (antibodyaminodextran-methotrexate), A. R. Oseroff et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 83: 8744-8748 (1986) (antibodyaminodextran-chlorine 6); S. Rakestraw et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 42174221 (1990) (antibody-dextran-Sn (IV)chlorine 6); R. J. Mrsnay et al., Eur. J. Cell. Biol. 45: 200-208 (1987) (ouabain-aminodextran-gold particle); J. W. M. Bulte et al., Magnetic Res. 25: 148-157 (1992) (anti particle); und anderen diskutiert, wie in S. S. Wong, "Chemistry of Protein Conjugation and Cross- Linking" (CRC Press, Boca Raton, Florida 1991) beschrieben.
Zusätzlich zu magnetischen Teilchen besteht auch Bedarf an Polystyrollatex-(PSL)- Teilchen, die mit Beschichtungen hydrophiler Polymere beschichtet worden sind und an die anschließend Antikörper gebunden werden können. Die mit Polymer beschichteten PSL-Teilchen können bei Zellpopulationsanalysen und Immunisierungsversuchen auf Bead-Basis verwendet werden, so hergestellte unspezifische PSL-Teilchen besitzen jedoch üblicherweise eine vergleichsweise niedrige Belegung mit verschiedenen funktionellen Gruppen, wie Carboxyl- oder Aminogruppen. Infolgedessen ist die kovalente Anbindung von Beschichtungsmaterialien, wie Dextran oder Gelatine, an die Oberfläche der PSL-Teilchen nicht zufriedenstellend.
Die verschiedenen, vorstehend beschriebenen Teilchen wurden auf dem Fachgebiet dazu verwendet, zahlreiche biologische Substanzen, insbesondere Antikörper, zu immobilisieren. Bei der Verwendung solcher Teilchen ist die Immobilisierung von Antikörpern durch kovalente Anbindung gegenüber der Immobilisierung von Antikörpern durch Adsorption, die eine sorgfältige und getrennte Einstellung des pH-Wertes und der Antikörperkonzentration für jeden verwendeten monoklonalen Antikörper erfordert, bevorzugt. P. Bagchi et al., J. Colloid Interface Sci., 83: 460478 (1981); J. Lyklema, Cvolloids and Surfaces, 10: 33-42 (1984); M. D. Bale et al., J. Colloid Interface Sci. 125: 516-525 (1988); C. C. Ho et al., ibid, 121: 564-570 (1988); "Proteins at Interfaces: Physicochemical and Biochemical Studies", ACS Symposium Series, Nr. 343, J. L. Brash and T. A. Horbett, Eds. (Washington: Amer. Chem. Soc., 1987); W. Norde, Adv. Coll. Interface Sci., 25: 267-340 (1986); A. V. Elgersma et al., Abstracts of the 198th Amer. Chem. Soc. Meeting, Miami Beach, Fla., Sept. 10-15, 1989, COLL 0113; und D. E. Brooks, Annenberg Center for Health Sciences und H. B. Wallis Research Facility bei der Eisenhower Latex Conference, Orlando, Fla., 4/5. Dez., 1989. Selbst wenn jedoch der pH-Wert und der Antikörper sorgfältig kontrolliert werden, besteht wenig Sicherheit dafür, dass die Orientierung des adsorbierten Antikörpers so sein wird, dass ein aktiver adsorbierter Antikörper resultiert. Adsorbierte Antikörper weisen auch bezüglich der Langzeitlagerung Probleme auf, welche von der Desorption der Antikörper von der Teilchenoberfläche herrühren. Des Weiteren neigen Proteine, wie Antikörper, dazu, ihre maximale Adsorption an hydrophoben Oberflächen beim oder nahe beim pl-Wert des Proteins zu erreichen. Wenn jedoch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den geladenen Gruppen wichtig sind, sollten die adsorbierende Oberfläche und das Adsorbat entgegengesetzte Nettoladungen aufweisen. Kovalente Kopplungsverfahren sind demgegenüber unter diesen Bedingungen nicht so empfindlich.
Kovalente Kopplungsverfahren sind mit Magnetitteilchen verwendet worden, die in carboxylmodifizierten Latex eingebettet, anschließend mit Aminodextran beschichtet [R. S. Molday et L: FEBS. Lett., 170: 232-238 (1984)] und mit einer Anzahl von Antikörpern in Derivate übergeführt worden sind. Gehört der Antikörper zum IpG-Isotyp, stellt das kovalente Kopplungsverfahren sicher, dass die Bindung zwischen dem Antikörper und dem Teilchen im Fc oder dem Gelenkbereich (hinge region) des Antikörpers und nicht im FAB-Bereich des Antikörpers erfolgt. Gehört der Antikörper zum pentamerischen IgM-Isotyp, der nur FAB-Bereiche ausgesetzt aufweist, lässt die Kopplung eines FAB-Bereichs an das Teilchen noch vier FAB-Bereiche ausgesetzt und für eine Reaktion verfügbar übrig.
Die vorliegende Erfindung stellt die Herstellung magnetischer und nichtmagnetischer Teilchen mit einer biologisch abbaubaren Beschichtung, an die seitenständig biologische Substanzen, wie monoklonale Antikörper, gebunden werden können, bereit. Die erfindungsgemäßen Teilchen können bei verschiedenen Zelltrenn- und Zelltestverfahren verwendet werden. Die biologische Abbaubarkeit der auf dem magnetischen oder Latex-basierenden Kernmaterial verwendeten Beschichtung ist bei der Zelltrenntechnologie wichtig. Antikörper können zum Beispiel mit magnetischen Teilchen, wie Manganferrit-Teilchen, die mit Gelatine/Aminodextran beschichtet sind, konjugiert werden. Diese Teilchen würden auf diese Weise eine proteinartige Beschichtung und einen Mangan-Eisenoxid-Kern enthalten, wovon alle biologisch abbaubar sind. Bei einem positiven Zellselektionsverfahren unter Verwendung solcher Teilchen dürfen sich, sobald die gewünschten Zellen von den anderen abgetrennt sind, die Teilchen und die Beschichtung in einer solchen Weise abbauen, dass die Zellen am Leben erhalten werden und zur weiteren Verwendung gezüchtet werden können. Alternativ kann das Enzym Kollagenase zuerst dazu verwendet werden, das Kernmaterial (magnetisch oder Latex) durch Verdauung der Gelatinebeschichtung freizusetzen. Das Kernmaterial kann anschließend aus der Zellsuspension entfernt werden, ehe die Zellen gezüchtet werden. Bei der negativen Zellselektion mit solchen biologisch abbaubaren Beads können die Beads in der Zellsuspension, aus der die Zielzellen entfernt worden sind, verbleiben, ohne die Lebensfähigkeit der restlichen Zellen zu beeinträchtigen. Bei Operationen zur Knochenmarksentfernung unter Verwendung biologisch abbaubarer Beads bestehen zum Beispiel weniger Bedenken, wenn einige Beads im entnommenen Knochenmark zurückbleiben, das auf den Patienten übertragen wird. Gegenwärtig werden von Ughelstad et al., internationale Patentveröffentlichung WO 83/03920, hergestellte, mit Antikörpern konjugierte, synthetische Polymer-Magnetit-Teilchen bei der Knochenmarksübertragung verwendet. Das Polymer ist biologisch nicht abbaubar und verleiht diesen Beads eine hydrophobe Oberfläche. Diese Hydrophobie, die bei den mit Gelatine beschichteten Teilchen der beanspruchten Erfindung nicht vorliegt, ist für die unspezifischen Wechselwirkungen zwischen den Beads und den Zellen verantwortlich. Als Folge dieser unspezifischen Wechselwirkung ist die Selektivität schlecht und es müssen mehr Beads verwendet werden, um die gewünschte Wirkung zu erzielen. Die beanspruchte Erfindung vermeidet diese Probleme.
Es wurde festgestellt, dass mit Gelatine beschichtete Teilchen einige Probleme aufweisen, was unspezifische Wechselwirkungen mit bestimmten Zellen betrifft, nämlich Blutplättchen [Clinical Hematology, 8th ed., M. M. Wintrobe et al., Eds (Lea & Febiger, Philadelphia, Pennsylvania, 1981), Kapitel 16] und Phagozytzellen, wie Monozyten [Basic & Clincal Immunology, 6th ed., D. P. Stites et al., Eds. (Appelton & Lange, East Norwalk, Connecticut 1987), Kapitel 9]. Das Problem tritt auf, weil die Aminosäuresequenz von Gelatine (repräsentiert durch die α-1-Kette von Ratten- und Kalbshautkollagen) drei Bereiche mit der Tripeptidsequenz Arg-Gly-Asp (RGD) [The Theory of the Photographic Process, 4th ed., T. H. James ed. (Mac Millan, New York 1977 Kapitel 2, seite 54] einschließt, was die RGD-Bindungssequenz von Fibronectin, einer Verbindung der extrazellulären Matrix, welche die Zellhaftung fördert [Biochem. Biophys. Res. Comm. 170: 1236 (1990)], verdoppelt. Diejenigen biologischen Zellen mit Fibronectin an bzw. auf deren Oberfläche exprimiert besitzen eine besondere Affinität zu Kollagen, das zu vernetzter Gelatine gleichwertig ist. Zum Beispiel werden sich die mit Antikörper konjugierten, mit Gelatine beschichteten Ferritteilchen, die bei der Trennung von Untergruppen weißer Blutkörperchen verwendet werden, auch an Fibronectin binden, das auf der Oberfläche von Blutplättchen und Monozyten vorhanden ist. Das Ergebnis ist eine unspezifische Zellverarmung, weil Monozyten und Blutplättchen sich genauso an die Teilchen binden werden, wie jene Zellen, die antikörperspezifische Antigene tragen. Die unspezifische Zellverarmung kann durch Verwendung eines Aminodextrans als äußerste Schicht von beschichteten Teilchen vermieden werden.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung stellt diskrete kolloidale Teilchen mit einem Kern aus einer polymeren Substanz mit einer hydrophober Oberfläche bereit, die mit einer wasserlöslichen Gelatine oder einem Aminodextran beschichtet ist. Der polymere Kern, der nicht aus Gelatine oder Aminodextran ist, ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus polymeren Materialien oder Substanzen, an deren Oberfläche aminreaktive Gruppen kovalent gebunden sind, und aus polymeren Substanzen, die keine aminreaktiven Gruppen auf der Oberfläche aufweisen. Die Mehrzahl der seitenständigen funktionellen Gruppen ist an beschichtete Teilchen gebunden. Die seitenständigen funktionellen Gruppen können endständige Aldehyd- oder Carboxylgruppen, Aminogruppen, Sulfhydrylgruppen oder Maleimidylgruppen und polyklonale oder monoklonale Antikörpern sein oder diese innerhalb ihrer Struktur aufweisen.
Die Erfindung stellt diskrete kolloidale Teilchen mit einem festen Kern aus einer beliebigen Substanz bereit, der in einer ersten Schicht mit einer wasserlöslichen Gelatine und in einer zweiten Schicht mit einem Aminodextran beschichtet ist, wobei die Beschichtung vernetzt oder durch die Einwirkung eines chemischen Vernetzungsmittels fixiert ist und eine Vielfalt von seitenständigen funktionellen Gruppen aufweist. Die seitenständigen funktionellen Gruppen können endständige Aldehyd- oder Carboxylgruppen, Sulfhydrylgruppen und polyklonale oder monoklonale Antikörpern sein oder diese aufweisen. Der Kern kann aus in Gelatinelösung gebildeten Metallteilchen oder vorgeformten Teilchen sein, die anschließend mit Gelatine beschichtet werden.
Die Erfindung stellt diskrete kolloidale Teilchen mit seitenständigen, biologisch funktionellen Gruppen bereit, wie polyklonale oder monoklonale Antikörper, welche an die vernetzte Gelatine- oder Aminodextranbeschichtung mittels eines heterobifunktionellen Mittels, wie zum Beispiel einer kurzen Diamin- oder Polyaminkette kovalent gebunden sind, um die mit Antikörper funktionalisierten Teilchen bei biologischen Trennungen und Tests vorteilhaft verwenden zu können. Das heterobifunktionelle Mittel fungiert als Verbrückungsgruppe zwischen der biologischen Substanz und dem vernetzten Aminodextran.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung diskreter kolloidaler Teilchen mit einem festen Kern aus polymerem Material mit einer hydrophoben Oberfläche bereit, die mit einem Aminodextran beschichtet ist, das zahlreiche funktionelle Gruppen aufweist. Das Verfahren umfasst allgemein die Beschichtung eines festen Kerns aus polymerem Material, der eine hydrophobe Oberfläche aufweist, mit einem Aminodextran ohne Ausbildung kovalenter Bindungen zwischen dem Aminodextran und dem Polymermaterial oder die Kopplung der Aminogruppen des Aminodextrans an reaktive Gruppen auf der Oberfläche des Polymermaterials (zum Beispiel Aldehyd- oder Carbonsäuregruppen auf der Oberfläche von Polystyrolteilchen); Vernetzung des adsorbierten Aminodextrans, um eine Produkt zu erhalten, das die erwünschten reaktiven Spezies an die vernetzte Aminodextranoberfläche kovalent gebunden enthält. Es ist zwar bevorzugt, das an die Oberfläche der Polymerbeads gekoppelte Aminodextran zu vernetzen, eine solche Vernetzung ist jedoch nicht unter allen Umständen erforderlich. Beeinflussen zum Beispiel das biologische Material beim Versuch oder die beim Versuch verwendeten Reagenzien das Polymermaterial nicht, ist eine Vernetzung nicht erforderlich. Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von teilchengebundenen polyklonalen und monoklonalen Antikörpern aus mit Aminodextran beschichteten Teilchen und die Verwendung solcher Teilchen bei biologischen Versuchen, insbesondere immunologischen Versuchen, bereit.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung diskreter kolloidaler Teilchen mit einem festen Kern aus jeglicher Substanz bereit, der mit einer biologisch abbaubaren ersten Schicht aus vernetzter Gelatine und einer biologisch abbaubaren zweiten Schicht aus einem Aminodextran mit seitenständigen funktionellen Gruppen beschichtet ist. Das Verfahren umfasst das Beschichten eines festen Kernteilchens, das eine hydrophobe Oberfläche aufweist, mit einer ersten Schicht aus Gelatine und einer zweiten Schicht aus Aminodextran, Vernetzen der adsorbierten äußeren Beschichtung und Derivatisieren der vernetzten Beschichtung, um ein Produkt zu erhalten, bei dem die gewünschten Spezies an die vernetzte Oberflächenbeschichtung kovalent gebunden sind. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von teilchengebundenen polyklonalen und monoklonalen Antikörpern bereit.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur entweder positiven oder negativen Trennung und zur Analyse biologischer Substanzen bereit, umfassend das Inkontaktbringen einer Lösung, die eine biologische Substanz enthält, mit einem Antikörper, der kovalent an die Oberfläche des mit Aminodextran beschichteten Kernteilchens gebunden ist; das Inkubieren des resultierenden Gemisches bei einer Temperatur und während einer Zeit, die ausreicht, einen Komplex zwischen dem Antikörper und der Substanz zu bilden; das Analysieren der die resultierenden Teilchen enthaltenden Lösung, um die Teilchen-verschobene Lichtstreuung und andere Teilchen- verschobene Eigenschaften zu bestimmen. Wenn gewünscht können die Teilchen auch aus der Lösung abgetrennt und eines oder beide mittels unabhängig durchgeführter Analysen analysiert werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Diagramm der Neutrophilenverarmung als eine Funktion des beim Verarmungsvorgang verwendeten Bead/Zell-Verhältnisses.
Fig. 2A-2L sind eine Reihe von Histogrammen, welche die ursprüngliche und die fortschreitende Lageverschiebung in Richtung auf eine geringere Frontstreuung (FS) oder kleinere Größe und mehr Seitenstreuung (LSS) oder größere Körnung im normalen Granulozytenbereich bei Zugabe eines höheren Titers an magnetischen Beads zu Zellproben veranschaulichen.
Fig. 3 ist ein Diagramm der tatsächlichen Blutzellenverarmung als Funktion des beim Verarmungsvorgang verwendeten Bead/Zell-Verhältnisses.
Fig. 4 ist ein Diagramm der Blutplättchenverarmung als Funktion des beim Verarmungsvorgang verwendeten Bead/Zell-Verhältnisses.
Fig. 5 ist ein Diagramm der Verarmung weißer Blutzellen als Funktion des beim Verarmungsvorgang verwendeten Bead/Zell-Verhältnisses.
Fig. 6 gibt die T4-Population-Verschiebungsanalyse durch T4-Antikörper, Aminodextran beschichtete Polystyrolbeads wieder, wie in Beispiel 5 durchgeführt.
In der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung und der bevorzugten Ausführungsformen bringen die Anmelder reaktive Maleimidylgruppen auf die mit Aminodextran beschichteten Teilchen und reaktive Sulfhydrylgruppen auf die Antikörper auf. Diese können auch umgekehrt aufgebracht werden, so dass die Maleimidylgruppen an die Antikörper und die Sulfhydrylgruppen an das Aminodextran gebunden werden. Die Anmelder haben auch die Verwendung von 2- Iminothiolanhydrochlorid als Modell für das Sulfhydrylreagenz und sulfo-SMCC (nachstehend beschrieben) als Modell für das Maleimidylreagenz ausgewählt. Andere aufgeführte Reagenzien oder solche mit ähnlicher Eigenschaft und ähnlichem Ergebnis können ebenfalls verwendet werden.
Die hier verwendeten Aldehyd/Sulfat-Polystyrollatex- und sulfatierten Polystyrollatex- Teilchen repräsentieren zwei unterschiedliche Arten von Teilchen. Die ersteren besitzen reaktive Aldehydgruppen, die sich mit einer Substanz, wie einem Aminodextran, verbinden und kovalente Bindungen bilden können. Die letzteren weisen keine reaktiven Gruppen auf. Auf der Oberfläche der sulfatierten Polystyrolteilchen wird ein Beschichtungsmittel adsorbiert, ohne kovalente Bindungen zwischen der adsorbierten Substanz und der Teilchenoberfläche zu bilden. Außer Polystyrollatex können andere polymere Materialien als Kernteilchen verwendet werden. Zum Beispiel können unter anderem Polyacrylat-, Polymethacrylat-, Polyester- und Polyphenylenoxidteilchen mit Gelatine oder einem Aminodextran beschichtet und, wie hier beschrieben, derivatisiert werden. Die Verfügbarkeit und Kosten dieser anderen Polymerteilchen machen jedoch die Verwendung von Polystyrolteilchen bevorzugt. Andere Überlegungen, die Polystyrol begünstigen, sind die einheitliche Größe und Gestalt der zu beschichtenden Teilchen. Die Größe der Polymerteilchen liegt im Bereich von etwa 0,1 bis 5,0 um. Die bevorzugte Teilchengröße liegt im Bereich von etwa 0,1 bis 1,0 um.
Letztendlich hängt die Wahl, ob eine Aminodextranbeschichtung vernetzt wird, von zwei Faktoren ab. Der erste ist der, ob das Aminodextran so an die Oberfläche der Polymerteilchen konjugiert ist, wie es dies wäre, wenn es zum Beispiel auf carboxylierte Beads beschichtet worden wäre oder nicht. Ist das Aminodextran nicht konjugiert, muss die Beschichtung vernetzt werden. Der zweite Faktor betrifft die Wahl durch den Praktiker. Ist die Aminodextranbeschichtung konjugiert, ist es dem Praktiker überlassen, die Beschichtung zu vernetzen oder nicht. Wenn eine "relativ dicke" Aminodextranbeschichtung erwünscht ist, wird im Allgemeinen die mit der Polymeroberfläche konjugierte Aminodextranbeschichtung vernetzt und zusätzliches Aminodextran dazu verwendet, um nicht umgesetzte reaktive Gruppen des Vernetzungsmittels zu blockieren. Die anschließenden Reaktionen werden, wie hier beschrieben, durchgeführt. Die Aminodextran-Vernetzungsmittel-Reaktionen können mehrmals durchgeführt werden, wenn dies gewünscht wird. Wird nur eine einzige Aminodextranschicht gewünscht, kann die mit der Oberfläche konjugierte Schicht ohne Vernetzung weiter derivatisiert werden, wie hier beschrieben, oder die Schicht kann vernetzt und die nicht vernetzten reaktiven Gruppen des Vernetzungsmittels durch Umsetzung mit Polyaminen, unter anderem mit Ethylendiamin und Triethylendiamin, blockiert werden. Diese Teilchen können dann weiter in Derivate übergeführt werden, wie hier gleichfalls beschrieben.

Namensverzeichnis der biologischen Reagenzien

Alle hier verwendeten Hinweise auf monoklonale Antikörper (Mab oder Ab) entsprechen den von der Coulter Corporation, Miami, Florida, für die von der Coulter Corporation hergestellten monoklonalen Antikörper verwendeten Identitätskennzeichnungen. Die folgende Information identifiziert hier die verwendeten Antikörper weiter. Die Verwendung der monoklonalen Antikörper dient nur als Beispiel und ist nicht dazu gedacht, die Erfindung zu beschränken. Der Ausdruck "CD" bezieht sich auf "Cluster Designation", wie sie von den International Workshops on Human Leukocyte Differentiation Antigens angenommen wurden. A.T.C.C ist die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
Andere hier verwendete, von der Coulter Corporation erhältliche Reagenzien sind:
MsIgGl-RD1/MsIg1-FITC: Maus IgG1-Phycoerythrin [RD1]/Maus IgG1- Fluoresceinisothiocyanat [FITC].
T11-RD1/B4-FITC: Ab T11-Phycoerythrin/Ab B4-FITC
T4-RD1/T8-FITC: Ab T4-Phycoerythrin/Ab T8-FITC.
1 · PBS: Man löse 53,8 g K&sub2;HPO&sub4; in 1,6 l destilliertem Wasser, gebe 12,8 g KH&sub2;PO&sub4; zu und rühre bis gelöst ist. Dann löse man 340 g NaCl in dieser Lösung. Nachdem alle Salze gelöst sind, fülle man mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 2 L auf und filtriere durch ein 0,2 um Filter. Die resultierende Lösung in 20x PBS. 1x PBS wird durch Verdünnung von 20x PBS mit 19 Tl. destilliertem Wasser hergestellt. Die 1x PBS-Lösung besitzt einen pH-Wert im Bereich von 7,1-7,3, typischerweise 7,2, und ist bezüglich NaCl 0,15 molar.

Detaillierte Beschreibung

Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden einheitliche Teilchen (das Kernmaterial) im Größenbereich von 0,1 bis 5,0 um mit Aminodextran oder mit Gelatine und Aminodextran beschichtet und die Beschichtung mittels eines chemischen Haftvermittlers fixiert oder chemisch an die Teilchenoberfläche gebunden. Die unbeschichteten Teilen weisen eine hydrophobe oder teilweise hydrophobe Oberfläche auf. Die bevorzugte Teilchengröße liegt im Bereich von 0,1 bis 1,0 um.
Die bei der beanspruchten Erfindung verwendeten magnetischen Teilchen können vorgeformte, in einer Gelatinelösung dispergierbare magnetische Teilchen sein, oder magnetische Teilchen, hergestellt bei der in situ-Verwendung von Gelatine zur Herstellung der magnetischen Teilchen. Das in situ-Verfahren zur Herstellung von monodispersen kolloidalen Teilchen aus Ferriten von Mangan, Zink, Mangan-Zink- Gemischen, Eisen, Barium, Kobalt und Nickel beinhaltet die Verwendung eines wässrigen Metallhydroxidgels, hergestellt durch Mischung von Eisen- oder Metallsalzen in einer wässrigen Gelatinelösung mit Kalium- oder Natriumhydroxid und Kalium- oder Natriumnitratlösung, wobei alle Lösungen mit Stickstoff gespült worden sind. Die Umwandlung des Gels in ein Metalloxidsol wird durch milde Wärmebehandlung bei 90ºC (niedrige Temperatur) während 4 bis 72 h erreicht, während dessen die Oxidation von Eisen durch das Nitrat erfolgt. Die magnetischen Teilchen im Hydrosol werden dann gewaschen und vor der Weiterverarbeitung in einer 1% wässrigen Gelatinelösung der nachstehend beschriebenen Art redispergiert. Bei der Herstellung magnetischer Teilchen unter Verwendung von in situ-Gelatine, wie hier beschrieben, wurde für diesen Zweck ein einziger Typ Gelatine für optimal befunden. Dies ist der Typ B oder alkalisch aufgeschlossene Gelatine mit einem pl-Bereich von 4,74 bis 5,0. Die Verfahrensweisen für die Herstellung von magnetischen Teilchen unter Verwendung von in situ-Gelatine ist in der US-A-5,062,991 und auch hier umfassend beschrieben. Gelatinen, die nach der vorliegenden Erfindung vernetzt werden, sind nachstehend angegeben.
Gelatine wird aus hochvernetztem Kollagen in Fasergeweben, wie Haut und Knochen, erhalten, die sauer oder basisch aufgeschlossen und anschließend thermisch bei oder über 39ºC abgebaut worden sind. Die Kollagenmoleküle vereinigen in sich die Helixstruktur der Proteine vom α-Typ mit der Wasserstoffbrückenbindung zwischen den Ketten der Proteine vom β-Typ. Die drei Kollagenpeptidketten, jede in der Form einer linksgängigen Helix, sind um einander gewickelt, um eine Superhelix zu bilden. Bei der Behandlung werden die drei Peptidstränge der Superhelix getrennt, indem die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Ketten aufgebrochen und durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Wasser ersetzt werden. Die getrennten Peptidketten besitzen regellos gekräuselte Konfigurationen. "The Theory of the Photographic Process", T. H. James, Ed., (New York: MacMillan Press, 1977). Die Sequenz der α-1-Peptidkette wurde ermittelt und gefunden, dass sie aus über 1000 Resten besteht. D. J. S. Hulmes et al., J. Mol. Biol., 79: 137 (1973). Sie enthalten ausgedehnte Segmente aus hauptsächlich unpolaren Resten, und die vorhandenen polaren Reste befinden sich nicht in den sauren oder basischen Bereichen. Des Weiteren stellt regellos gekräuselte Gelatine im Gegensatz zu sphärischen Proteinen, welche dazu neigen ihre hydrophilen Reste auf ihrer Oberfläche nach außen zu stellen und ihre hydrophoben Reste in ihrer Struktur zu verbergen (vergl. R. E. Dikkerson et al., « The Structure and Action of Proteins » (Menlo Park: Benjamin, 1969), die hydrophoben Reste so, dass sie für die Adsorption hydrophober Teilchen, wie Polystyrollatex-Teilchen oder Magnetit- und Ferritteilchen, auf ihrer Oberfläche leicht verfügbar sind. Wird wässrige Gelatine an der Oberfläche eines Teilchens adsorbiert, neigen ihre hydrophilen Seitenketten (Aspargyl-, Glutamyl- und Lysylreste) dazu, nach außen zur wässrigen Phase gestellt zu werden. Die Lysylgruppen, die als intramolekulare Vernetzungspunkte im Kollagen fungieren, werden für die Vernetzung in der adsorbierten Gelatine zugänglich sein. Glutaraldehyd wird häufig als Vernetzungsmittel verwendet. U.S. Patent Nr. 4,478,946 von Van der Merwe et al. und S. B. Sato et al., J. Biochem., 100,1481.1496 (1986).
Eine Anzahl unterschiedlicher, üblicherweise bifunktioneller Vernetzungsmittel, wie Bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)-ethyl]sulfon, Disuccinimidyltartrat, Ethylenglykolbis(succinimidylsuccinat), Disuccinimidylsuberat und Glutaraldehyd können bei der beanspruchten Erfindung verwendet werden. Glutaraldehyd, das bevorzugte Vernetzungsmittel für Gelatine und Aminodextran, enthält, wie im Handel erhältlich, hauptsächlich Monomer, das bei 280 nm (Nanometer) absorbiert. Im Handelsprodukt liegt jedoch eine beträchtliche Menge an polymerem Material vor, das eine Absorption bzw. Extinktion bei 235 nm ergibt. Die polymeren Spezies, wahrscheinlich Trimere und lineare Oligomere, besitzen eine ausreichende Länge, um intra- und intermolekulare Brücken zwischen Aminogruppen zu bilden, die auf der adsorbierten Gelatine vorliegen. Bei wohlüberlegter Wahl der Reaktionsdauer zwischen adsorbierter Gelatine oder Aminodextran und Glutaraldehyd kann die Gelatine in geeigneter Weise auf dem Kernteilchen so fixiert werden, dass sie während der nachfolgenden Trenn-, Reaktions- und Waschstufen nicht entfernt wird. Große Flocken, die durch übermäßige Vernetzung freier Gelatine gebildet werden, können dadurch vermieden werden, so dass die Vernetzung zwischen den Teilchen vernachlässigbar ist.
Die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeigneten Typen Gelatine sind, Typ A, sauer aufgeschlossen, isoelektrischer Punkt pH 8,3-8,5, und Typ B, alkalisch aufgeschlossen, isoelektrischer Punkt, pH 4,75-50. Jeder Typ ist in einer Reihe von Bloom-Zahlen erhältlich, welche die Gelstärke angeben. Bloom-Zahlen der Typ A Gelatine, die bei der beanspruchten Erfindung verwendbar sind, reichen von 60 bis 300. Bloom-Zahlen der Typ B Gelatine, die bei der beanspruchten Erfindung verwendbar sind, reichen von 60 bis 225. Die Typ A Gelatine mit 175 Bloom, die bei der bevorzugten Ausführungsform der beanspruchten Erfindung bevorzugt ist, wurde wegen ihrer vergleichsweise großen Anzahl von Lysylresten und ihrer niedrigeren Bloomzahl ausgewählt, um die intermolekulare Wechselwirkung zwischen den Gelatinemolekülen auf ein Mindestmaß zu beschränken. Zur optimalen Adsorption auf Magnetit- und Ferritteilchen wurde sie auf pH 8,4, der Mitte des Bereichs ihres isoelektrichen Punktes, gepuffert, bei welchem pH-Wert sie am besten in Wasser löslich ist und die niedrigviskoseste Lösung gibt. Die Instabilität von auf Ferritteilchen adsorbierter Gelatine, die bei Zugabe von Glutaraldehyd auftritt, wurde bei der vorliegenden Erfindung dadurch überwunden, dass stärker verdünnte Teilchen- und Gelatinekonzentrationen [0,1% Gewicht/Volumen (Gew./Vol.)] an Stelle von Feststoffsupensionen mit 2,5% Gewicht/Volumen (Gew/Vol), wie sie hier bei anderen Reaktionen verwendet wurden, in Verbindung mit einem inerten polymeren Stabilisator, Polyvinylpyrrolidon (PVP), der nicht mit Glutaraldehyd reagiert, verwendet wurden. Die Verwendung des Stabilisators und der um das 25-Fache geringeren Gelatinekonzentrationen vermeidet die Vernetzung zwischen den Teilchen während der Fixierungsreaktion mit Glutaraldehyd. Da die Polymerdesorption im Vergleich zur Fixierungsreaktion mit Glutaraldehyd ein sehr langsamer Vorgang von etwa 6 min ist, wurde eine stabile Beschichtung um das Kernteilchen erzeugt.
Damit sie auf dem biologischen und medizinischen Fachgebiet verwendbar ist, sollte die Aminodextran- oder Gelatine/Aminodextran-Beschichtung funktionelle Gruppen enthalten, die mit biologisch aktiven Substanzen, wie Antikörpern, konjugiert werden können, um an die Teilchenoberfläche gebundene, immobilisierte biologisch wirksame Substanzen zu erzeugen. Die kovalente Bindung biologischer Substanzen an die Teilchenoberfläche ist gegenüber der einfachen Adsorption bevorzugt. Die Anbindung eines Antikörpers, polyklonal oder monoklonal, an die vernetzte Gelatineoberfläche wird durch Verwendung "kurzkettiger" Diamine oder Polyamine und eines heterobifunktionelles Reagens erreicht (Das Wort Polyamin schließt hier nachstehend Diamine ein). Das Polyamin wird mit den restlichen Aldehyd- oder Carboxylgruppen umgesetzt, die entweder von Natur aus oder infolge der Schritte dieser Erfindung auf der vernetzten Gelatineoberfläche vorliegen. Die Verwendung des Polyamins dient nicht nur dazu, die Aldehyd/Carboxyl-Gruppen zu blockieren, sondern auch dazu, Aminogruppen, wie Lysyl-Aminogruppen wiederherzustellen, die während des Vernetzungsvorgangs abgebaut wurden. Dieser Vorgang wird im Allgemeinen in zwei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe werden nicht umgesetzte, endständige Aldehydgruppen mit einem Polyamin umgesetzt, und die resultierende Schiff'sche Base anschließend mit Nariumborhydrid (NaBH&sub4;) reduziert, um stabile gesättigte C-N- Bindungen zu erzeugen. In der zweiten Stufe werden exponierte Carbonsäurereste (glutaminische, asparaginische) der Gelatine in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimids, wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC), an das Polyamin gebunden.
Kurzkettige Polyamine, einschließlich Diamine, sind bevorzugt, um die Vernetzung benachbarter Aldehyd- oder Carboxylgruppen auf dem gleichen Teilchen oder die Verbindung solcher Gruppen auf verschiedenen Teilchen zu vermeiden. Eine Aminogruppe des Polyamins reagiert mit der Gelatineoberfläche und das/die andere(n) bleiben nicht umgesetzt und für die direkte oder indirekte Anbindung an eine biologische Substanz verfügbar. Beispiele für "kurzkettige" Polyamine schließen ein: Ethylendiamin, Phenylendiamin, Propylendiamin, 1,4-Cyclohexandiamin, Cylohexendiamin, Tetramethylendiamin, Diethylentriamin, 1,5-Diamino-3-(2-aminoethyl)pentan [(H&sub2;NCH&sub2;CH&sub2;)&sub3;C] und andere Polyamine der allgemeinen Formel H&sub2;NCH&sub2;-(CH&sub2;)x- CHy(CH&sub3;)z-NH&sub2; und C&sub6;H4+a(NH&sub2;)&sub2;&sub1;, worin x = 0 bis 3, y = 1 oder 2 und z = 1, wenn y = 1 oder z = 0, wenn y = 2 und a = 0 oder 6 ist. Ethylendiamin ist bevorzugt.
Die Anbindung der biologischen Substanz an das Teilchen beinhaltet die Aktivierung der freien Aminogruppe des beschichteten, vernetzten Teilchens mit einem heterobifunktionellen Reagenz, wie 2-Iminothiolanhydrochlorid (IT), Sulfosuccinimidyl-4-(N- maleinimdomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (suIfoSMCC), m-Maleimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimidester, N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat, Succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl)butyrat, N-Succinimidyl-(4-iodo-acetyl)aminobenzoat, wobei die vorstehend aufgeführten Reagenzien als Ersatz für Glutaraldehyd und ähnliche dienen. 2-Iminothiolanhydrochlorid und die Maleimidyl/-Succinimidyl-Reagenzien sind bevorzugt. E. Ishikawa, Immunoassay Supp., 1: 1-16 (1980) und J. Immunoassay, 4: 209-227 (1983); M. Imagawa et al., J. Appl. Biochem., 4: 41-47 (1982); und M. D. Partis, J. Protein Chem., 2: 263-277 (1983). Bei Verwendung von sulfo-SMCC wird das aktive Sulfosuccinimidylesterende des sulfo-SMCC bei pH 7,0-7,5 mit Aminen unter Bildung von Peptidbindungen reagieren. Die resultierende sulfo-SMCC/Diamin- Verbrückungseinheit ist ungefähr 16 Å lang.
Bei der Durchführung der Polyamin- und sulfo-SMCC-Umsetzungen wurde die Teilchenaggregation durch mikroskopische Untersuchung (1000-Fache Vergrößerung) und durch Lichtstreuungsanalyse unter Verwendung eines Coulter N4MD Submikronteilchengrößenanalysators (Coulter Corporation, Miami, Florida) oder einem ähnlichen Gerät überwacht.
Die Maleimidylgruppe von sulfo-SMCC wird bei pH 6,5-7,5 mit den freien Sulfhydrylgruppen unter Bildung einer stabilen kovalenten Thioetherbindung reagieren. Es ist jedoch wesentlich, dass die beschichteten Teilchen, mit denen das sulfo-SMCC umgesetzt wird, keine freien Sulfhydrylgruppen enthält, die mit dem Maleimidylende des sulfo-SMCC reagieren könnten. Sulfhydrylgruppen finden sich auf oder werden von Cystin- und Cysteinaminosäureresten erzeugt, von denen Gelatine sehr wenige aufweist. Folgerichtig braucht man kein Proteinmodifizierungmittel, um die freien Sulfhydrylgruppen vor der Umsetzung mit sulfo-SMCC zu blockieren, wenn Gelatine als erste Beschichtung verwendet wird.
Biologische Substanzen, insbesondere monoklonale oder polyklonale Antikörper, können an das Maleimidylende von mit sulfo-SMCC funktionalisierten Teilchen über die vorhandenen Sulfhydrylgruppen, die entweder von Natur aus oder durch Derivatisierung auf den biologischen Substanzen vorhanden sind, gebunden werden. Biologische Substanzen, die Cysteinylreste besitzen, enthalten von Natur aus Sulfhydrylgruppen. Um zusätzliche Sulfhydrylgruppen einzuführen, werden die Aminogruppen der biologischen Substanzen mit Traut's Reagens, 2-Iminothiolanhydrochlorid (IT) bei einem pH-Wert im Bereich von 7 bis 10 aktiviert. M. Erecinska, Biochem. Biophys. Res. Commun., 76: 495-500 (1977); J. M. Lambert et al., Biochemistry, 17: 5406-5416 (1978); und M. E. Birnbaumer et al., Biochem. J., 181: 201-2313 (1979). Sind die Biosubstanzen Antikörper, werden Lysyl-Antikörper und endständige Aminogruppen durch IT aktiviert. Bei der vorliegenden Erfindung wurden die Reaktionsbedingungen und die Konzentration der Reaktanten variiert, um die optimale Anbindung zu bestimmen, so dass die Biosubstanz, im besonderen Antikörper, ihre maximale funktionale Aktivität erreicht, wenn sie mit den Substratteilchen konjugiert wird. Obwohl Maleimide in Lösung ziemlich schnell mit Sulfhydrylgruppen reagieren, wurden den gleichen, auf Teilchen immobilisierten Gruppen längere Reaktionszeiten eingeräumt, um mit dem Protein zu reagieren. Die Teilchen- und Antikörperkonzentrationen während der Antikörperkonjugation wurden optimiert, um Aggregation zu vermeiden, insbesondere wenn IgM-Antikörper verwendet wurden. Die für IgM- Antikörper optimierten Verfahren können auf alle monoklonalen Antikörper mit einem isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 5,0 bis etwa 9,0 angewendet werden. Im Allgemeinen wurden etwa um das 30-fache weniger Antikörper gebraucht, um eine kovalente Anbindung zu erreichen, als für eine einfache Adsorption gebraucht wird; Eine wichtiger Gesichtspunkt, wenn teuere oder schwer zu beschaffende Antikörper beteiligt sind.
Die optimale Konzentration für einen mit Iminothiolan aktivierten Antikörper zur Verwendung bei Konjugationsreaktionen mit Maleimidyl-aktivierten Teilchen wurde unter Verwendung von aktivierten Antikörperbindungskurven (Oberfläche Antikörper gegen Antikörpergesamtkonzentration) bestimmt. Nach einer typischen Konjugationsperiode wird eine Probe entnommen und durch ein 0,2 um Filter mit geringer Proteinbindung filtriert. Das Filtrat wird spektrophotometrisch analysiert und die Antikörperoberfläche anhand der Differenz zwischen Gesamtantikörper in der Ausgangslösung und dem Antikörper im Filtrat (Gesamtantikörper - Filtratantikörper) bestimmt. Die Bindungswerte bei von der Antikörper(Ab)-Konzentration abhängigen Versuchen weisen Eigenschaften vom Typ der Langmuir-Isotherme auf; d. h. einen im Vergleich zur Antikörperoberflächenkonzentration linearen Konzentrationsbereich bei niedriger Antikörpergesamtkonzentration, einen flachen Wendepunkt und ein Plateau, das eine Sättigung auf der Teilchenoberfläche bei hohen Konzentrationen anzeigt. Die tatsächlich verwendeten Antikörperkonzentrationen waren jene am Wendepunkt oder Konzentrationen geringfügig über dem Wendepunkt. Die Bindekonstanten wurden graphisch durch Umformung der Hyperbelgleichung in eine solche für eine gerade Linie erhalten. Es wurde ein doppelt reziprokes Diagramm aus 1/n&sub2;s gegen 1/C&sub2; konstruiert, wobei n&sub2;s die pro Gramm Teilchen gebundene IT-Ab-Molzahl und C&sub2; die molare Konzentration an freiem IT-Ab im Gleichgewicht bedeutet. Ein linearer Verlauf zeigt ein Bindungverhalten vom Langmuir-Typ an. Die Bindungskonstanten K&sub1; = nsK von IT-Ab für sulfo-SMCC-aktivierte Ferriteilchen wurden unter Verwendung der Gleichung 1/n&sub2;s = 1/(nsKC&sub2;) + 1/nss, berechnet, worin K die echte Bindungskonstante und n die Molzahl der Bindungsstellen pro Gramm Ferrtitteilchen ist. Die lineare Regressionsanalyse der Diagramme für verschiedene Antikörper führte zu folgenden Ergebnissen:
Die Ergebnisse für die Ferritteilchen stimmen gut mit ähnlichen Werten für im Handel erhältliche carboxylmodifizierte Beads (23% Magnetit, 0,980 um Durchmesser, erhalten von Rhone-Poulenc) überein, die mit Aminodextran kovalent beschichtet und an monoklonale Antikörper und Protein gebunden sind. Dies sind die Ergebnisse:
Zusätzlich zu Beads mit Ferritkernen wurde die vorliegende Erfindung auch unter Verwendung monoklonaler Antikörper evaluiert, die an vernetzte, mit Gelatine beschichtete Polystryrolbeads konjugiert waren. Die Bindungskonstanten für diese Antikörper, die gut mit den beiden vorstehend angegebenen Evaluierungen übereinstimmen, sind wie folgt:
Die Ergebnisse mit den Polystyrolbeads zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf magnetische Sphäroide beschränkt ist, sondern für alle kolloidalen Teilchen verwendet werden kann, die eine hydrophobe Oberfläche besitzen.

Beispiele

I. HERSTELLUNG MAGNETISCHER TEILCHEN MIT EINER GELATINEBESCHICHTUNG (nur Bezugsbeispiel, kein erfindungsgemäßes Beispiel)

Herstellung von Magnetit und anderen magnetischen Teilchen in Gelatinelösung. 10 mmol (5 ml) 2-m KNO&sub3;-Lösung, 12,5 mmol (2,5 ml) 5-m KOH-Lösung und 11,25 ml doppelt destilliertes Wasser (DDW) wurden gemischt und 10 min mit N&sub2;-Gas gespült (Lösung A). Der Lösung A wurden in einem Pyrex® Kolben 6,25 mmol (6,25 ml) 1-m FeSO&sub4;-Lösung und 25 ml frisch bereitete, mit N&sub2; gespülte, 2% Typ B, 225 Bloom, Rinderhautgelatinelösung (die verwendbare Gelatinelösung liegt im Bereich von 0,8% bis 2,0%) zugesetzt, gemischt, mit N&sub2; Gas gespült, dicht verschlossen und ohne zu Bewegen 4 h bei 90ºC in einem Ofen aufbewahrt.
Nachdem die Suspension aus schwarzen Magnetitteilchen Raumtemperatur angenommen hatte, wurde sie 1/2 h beschallt, mit 1% Typ B, 225 Bloom Gelatinelösung gewaschen und dann als nächsten Schritt mit einem großen Überschuss 1% (Gew./Vol.) Gelatine versetzt.
Auch Metallferrite können unter Verwendung von Gelatine in situ hergestellt werden. Bei Versuchen mit anderen Metallen, namentlich Mn²&spplus;, Zn²&spplus;, Co²&spplus; Ni²&spplus; und (M²&spplus;), wurde ein M²&spplus; : Fe²&spplus;-Molverhältnis von 1 : 2 eingehalten, aber bei Co²&spplus; und Ni²&spplus; Nitrat an Stelle von Sulfat verwendet. Das Gesamtmetall/Hydroxid-Molverhältnis betrug 1 : 2, die KNO&sub3;/Gesamtmetall- und KNO&sub3;/KOH-Molverhältnisse wurden jedoch verändert. Bei der Zubereitung des gemischten Mn/Zn-Ferrits wurde ein Mangansulfat/Zinksulfat-Molverhältnis von 1 : 1 und die gleiche molare Gesamtmenge an Nichteisenmetallionen verwendet. Es folgt ein Beispiel. 10 mmol (5 ml) 2-m KNO&sub3;- Lösung, 18,75 mmol (3,75 ml) 5-m KOH-Lösung und 6,875 ml DDW wurden gemischt und 10 min mit N&sub2; Gas gespült (Lösung C). 6,25 mmol (6,25 ml) 1-m FeSO&sub4;- Lösung, 3,125 mmol (3,125 ml) 1-m Co(NO&sub3;)&sub2;-Lösung und 25 ml Typ B, 225 Bloom, Rinderhautgelatinelösung wurden gemischt und 10 min mit N&sub2; Gas gespült (Lösung D). Die Lösung D wurde der Lösung C in einem Pyrex® Kolben zugesetzt, gemischt, mit N&sub2; Gas gespült, dicht verschlossen und ohne Bewegung 5 h in einem Ofen bei 90ºC aufbewahrt. Nachdem die Suspension aus braunen Teilchen Raumtemperatur angenommen hatte, wurde sie 1/2 h beschallt, mit 1% Typ B, 225 Bloom Gelatinelösung gewaschen und dann als nächsten Schritt mit einem großen Überschuss 1% Gew./Vol. Gelatine in Berührung gebracht.
Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurden Kobalt- und Nickelferritteilchen mit einem Durchmesser von etwa 0,1 bis 0,2 um und sphärischer Gestalt in Form großer, lose zusammengehaltener Aggregate gebildet. Zink lieferte selbst nach 72 h Wärmebehandlung ein hellbraunes magnetisches Material mit einem Durchmesser kleiner als 0,2 um in geringer Ausbeute. Dunkelbraune Mangan- Ferrit-Teilchen mit einheitlicher, sphärischer Gestalt und einem Durchmesser von 0,3 um wurden als Einzeltleichen in einer Ausbeute von 83-88% erhalten. Ähnliche hellbraune Mangan-Zink-Ferritteilchen wurden nach 72 h Wärmebehandlung bei 90ºC in einer Ausbeute von 49-55% hergestellt. Für Barium wurde das Verfahren modifiziert, da BaSO&sub4; in Wasser unlöslich ist (Abgesehen von den Fällen, in denen Barium vorliegt, können die zweiwertigen Metalle in Form ihrer Chloride, Sulfate oder auch Nitrate verwendet werden). Demzufolge wurden 6,25 mmol (6,25 ml) 1-m FeCl&sub2;-Lösung, 0,5 mmol (5,0 ml) 0,1-m Ba(NO&sub3;)&sub2;-Lösung und 25 ml 2% Gelatine gemischt und 10 min mit N&sub2; Gas gespült (Lösung D). Die Lösung C und das übrige Ferritherstellungsverfahren blieben unverändert, außer dass 10 mmol KOH-Lösung (2 ml) verwendet und die Wärmebehandlung 20 h fortgesetzt wurde. Es fielen schwarze Bariumferritteilchen mit uneinheitlicher, nicht-sphärischer Gestalt mit einem Durchmesser von 0,2 um an.

Herstellung von Gelatine beschichteten magnetischen Teilchen

Eine Menge magnetischer Teilchen, zum Beispiel Mangan-Ferrit-Teilchen mit einheitlicher Größe (0,3 um) und sphärischer Gestalt, die unter Verwendung von in situ-Gelatine nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, wurden mit einem großen Überschuss von 1% Gew./Vol. Typ B, 225 Bloom wässriger Gelatinelösung in Berührung gebracht. Alternativ wurden vorgeformte (d. h. nach anderen Verfahren als der in situ-Verwendung von Gelatine) dispergierbare magnetische Teilchen, zum Beispiel Mangan-Ferrit-Teilchen einheitlicher Größe (0,3 um) und sphärischer Gestalt mit einem großen Überschuss von 1% Gew./Vol., Typ B, 225 Bloom Gelatinelösung bei Umgebungstemperatur während etwa 60 min in Berühung gebracht. Die Teilchen (jedes der obigen) wurden dann magnetisch abgetrennt und 5-mal mit einer 2% Gew./Vol., Typ A, 175 Bloom Gelatinelösung in 0,2-m Natriumchlorid, pH-Wert 8,4, gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Teilchen bei Umgebungstemperatur bis zu mehreren Monaten in Form eine 2,5% Gew./Vol. Feststoffsuspension in einer wässrigen, 0,2-m Nariumchlorid und 0,1% Natriumazid enthaltenden, 2% Gew./Vol. Lösung der Typ A Gelatine gelagert. Vorausgesetzt, der Azidgehalt in der Lagerlösung wird aufrechterhalten, kann die Suspension bis zu etwa 3 Monaten gelagert werden.

Vernetzung der adsorbierten Gelatine

62,5 ul 25% wässrige Glutaraldehydlösung (0,156 mmol) werden zu 120 ml 1% wässrigem Polyvinylpyrrolidon (MW = 40000) in 0,2-m wässrigem Natriumchlorid zugesetzt, pH-Wert 7,2. Zu dieser Glutaraldehydlösung werden 5 ml der oben hergestellten 2,5% Feststoffsuspension zugesetzt und die resultierende Suspension bei Umgebungstemperatur während einer Zeitspanne von 3-15 min, vorzugsweise etwa 6 min, gemischt.

Blockierung nicht-umgesetzter Aldehydgruppen

0,105 ml 99% Ethylendiamin (1.56 mmol) wurden zu 125 ml einer Suspension von fixierten, mit Gelatine beschichteten Teilchen (0,1% Gew./Vol. Feststoff) in einer 0,2-m Natriumchlorid enthaltenden 1% PVP-Lösung zugesetzt; pH-Wert 7,2. Die resultierende Suspension wurde während einer Zeitspanne von etwa 1 bis 4 Stunden, vorzugsweise 2 Stunden, in einer 250 ml Gewebekulturflasche gemischt.
Am Ende der Mischzeit wurden 1,25 ml einer 10 mg/ml Natriumborhydrid (NaBH&sub4;) enthaltenden Lösung in 0,1-mmol KOH zu den magnetischen Teilchen zugegeben und die resultierende Suspension weitere 15 min gemischt. Die Teilchen wurden anschließend magnetisch abgetrennt und mehrmals, vorzugsweise 3-mal, mit wässriger 0,2-m Natriumchloridlösung gewaschen.

Vernetzung der adsorbierten Gelatine ohne Verwendung von Polyvinylpyrrolidon als Stabilisator.

5 ml Manganferrit-Teilchen mit einem Feststoffgehalt von 2,5% Gew./Vol., die in einem 2% Gew./Vol., Typ A, 175 Bloom Gelatine enthaltenden, 0,1-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,4 dispergiert sind, und wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurden, werden magnetisch abgeschieden. Die klare, überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und der Rückstand aus magnetischen Teilchen wurde in 5 ml 3 mg/l, Glutaraldehydlösung redispergiert, die durch Mischen von 56 ul 25% Glutaraldehydlösung mit 5 ml 1-mn wässrigem Kaliumhydroxid, pH-Wert 10,00, hergestellt wurde. Die resultierende Suspension der magnetischen Teilchen wurde etwa 30 min. vorzugsweise rollend bzw. walzend gemischt. Nachdem die Addition des Glutaraldehyd und das Mischen abgeschlossen war, wurden etwa 34 ul Ethylendiamin (Diamin/Glutaraldehyd-Molverhältnis = 10 : 1) zugegeben und das Reaktionsgemisch weitere 2-3 h gerührt. Anschließend wurde sogleich etwa 0,313 ml einer 40 mg/ml Natriumborhydridlösung in 1-mmol KOH zugegeben und die Reaktion und das resultierende Gemisch etwa 10-30 min gerührt. Die vernetzten Teilchen wurden dann 3-mal unter Anwendung magnetischer Trennung gewaschen und in 5 ml wässrigem 1-mmol Kaliumhydroxid resuspendiert.
Für die Elementaranalyse wurden 5 ml Suspension der auf den Manganferrit- Teilchen vernetzten Gelatine nochmals 15-mal mit destilliertem Wasser gewaschen und der magnetisch abgetrennte Rückstand bei 100ºC im Ofen getrocknet. Die Analyse ergab folgende Gewichtsprozente: Mn, 19,05%; Fe, 49, 49%; C, 0,54%; H < 0,5%; O, 30,92 aus der Differenz. Der Kohlenstoffgehalt der Gelatine in gewichtsprozent kann aus ihrem Aminosäuregehalt erhalten werden, welche ergibt: C, 50,46%; H, 6,765%; N, 18,27%; O, 24,29% und S, 0,21% (vergl. "The Theory of the Photographic Processes", 4. Ausg., T. H. James, ed. (Macmillan, New York, 1977), Kapitel 2, S. 52). Daraus ergibt sich für 1 Gramm gelierter Ferritteilchen 1 g · 0,0054/0,5056 = 0,01070 g Gelatine und 0,9893 g Ferrit. Das Teilchenvolumen für sphärische Manganferrit-Teilchen mit einem Durchmesser von 0,29 um beträgt 1,277 · 10&supmin;¹&sup4; cm³. Bei Verwendung einer Teilchendichte von 4,24 g/cm³ beträgt die Teilchenmasse 5,414 · 10&supmin;¹&sup4; g und die Teilchenzahl in 0,9893 g Ferrit 1,827 · 10¹³. Die Gelatinemasse pro Teilchen beträgt demzufolge 5,856 · 10&supmin;¹&sup6; g. Nimmt man, ausgehend von 2% Gew./Vol. Gelatine vor der Vernetzung mit Glutaraldehyd die Dichte der Gelatinebeschichtung zu 0,02 g/cm³ an, beträgt das Gelatinevolumen pro Teilchen 2,92 · 10&supmin;&sup5; Demzufolge beträgt das Gesamtvolumen (Ferrit und Gelatine) pro Teilchen 4,205 · 10&supmin;¹&sup4; cm und der Radius eines aus Ferrit und Gelatine bestehenden kugelförmigen Teilchens 2,157 · 10&supmin;&sup5; cm oder 0,2157 um. Die Dicke der Gelatinebeschichtung beträgt dann 0,2157 um - 0,145 um (mittlerer Radius der Ferritteilchen) = 0,145 um (d. h. etwa 71 nm). Dieser Wert für die Dicke der Gelatinebeschichtung stimmt gut mit den folgenden Adsorptionswerten auf verschiedenen Oberflächen überein, wie sie aus folgenden Veröffentlichungen erhalten wurden.
1. A. T. Kudish et al., Proteins at Interfaces, ACS Symposium Series 343, T. L. Brash und T. A. Horbett eds., (Washington, D. C.; American Chemical Society 1987), Kapitel 17, S. 261-277: Typ A Schweinehautgelatine auf Glas ergab eine Dicke der Beschichtung von 750 Å (0,075 um) und Type B Kalbshautgelatine auf Glas ergab eine Dicke der Beschichtung von 500 Å (0,050 um).
2. N. Kawaniski et al., J. Phys. Chem. 94: 4611-4617 (1979): Typ G Gelatine, Bloom 259, auf Glimmer ergaben eine Kraft versus Abstand (zwischen Glimmeroberflächen) anziehendes Minimum bei 75 nm (750 Å).
3. H. Meltger et al., J. Colloid Interface Sci. 126: 292-303 (1988): Denaturiertes Kalbshautkollagen (d. h. Gelatine) ergab auf Glas eine Filmdicke von 600-700 Å (0,060-0,070 um).
Werden die Teilchen nicht nur zur Analyse, sondern weiter verwendet, werden die restlichen Aldehydgruppen durch Umsetzung mit einem Diamin entfernt.

Reaktion mit Carboxylatresten der fixierten Gelatine

2,11 ml 99% Ethylendiamin werden zu 118 ml einer Suspension der mit Aldehyd blockierten Beads, 0,1% Gew./Vol. Feststoffgehalt, in wässriger 0,2-m NaCl zugegeben. Die resultierende Suspension wurde etwa 15 min. physikalisch und durch Beschallung gemischt. Nach dem Mischen wurden 4,5 ml einer 10 mg/l, enthaltenden EDAC in 0,2-m NaCl zugegeben und die Suspension zuerst etwa 15 min physikalisch und durch Beschallung gemischt und abschließend während einer Zeitspanne von etwa 8-16 h physikalisch gemischt. Die Inhalte des Kolbens wurden dann magnetisch getrennt, mehrmals mit 1X PBS gewaschen, durch Beschallung in 1X PBS etwa 30 min gemischt und abschließend in 1X PBS auf 5 ml mit einem Feststoffgehalt von 2,5% Gew./Vol. aufkonzentriert. Bei der Herstellung im größeren Maßstab (100x) wurde die vorausgehende Blockierungsstufe mit Aldehyd und die EDAC-Kopplungsstufe kombiniert, um mehrfache Trenn- und Waschvorgänge zu vermeiden. Die Kombination der Stufen führte zu keinerlei Aktivitätsverlust bei den mit Antikörper konjugierten Beads als Endprodukt.

Aktivierung Diamin-behandelter Teilchen mit sulfo-SMCC

Im Allgemeinen wurden 27 ul frisch bereitetes 10 mg/ml sulfo-SMCC in 1X PBS pro Milliliter 2,5% Gew./Vol. Magnetteilchensuspension verwendet. Bei einer typischen Zubereitung wurden 135 ul sulfo-SMCC-Lösung zu 5 ml 2,5% Gew./Vol. Teilchen zugegeben. Das Gemisch wurde in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff etwa 1 h rollend gemischt, etwa 5 min durch Beschallung gemischt, magnetisch getrennt und mehrmals mit 1X PBS gewaschen.
Die funktionalisierten, vernetzten, mit Gelatine beschichteten Teilchen aus den obigen Versuchsreihen weisen seitenständige Maleimidylgruppen auf und sind für eine Reihe medizinischer und/oder biologischer Verwendungen brauchbar. Wenn die Substanz, die an die Teilchen konjugiert werden soll, eine ausreichend aktive Sulfhydrylgruppe aufweist, ist eine Aktivierung der Substanz nicht erforderlich und der folgende Schritt kann unterbleiben.

Antikörperaktivierung mit 2-Iminothiolanhydrochlorid.

Es wurde ein 51,24 mg/ml Konzentrat von monoklonalem Antikörper T11 in 1X PBS hergestellt, das 0,1% NaN&sub3; enthielt. Für 10 mg Antikörper T11 und eine Antikörperkonzentration von 15 mg/ml während der Kopplung sollte das gesamte Reaktionsvolumen 0,667 ml betragen. Bei Verwendung eines IT : T11-Aktivierungsverhältnisses von 15 : 1 ist 0,9375 umol (0,129 mg) IT (65 ul mit 2 mg/ml IT) in 1X PBS erforderlich. Daher wurden 0,407 ml 1X PBS-Lösung zu 0,195 ml T11- Konzentrat gegeben und der resultierende Lösung weitere 65 ul 2 mg/ml IT-Lösung zugesetzt. Die resultierende Gesamtlösung wurde in einem Reaktionsröhrchen 1 h rollend gemischt. Der Inhalt des Reaktionsröhrchens wurde oben auf eine G-50 Sephadex-Säule aufgegeben, mit 100 ml 1X PBS ins Gleichgewicht gesetzt und gewaschen. Der derivatisierte Antikörper wurde mit 1X PBS eluiert und es wurden unter Verwendung eines UV-Monitors eine Reihe von 2,5 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen in der Mitte der bei 280 nm absorbierenden Bande wurden vereinigt und der A&sub2;&sub8;&sub0;-Wert zur Bestimmung der T11/IT-Antikörperkonzentration verwendet. Die T11/IT-Konzentration betrug typischerweise etwa 3,0 mg/ml. Die T11/IT-Lösung kann durch Entfernung des Lösungsmittels konzentriert werden.

Konjugation von T11/IT mit sulfo-SMSS derivatisierten Teilchen.

Bei einer Konjugation im Labormaßstab mit einem Gesamtvolumen von 5 ml betrug die Feststoffkonzentration der Teilchen 2,5% (Gew./Vol.) und die T11/IT- Konzentration 0,9 mg/ml. Sobald in einer Probe die Konzentration an gereingter T11/IT-Lösung 12,850 mg/ml betrug, wurden 2,392 ml T11/IT-Antikörperlösung in 1X PBS zu 5 ml 2,5% (Gew./Vol.) Feststoff enthaltenden, mit sulfo-SMCC aktivierten Teilchen zugegeben, die durch Entfernung von 2,432 ml Überstand aufkonzentriert worden war. Die T11/IT-Lösung wurde zu den Teilchen in Teilmengen von 0,5 ml unter Schallmischung und schneller physikalischer Mischung zwischen den Zugaben zugegeben. Die resultierende Lösung wurde dann in einem 15 ml Röhrchen etwa 2 h rollend gemischt. Es wurde eine 1 ml Prüfprobe abgenommen, durch ein 0,2 um Filter mit geringem Proteinbindevermögen filtriert und das Filtrat durch Messung der Absorption bei 280 nm auf T11-Antikörper spektrophotometrisch analysiert; A&sub2;&sub8;&sub0; = c (Überstand) = 0,3986 mg/ml. [Differenzmessung, c (Oberfläche) = c (total) - c (Überstand). Demzufolge ist c (Oberfläche) = 0,9 mg/ml - 0,3986 mg/ml = 0,501 mg/ml. Dies entspricht einer T11-Oberflächenbelegung von 20 mg T11 pro Gramm Teilchen, oder bei einer spezifischen Oberfläche von 4,89 m²/g bei Mangan- Ferrit-Teilchen einer solchen von 4,1 mg T11/m² Teilchenoberfläche. Ähnliche Verfahrensweisen mit 2- und 3facher Verdünnung der Teilchenkonzentration aber der gleichen Antikörpergesamtkonzentration während der Konjugation lieferten höhere Oberflächenbelegungen mit Antikörper. Es wurde jedoch eine Grenze erreicht, als eine 4-fache Verdünnung der Teilchenkonzentration keine höhere Oberflächenbelegung mit Antikörper brachte.

Blockierung nicht-umgesetzter Maleimidyl- und Sulfhydrylgruppen.

Nicht-umgesetzte Maleimidylgruppen auf den mit sulfo-SMCC aktivierten Teilchen wurden nach der Antikörperkonjugation mit Cystein blockiert. Typischerweise wurden 0,480 ml, enthaltend 5 mg/ml L-Cystein in 1X PBS, zu den verbleibenden 4 ml des Konjugationsgemisches der vorausgehenden Stufe zugegeben und die resultierende Lösung 15 min rollend gemischt. Nicht-umgesetzte Sulfhydrylgruppen wurden durch Zugabe von 0,534 ml 20 mg/ml Iodacetamid in 1X PBS blockiert und anschließend 0,100 ml 1-m Natriumboratpufferlösung vom pH-Wert 9,8 zugegeben Die resultierende Lösung wurde 30 min rollend gemischt, das blockierte, konjugierte Gemisch magnetisch getrennt und die Teilchen 3-mal mit 1X PBS, das 1% Rinderserumalbumin (Fraktion V, Wärmeschock) und 0,1% NaN&sub3; (BSA Pufferlösung) enthielt, gewaschen. Nach dem Waschen wurde den Teilchen 4 ml der vorhergehenden BSA-Lösung zugesetzt, die Teilchen etwa 1 h rollend gemischt, 8-16 h bei 4ºC aufbewahrt, magnetisch getrennt, und weitere 3-mal mit BSA-Puffer gewaschen.
Antikörper enthaltende Teilchen, die nach dem hier beschriebenen Verfahren hergestellt werden, haben sich bei verschiedenen Zelltrennversuchen als nützlich erwiesen. Die bei den Versuchen verwendeten biologischen Substanzen, welche die Erfindung benützen, können ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus normalen oder nicht-normalen T-Zellen, B-Zellen, Leukozyten, Viren, Erythrozyten, Zellen von Brust, Gebärmutter, Dickdarm, Niere, Leber, Lunge, Hoden, Magen, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, und dergleichen, mit der Maßgabe, dass die biologische Substanz ein determinierendes Antigen enthält, das sich an einen Antikörper binden kann.
Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, die mit der vorstehend beschriebenen Ausführungsform mit magnetischen Teilchen gleichwertig ist, sind die Maleimidylgruppen und die Sulfhydrylgruppen gegeneinander ausgetauscht. Das heißt, die mit vernetzter Gelatine beschichteten Teilchen sind so derivatisiert, dass sie seitenständige Gruppen aufweisen, die an Stelle der Maleinimidylgruppen, wie vorstehend beschrieben, in reaktiven Sulfhydrylgruppen enden und die Antikörper so derivatisiert sind, dass sie an Stelle der Sulfhydrylgruppen, wie oben beschrieben, reaktive Maleimidylgruppen besitzen. Die Verfahren zur Herstellung dieser gleichwertigen Ausführungsform sind die gleichen, wie vorstehend beschrieben. In beiden Fällen ist der Antikörper mit der Gelatineoberfläche durch eine Molekülbrücke verbunden, die wie beschrieben, hergestellt wird.
Die folgenden Beispiele sollen die Anwendbarkeit der beanspruchten Erfindung veranschaulichen und nicht als Beschränkung der Erfindung angesehen werden.

Bezugsbeispiel 1. Protokoll über den Verarmung magnetischer Beads von T-Zell- und B-Zellpopulationen.

Einzellige Zellen (MNC) wurden aus Vollblutproben durch Dichteisolierung an Ficollhypaque Gradienten und Waschen in PBS erhalten. 1 · 10&sup6; MNC in 1X PBS wurden einer Reihe von Reaktionsröhrchen zugesetzt, die 5, 10, 25, 50 und 100 ul einer mit monoklonalem Antikörper (mAb) konjugierten Suspension magnetischer Teilchen enthalten (2,5% Gew./Vol.) und geprüft. Es wurden zwei Reaktionsröhrchen für jede Verarmung und die nicht verarmte Kontrollprobe bereitgestellt. Die resultierenden Suspensionen wurden dann 3 min in einer Mehrfachschüttelmaschine oder in einem Einzelröhrchenschüttler geschwenkt. Am Schluss der Inkubation wurde die Zellsuspension für insgesamt 2 min dem Magnetfeld ausgesetzt, das von einem, ein einzelnes Röhrchen aufnehmenden Magnetgestell erzeugt wurde. Am Schluss der magnetischen Trennung wurden die nicht gebundnen Zellen extrahiert, indem die gesamte klare Flüssigkeit aus dem Zentrum des Röhrchens mit einer Pasteur-Pipette abgezogen wurde.
Für die T- oder B-Zellen (T11, T3, T8, B1, B4) wurden die nach der Verarmung gesammelten Zellsuspensionen direkt mit den Originalzellsuspensionen vor der Verarmung der Teilchen verglichen. Die ursprünglichen und die verarmten Proben wurden 5 min mit 1200 Upm zentrifugiert und der Überstand abdekantiert, wobei etwa 100 ul 1 · PBS in jedem Röhrchen zurückblieben. Von jedem Paar der Verarmungsröhrchen wurde ein Röhrchen mit 10 ul CYTO-STAT® MsIgG1-RD1/-MsIgG1-FITC- Prüfreagenz (MS) und das andere Röhrchen mit 10 ul CYTO-STAT® T11-RD/B4- FITC-Reagenz (für T11-, T3-, B1- oder B4-Aufschlüsse) oder mit 10 ul T4-RD1/T8- FITC-Reagenz (für T4- oder T8-Aufschlüsse) bei Raumtemperatur 10 min lang angefärbt. Am Ende der Inkubation wurde zu jeder Probe 500 ul PBS zugegeben und die Proben mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Proben wurden auf dem EPICS® Profile unter Verwendung des MBead 2-Farbenprogramms analysiert. (EPICS® und CYTO-STAT® sind eingetragene Warenzeichen der Coulter Corporation). Während die mit MS-Prüfreagenz angefärbte Probe laufen gelassen wurde, wurde überprüft, ob die Lymphozytenpopulation vollständig in der Bilddatei 1 enthalten war, und wenn erforderlich, nachgeregelt. Die linke Seite des Diskriminators 2 wurde für jedes Fluoreszenzhistogramm auf dem Kanal so eingestellt, dass eine positive Färbung von < 1% resulltieren würde. Dies erfolgte für jede mit dem MS- Prüfreagenz angefärbte Probe, wobei das entsprechend angefärbte Röhrchen anschließend mit den spezifischen Antikörper analysiert wurde. Die Daten wurden gesammelt und als Absolutzahl positiv angefärbter Zellen im roten und grünen Histogramm (T und B oder T4 und T8) registriert, und nicht in Prozent positiv. Die Prüfergebnisse sind nachstehend zusammengefasst.

Bezugsbeispiel 2.

Protokoll über die Verarmung magnetischer Beads roter Blutzellen (RBC).

100 ul Na&sub4;EDTA-antikoaguliertes Vollblut wurde in eine Reihe von Reagenzgläsern eingefüllt. Jedem Reagenzglas wurden 25 bis 150 ul einer KC-16-Suspension konjugierter magnetischer Teilchen (2,5% Gew./Vol.) zugesetzt und das Gesamtvolumen mit PBS auf 250 ul eingestellt. Die Suspension wurde 3-5 min in einer Mehrfachschüttelmaschine oder in einem Einzelröhrchenschüttler bei niedriger Mischgeschwindigkeit geschwenkt. Nachdem das Mischen beendet war, wurde jedem Probenröhrchen 1 ml PBS zugesetzt und dieses dann 2-5 min in ein Magnetgestell gestellt. Der gesamte Überstand wurde mit einer Pasteur-Pipette entfernt und in etikettierten Röhrchen aufbewahrt. Die Proben wurden auf einem Coulter S-plus® IV oder einem ähnlichen rbc-Zähler als rbc-Gesamtzahl/ml Vollblut analysiert. Bei der positiven Prüfung sollten 100 ul Vollblut plus 1,150 ml 1X P > BS eine 100% rbc-Anzahl und bei der negativen Prüfung 100 ul Vollblut plus 1,150 ml Ansatzlysat oder ein ähnliches, Lysemittel, einen Zahlenwert von 0% ergeben. Die Prozentzahl an aufgeschossenen rbc = 100% [(rbc Anzahl im Probenröhrchen)/(100% rbc Anzahl)].

Bezugsbeispiel 3. Protokoll über den Verarmung magnetischer Beads von Leukozyten.

100 ml Na&sub4;EDTA-antikoaguliertes Vollblut wurden gesammelt, auf eine Reihe von Zentrifugenröhrchen verteilt und 10 min bei 500 G zentrifugiert. Der Hauptanteil des Plasmas wurde entfernt und die lederfarbene Zellschicht aus jedem Röhrchen entfernt, vereinigt, und nochmals 10 min bei 500 G zentrifugiert. Die Zellen und das Plasma machen das Leuko-reiche Vollblut aus, das eine rbc-Zahl von nicht mehr als 8,0 · 10&sup9;/ml und 2-4 · 10&sup7;/ml weiße Blutzellen (wbc) aufweisen sollte.
100 ul Leuko-reiches Vollblut wurde in eine Anzahl Röhrchen pipettiert. In jedes Röhrchen wurde eine Menge von 10 bis 160 ul einer Suspension magnetischer Beads (2,5% Gew./Vol.) einpipettiert und anschließend 200 ul 1X PBS zugegeben. (Merke! Die Niedrigtiterstufen mit 10 bis 40 ul Beads sollten zuerst gefahren werden. Zusätzliche Beads werden nur zugegeben, wenn mit 40 ul keine vollständige Verarmung erhalten wird). Jedes Röhrchen wurde 3-5 min bei geringer Geschwindigkeit geschwenkt. Dann wurden 2 ml 1X PBS zugegeben, der Inhalt des Röhrchens gemischt und anschließend 2 min magnetisch getrennt. Die gesamte überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und in ein zweiten Röhrchen gefüllt, das dann 5 min bei 400 G zentrifugiert wurde. Der resultiernde Überstand wurde dann mit einer Pipette sorgfältig entfernt und analysiert.
Die Leuko-reichen oder die Leuko-armen Vollblutproben wurden durch Zugabe von 10 ul einer ein- oder zweifarbigen Antikörperpräparation analysiert, die auf die Unterscheidung aufgeschlossener spezifischer Zellen aus einem Gemisch von Zellen ausgelegt war. Wurden zum Beispiel T11-konjugierte magnetische Beads bei der Verarmung verwendet, wurde die T11-B4-Doppelfarbe verwendet, um zwischen der tatsächlichen Verarmung der T11-Zellen und der nicht spezifischen Verarmung von T11-Zellen (d. h. B-Zellen) zu unterscheiden. Das Gemisch wurde geschwenkt und 10 min bei Raumtempertur im Dunkeln inkubiert. Die Kontrollproben bestanden in isotypen Kontrollen und Antikörperkontrollen mit nicht aufgeschlossenen Zellen. Die Röhrchen wurden dann auf einem Coulter EPICS® Q-prep oder einem ähnlichen Gerät befestigt und nach dem 35 s Lyse-Verfahren untersucht. Nachdem die rbcs aufgelöst und die Proben befestigt waren (Q-prep), wurden alle Proben auf einem Coulter EPICS® Profile Durchflusszytometer oder einem ähnlichem Gerät analysiert. Dieses Vorgehen ist erforderlich, um Werte in Form der tatsächlichen Anzahl von Zellen pro Probevolumen zu erhalten. Es wurden Programme, erhältlich bei Profile, verwendet, um Lymphozyten und Knochenmarkzell-Monozyten- Populationen zu analysieren.
ul: 4,5 · 10&sup6; wbc, 1 · 10&sup7; rbc und 4,3 · 10&sup7; Blutplättchen; und 80 ul: 4,5 · 10&sup6; wbc, 1 · 10&sup7; rbc und 4,3 · 10&sup7; Blutplättchen. Die Ergebnisse zeigen, daß 40 ul von 2,5% festen Beads, die 1,85 · 10¹&sup0; Teilchen enthielten, 4,3 · 10&sup8; rbc entfernten, was ein Teilchen/rbc-Verhältnis von 43 ergibt.
4. Bei einem Knochenmarkzelltest ergab die nicht verarmte Kontrollprobe eine Zahl von 73821 Lymphozyten, 13426 Monozyten und 55661 Granulozyten. Die Verarmungsuntersuchungen wurden unter Verwendung von 10, 20, 30 und 40 ul 2,5% Gew./Vol. festen magnetischen Beads durchgeführt, die mit KC-48-Antikörper konjugiert waren. Die Ergebnisse lieferten für jeweils 10 ul Zahlenwerte von: 70330, 9309 und 340; für 20 ul von 68414, 2006 und 1332; für 30 ul von 62966, 1597 und 922; und für 40 ul von 59340, 1546 und 899.
Eine ähnliche Verarmungsuntersuchung wurde unter Verwendung von 10, 20, 30 und 40 ul 2,5% Gew./Vol. festen magnetischen Beads durchgeführt, die mit 1D3- Antikörper konjugiert waren. Die Ergebnisse lieferten für jeweils 10 ul Zahlenwerte von 76405, 13839 und 1597; für 20 ul von 73198, 8653 und 1216; für 30 ul: von 65667, 2590 und 2130; f+ür 40 ul von 66276, 1906 und 1686.
Eine weitere Verarmungsuntersuchung wurde unter Verwendung von 10, 20, 30 und 40 ul 2,5% festen magnetischen Beads durchgeführt, die mit MO2-Antikörper konjugiert waren. Die Ergebnisse lieferten für jeweils 10 ul Zahlenwerte von 72563, 3107 und 56520; für 20 ul von 72905, 3616 und 34533; für 30 ul von 69644, 1618 und 32313; und für 40 ul von 69477, 1210 und 30899.
5. Bei einem Erythrozyten/Blutplättchen-Versuch enthielt die nicht verarmte Kontrollprobe 7 · 10&sup6; wbc, 4,9 · 10¹&sup0; rbc und 3,0 · 10&sup7; Blutplättchen. Die Verarmungsuntersuchungen wurden mit 20, 40, 60 und 80 ul 2,5% festen magnetischen Beads durchgeführt, die mit PLT-1-Antikörper konjugiert waren. Die Ergebnisse nach der Verarmung waren für 20 ul: 10 · 10&sup6; wbc, 5,4 · 10¹&sup0; rbc und 1 · 10&sup6; Blutplättchen; 40 ul: 10 · 10&sup6; wbc, 5,8 · 10¹&sup0; rbc und 1 · 10&sup6; Blutplättchen; 60 ul: 7 · 10&sup6; wbc, 5,1 · 10¹&sup0; rbc und 1 · 10&sup6; Blutplättchen; und 80 ul: 10 · 10&sup6; wbc, 5,6 · 10¹&sup0; rbc und 0 Blutplättchen.

II. HERSTELLUNG MAGNETISCHER TEILCHEN MIT EINER ERSTEN SCHICHT AUS GELATINE UND EINER ZWEITEN SCHICHT AUS AMINODEXTRAN

Herstellung von Aminodextranen.

Verfahren A: Herstellung von Aminodextran im Kleinmaßstab.

Aminodextran wurde durch teilweise Spaltung und Oxidation des Glucopyranoserings im Dextran zu aldehydfunktionellen Gruppen, Kopplung der Aldehydgruppen mit 1,3-Diaminopropan unter Bildung von Schiff'scher Base-Bindungen und Reduktion der Schiff'schen Base-Bindungen unter Bildung stabiler Kohlenstoff-Stickstoff- Bindungen hergestellt. Bei einem typischen Verfahren werden 20 g Dextran in 150 ml eines 50 mmol Kaliumacetatpuffers, pH 6,5, gelöst. Dem Dextran wird eine Lösung von 2,14 g Kaliumperiodat während etwa 10 min unter heftigem magnetischen Rühren zugegeben. Die resultierende Lösung wurde etwa 1,5 h bei Raumtemperatur, 15-27ºC, gerührt und dann gegen destilliertes Wasser dialysiert. 20 ml 1,3- Diaminopropan wurden mit 20 ml destilliertem Wasser gemischt, in einem Eisbad gekühlt, intensiv gerührt und der pH-Wert während etwa 15 min durch Zugabe von Eisessig auf etwa 11,5 bis etwa 8,7 eingestellt. Typischerweise wurden etwa 15-20 ml Eisessig verwendet. Die dialysierte Dextranlösung wurde während etwa 15-20 min zu der abgekühlten Diaminlösung tropfenweise zugegeben. Nach Abschluss der Zugabe wurde die resultierende Lösung etwa 2,25 h bei Raumtemperatur gerührt. Dem Dextranreaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur im Verlauf von etwa 15 min eine reduzierende Lösung aus 0,8 g Natriumborhydrid in 10 ml 0,1-mmol Natriumhydroxid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde während der Zugabe des Borhydrids gerührt, um den meisten Schaum auszutreiben. Die rohe Aminodextranlösung wurde gegen destilliertes Wasser erschöpfend dialysiert, bis die Leitfähigkeit des Ausflusses 3-4 uOhm/cm betrug. Die dialysierte Lösung wurde anschließend durch ein 0,2 um Filter filtriert und während 24 h in einem Dora-Dry® Mikroprozessor-gesteuerten Gefriertrockner, Modell TDS.00030-A, (FTS Systems, Inc.) gefriergetrocknet, um 4,25 g flockige, hellgelbe Kristalle in 21% Ausbeute zu liefern.

Verfahren B: Herstellung von Aminodextran im Großmaßstab.

Die Verfahrensweise von Verfahren A wurde für die Herstellung von Aminodextran im Großmaßstab und für die Erhöhung der in das Aminodextran eingeführten Aminogruppen modifiziert. Die Hohlfasermembranfiltration ersetzte die Dialyse und es wurde ein kleineres Diamin/Periodat-Verhältnis verwendet, um eine weitergehende Spaltung des Zuckerpolymers in niedermolekulare Bruchstücke zu verhindern. Eine Hohlfaserkartusche (Polysulfon, 3 ft³ Membranoberfläche, 1 mm Faserdurchmesser und 5000 MG Molekulargewichtstrenngrenze) wurde senkrecht auf eine Schlauchpumpe (zwei Pumpenköpfe, maximaler Durchfluss etwa 4,56 l/min mit einer Schlauchleitung aus Norprene® Nr. 18 in Nahrungsmittelqualität) montiert und lieferte 15-20 psi, die 5-10 psi in der Rücklaufleitung entsprechen. Das Filtrat wurde nach jeweils 50-100 ml/min gesammelt. Das Waschen erfolgte unter Verwendung von 20-30 l destilliertem Wasser während etwa 6-8 h. Die spezifische Leitfähigkeit wurde auf etwa 3-4 uOhm·cm&supmin;¹ herabgesetzt und der pH-Wert betrug etwa 6,0-6,5. Bei der Entsalzung wurde ein Aufgabevolumen von 2 l aufrechterhalten und dann bei der ersten Wäsche des oxidierten Dextrans auf 800 ml und bei der zweiten Wäsche des Aminodextrans auf 400 ml konzentriert.
Bei einer Standardherstellung im größeren Maßstab wurden 80 g Dextran in einen 1 l ("quart") Mischbecher aus Glas gegeben, der 600 ml destilliertes Wasser enthielt. Der Feststoff wurde etwa 2-5 min bei mittlerer Geschwindigkeit gemischt, um das gesamte Dextran zu lösen. 8,56 g Nariumperiodat wurden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und die resultierende Lösung während etwa 10 min unter heftigen Rühren mit einem Magnetrührer der Dextranlösung tropfenweise zugesetzt.
Nach Abschluss der Zugabe wurde das resultierende Gemisch weitere 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Das resultierende viskose Reaktionsgemisch wurde mit destilliertem Wasser auf 2 l verdünnt und unter Verwendung einer Hohlfaserkartusche entsalzt. Die anfängliche spezifische Leitfähigkeit betrug 1,5 mOhm·cm&supmin;¹ oder mehr und der anfängliche pH-Wert betrug 4,0. Es wurden etwa 18-20 l destilliertes Wasser verwendet, um eine Lösung mit einem pH-Endwert von 6,0-6,5 zu erhalten.
Das Endvolumen der gewaschenen, oxidierten Dextranlösung betrug 800 ml. Zu der gewaschenen, oxidierten Dextranlösung wurde bei Raumtemperatur während etwa 10 min 80 ml farbloses, flüssiges 1,3-Diaminopropan langsam zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde anschließend weitere 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Rühren beendet war, wurden 3,2 g Natriumborhydrid, das in 40 ml 1 mmol wässrigem Nariumhydroxid gelöst war, zu dem bei Raumtemperatur befindlichen Aminodextrangemisch während etwa 5 min unter Rühren mit einem Magnetrührer zugegeben. Nach beendeter Zugabe des Natriumborhydrids wurde das resultierende Gemisch noch 1 h gerührt und dann unter Verwendung einer Hohlfaserkartusche entsalzt. Die anfängliche spezifische Leitfähigkeit betrug 5,0 mOhm·cm&supmin;¹ oder mehr und der anfängliche pH-Wert betrug etwa 12,0. Es wurden etwa 20-25 l destilliertes Wasser benötigt, um die spezifische Leitfähigkeit auf etwa 3-4 u Ohm·cm&supmin;¹ und den pH-Wert auf 6,0-6,5 herabzusetzen. Das Endvolumen der Aminodextranlösung betrug 400 ml. Diese Lösung wurde durch ein steriles 0,2 um Celluloseacetatfilter filtriert und anschließend während 48 h gefriergetrocknet, um 48 g flockige, blassgelbe Kristalle in 52% Ausbeute zu erhalten.
Die Elementaranalyse (C, H, N) wurde für zwei nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren aus Dextran T-2M hergestellten Proben erhalten. Die Analysenwerte sind:
Probe 1. 20 g Dextran Maßstab, entsalzt durch Dialyse.
Beobachtet: C: 43.04; H, 6,60; N, 1,09, O (aus Differenz), 49,27.
Probe 2. 80 g Dextran Maßstrab, entsalzt durch Membranfiltration.
Beobachtet: C, 42,53; H, 6,52; N, 1.01; O (aus Differenz), 49,94.
Berechnet für C&sub4;&sub6;H&sub7;&sub9;NO&sub3;&sub7;·3 H&sub2;O: C, 42,76; H, 6,63; N, 1.08; O, 49,53.
Die Aminodextrananalysen waren für beide Herstellungen sehr ähnlich, was zeigt, dass das gleiche Produkt erhalten wurde, unabhängig davon, ob die Entsalzung durch Dialyse oder Membranfiltration erfolgte. Die für die Probe 1 erhaltene empirische Formel C&sub4;&sub6;H&sub4;&sub8;NO&sub4;&sub0;, ist der Formel C&sub4;&sub6;H&sub7;&sub9;NO&sub3;&sub7;·3 H&sub2;O sehr ähnlich, die auf 29 Glucoseeinheiten (C&sub6;H&sub1;&sub0;O&sub5;), 1 Einheit aus einem vollständig Diamin substituierten Zuckerring (C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub8;N&sub4;O&sub3;) und 12 Einheiten Wasser beruht. Der Grad der Diaminsubstitution in Dextran war daher 1/30 in der Probe 1, im Gegensatz zum theoretischen Wert von 1/12, der auf einer 100% Periodatspaltung und Diaminsubstitution beruht. Die für die Probe 2 erhaltene empirische Formel, C&sub4;&sub9;H&sub9;&sub0;NO&sub4;&sub3; ähnelt sehr stark der Formel C&sub4;&sub9;H&sub8;&sub4;NO&sub4;&sub0;·3 H&sub2;O, die auf 31 Einheiten Glucose, 1 Einheit eines vollständig mit Diamin substituierten Zuckerrings und 12 Einheiten Wasser beruht. Der Substitutionsgrad durch Diamin im Dextran betrug 1/32 für die Probe 2.
Bei der Herstellung von Aminodextran beschichteten Teilchen wurden bei Verwendung von Aminodextranen mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 10000, 40000 und 2000000 (T-10, T-40 und T-2M) mit 1X (1X = 3,3% Ersatz der Zuckerreste), 2X (6,6%), 3X (9,9%) und 5X (16,5) an molaren Mengen von Aminogruppen, ähnliche Ergebnisse erhalten. Alle Aminodextrane wurden anfänglich nach den Verfahren A und B hergestellt, wobei die 2fachen und 3fachen Mengen Periodat verwendet wurden, die bei der 1X Oxidation von Dextran verwendet wurde. Die für die Bildung der Schiff'schen Base verwendete Menge 1,3-Diaminopropan wurde konstant gehalten.
Es erfolgten Modifizierungen der Verfahren A und B zur Herstellung von Aminodextranen, die erstmals in der Serien Nr. 07/827,347 offen gelegt worden sind. Diese Modifizierungen beinhalten die Oxidation und Spaltung des Dextranglucoserings mit dem Periodatanion, die Diaminaddition und die Reduktion der Schiff'schen Base mit Natriumborhydrid. Die Modifizierungen führten zu einer erhöhten Ausbeute an Aminodextranen, insbesondere an 5X-Aminodextran. Im Allgemeinen bestand die erste Modifizierung darin, nur einen zehn Prozent (10%) Diaminüberschuss über das stöchiometrische 2 : 1 Diamin/Periodat-Molverhältnis zu verwenden, wie vorstehend offen gelegt. Zweitens wurde die Diaminadditionsreaktion bei einer Temperatur im Bereich von 5-10ºC durchgeführt. Drittens wurde die Diaminadditionsreaktion spektroskopisch im nahen Ultraviolett (UV)-Bereich bezüglich der Bildung der Schiff' schen Base überwacht. Die Bildung der Schiff'-schen Base wurde als abgeschlossen betrachtet, wenn die mitlaufenden Spektralanalysen zeigten, dass ein Plateau erreicht war. Die Reaktion wurde anschließend abgebrochen. Diese Modifizierungen setzten die Aminolyse der polymeren Zuckergruppen in leichtere Bruchstücke herab und lieferten so nach der Reinigung und Konzentrierung bei der Filtration mit Hohlfasermembranen eine höhere Produktausbeute. Die Hohlfaserfiltration erfolgte unter Verwendung einer Polysulfonkartusche mit 3 ft² Membranoberfläche, 1 mm Faserdurchmesser und einer Molekulargewichtstrenngrenze von 5000. Die Kartusche wurde senkrecht auf eine Schlauchpumpe mit zwei Pumpenköpfe montiert, die beim max. Durchfluss von etwa 4,56 I/min bei Verwendung einer Schlauchleitung aus Norprene® Nr. 18 in Nahrungsmittelqualität, 15-20 psi lieferte. Bei dieser Anordnung betrug der Druck in der Rücklaufleitung etwa 5-10 psi. Das Filtrat wurde alle 50-100 ml/min gesammelt. Das Waschen erfolgte unter Verwendung von 20-30 l destilliertem Wasser während etwa 6-8 h. Das folgende Verfahren zur Herstellung von 5X- Aminodextran soll die modifizierte Arbeitsweise veranschaulichen, die auf die Herstellung aller Aminodextrane anwendbar ist.

Verfahren C: Herstellung von 5X-Aminodextran.

T-2M-Dextran (50 g, 0,308 mol, erhalten von Sigma oder Pharmacia) wurde in einen 1 quart oder 1 Liter Mischbecher aus Glas gegeben, der 300 ml destilliertes Wasser enthielt. Das Gemisch wurde mit maximaler Geschwindigkeit gemischt, bis das gesamte Dextran gelöst war, typischerweise während etwa 3 bis 5 min. Der Dextranlösung wurde während etwa 10 min unter heftigem Rühren mit einem Magnetrührer eine Lösung aus 26,75 g (0,125 mol) NaIO&sub4; in 300 ml destilliertem Wasser zugesetzt. Nach beendeter Periodatzugabe wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur weitere 3 h gemischt. Nach Ablauf der 3 h wies das 600 ml betragende Reaktionsvolumen eine anfängliche spezifische Leitfähigkeit von 9,7 mOhm·cm&supmin;¹ und einem Anfangs-pH-Wert von 2,5 auf. Das Reaktionsgemisch wurde mit 2 l destilliertem Wasser verdünnt und unter Verwendung einer Hohlfaserkartusche entsalzt. Das Waschen erfolgte mit 15 bis 18 l destilliertem Wasser und lieferte 600 ml gewaschene, oxidierte Dextranlösung mit einer spezifischen Leitfähigkeit von 10 mOhm·cm&supmin;¹ und einem pH-Wert von 6,7
Die oxidierte Dextranlösung wurde in einem Eisbad auf etwa 8ºC abgekühlt und der oxidierten Dextranlösung während etwa 10 min 23,2 ml (0,275 mol) 1,3- Diaminopropan zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde gerührt und die Eisbadtemperatur aufrechterhalten. Die Bildung der gelben Schiff'schen Base wurde an einer extrahierten Probe alle 10-15 min durch Messung der Absorption im nahen UV bei 335 nm überwacht. Bei einem typischen Versuch ergaben die Messungen bei 335 nm bei Verwendung einer Schichtdicke der Zelle von 1 mm: Tabelle 1
Nachdem die Absorption bzw. Extinktion ein Plateau erreicht hatte, wurde dem Reaktionsgemisch während etwa 10 min bei Raumtemperatur unter Rühren mit einem Magnetrührer 19,3 g (0,500 mol) Natriumborhydrid in 19,3 ml 1 mmol wässrigem Kaliumhydroxid zugesetzt. Nach beendeter Zugabe des Nariumborhydrids wurde das Reaktionsgemisch noch etwa 2 h bei Raumtemperatur weitergerührt. Nach beendetem Rühren lieferte die spektroskopische Messung bei 335 nm unter Verwendung einer Zelle mit einer Schichtdicke von 1 cm einen Extinktionswert von 0,067 Einheiten, der anzeigt, dass die Schiff'sche Base im Wesentlichen verschwunden war. Das Reaktionsgemisch mit einem Volumen von etwa 1000 ml wurde anschließend unter Verwendung einer Hohlfaserkartusche entsalzt. Die spezifische Anfangsleitfähigkeit betrug 43 mOhm·cm&supmin;¹ und der Anfangs-pH-Wert 11,0. Es wurden etwa 18 bis 20 l destilliertes Wasser als Waschflüssigkeit verwendet, um etwa 300 ml 5X-Aminodextralösung mit einer spezifischen Leitfähigkeit von etwa 4 bis 6 u Ohm·cm&supmin;¹ und einen pH-Wert von 6,5 bis 7,0 zu liefern. Die 5X-Aminodextranlösung wurde durch ein 0,2 um Cellulosenitratfilter filtriert und während 48 h in einem Dora- Dry® Mikroprocessor-gesteuerten Gefriertrockner, Modell TDS.00030-A, (FTS Systems, Inc.) gefriergetrocknet, um 24 g (48% Ausbeute) flockige, blassgelbe Kristalle zu liefern. Elementaranalyse: C = 45,83%, H = 7,00%, N = 4,49%, 0 (durch Differenz) = 42,68%. Berechnete Analyse für C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub2;O8,25N: C = 46,15%, N = 4,48%, O = 42,26%.
Die auf der tatsächlichen Analyse beruhende empirische Formel C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub2;O8,3N ist der Formel C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub2;O8,25N sehr ähnlich, die auf 6 Einheiten Glucose pro einer Einheit vollständig Diamin-substituiertem Zukerring (C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub8;N&sub4;O&sub3;) beruht. Danach war der Diaminsubstitutionsgrad im Dextran 1/7, im Gegensatz zum theoretischen Wert von 1/2,5, der auf 100% Periodatspaltung und Diaminsubstitution beruht. Wiederholungsversuche im 100 g und 300 g Dextranmaßstab lieferten ein Produkt mit dem gleichen Substitutionsgrad.

Herstellung von Magnetit- und anderen Magnetteilchen in Gelatinelösung.

Metallferrite (MFe&sub2;O&sub4;, worin M = Fe²&spplus;, Mn²&spplus;, Zn²&spplus;, Co²&spplus;, Ni²&spplus; und Ba²&spplus;) einschließlich Magnetit, können in situ mit Typ B Gelatine hergestellt werden, wie vorstehend beschrieben. Um die Erfindung noch weiter zu veranschaulichen, wurde Manganferrit wie folgt hergestellt.
62,5 mmol (62,5 ml) 1-m Fe&sub2;SO&sub4;-Lösung, 100 mmol (50 ml) 2-m KNO&sub3;-Lösung, 31,25 mmol (31,25 ml) 1-m MnSO&sub4;-Lösung und 72,92 ml destilliertes Wasser wurden miteinander in einem Pyrex® Kolben gemischt und 10 min mit N&sub2;-Gas gespült (Lösung A). Zur Lösung A wurden dann 166,6 mmol (33,33 ml) 5-m KOH zugegeben, mit N&sub2;-Gas gespült und während etwa 5-15 min bei Raumtemperatur (18-27ºC) beschallt, um eine homogene, dunkelgrüne Dispersion aus Fe(OH)&sub2; zu liefern. Nach der Schallbehandlung wurden dem Fe(OH)&sub2;-Gel 250 ml einer 2% Lösung von alkalisch aufgeschlossener, Typ B, 225-Bloom, Rinderhautgelatine zugegeben, gemischt, mit N&sub2;-Gas gespült, dicht verschlossen, etwa 5 bis 10 min beschallt und etwa 24 h ungestört in einen 90ºC Ofen aufbewahrt. Nach dem Erhitzen im Ofen wurde der Pyrex® Kolben samt Inhalt aus dem Ofen entnommen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Nach beendeter Abkühlung wurde die Suspension brauner Teilchen im Kolben gemischt und in zwei 250 ml Gewebekulturflaschen dekantiert. Die Fraktion in jedem Kolben wurde etwa 5-mal mit 1% Gew./Vol. Typ B Gelatine oder 1% Aminodextranlösung gewaschen. Nach dem Waschen wurden die magnetischen Teilchen wieder vereinigt, in ausreichend 1% 1X-Aminodextranlösung suspendiert, so dass das Gesamtvolumen 500 ml betrug, und etwa 0,5 h beschallt. Die Teilchen wurden bei Kühltemperaturen von etwa 5-10ºC während einer Zeitspanne von 8 h bis zu mindestens 6 Monaten aufbewahrt. Die Lagerung erfolgte in Form von Suspensionen mit einem Feststoffgehalt von 2,5% Gew./Vol. in 1X- Aminodextranlösung, die 0,1% Gew./Vol. Natriumazid enthielt. Die Teilchen können alternativ sofort nach ihrer Herstellung in Typ B Gelatine und Waschen mit 1X- Aminodextran verwendet werden.

Herstellung von 5X-Aminodextran beschichteten Magnetteilchen.

Verfahren 1: Eine abgemessene Menge nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellter, gelagerter Manganferrit-Teilchen mit einheitlicher Größe von 0,3 um und sphärischer Gestalt wurde mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen, bei 105ºC getrocknet und das Gew./Vol.-Feststoffverhältnis in der Suspension bestimmt. Eine Probe, deren Analyse eine Gew./Vol.-Feststoffverhältnis von 0,56% ergab, wurde hier verwendet.
100 ml der mit Gelatine hergestellten, in Aminodextran gelagerten Manganferrit- Teilchen mit 0,56% Gew.-/Vol. Feststoff wurden magnetisch getrennt und mit dem gleichen Volumen 2% Gew./Vol. 5X-Aminodextranlösung resuspendiert. Die 100 ml- Suspension aus braunen Teilchen wurde etwa 10 min beschallt und dann über Nacht (etwa 8-16 h) in einer Gewebekulturflasche auf einem Kreisschüttler gemischt. Nach beendetem Mischen wurde der pH-Wert mit etwa 20 ul 5-m wässrigem Kaliumhydroxid auf 10,0 eingestellt. Das adsorbierte 5X-Aminodextran wurde durch Zugabe von 1,173 ml 25% wässrigem Glutaraldehyd (3,11 mmol) zu der pH- eingestellten Teilchensuspension und Mischen der resultierenden Suspension während einer Zeitspanne im Bereich von 1 bis 4 h, vorzugsweise 1 h, unter Verwendung eines Kreisschüttlers vernetzt. Die vernetzten Teilchen wurden magnetisch getrennt, der Überstand gemessen und verworfen, und die Teilchen zur Blockierung und Stabilisierung der nicht-umgesetzten Aldehydgruppen in einem Volumen 1% 5X-Aminodextranlösung redispergiert, das dem verworfenen Überstand entsprach. Alternativ kann eine Polyaminlösung, wie eine Ethylendiamin- oder 1,3- Diaminopropanlösung verwendet werden, um die nicht-umgesetzten Aldehydgruppen zu blockieren. Die molare Polyaminmenge beträgt etwa das 10-Fache der verwendeten Glutaraldehydmenge. Die redispergierten Teilchen werden geschüttelt und beschallt, um sie zu dispergieren und die resultierende Suspension über Nacht in einem Kreisschüttler gemischt. Anschließend wurde der Suspension eine 23,5 ml Probe mit 10 mg/ml Natriumborhydrid (6,22 mmol NaBH&sub4;) in 1-mmol wässrigem Kaliumhydroxid zugesetzt und das resultierende Gemisch weitere 0,5 h auf dem Kreisschüttler gemischt. Die Teilchen wurden anschließend magnetisch getrennt und mehrmals (mindestens 3-mal) mit 1X PBS gewaschen und auf ein Volumen von 22,4 ml aufkonzentriert, um eine Suspension mit 2,5% Gew./Vol. Feststoff zu ergeben.
Verfahren 2: Eine 60,2 ml Probe mit 0,83% Gew./Vol. Feststoff in Form von Mangan-Ferrit-Teilchen, die in 1% Gew./Vol. 1X-Aminodextranlösung suspendiert sind, die 0,1% Natriumazid enthält, wurde magnetisch getrennt und mehrmals mit 20 ml Portionen 0,2-m wässrigem Natriumchlorid gewaschen. Nach dem Wachen wurden die Teilchen in 3,75 mg/ml 5X-Aminodextran in 0,2-m Natriumchloridlösung (etwa 20 ml) resuspendiert, um eine Suspension mit 2,5% Gew./Vol. Feststoff zu ergeben. Als Nächstes wurde der Suspension für jeden Milliliter 2,5% Gew./Vol. Feststoffsuspension, 9 ul 10 mg/ml EDAC·HCl in 0,2-m Nariumchloridlösung zugegeben (180 ul insgesamt). Das resultierende Gemisch wurde in einer 50 ml Gewebekulturflasche während einer Zeit im Bereich von 12 bis 16 h im Kreis geschüttelt. Die Teilchen wurden magnetisch getrennt, mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen und in 1X PBS resuspendiert, um 20 ml einer Suspension mit 2,5% Gew./Vol. Feststoff aus magnetischen Teilchen zu liefern, die eine Beschichtung besitzen, die durch eine Kondensationsreaktion zwischen Gelatine und Aminodextran gebildet wurde. Diese Kondensationsreaktion erfolgt zwischen den Aminogruppen des Aminodextrans und den in der Gelatine vorhandenen Carboxylgruppen. EDAC entfernt das bei der Kondensationsreaktion gebildete Wasser als Harnstoff. Die Verwendung von Vernetzungsmitteln, wie Glutaraldehyd ist nicht erforderlich. Die resultierenden Teilchen werden als zu Teilchen gleichwertig angesehen, die eine erste Schicht aus Gelatine, eine zweite Schicht aus Aminodextran aufweisen und die durch ein chemisches Vernetzungsmittel vernetzt sind.

Bestimmung der Schichtdicke von vernetzter Gelatine und 5X-Aminodextran A. Dicke der Gelatine.

Eine Glutaraldehydlösung wurde als Vernetzer durch Mischen von 56 ul 25% wässrigem Glutaraldehyd mit 5 ml 1-mmol wässrigem Kaliumhydroxid bereitet. Die Teilchen aus 5 ml einer 2,5% Gew./Vol. Feststoffsuspension von Manganferrit-Teilchen, hergestellt in Typ B Gelatine, wie beschrieben, und in 2% Gew./Vol., Typ A, 175- Bloom Gelatine in 0,1-m Phosphatpufferlösung, pH 8,4, suspendiert, wurden magnetisch getrennt und der flüssige Überstand verworfen. Die abgetrennten Teilchen wurden in 5 ml der Glutaraldehydlösung resuspendiert und etwa 30 min. vorzugsweise rollend, gemischt. Die Teilchen wurden wiederum magnetisch abgetrennt und 3-mal mit 5 ml 1-mmol wässrigem Kaliumhydroxid gewaschen, ehe sie in 5 ml 1- mmol wässrigem Kaliumhydroxid redispergiert wurden.
Die Elementaranalyse erfolgte mit 5 ml vernetzten, mit Gelatine beschichteten Manganferrit-Teilchen, die 15-mal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 110ºC bis zur Gewichtskonstanz getrocknet worden waren. Die Analyse ergab: Mn = 19,05%; Fe = 49, 49%; C = 0,54%, H < 0,5%, N < 0,5% und O (aus Differenz) = 30,92%. Die Gewichtsprozent Kohlenstoff in der Gelatine können aus ihrem Aminosäuregehalt erhalten werden (The Theory of the Photographic Process, 4. Ausg., T. H. James et al. (Macmillan, New York, 1976), Kapitel 2, Seite 52. Die hier verwendete Typ A Gelatine ergibt: C = 50,46%, H = 6,765%, N = 18,27%, O = 24,29% und S = 0,21%. Mit dieser Information kann die Dicke der Gelatineschicht berechnet werden.
Bei Verwendung von 1 g Gelatine-beschichteter Ferritteilchen liegt 1 g · 0,0054/0,5406 = 0,01070 g Gelatine und 0,9893 g Ferrit vor. Das Teilchenvolumen eines kugelförmigen Manganferrit-Teilchens mit einem Durchmesser von 0,29 um beträgt 1,277 · 10&supmin;¹&sup4; cm³ und die Zahl der Manganferrit-Teilchen in 0,9893 g Manganferrit beträgt 1,827 · 10¹³. Folglich beträgt die Gelatinemasse pro Ferritteilchen 5,856 · 10&supmin;¹&sup6; g.
Nimmt man die Dichte der Gelatinebeschichtung, ausgehend von 2% Gew./Vol. vor der Vernetzung mit Glutaraldehyd, zu 0,03 g/cm³ an, beträgt das Gelatinevolumen pro Teilchen 2,92 · 10&supmin;¹&sup4; cm. Folglich beträgt das Gesamtvolumen Gelatine plus Ferrit pro Teilchen 4,205 · 10&supmin;¹&sup4; cm³ und der Radius eines kugelförmigen Gelatine- Ferrit-Teilchens 2,157 · 10&supmin;&sup5; cm (0,2157 um). Die Dicke der Gelatinebeschichtung auf dem Manganferrit-Kügelchens beträgt demzufolge 0,2157 um - 0,145 um (der mittlere Radius des Ferritkügelchens) = 0,0707 um (71 nm). Dies stimmt gut mit den von A. T. Kudish et al., Proteins at Interfaces, ACS Symposium Series 343, J. O. Brash et al. eds. (American Chem. Soc., Washington, D. C., 1987), Seiten 261-277, angegebenen Werten von 750 Angstrom auf Glas; den von N. Kawanishi, et al., J. Phys. Chem. 94: 4611-4617 (1990) angegebenen 75 nm auf Glimmer und den von H. Metzer et al., J. Colloid Interface Sci. 126: 292-303 (1988) angegebenen 600-700 Angstrom auf Glas überein.
Die Dicke der Gelatineschicht wurde auf ähnliche Weise für die Manganferrit- Teilchen berechnet, bei denen die Gelatineschicht mit Polyvinylpyrrolidon (PVP) als Stabilisator vernetzt wurde. Die Elementaranalyse ergab: Mn = 18,84%, Fe = 47,82%, C = 1,67%, H < 0,5%, N < 0,5% und O (aus der Differenz) = 31,67%. Die Dicke der Gelatinebeschichtung wurde zu 148 nm berechnet. Es wird angenommen, dass die dickere Beschichtung bei Verwendung von PVP auf Verfahrensunterschieden beruht. Die dickere Beschichtung wurde erhalten, wenn die Ferrit- Gelatine-Lösung bei der ursprünglichen Verfahrensweise von 2% auf 0,08% herabgesetzt und 1% PVP zugesetzt wurde. Die dünnere Beschichtung wurde erhalten, wenn die Gelatine-Ferrit-Teilchen aus der 2% Gelatinelösung abgetrennt und im Vernetzungsmittel redispergiert wurden. Dies führte dazu, das kein überschüssiges Polymer vorlag, weder Gelatine, noch PVP.

B. Aminodextrandicke

Manganferrit-Teilchen wurden mit 5X-Aminodextran (Verfahren 1) beschichtet, die sogleich vernetzt, blockiert und stabilisiert wurden. Die resultierenden Teilchen wurden mehrmals mit dest. Wasser gewaschen, magnetisch getrennt und bei 110ºC getrocknet. Die Elementaranalyse ergab: Mn = 14,04%, Fe = 44,36%, C = 2,97% und O (aus der Differenz) = 38,63%. Für 5X-Aminodextran, analysiert unter der Annahme eines C-Gehaltes von 45,83% und einer 2% Gew./Vol. Aminodextranbeschichtung, beträgt die geschätzte Dicke der Aminodextranschicht 218 nm.

Aktivierung Diamin-behandelter Teichen mit sulfo-SMCC.

Die gleichen, für die Aktivierung von Gelatine beschichteten Teilchen mit sulfo- SMCC beschriebenen Verfahren, werden verwendet, um die mit 5X-Aminodextran beschichteten Teilchen zu aktivieren, außer dass zur Aktivierung die 5-fache Menge sulfo-SMCC verwendet wurde. Werden die magnetischen Teilchen mit 1X-, 2X- oder 3X-Aminodextran beschichtet, wird entsprechend die 1-, 2- oder 3-fache Menge sulfo-SMCC verwendet.

Antikörperaktivierung mit 2-Iminothiolanhydrochlorid.

Antikörper wurden nach den hier vorstehend beschriebenen Verfahren mit 2- Iminothiolan aktiviert. Besitzt der Antikörper oder eine andere Substanz, welche an die aktivierten Teilchen konjugiert werden soll, genügend reaktionsfähige Sulfhydrylgruppen, kann die Aktivierung mit 2-Iminothiolanhydrochlorid nicht erforderlich sein. Der Fachmann wird auch erkennen, dass die Aktivierung von Teilchen, damit sie Maleidimylgruppen enthalten, und die Aktivierung von Antikörpern oder anderen Substanzen gegeneinander ausgetauscht werden können. Das heißt, die Teilchen können durch Einführung reaktionsfähiger Sulfhydrylgruppen aktiviert und der Antikörper oder eine andere Substanz kann aktiviert werden, damit sie reaktionsfähige Maleimidylgruppen enthält.
Das folgende Beispiel soll die Anwendbarkeit der Erfindung veranschaulichen, die Erfindung jedoch nicht beschränken. Sofern nichtsanderes angegeben, wurde das Verfahren 1 verwendet, um Teilchen mit 5X-Aminodextran zu beschichten. In diesem Beispiel werden zwei Verfahren zur Auszählung Neutrophiler in einer Leukozyten-reichen (Leuko-reichen) Vollblutprobe beschrieben. Bei beiden Verfahren wurden beschichtete Beads, bei denen der monoklonale Antikörper 1D3 an 5X- Aminodextran konjugiert war und die Durchflusszytometrie verwendet.
Beim ersten Verfahren wurde eine Reihe 1D3 enthaltender magnetischer Beadtiter hergestellt, mit der Leuko-reichen Blutprobe gemischt und dann magnetisch aus der Probe abgetrennt. Die Überstände mit den verarmten Neutrophilen wurden anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert, um den Punkt zu bestimmen, an dem die Neutrophilenverarmung vollständig war. Die Proben wurden in Richtung vom niedrigsten zum höchsten Titer analysiert und die Verarmung an einen konstanten Zytometerwert erkannt.
Beim zweiten Verfahren wurden die Vollblutproben mit den gleichen Titern von 1D3- konjugierten magnetischen Beads gemischt, aber keine magnetische Trennung durchgeführt. Die Gemische wurden mittels Durchflusszytometire auf Neutrophile analysiert, die sich wegen der Änderung der Zellgröße, der Gestalt oder des Brechungsindex infolge der Anlagerung der magnetischen Beads an die neutrophilen Zelloberflächen aus dem normalen Granulozytenbereich im Front/Seiten (orthogonalen)-Streuhistogramm hinausbewegt haben. Hat die verlagerte Neutrophilenpopulation oder ihre Zahl einen Plateauwert erreicht, wurde ihr Wert im Lichtstreuhistogramm oder sein Fluoreszenzwert im Bereich der Bilddatei mit den entsprechenden Werten für alle weißen Blutzellen (Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten) verglichen, um die relative Neutrophilenzahl zu erhalten.
Die Verwendung wohldefinierter Ferritteilchen mit einheitlicher Größe, einheitlicher sphärischer Gestalt und einheitlichen Brechungsindexeigenschaften ist wesentlich, um eine erkennbare, genaue Streulichtverschiebung durch biologische Zellen zu erhalten, die an die Oberfläche von Teilchen konjugiert sind, wie die hier beschriebenen Teilchen. Zusätzlich zur Streuung elektrischer Dipole, die von den chemischen Substanzen herrührt, kann die Streuung magnetischer Dipole durch die Ferritteilchen einen wesentlichen Beitrag zur Streulichtintensität leisten, die von den Konjugaten der Zellteilchen ausgeht [J. A. Stratton, Electromagnetic Theory (McGraw Hill, New York 1941), Seite 437, und C. F. Bohren und G. R. Huffman, Adsorption and Scattering of Light by Smal Particles (Wiley, New York 1983), Seite 141]. J. J. Murry, Optics 4: 1011 (1965) hat eine Lichtstreuung mit kleinem Winkel durch magnetische Teilchen, wie Magnetit gemessen.
Der Durchmesser der Manganferrit-Teilchen, die hierbei verwendet wurden, betrug 0,29 ± 0,08 um. Dieser Durchmesser liegt außerhalb des mittleren Durchmesserbereichs von 0,65-3,0 um bei Polystyrollatex und magnetischen Latexteilchen, die bei der Internationalen Patentveröffentlichung WO 90/13013 mit dem Titel METHOD AND APPARATUS FOR SCREENING CELLS OR FORMED BODIES WITH POPULATIONS EXPRESSING SELECTED CHARACTERISTICS UTILIZING AT LEAST ONE SENSING PARAMETER und WO 92/09682 (an Coulter Corporation, dem Anmelder hier) mit dem Titel METHOD AND APPARATUS FOR SCREENING MICROSCOPIC CELLS USING LIGHT SCATTER TECHNIQUES, verwendet wurden. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Polystyrollatex-Teilchen hatten eine einheitliche Größe und Gestalt. Obwohl jedoch die magnetischen Latexteilchen, die durch Einbettung ferrofluider Teilchen wechselnder Größe und Gestalt in den Latex während der Emulsionspolymerisation (U.S. Patent Nr. 4,358,388 an Daniel et al.) gebildet worden waren, eine sphärische Gestalt aufwiesen, schwankte ihre Größe stark. Während zum Beispiel der mittlere Teilchendurchmesser 0,7 um betrug, variierten die einzelnen Teilchen von 0,2 um bis 1,0 um. (Ein zusätzliches Problem rührt von dem Umstand her, dass die Struktur der in den Polystyrollatex eingebetteten Teilchen nicht definierbar ist.) Die Teilchen mit kleinem Durchmesser waren sehr zahlreich, obwohl ihr Gewicht in Gewichtsprozent gemessen, gering war. Folgerichtig besetzen die mit Antikörper konjugierten kleineren Teilchen infolge ihrer größeren Beweglichkeit, verglichen mit der Beweglichkeit der größeren Teilchen, bevorzugt die antigenen Stellen der Zelloberfläche. Der Beitrag dieser kleinen Teilchen zur Verschiebung der Lichtstreuung von Zellen ist jedoch gering und die Verwendung dieser magnetischen Teilchen, um eine echte Auszählung oder einen Zahlenwert der anvisierten verschobenen Zellpopulation zu erhalten, ist unzuverlässig. Dies kann teilweise auf ein resultierendes niedriges magnetisches Dipolmoment zurückzuführen sein, wenn eine Summierung über viele magnetische Teilchen mit unterschiedlicher räumlicher Orientierung innerhalb der Latexteilchen erfolgt.
Zusätzlich zu ihrer einheitlichen Größe und einheitlichen sphärischen Gestalt unterscheidet sich der Brechungsindex dichter, mikrokristalliner Ferritteilchen, die wie hier beschrieben, gebildet und beschichtet sind, hinreichend vom Brechungsindex von Polystyrollatex und biologischen Zellen. Wird eine ausgewählte Zellmenge oder werden Untergruppen an diese magnetischen Teilchen gekoppelt, erfolgen große Verschiebungen im Front/Seiten-Streuhistogramm der konjugierten Zellen, im Vergleich zum Histogramm nicht-konjugierter Zellen. Demzufolge können an Teilchen konjugierte Zellen von nicht an Teilchen konjugierte unterschieden werden.

Beispiel 1: Auszählung von Neutrophilen

Probenherstellung

Eine 50 ml Probe Na&sub4;EDTA-antikoaguliertes Vollblut wurde auf eine Reihe von Zentrifugenröhrchen aufgeteilt und etwa 10 min bei 500 G zentrifugiert. Der Hauptanteil des Plasmas wurde entfernt und die lederfarbene Zellschicht aus jedem Gläschen entfernt, vereinigt und nochmals etwa 10 min bei 500 G zentrifugiert. Insgesamt machen die lederfarbenen Zellen und das Plasma das Leuko-reiche Vollblut aus, das einen Gehalt an roten Blutzellen (rbc) von nicht größer als 8,0 · 10&sup8;/ml und einen Gehalt an weißen Blutzellen (WBC) zwischen 2-4 · 10&sup7;/ml haben sollte. 100 ul der Leuko-reichen, lederfarbenen Zellen wurden in eine Reihe von Reagenzgläser pipettiert. Abgemessene Mengen von 5 bis 250 ul mit 2,5% Gew./Vol. suspendiertem Feststoff in Form von mit 1D3-konjugierten, mit 5X-Aminodextran beschichteten Manganferrit-Teilchen, wie hier beschrieben, wurden in getrennte Reagenzgläser pipettiert. Die Titer der Ferritteilchensuspension waren typischerweise 0, 5, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200 und 250 ul. Das Volumen eines jeden Röhrchens wurde dann durch Zugabe von 1X PBS auf 350 ul aufgefüllt. Jedes Röhrchen wurde 6 min bei niedriger Geschwindigkeit geschüttelt und der Inhalt eines jeden Röhrchens magnetisch gesammelt und 60 s getrennt. Die überstehende Flüssigkeit, die eine Leukozyten-verarmte (Leuko-verarmte) Probe konstituiert, wurde mit einer Pipette sorgfältig entfernt und in ein zweites Röhrchen für die Analyse übergeführt.
Leuko-reiche (nicht verarmte) und verarmte lederfarbene Zellproben ("buff colored cell samples") wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert, um zwischen dem echten neutrophilen Verarmung und der nicht spezifischen Neutrophilenverarmung zu unterscheiden; d. h. der Verarmung von Lymphozyten, Monozyten, Eosinophilen, Basophilen, zusätzlich zu Neutrophilen. Jede Analysenprobe wurde durch Zugabe von 10 ul eines einfarbigen Antikörperreagens CYTO-STAT®KC56-FITC (Coulter Corporation, Miami, Florida) behandelt, geschwenkt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kontrollproben waren isotype Kontrollproben und Antikörperkontrollproben, die an nicht verarmte lederfarbene Zellen konjugiert waren. Die Röhrchen wurden dann in ein Counter EPICS Profile II Durchflusszytometer überführt und nach dem 35 s Lyseverfahren behandelt. Nachdem die rbcs aufgelöst und die Proben fixiert waren (Q-prep), betrug das Gesamtvolumen jeder Probe 1100 ul. Anschließend wurden alle Proben auf einem Coulter EPICS Profile II Cytometer oder einem ähnlichen Gerät analysiert. Die Programme, erhältlich bei Profile II, wurden benutzt, um die Lymphozyten und Monozyten-Knochenmarkzellen- Populationen in Form von Fluoreszenzsignalen zu analysieren. Um die Anzahl Zellen pro Probenvolumen abzuschätzen, wurde der wbc-Anteil der nicht verarmten Probe auf einem Coulter S-Plus Counter zu (4,19 · 10&sup6; wbc), 100 ul Probeaufgabe, bestimmt und mit den gemessenen Fluoreszenzgesamtsignalen (1,81 · 10&sup6;) für Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten in der nicht verarmten Probe und nach 100 ul Probenaufgabe verglichen. Bei der Auswertung dieser Messungen wurden die für die verarmten Proben bestimmten Fluoreszenzsignale um den Faktor 2,31 [ (4,19 · 10&sup6;) + 1,81 · 10&sup6;)] und mit den Verdünnungsfaktor von 11 erhöht, um die tatsächliche Zellzahlen zu erhalten.

Verfahren 1. Durchflusszytometrische Analyse von Neutrophilen nach Verarmung der magnetischen Beads in den Proben.

Ein Versuch mit Knochenmarkzellen einer nicht verarmten Kontrollprobe lieferte 29131 Lymphozyten-, 19282 Monozyten- und 116479 Granulozytenzahlen in Form von Fluoreszenzsignalen. Der prozentuale Granulozytenanteil an der gesamten wbc-Population beträgt daher 70,6%. Die unter Verwendung des Coulter S-Plus®- Counters erhaltenen Ergebnisse ergaben einen Granulozytengesamtanteil von 71,7%. Die Verarmungsanalyse erfolgte unter Verwendung von 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200 und 250 ul 0,25% festen magnetischen Beads, die mit dem monoklonale Antikörper 1D3 konjugierten waren. Die Ergebnisse (Tabelle 2) waren: Tabelle 2
Sowohl Neutrophile als auch Monozyten waren über alle Titer mit 1D3-konjugierten magnetischen Beads verarmt. Die Entfernung der Monozyten kann vermieden oder durch Herabsetzung der Schüttelzeit für die "buff cells" und des Gemischs magnetischer Beads von 6 min auf 30 s und die Zeit für die magnetische Trennung von 60 s auf 15 s, wesentlich reduziert werden. Auf der Basis der Differenz der Fluoreszenzsignale für Granulozyten zwischen nicht-verarmter und verarmter Probe und der wbc-Gesamtfluoreszenzsignale in der nicht verarmten Probe betrug der Prozentsatz an Neutrophilen in den gesamten wbcs 66,8%.
Die Werte der Neutrophilenverarmung wurden unter Verwendung des Wertes 4,18 · 10¹&sup0; Manganferrit-Teilchen/ml für eine 0,25% Gew.-/Vol. Feststoffsuspension und den Faktor 25,41 (der Fluoreszensignalfaktor ist das 2,31 Fache des Verdünnungsfaktors 11, beide vorstehend erhalten) in die Bead- und Zellwerte umgewandelt, um die Fluoreszenzsignale in Granulozytenzellzahlen umzuwandeln. Die resultierenden Werte (Tabelle 3) sind: Tabelle 3
Fig. 1, welche die Zahl der verarmten Neutrophilen gegen das Verhältnis von magnetischen Beads zu Zellen darstellt, zeigt, dass für die Verarmung der Neutrophilen mit einem magnetischem Beadtiter von 0,25% (Gew./Vol.) zwischen 100 ul und 150 ul ein Plateau erreicht wird, wenn 2,8 · 10&sup6; Neutrophile bei Verwendung eines Bead/Zell-Verhältnisses von 2000 : 1 vollständig verarmt werden. Dies entspricht 66,8% der mit dem Coulter S-Plus®-Counter ermittelten wbc-Gesamtzahl von 4,19 · 10&sup6;.

Verfahren 2. Durchflusszytometrische Analyse von durch magnetische Beads verschobenen Neutrophilen

Leuko-reiche Gemische aus "buff cells" und magnetischen Beads wurden hergestellt, wie für die Herstellung von Proben zur Analyse unter Verwendung eines Coulter Profile II Cytometers beschrieben, jedoch nicht magnetisch getrennt. Programme wurden in das Profil eingeführt, um Lymphozyten und Knochenmarkzell- Monozytenpopulationen im Front/Seiten-Streuhistogramm zu analysieren, wobei insbesondere bei jenen Neutrophillen, die aufgrund von Größenänderungen aus dem normalen Granulozytenbereich verschoben waren, die Körnung oder der Brechungsindex durch Bindung der Neutrophilen an die magnetischen Ferritteilchen hervorgerufen wurde. Die Reihe von Histogrammen in Fig. 2 zeigt eine deutliche und zunehmende Verschiebung in Richtung auf die Frontstreuung (FS) oder kleinere Größe und eine stärkere Seitenstreuung (LSS) oder größere Körnung im normalen Granulozytenbereich, wenn den Zellproben höhere Titer an magnetischen Beads zugesetzt wurden.
Der Brechungsindex und die magnetischen Eigenschaften können jedoch den erwarteten normalen Trend zu größerer Größe (größere FS) und größerer Körnung (größere LSS) umkehren, wenn Teilchen an die Zielzellen gebunden werden. Monozyten werden in die gleichen Richtung wie die Granulozyten verschoben, mit dem Ergebnis, dass sie am Ende bei den höchsten Titern an magnetischen Beads den gleichen Bereich besetzten, den normalerweise die Granulozyten besetzen. Lymphozyten wurden solange nicht verschoben, bis Titer größer als 100 ul an 0,25% fester magnetischer Beads verwendet wurden. Bei diesen hohen Titern wurden die Lymphozyten offensichtlich entfernt, weil eine Verschiebung aus dem von Lymphozyten besetzten Bereich im Front/Seiten-Streuhistogramm auftritt. Diese ersichtliche Verschiebung tritt dann auf, wenn ein Überschuss an magnetischen Beads vorliegt, die weder an Monozyten noch an Neutrophile gebunden sind. Die überschüssigen Beads scheinen die Körnung der Lymphozyten nicht dadurch zu stören, dass sie diese binden, sondern dass sie von den überschüssigen magnetischen Ferritteilchen zurückgestreut werden. Die nachstehende Tabelle 4 gibt die Originalgranulozytenzahl, die verschobene Granulozytenzahl und die Prozent an verschobenen Granulozyten bei Verwendung unterschiedlicher Titer von 0,25% Gew./Vol. Feststoff enthaltenden, mit 1D3 konjugierten, mit 5X-Aminodextran beschichteten Manganferrit-Teilchen wieder. Tabelle 4
Für einen 100 ul Titer ergab die Gesamtanalyse eine Lymphozytenzahl von 26604, eine Monozytenzahl von 1045, eine Zahl nicht verschobener Granulozyten von 17449 und eine Zahl von 88145 verschobener Granulozyten. Hieraus wurde der prozentuale Anteil von Neutrophilen an der wbc Gesamtzahl zu 66,2 berechnet. Der mittels der Populationsverschiebungsmehtode erhaltene prozentuale Neutrophilenanteil von 66,8 stimmt gut mit dem durch die Verarmung der magnetischen Beads erhaltenen Wert überein.
Zur weiteren Veranschaulichung der Anwendbarkeit der Erfindung wurden zusätzlich Verarmungsuntersuchungen an (a) roten Blutzellen und Blutplättchen, und (b) weißen Blutzellen durchgeführt.

Beispiel 2. Verarmung roter Blutzellen und Blutplättchen mit magnetischen Beads.

100 ul Na&sub4;EDTA-antikoaguliertes Vollblut wurde in mehrere Reagenzgläser gegeben. Titer von 20-160 ul mit 2,5% Feststoff, mit KC-16-konjugierten, mit 5X- Aminodextran beschichtete Manganferrit-Teilchen wurden den Reagenzgläsern zugesetzt und das Gesamtvolumen in jedem Röhrchen mit 1X PBS auf 260 ul eingestellt. Die resultierenden Gemische wurden entweder auf einem Mehrfachschüttler oder einem Einfachschüttler bei einer niedrigen Mischgeschwindigkeit von 6 min gemischt. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit einer Pasteur-Pipette entfernt und in etikettierten Röhrchen aufbewahrt. Die Proben wurden mit einem Coulter S-Plus® oder einem ähnlichen rbc-Zähler als rbc-Gesamtzahl pro 100 ul Probe (Vollblut plus Beads plus 1x PBS) analysiert.
Die nachstehende Tabelle 5 fasst die Ergebnisse eines Erythrozyten/Blutplättchen- Versuchs zusammen. Der 0 ul-Wert entspricht der nicht verarmten Kontrollprobe. Die Verarmung erfolgte unter Verwendung von 1,25% Gew./Vol. Feststoff enthaltenden, mit KC-16 konjugierten, mit 5X-Aminodextran beschichteten Beads. Der monoklonale Antikörper KC-16 bindet sich nur an Erythrozyten und nicht an Leukozyten oder Blutplättchen. Tabelle 5
Die Anzahl magnetischer Beads/ml für Suspensionen mit 2,5% Gew./Vol. Feststoff beträgt 4,18 · 10¹¹. Verwendet man das Diagramm von Fig. 3, welches die Anzahl der verarmten rbcs gegen das Bead/Zell-Verhältnis wiedergibt, enthielten 160 ul 1,25% Gew./Vol. Feststoff enthaltende Beads 3,36 · 10¹&sup0; magnetische Teilchen, von denen 4,37 · 10&sup8; rbcs entfernt wurden, woraus ein Verhältnis von Teilchen zu (gebundenen rbc) von 77 resultiert.
Der Versuch wurde mit magnetischen Beads wiederholt, die mit 5X-Aminodextran nach Verfahren 2 beschichtet waren. Der Versuch wurde unter Verwendung von 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200 und 250 ul Titern mit 2,5% Gew./Vol. Feststoff, mit KC-16 konjugierten, mit 5X-Aminodextran beschichteten Manganferrit-Teilchen durchgeführt. Die positive Kontrollprobe bestand in 100 ul Vollblut in 250 ul 1X PBS, die sogleich mit 1,000 m) 1X PBS verdünnt wurde. Die wbc-, rbc- und Blutplättchenzahlen für die nicht aufgeschlossene Kontrollprobe wird in der nachstehenden Verarmungstabelle 6 als 0 ul Beads aufgeführt. Tabelle 6
Ein Diagramm, das die Anzahl der verarmten rbcs gegen das Teilchen/Zell- Verhältnis wiedergibt, wird ein Plateau aufweisen, ähnlich dem in Fig. 2 dargestellten. 150 ul magnetischer Teilchen mit 2,5% Gew./Vol. Feststoff enthielten 6,3 · 10¹&sup0; Teilchen und entfernten 4,3 · 10&sup8; rbcs für ein Teilchen/rbc-Verhältnis von 147.
Ein Verarmungstest an Blutplättchen wurde mit 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 und 200 ul einer 0,83% Gew./Vol. Feststoff enthaltenden, mit monoklonalem Antikörper PLT- 1 (Coulter Corporation, Hialeah, Florida) konjugierten, mit 5X-Aminodextran beschichteten Manganferrit-Teilchen durchgeführt. Das Gesamtvolumen wurde je nach Bedarf mit 1X PBS auf 350 ul eingestellt. Die positive Kontrollprobe bestand in 100 ul mit 250 ul 1X PBS verdünntem Vollblut. Die wbc, rbc und Blutplättchen für die nicht verarmte Kontrollprobe sind in der nachstehenden Verarmungstabelle 7 als 0 ul Beads aufgeführt. Tabelle 7
Die in Fig. 4 aufgetragenen Ergebnisse zeigen, dass 100 ul 0,83% Gew./Vol. Feststoffbeads, welche 1,39 · 10¹&sup0; Teilchen enthalten, 1,79 · 10&sup7; Blutplättchen entfernt haben, was ein Teilchen/Blutplättchen-Verhältnis von 779 ergibt.

Beispiel 3. Verarmung weißer Blutzellen mit magnetischen Beads

Die Herstellung Leuko-reicher Proben, ihre Verarmung von mit monoklonalem Antikörper KC-56 (Coulter Corporation) konjugierten, mit 5X-Aminodextran beschichteten Manganferrit-Teilchen und die nach der magnetischen Verarmung gemäß Verfahren 1 erfolgte Analyse der überstehenden Flüssigkeiten sind denen ähnlich, die für die Verarmung der Neutrophilen unter Verwendung von mit Antikörper 1D3 konjugierten magnetischen Beads beschrieben wurden. Die Verarmungstests wurden unter Verwendung von 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200 und 250 ul 0,833% Feststoff enthaltenden, mit KC-56 konjugierten, mit 5X-Aminodextran beschichteten Manganferrit-Teilchen durchgeführt. Die als Fluoreszenzsignale erhaltenen Lymphozyten-, Monozyten- und Granulozytenzahlen für die nicht verarmte Kontrollprobe sind in der folgenden Verarmungstabelle 8 als 0 ul Beads aufgeführt. Tabelle 8
Um die Anzahl Zellen pro Probenvolumen zu bestimmen, wurde die Anzahl wbc (2,86 · 10&sup6;) der nicht verarmten Probe mit einer 100 ul Aufgabemenge in einen Coulter S-Plus® Counter bestimmt und diese Anzahl mit den gesamten Fluoreszenzsignalen (8,57 · 10&sup5;) für Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten einer nicht verarmten Probe mit einer 100 ul Aufgabemenge in einem Coulter EPICS® Profile II Durchflusszytometer verglichen. Bei der Auswertung wurden die Fluoreszenzsignale um den Faktor 3,34 [d. h. (2,86 · 10&sup6;) = (8,57 · 10&sup5;)] und der Verdünnungsfaktor um 11 vergrößert, um die Zellzahlen zu erhalten. Die Beadzahlen wurden unter Verwendung von 1,39 · 10¹¹ Teilchen/ml für eine Suspension mit 0,833% Gew./Vol. Feststoff berechnet. Die nachstende Verarmungstabelle 9 gibt die Ergebnisse als Anzahl aufgelöster wbc · 10&sup5;, Anzahl der bei der Verarmung verwendeten magnetischen Beads · 10&sup8; und das Bead/Zell-Verhältnis · 10³ in tabellarischer Form wieder. Tabelle 9
Fig. 5 ist ein Diagramm, das die Anzahl verarmter wbcs gegen das magnetische Bead/Zell-Verhältnis zeigt. Fig. 5 zeigt einen steilen Anstieg der Bead/Zell-Werte von 2,15 · 10³ und 4,13 · 10³ und ein bei 100 ul beginnendes Plateau bei einem Beadtiter von 0,833% Gew./Vol., wenn 2,85 · 10&sup6; wbcs bei einem Bead/Zell- Verhälntis von etwa 4900 : 1 verarmt waren. Die Entfernung der größeren Granulozytenzellen beginnt, nachdem beinahe alle Lymphozyten und Monozyten verarmt waren. Dies steht im Einklang mit der Forderung, wonach eine größere Zahl von an Granulozyten gebundene magnetische Beads benötigt wird, um diese Zellen zu entfernen. Das heißt, dass zur magnetischen Abtrennung von Granulozyten an jede der großen Granulozytenzellen mehrere magnetische Teilchen gebunden sein müssen, damit ein ausreichendes magnetisches Moment erhalten wird, um die Zellen physikalisch aus der Lösung in Richtung des Magnetfeldes zu bewegen. Für die Granulozytenverarmung gibt es keinen eigenen Wendepunkt, wie Fig. 5 zeigt. Einige Granulozyten werden jedoch im Front/Seiten-Streuhistogramm nach höheren Titern verschoben und zwar unmittelbar vor der vollständigen Verarmung. Dies deutet darauf hin, dass einige Granulozyten vorliegen, die durch magnetische Trennung nicht entfernt wurden, sondern in Suspension mit einer beträchtlichen Anzahl an diese Zellen gebundenen magnetischen Beads blieben.

III. HERSTELLUNG VON POLYMERTEILCHEN MIT BIOLOGISCH ABBAUBAREN BESCHICHTUNGEN

A. Gelatine beschichtete Polymerteilchen (nur als Bezugsbeispiel, kein erfindungsgemäßes Beispiel)

Herstellung von Gelatine beschichteten Latexteilchen

Sulfatierte Polystyrollatex-Teilchen (IDC Corporation, Portland, Oregon) mit einheitlicher Größe (1,17 um ± 3,0%) und sphärischer Gestalt wurden, um bei der Erfindung als Beispiel zu dienen, in destilliertem Wasser dispergiert und bei 3000 Upm 10 min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und die Teilchen in 1% wässriger Typ A Gelatine mit 175 Bloom und einem Feststoffgehalt von 2,5% Gew./Vol. redispergiert, 1 min durch Beschallung gemischt, um die Redispergierung zu unterstützen, und 8-16 h rollend gemischt. Die sulfatierten Polystyrollatex- Teilchen besaßen keine an das Styrol gebundenen aminreaktiven Gruppen. Gruppen können jedoch auf die gleiche Weise verwendet werden, selbst wenn die Gelatine einige wenige, wenn überhaupt, Aminogruppen enthält. Weiterhin können die Styrollatex-Teilchen darin eingebettete magnetische Teilchen aufweisen, wobei die Teilchen aus magnetischen Kernen mit einer Polymerbeschichtung bestehen können, in diesem Fall aus einer Beschichtung aus Polystyrollatex. Werden solche magnetischen Teilchen verwendet, kann die Abtrennung magnetisch anstatt durch Zentrifugieren erfolgen.

Vernetzen der adsorbierten Gelatine und Blockierung nicht-umgesetzter Aldehydgruppen

Eine abgemessene Menge von 0,300 ml 25% Glutaraldehyd (0,749 mmol) wurde 575 ml einer, 1% Polyvinylpyrrolidon (Mr = 40000) enthaltenden Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1X PBS) zugesetzt. Anschließend wurden der Glutaraldehydlösung 25 ml sulfatierte Polystyrollatex-Teilchen mit 2,5% Gew./Vol. Feststoff in einer 1% Lösung von Typ A, 175 Bloom Gelatine zugegeben. Nach dem Mischen wurden zu den 600 ml Teilchen in 1X PBS 0,505 ml 99% Ethylendiamin (7,49 mmol) zugegeben und das resultierende Gemisch etwa 2 bis 3 h rollend gemischt. Der Suspension wurden 6,0 ml, 10 mg/ml enthaltendes, NaBH&sub4; in 0,1-mmol wässriger KOH zugesetzt und nochmals 15 min rollend gemischt. Die Teilchen wurden auf der Zentrifuge 3-mal mit 0,2-m wässriger NaCl gewaschen und dekantiert. Nach dem Waschen wurden die Teilchen in 0,2-m NaCl redispergiert, um 24 ml einer 2,5% Gew./Vol.-Feststoffsuspension zu ergeben.

Vernetzung von adsorbierter Gelatine ohne Polyvinylpyrrolidon als Stabilisator

56 ul 25% wässrige Glutaraldehydlösung wurde mit 5 ml 1-mmol wässrigem Kaliumhydroxid gemischt. 5 ml 2,5% Feststoff enthaltende, sulfatierte Polystyrollatex- Teilchen, die in 2% Gew./Vol. Typ A Gelatine, 0,1-m in Phosphatpuffer, pH 8,4, suspendiert waren, wurden durch Zentrifugieren getrennt und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Die abgetrennten, mit Gelatine beschichteten Polystyrollatex- Teilchen wurden in 5 ml der 3 mg/ml enthaltenden, wie hierin beschrieben, zubereiteten Glutaraldehydlösung suspendiert. Die resultierende Lösung wurde etwa 30 min. vorzugsweise rollend, gemischt. Nachdem die Glutaraldehydzugabe und das Mischen beendet waren, wurde dem Reaktionsgemisch 20 ul Ethylendiamin (Diamin/-Glutaraldehyd-Molverhälltnis = 2 : 1) zugesetzt, das dann weitere 2 bis 3 h gerührt wurde. Anschließend wurden 0,313 ml einer 40 mg/ml enthaltenden Natriumborhydridlösung (100 mg pro Gramm Beads) in 1-mmol KOH zur Reaktion zugegeben und das resultierende Gemisch etwa 10-30 min gerührt. Die vernetzten Teilchen wurden anschließend durch Zentrifugieren abgetrennt, 3-mal gewaschen und in 5 ml 0,2-m wässrigem Natriumchlorid resuspendiert.

Kopplung von Ethylendiamin an Carboxylreste von Gelatinebeschichtungen auf Polystyrollatex-Teilchen

Eine abgemessene Menge von 0,404 ml 99% Ethylendiamin (6,00 mmol) wurde mit 24 ml fixierten, Aldehyd-blockierten, Gelatine beschichteten Polystyrolteilchen mit 2,5% Gew./Vol. Feststoff, mit oder ohne Verwendung von Polyvinylpyrrolidon als Stabilisator, gemischt. Zu den Teilchen wurde eine 0,960 ml Probe von 10 mg/ml EDAC (0,50 mmol) in 0,2-m NaCl-Lösung zugegeben und in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen 8-16 h rollend gemischt. Der Inhalt des Röhrchens wurde nach 10 min Zentrifugieren bei 3000 Upm 5-mal mit 1X PBS gewaschen und dekantiert. Die Teilchen wurden dann in genügend 1X PBS resuspendiert und ergaben ein Gesamtvolumen von 24 ml.

Teilchenaktivierung durch Kopplung von sulfo-SMCC und Antikörper an Gelatinebeschichtete Polystyrollatex-Teilchen

Die Aktivierung der Teilchen und die Kopplung von monoklonalen Antikörpern an Gelatine beschichtete Polystyrolteilchen erfolgte nach dem gleichen Verfahren, wie für magnetische Beads, außer dass die Abtrennung der Teilchen durch 10 min. Zentrifugieren bei 3000 Upm und anschließendes Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit erfolgte.

B. AMINODEXTRAN-BESCHICHTETE TEILCHEN.

Herstellung von Aminodextranen

Die zur Beschichtung der Polymerteilchen verwendeten Aminodextrane wurden, wie vorstehend beschrieben, hergestellt.

Herstellung von Aminodextran beschichteten, funktionalisierten Polystyrollatex- Teilchen.

Zwei Arten von funktionalisierten Polystyrollatex-Teilchen oder Beads wurden erfindungsgemäß unter Verwendung von 5X-Aminodextran als Beispiel für ein Beschichtungsmaterial beschichtet. Die erste Art bestand in Carboxylatmikrokugeln in Form von Mehrfachbeads mit 2,01 um Durchmesser (0,046 um Standardabweichung) von Polyscience, Inc., Warrington, Pennsylvania, und die zweite Art waren Aldehyd- oder Aldehyd/Sulfat-funktionelle Polystyrollatex-Teilchen mit einem Durchmesser von 2,15 um ± 5,5% der IDC Corporation, Portland, Oregon. Keine dieser Teilchenarten war magnetisch. Magnetische Teilchen können jedoch auf die gleiche Weise beschichtet und magnetisch abgetrennt werden, anstatt die Beads aus dem suspendierenden Medium durch Zentrifugieren abzutrennen. Der erste Schritt bei der Beschichtung der Beads mit 5X-Aminodextran war die Kopplung von 5X- Aminodextran an die funktionellen Gruppen auf der Teilchenoberfläche durch Kondensationsreaktion zwischen den Carboxyl- oder Aldehydgruppen auf der Oberfläche und den Aminogruppen von 5X-Aminodextran.

Verfahren 1. Kopplung an Carboxylat-Polystyrollatex-Teilchen.

Fünf Milliliter (5 ml) 10 mg/ml wässrige 5X-Aminodextranlösung und 1 ml 2-m wässriges NaCl wurden zu 4 ml einer 2,5% Gew./Vol. wässrigen Suspension von carboxylierten Polystyrolatex-Teilchen gegeben. Anschließend wurde die kolloidale Latexteilchendispersion mit 230 ul 10 mg/ml wässrige Lösung eines wasserlöslichen Carbodiimids, zum Beispiel EDAC·HCl, versetzt und das gesamte Gemisch während einer Zeitspanne von etwa 8 bis 16 h, vorzugsweise mit einem Rollmischer, gemischt.

Verfahren 2. Kopplung an Aldehyd/Sulfat-Polystyrollatex-Teilchen

Fünf Milliliter (5 ml) 10 mg/ml wässriges 5X-Aminodextran und 2,619 ml destilliertes Wasser wurden zu 2,381 ml einer wässrigen, 4,2% Gew./Vol. Feststoff enthaltenden Suspension von Aldehyd/Sulfat-Polystyrollatex-Teilchen zugegeben. Der pH-Wert der Dispersion wurde dann durch Zugabe von 2 ul 5-m wässrige Kaliumhydroxidlösung auf 10,0 eingestellt. Das resultierende Gemisch wurde anschließend während einer Zeitspanne von etwa 8 bis 16 h, vorzugsweise mit einem Rollmischer, gemischt.

Vernetzung von 5X-Aminodextran mit Polystyrollatex-Teilchen.

Die mit Aminodextran beschichteten Beads, die entweder nach Verfahren 1 oder 2 hergestellt worden waren, wurden 3- bis 4-mal durch Suspendieren in destilliertem Wasser und 10 min Zentrifugieren mit 3000 Upm gewaschen. Die Beads wurden dann in 10 ml 2% Gew./Vol. wässrigem 5X-Aminodextran resuspendiert und etwa drei (3) Stunden, vorzugsweise mit einem Rollmischer, gemischt. Nachdem das Mischen beendet war, wurde der pH-Wert durch Zugabe von 2 ul 5-m wässrigem Kaliumhydroxid auf etwa 10 eingestellt. Unmittelbar nach der pH-Einstellung wurden 0,117 ml 25% Glutaraldehydlösung (0,311 mol oder 1 mol pro mol Aminogruppen im 5X-Aminodextran) zugegeben und die Beads enthaltende Lösung damit etwa 1 h, vorzugsweise rollend, gemischt. Nach 15 min Mischen wurde die für die Bildung Schiff'scher Basen kennzeichnende gelbe Farbe beobachtet. Die Beads wurden anschließend durch Zentrifugieren vom freien Glutaraldehyd und Aminodextran abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Um nicht umgesetzte Aldehydgruppen zu blockieren, wurden die Beads in 10 ml 1% Gew./Vol. 5X-Aminodextran resuspendiert und während einer Zeitspanne von etwa 8-16 h, vorzugsweise rollend, gemischt. Alternativ kann Ethylendiamin (10 mol pro mol Glutaraldehyd) als Reagenz zur Blockierung verwendet werden. Die bei diesen Reaktionen gebildete Schiff' sche Base wurde durch Zugabe von 2,35 ml 10 mg/ml Natriumborhydrid zum Bead- Gemisch und etwa 30 min Weiterrühren reduziert. Unmittelbar danach wurden die Beads 4-mal unter Verwendung von 1X PSB durch Zentrifugieren gewaschen. Die überstehenden Waschflüssigkeiten wurden verworfen und die gewaschenen Beads in ausreichend 1X PBS suspendiert, um eine Suspension von entweder 5X- Aminodextran beschichteten carboxylierten Beads oder 5X-Aminodextranbeschichteten Aldehyd/Sulfat-Beads mit einem Gesamtvolumen von 10 ml zu ergeben. Mit 1X-, 2X- und 3X-Aminodextran beschichtete Beads können auf ähnliche Weise hergestellt werden.

Vernetzung von 3X-Aminodextran auf sulfatierten Polystyrollatex-Teilchen

Polystyrollatex-Teilchen, die keine chemisch reaktiven Gruppen besitzen, mit denen ein Aminodextran eine Bindung eingehen kann, erfordern die Verwendung modifizierter Beschichtungs- und Vernetzungsverfahren. Die bei diesem Verfahren verwendeten sulfatierten Polystyrollatex-Teilchen besitzen keine Aldehydgruppen, wie sie auf Aldehyd/Sulfat-Teilchen vorliegen.
16,7 ml 30 mg/ml wässriges 3X-Aminodextran und 77,2 ml destilliertes Wasser werden in einer 250 ml Gewebekulturflasche zu 6,1 ml einer 8,2% Gew/Vol. Feststoff enthaltenden Suspension sulfatierter Polystyrollatex-Teichen (2,13 um mittlerer Teilchendurchmesser IDC) zugegeben. Der pH-Wert der resultierenden Suspension wurde dann durch tropfenweise Zugabe von 0,1-m wässrigem Nariumhydroxid (es wurden etwa 20 Tropfen verwendet) auf 10,0 eingestellt. Die Flasche wurde auf einen Kreisschüttler befestigt und ihr Inhalt etwa 8-16 h gemischt. Nach dem Mischen wurde die Bead-Suspension mit 1,130 ml 25% Glutaraldehydlösung (3 mg Glutaraldehyd pro ml Reaktionsvolumen) versetzt, die dann weitere 30 min im Kreis geschüttelt wurde. Die nicht-umgesetzten Aldehydgruppen wurden dann durch Zugabe von 2 ml Ethylendiamin (10 mol pro mol Glutaraldehyd) blockiert und noch etwa 3 h weitergeschüttelt. Schließlich wurde zu der Latexteilchensuspension 1 ml 10 mg/ml wässriges Natriumborhydrid und 1 mmol Kaliumhydroxidlösung zugegeben, die dann noch etwa 30 min weiter geschüttelt wurde, um die Bindungen der Schiff' schen Base zu reduzieren und zu stabilisieren. Die Latexteilchen wurden dann abgetrennt und 4-mal durch Zentrifugieren bzw. unter Verwendung von 1X PBS gewaschen. Die Beads wurden in 1X PBS resuspendiert und das Volumen der Suspension auf 2,5% Gew./Vol. Feststoff (Endvolumen etwa 20 ml) eingestellt, das bei nachfolgenden Reaktionen verwendet werden kann.

Teilchenaktivierung durch Kopplung von sulfo-SMCC und Antikörper an 5X- Aminodextran-beschichtetes Polystyrol.

Die Anbindung von monoklonalen Antikörpern an Aminodextran beschichtete Polystyrollatex-Teilchen wurde, wie hier für Gelatine beschichtete Latexteilchen beschrieben, durchgeführt, außer dass 33,75 ul 10 mg/ml sulfo-SMCC-Lösung pro ml 2,5% Gew./Vol. Feststoff enthaltende Bead-Suspension verwendet wurde. Die erfindungsgemäß hergestellten, Antikörper konjugierten, Aminodextran beschichteten Polystyrollatex-Teilchen können bei verschiedenen Zellpopulationsanalysen mittels Durchflusszytometrie und anderen Arbeitsweisen verwendet werden. Vergleiche zum Beispiel die Internationlae Patentveröffentlichung WO 90/10313.
Sofern nichts anderes angegeben, liegt die an Beads konjugierte Menge an monoklonalem Antikörper im Bereich von 3 bis 5 mg Antikörper pro m² Beadoberfläche. Die Beads werden zum Beispiel durch Reaktion eines aktivierten Antikörpers, wie einem mit Iminothiolan aktivierten Antikörper, mit aktivierten Beads hergestellt. Die Reaktion verwendet typischerweise 0,625 mg aktivierten Antikörper pro ml 1% Gew./Vol. Beadsuspension.

Beispiel 4. Verschiebungsanalyse der Polystyrolbead-T-Zellpopulation mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von mit Aminodextran beschichteten Polystyrollatex-Beads

Eine 50 ml Probe Na&sub4;EDTA-antikoaguliertes Vollblut wurde erhalten, auf eine Reihe von Zentrifugenröhrchen aufgeteilt und zehn (10) Minuten bei 500 G zentrifugiert. Der Hauptanteil des Plasmas wurde entfernt und die in jedem Röhrchen verbleibende, lederfarbene Zellschicht vereinigt und nochmals 10 min mit 500 G zentrifugiert. Das restliche Plasma und die lederfarbenen Zellen wurden getrennt. Die lederfarbenen Zellen und das Plasma machen zusammen das Leuko-reiche Vollblut aus.
Die lederfarbenen Zellen wurden mit 1X PBS verdünnt, um eine Reihe Proben zu erhalten, die, wie mit einem Coulter S-Plus Counter bestimmt, jeweils 4, 6, 8, 10 und 12 · 10&sup5; weiße Blutzellen (wbc) enthalten. 100 ul Anteile einer jeden der 4, 6, 8, 10 und 12 · 10&sup5; wbc-Proben wurden dann in eine Reihe von Reagenzgläser pipettiert. Anschließend wurden Teilmengen von 5, 10, 15, 20, 30 und 40 ul einer Suspension von monoklonalem Antikörper T4, der an mit 3X-Aminodextran beschichteten, sulfatierte Polystyrollatex-Beads (1% Gew./Vol. Feststoff, 3-5 mg Antikörper pro m² Beadoberfläche und 1,786 · 10&sup9; Teilchen pro ml) konjugiert war, für jede der wbc-Konzentrationen in ein separates Probenröhrchen pipettiert. Jedes Röhrchen wurde dann 2 min geschwenkt. Im Anschluss an die Verwirbelung wurde jeder Probe 10 ul CYTO-STAT® T4-RD1/T8-FITC Zweifarbenantikörperreagenz zugefügt, um zwischen der tatsächlichen T4+-Zellmarkierung und der nicht spezifischen Markierung von T-Zellen, unterscheiden zu können, d. h. T8-Zellen. Die Proben wurden geschüttelt und bei Raumtemperatur (Bereich: 18-27ºC) 10 min inkubiert. Die Proberöhrchen wurden dann auf einen Coulter Q-Prep® (Coulter Corporation, Miami, Florida) oder ein ähnliches Gerät gegeben und nach dem 35 s Lyseverfahren behandelt, um die roten Blutzellen (rbc) zu lysieren. Nachdem die rbcs lysiert und die Proben fixiert (Q-Prep) waren, wurden alle Proben auf einem Coulter EPICS® Profile II Durchflusszytometer oder einem ähnlichen Gerät analysiert. Es wurden in das Profile installierte Standardprogramme verwendet, um die Lymphozyten- und Monozyten-Knochenmarkzell-Population als Fluoreszenzsignale zu ermitteln, insbesondere jene Lymphozyten, die sich aufgrund einer Änderung der Größe und/oder Körnung infolge der Bindung von Polystyrollatex-Teilchen im verschobenen Front/Seiten-Streubereich befinden.
Das Profile II war mit DNA-Check Beads (Coulter Corporation, Miami, Florida) zur Eichung und mit Standard-Brite Beads (Coulter Corporation) für die Fluoreszenzintensität kalibriert. Es wurde eine "buff cell"-Probe verwendet, die keine Polystyrolbeads und keine Fluoreszenzindikatoren enthielt, um die Population (Menge) an Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten zu bestimmen. Die Lymphozytenpopulation wurde für die Fluoreszenzanalyse in der Bilddatei erfasst und alle drei Arten von Zeilpopulationen wurden für die Zellzählung als Fluoreszenzsignale gespeichert. Eine "buff cell"-Probe ohne Polystyrolbeads wurde mit CYTO-STAT® MsIg1-RD1/Ms-Ig1-FITC als Kontrollreagens eingefärbt und um Quadranten und Gradienten einzustellen. Eine "buff cell"-Probe, die das Fluoreszenzdoppelreagens T4-RD1/T8-FITC und keine Polystyrolbeads enthält, wurde verwendet, um die Farbeinstellung zu kompensieren. Eine "buff cell"-Probe mit 40 ul T4-konjugierten Polystyrollatex-Teilchen wurde verwendet, um die Lage der verschobenen Zellpopulation zu bestimmen, die in der Bilddatei erfasst und gespeichert wurde. Eine "buff cell"- Probe von T4-konjugierten Polystyrollatex-Teilchen wurde mit MsIgG1-RD- 1/MsIgG1-FITC Kontrollreagens angefärbt und dazu verwendet, Quadranten und Gradienten einzustellen. Eine Probe T4-konjugierter Polystyrollatex-Beads ohne "buff cells" oder Fluoreszenzreagenz wurde verwendet, um sicherzustellen, dass Beads nicht die Zellen auf dem Streudiagramm störten. Nach Abschluss der vorstehenden Schritte wurden "buff cell"-Proben, welche die verschiedenen wbc- Konzentrationen und den Zweifarbenindikator (RD1 und FITC) enthalten, dazu verwendet, eine Original-T4-Zellfluoreszensignalzahl zu bestimmen. Letztendlich wurde eine "buff cell"-Probe mit Zweifachfarbindikator und verschiedenen Mengen (5, 10, 15, 20, 30 und 40 ul) der der T4 enthaltenden Beads mit einer Konzentration von 3- 5 mg T4/m² Beadoberfläche verwendet, um für die T4-Zellen die Fluoreszenzellsignalzahl im Bereich des Front/Seiten-Streudiagramms zu bestimmen, die von der restlichen Lymphozytenpopulation weg in Richtung auf größere Größe und/oder Körnung verschoben ist.
Bei der Zubereitung der Prüf- und Kontrollproben ist es wichtig, dass die Antikörper/Bead-Konjugate mit den "buff cell"-Proben vor der Zugabe der Fluoreszenzindikatoren gemischt werden, um die Absättigung der antigenen Stellen auf den T- Zellen durch die kleineren und beweglicheren Konjugate aus molekularem Farbstoff und Antikörper zu vermeiden. Die Anzahl der T4-Zellen wurde aus den T4- Fluoreszenzsignalen und aus den S-Pluso Counter/Profile II Vergleichswerten abgeschätzt, [T4-Signale (ohne Beads) - T4-Signale (40 ul Beads)] · [Q-Prep Verdünnungsfaktor (11)] · [(S-Plus Lymphozytenzahl) + (Lymphozytengesamtsignale) = 1,24]. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 10 und in Fig. 1 als Anzahl der verschobenen T4-Zellen gegen das Bead/T4-Zell-Verhältnis zusammenfassend dargestellt. Tabelle 10
Der prozentuale Anteil an Lymphozyten in der wbc-Probe betrug bei Bestimmung mit einem S-Plus®-Counter 38,9%. Der prozentuale Anteil an T4-Zellen an den Lymphozyten wurde bestimmt nach der Gleichung
%T4-Zellen = 100% · [(Anzahl T4-Zellen in der verschobenen Population beim Plateau im Diagramm + wbc Anzahl)] + 0,389.
Die prozentualen T4-Anteile betrugen 39,3%, 39,3% 38,3%, 37,8% und 38,6%, entsprechend wbc-Konzentrationen von 12, 10, 8, 6 und 4 · 10&sup5;. Die T4-Prozentzahlen betrugen auf der Grundlage der relativen Fluoreszenzsignale von verschobenen und nicht verschobenen Lymphozytenpopulationen, [(T4-Signale (keine Beads) - T4- Signale (40ul Beads)] + (Lymphozytengesamtsignale), im Front/Seiten- Streudiagramm 39,2, 39,4, 38,4, 38,0 bzw. 39,0. Ähnliche Versuche mit monoklonalem Antikörper T-4, der an sulfatierte Polystyrollatexbeads, die mit einer Typ A Gelatine beschichtet waren, konjugiert war, wurden von verschobenen Monozyten aufgrund unspezifischer Wechselwirkungen mit der vernetzten Gelatine gestört. Die Verwendung von Aminodextran beschichteten Polystyrollatexbeads stellt demzufolge eine lebensfähige Alternative dar, wenn eine solche Störung beobachtet wird.

Beispiel 5. T4- und T8-Zellpopulationsanalyse unter Verwendung von 5X-Aminodextran beschichteten Polystyrollatex-Teilchen.

Monoklonale T4- und T8-Antikörper wurden an 5X-Aminodextran beschichtete Carboxylat-Polystyrollatex-Teilchen und an 5X-Aminodextran beschichtete Aldehyd/Sulfat-Polystyrollatex-Teilchen konjugiert. Die Teilchen wurden in 1X PBS suspendiert, um ein 1% Gew./Vol. Gemisch zu liefern. Eine ausreichende Menge konjugierter T4- oder T8-Teilchen wurden zu 200 ul Vollblut hinzugefügt. Das Probenvolumen wurde durch Zugabe von 1X PBS auf 300 ul aufgefüllt und dann 2 min geschwenkt. Eine 100 ul Teilmenge wurde für die Analyse der Population verschobener T-Zellen unter Verwendung des von T. Russel et al. in der Internationlaen Patentveröffentlichung WO 90/18013 beschriebenen Verfahrens auf ein Coulter VCS® (Coulter Corporation, Miami, Florida) oder ein ähnliches Gerät aufgegeben. Die Zugabe von Ansatzlyse für die roten Blutzellen und von Lyseinhibitor wurde vom Gerät selbsttätig gesteuert. Der Prozensatz an T4- oder T8-Zellen entspricht der T- Zellpopulation, die in einen nicht belegten DC/Opazitäts-Bereich verschoben ist. Der prozentuale Anteil von T4- oder T8-Zellen = [(verschobene T4- oder T8- Zellpopulation) + (gesamte Originallymphozyten-population)] · 100%. Diese Prozentanteile erhält man aus einem Diagramm, in dem DC gegen [(RF-85) + DC] aufgetragen ist, wobei RF der Radiostreufrequenz, DC dem Widerstand der Direktstromzelle entspricht und -85 eine Konstante ist. Die verwendeten Anteile an mit konjugiertem monoklonalen Antikörper beschichteten Teilchen (1% Gew./Vol.) und der ermittelte prozentuale Anteil an T4-Zellen sind in Tabelle 11 dargestellt.
Bei Verwendung jeder der beiden Teilchenarten wurde ein Plateau bei etwa 44,1-44,4% T4-Zellen beobachtet, wenn alle T4-Zellen durch einen Überschuss an mit T4-Antikörper beschichteten Polystyrolbeads verschoben worden waren. Dieser Endpunkt kann als der wahre prozentuale Anteil an T4-Zellen innerhalb der Lymphozytenpopulation der analysierten Vollblutprobe betrachtet werden. Tabelle 11.

Kopplung von 1X-Aminodextran an Tosyl-aktivierte, Magnetit-enthaltende Polystyrolteilchen (keine Vernetzung).

2 ml 30 mg/ml enthaltende, einheitliche, poröse Polystyrolteilchen mit darin eingebettetem magnetischen Material (M-450 Dynabeads®, Tosyl-aktiviert, 4,5 um ± 5%; Dynal, Incorporated) wurden 3-mal mit 0,25-m Boratpuffer, pH = 9,8, gewaschen. 0,198 ml 45,4 mg/ml enthaltendes 1X-Aminodextran zu den gewaschenen Beads zugegeben und das Gesamtvolumen mit Boratpuffer auf 2,4 ml eingestellt, um eine Suspension mit 2,5% Gew./Vol. Feststoff mit einer 1X-Aminodextrankonzentration von 3,75 mg/ml zu ergeben. Die Suspension wurde dann 8-16 h gemischt. Die Teilchen wurden anschließend magnetisch abgetrennt, 4-mal mit 2,4 ml 1X PBS gewaschen und in 1X PBS resuspendiert, um eine Teilchensuspension mit einem Gesamtvolumen von 2,4 ml zu ergeben.
Monoklonaler Antikörper T-11 wurde unter Verwendung des hier für die Konjugation monoklonaler Antikörper an Gelatine beschichtete Ferritteilchen beschriebenen Verfahrens an die IX-Aminodextran beschichteten M-450 Beads konjugiert. Die Antikörperkonjugierten Teilchen wurden dann bei einem T11/B4-Lymphoidzelltest verwendet, der unter Verwendung des Verfahrens von Bezugsbeispiel 1 durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 für Proben zusammengefasst, die mit 0, 25, 50 und 100 ul T11-Antikörper-konjugierten M-450-Teilchen behandelt worden waren. Tabelle 12

Kopplung von 5X-Aminodextran an Polystyrol-Magnetit-Teilchen

50 ml Polystyrol-Magnetit-Teilchen (10% GewNol. Feststoff in 0,5% SDS, 0,980 um mittlerer Durchmesser, -COOH als funktionelle Gruppe, 23,1% Magnetit) wurden in einen Reaktionskolben gegeben, der 150 ml 1% Natriumazid und 10 mmol Natriumbicarbonatlösung enthielt. Der Inhalt wurde etwa 8-16 h mit einem Schüttler gemischt und die Teilchen dann 2-mal magnetisch getrennt und mit 200 ml 10-mmol wässrigem Natriumbicarbonat gewaschen. Die gewaschenen Teilchen wurden dann in 0,2-m wässrigem Natriumchlorid suspendiert und das Volumnen der Suspension auf etwa 150 ml eingestellt. Es wurde eine Lösung von 750 mg 5X-Aminodextran in etwa 10 ml 0,2-m wässrigem Natriumchlorid bereitet und der Teilchensuspension zugesetzt. Das Gesamtvolumen wurde dann mit 0,2-m wässrigem Natriumchlorid auf 200 ml eingestellt, um eine Suspension mit 2,5% Gew./Vol. Feststoff bei einer 5X-Aminodextrankonzentration von 3,75 mg/ml zu ergeben. Anschließend wurde der Teilchensuspension eine 1,80 ml Probe von 10 mg/ml EDAC in 0,2-m wässrigem. Natriumchlorid zugesetzt, um die Kopplung der Aminogruppen des Aminodextrans an die auf der Teilchenoberfläche vorliegenden COOH-Gruppen zu erleichtern. Die EDAC enthaltende Suspension wurde während etwa 8-16 h auf einem Kreisschüttler gemischt, dann magnetisch getrennt und 3-mal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die gewaschenen, mit 5X-Aminodextran beschichteten Beads wurden in ausreichend 1 · PBS resuspendiert, um 200 ml einer Suspension mit 2,5% Gew./Vol. Feststoff zu ergeben.

Aktivierung von 5X-Aminodextran beschichteten Polystyrol-Magnetit-Teilchen durch sulfo-SMCC

Von den nachstehenden Unterschieden abgesehen, wurden monoklonale Antikörper an die 5X-Aminodextran beschichteten Polystyrol-Magnetit-Teilchen nach dem Verfahren konjugiert, das hier für die Konjugierung monoklonaler Antikörper an Gelatine-beschichtete Teilchen beschrieben wurde.
1. Die Aktivierung der 5X-Aminodextran eschichteten Teilchen erfolgte unter Verwendung von 33,75 ul 10 mg/ml sulfo-SMCC- Lösung pro 1 ml 2,5% Gew./Vol. Feststoffsuspension.
2. Die Antikörper-Teilchen-Kopplung erfolgte unter Verwendung von etwa 0,313 mg mit Iminothiolan aktiviertem monoklonalen Antikörper pro 1 ml Suspension von aktivierten Teilchen mit 1,25% Gew./Vol. Feststoff.
Die Aktivierung von Beads durch Iminothiolan und von Antikörpern durch sulfo- SMCC kann wechselseitig erfolgen oder es können andere Reagenzien zur Aktivierung verwendet werden, wie hier an anderer Stelle spezifiziert.

Beispiel 6. Zusammenfassung der Prüfergebnisse von Antikörpern, die an 5X-Aminodextran beschichtete Teilchen konjugiert sind.

Die nachstehenden Versuchsergebnisse wurden unter Verwendung der in den Bezugsbeispielen 1 bis 3 beschriebenen Protokolle erhalten.

A. Erythrozyten/Blutplättchen-Test

Ein Erythrozyten/Blutplättchen-Test wurde unter Verwendung von 0-250 ul 0,8333% Gew./Vol. Feststoff mit KC-16-konjugierten magnetischen Beads durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigen, dass 100 ul 0,833% Gew./Vol. Beads 1,32 · 10&sup9; Teilchen enthalten, die 4,9 · 10&sup7; rbcs aus der Testprobe entfernen, was ein Bead/Zell-Verhältnis von 27 ergibt. Tabelle 13: rbc-Verarmung unter Verwendung magnetischer Beads

B. T4/T8-Lymphoidzelltest.

Ein T4/T9-Lymphoidverarmungstest wurde unter Verwendung von 0-125 ul, 0,025% Gew./Vol. Feststoff enthaltenden, mit monoklonalem T4-Antikörper konjugierten, magnetischen Beads durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 zusammengefasst. Nachdem die Fluoreszenzsignale der Gesamtlymphozyten gegen die Anzahl der auf dem Coulter C-Plus® Counter gemessenen Lymphozytenzahlen aufgetragen waren, wurde die nach jeder Verarmung verbleibende Anzahl von T4-Zellen beurteilt und diese Werte dazu verwendet, um nachzuweisen, dass 150 ul 0,25% Gew./Vol. Feststoff enthaltende Beads 6,0 · 10&sup7; Teilchen enthalten, die 6,0 · 10&sup5; T4-Zellen entfernten, wobei sie ein Bead/Zell-Verhältnis von 100 lieferten. Tabelle 14: T4-Zellenverarmung unter Verwendung magnetischer Beads

C. Erythrozyten/Blutplättchen-Test.

Ein Erythrozyten/Blutplättchen-Test wurde unter Verwendung von 0-250 ul 0,25% Gew./Vol. Feststoff enthaltenden, mit monoklonalem Antikörper PLT-1 konjugierten magnetischen Beads durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigen, dass 200 ul 0,25% Gew./Vol. Feststoff enthaltende Beads 7,92 · 10&sup8; Teilchen enthalten, die 9,2 · 10&sup6; Blutplättchen entfernten, wobei sie ein Bead/Blutplättchen-Verhältnis von 8,6 lieferten. Tabelle 15: Blutplättchenverarmung unter Verwendung magnetischer Beads

D. Knochenmarkzelltest

Ein Knochenmarkzelltest wurde unter Verwendung von 0-250 ul, 0,125% Gew./Vol., mit monoklonalem Antikörper MO2 konjugierten magnetischen Beads durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigen, dass 200 ul, 0,125% Gew./Vol. Feststoff enthaltende Beads 4,0 · 10&sup8; Teilchen enthalten, die schätzungsweise 4,8 · 10&sup4; Monozyten entfernen, wobei sie ein Bead/Monozyten-Verhältnis von 8,3 · 10³ liefern. Tabelle 16: Verarmung von Monozytenzellen unter Verwendung magnetischer Beads

E. Knochenmarkzelltest

Ein Knochenmarkzelltest wurde unter Verwendung von 0-250 ul, 0,1% Gew./Vol. Feststoff enthaltenden, mit monoklonalem Antikörper KC-48 konjugierten Beads durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigen, dass 150 ul, 0,1% Gew./Vol. enthaltende Beads 2,4 · 10&sup8; Teilchen enthalten, die schätzungsweise 1,6 · 10&sup6; Granulozyten entfernen, wobei sie ein Bead/Granulozyten-Verhältnis von 149 liefern. Tabelle 17: Verarmung von Granulozytenzellen unter Verwendung magnetischer Beads
Eine ähnliche Verarmungsuntersuchung wurde unter Verwendung der gleichen Kontrollprobe wie in Tabelle 17 und 0-250 ul, 0,5% Gew./Vol. Feststoff enthaltenden, mit monoklonalem Antikörper 1D3 konjugierten magnetischen Beads durchgeführt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 18 zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigen, dass 50 ul, 0,5% Gew./Vol. Feststoff enthaltender Beads 4,0 · 10&sup8; Teilchen enthalten, die schätzungsweise 1,54 · 10&sup6; Neutrophile entfernen, wobei sie ein Bead/Neutrophilen-Verhältnis von 260 liefern. Tabelle 17. Verarmung neutrophiler Zellen unter Verwendung magnetischer Beads.

F. T11/B4-Lymphoidzelltest.

Ein T11/B4-Lymphoidzelltest wurde unter Verwendung von 0-60 ul, 0,25% Gew./Vol. Feststoff enthaltender, mit monoklonalem Antikörper T11 konjugierten, magnetischen Beads durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 zusammengefasst. Die Ergebnissse zeigen, dass 20 ul 0,25% Gew./Vol. Feststoff enthaltender Beads 8,0 · 10&sup7; Teilchen enthalten, die schätzungsweise 6,46 · 10&sup5; T11+ Zellen entfernen, wobei sie ein Bead/T11+ Zellen-Verhältnis von 124 liefern. Tabelle 19. Verarmung von T11+ Zellen unter Verwendung von magnetischen Beads
Eine zweite Verarmunguntersuchung wurde unter Verwendung der gleichen Kontrollprobe, wie die in Tabelle 19 verwendete, durchgeführt und die Proben unter Verwendung von 5-60 ul, 0,25% Gew./Vol. Feststoff enthaltenden, mit monoklonalem Antikörper B4 konjugierten magnetischen Beads verarmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 20 zusammengefasst. Die Ergebnisse zeigen, dass 40 ul 0,25% Gew./Vol. Feststoff enthaltender Beads 1,6 · 10&sup8; Teilchen enthalten, die schätzungsweise 1,23 · 10&sup5; B4+ Zellen entfernen, wobei sie ein Bead/B4+-Zellen- Verhältnis von 1300 liefern. Tabelle 20 Verarmung von B4+-Zellen unter Verwendung magnetischer Beads

G. Knochenmarkzelltest unter Verwendung magnetischer Beads.

Ein Knochenmarkzellverarmungstest an wbc wurde unter Verwendung von 0-250 ul , 0,5% Gew./Vol. Feststoff enthaltender, mit monoklonalem Antikörper KC-56 konjugierten, magnetischen Beads durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 zusammengefasst. Die Ergebnissse zeigen, dass 250 ul Beads 1,98 · 10&sup9; Teilchen enthalten, die schätzungsweise 1,35 · 10&sup6; wbcs entfernen, wobei sie ein Bead/wbc Zellen-Verhältnis von 1470 liefern. Tabelle 21: wbc-Verarmung

Claims

1. Diskrete kolloidale Teilchen mit einer Oberflächenbeschichtung, welche eine Vielzahl seitenständiger funktioneller Gruppen aufweist, wobei die Teilchen umfassen:

(a) einen festen Nicht-Gelatine, Nicht-Aminodextran-Kern;

(b) eine erste Schicht aus mindestens einer Substanz, ausgewählt aus

(i) einer alkaligehärteten Gelatine vom Typ B mit einer Gelstärke nach Bloom von 60 bis 225 und

(ii) einer säuregehärteten Gelatine vom Typ A mit einer Gelstärke nach Bloom im Bereich von 60 bis 300 und

(iii) einem Aminodextran;

(c) wenn die Beschichtung eine Gelatine vom Typ A oder B ist, eine zweite Aminodextranschicht und

(d) seitenständige funktionelle Gruppen, kovalent an die äußerste Schicht gebunden, wobei die oder jede Beschichtung auf dem Kern entweder:

(I) mittels eines chemischen Vernetzungsmittels vernetzt ist oder

(II) nicht vernetzt ist oder mittels eines chemischen Vernetzungsmittels vernetzt ist, wenn die äußerste Beschichtung ein Aminodextran ist, welches kovalent an den Kern gebunden ist.

2. Teilchen nach Anspruch 1, wobei der Kern aus

(i) nur einer magnetischen Substanz,

(ii) einer Polymersubstanz, entweder magnetisch oder nicht magnetisch, die aminreaktive Oberflächengruppen aufweist, und

(iii) einer Polymersubstanz, entweder magnetisch oder nicht magnetisch, welche keine aminreaktiven Oberflächengruppen aufweist, ausgewählt ist und wobei die oder jede Beschichtung des Kerns entweder:

(I) durch die Wirkung eines chemischen Vernetzungsmittels vernetzt ist, wenn der Kern keine aminreaktiven Oberflächengruppen aufweist, oder

(II) nicht vernetzt ist oder mittels eines chemischen Vernetzungsmittels vernetzt ist, wenn die erste Beschichtung ein Aminodextran ist und der Kern aminreaktive Oberflächengruppen aufweist, wobei das Aminodextran kovalent an die Kernoberfläche durch Reaktion zwischen den aminreaktiven Gruppen und den Amingruppen an dem Aminodextran gebunden ist.

3. Teilchen nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Kern eine Polymersubstanz ist und nur die erste Beschichtung vorhanden ist und ein Aminodextran ist.

4. Teilchen nach Anspruch 2, wobei der Kern aus einer Substanz nur aus Polymer oder einer polymeren magnetischen Substanz ausgewählt ist und die erste Beschichtung ein Aminodextran ist.

5. Teilchen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste Beschichtung eine Gelatine vom Typ B umfasst und die zweite Beschichtung ein Aminodextran umfasst, wobei entweder beide Beschichtungsschichten auf der Kernoberfläche vernetzt sind oder die erste Beschichtung auf dem Substrat adsorbiert ist und die zweite Beschichtung daran mittels einer Kondensationsreaktion gebunden ist.

6. Teilchen nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Kern eine magnetische Substanz umfasst.

7. Teilchen nach Anspruch 6, wobei die Kernoberfläche hydrophob ist.

8. Teilchen nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Kern eine Größe von 0,1 um bis 5,0 um aufweist.

9. Teilchen nach Anspruch 8, wobei der Kern zwischen 0,1 und 1,0 um groß ist.

10. Teilchen nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Kern Polystyrol- Latex umfasst.

11. Teilchen nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Kernoberfläche aminreaktive funktionelle Gruppen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aldehyden, Carbonsäuren und Estern und Tosylgruppen, aufweist.

12. Teilchen nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Vernetzungsmittel Glutaraldehyd ist.

13. Teilchen nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Aminodextran aus 1X-, 2X-, 3X- oder 5X-Aminodextran ausgewählt ist.

14. Teilchen nach Anspruch 13, wobei das Aminodextran ein 5X-Aminodextran ist.

15. Teilchen nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die seitenständigen funktionellen Gruppen der äußersten Beschichtung aus der Gruppe der Aminogruppen, Maleimidylgruppen, Sulfhydrylgruppen und einer biologischen Substanz ausgewählt sind.

16. Teilchen nach Anspruch 15, wobei die seitenständigen funktionellen Gruppen biologische Substanzen, ausgewählt aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern und biologischen Zellen, sind.

17. Teilchen nach Anspruch 16, wobei die funktionellen Gruppen polyklonale Antikörper sind.

18. Teilchen nach Anspruch 16, wobei die funktionellen Gruppen monoklonale Antikörper sind.

19. Teilchen nach Anspruch 15, wobei die seitenständigen funktionellen Gruppen Aminogruppen sind.

20. Teilchen nach Anspruch 15, wobei die seitenständigen funktionellen Gruppen aus Maleimidylgruppen und Sulfhydrylgruppen ausgewählt sind.

21. Teilchen nach Anspruch 20, wobei eine biologische Substanz entweder an die Maleimidylgruppen oder die Sulfhydrylgruppen gebunden ist.

22. Teilchen nach Anspruch 21, wobei die biologische Substanz wie in einem der Ansprüche 16 bis 18 definiert ist.

23. Teilchen nach einem der Ansprüche 21 oder 22, wobei die biologische Substanz reaktive Substituenten umfasst, ausgewählt aus Sulfhydryl- und Maleimidylsubstituenten, mit der Maßgabe, daß, wenn die seitenständigen funktionellen Gruppen der Teilchen Maleimidylgruppen sind, die reaktiven Substituenten Sulfhydrylgruppen sind, und daß, wenn die seitenständigen funktionellen Gruppen Sulfhydrylgruppen sind, die reaktiven Substituenten Maleimidylgruppen sind.

24. Teilchen nach Anspruch 15, wobei die funktionellen Gruppen eine biologische Substanz umfassen, die an die äußerste Beschichtung des Kerns gebunden ist.

25. Teilchen nach Anspruch 24, wobei die biologische Substanz an die äußerste Beschichtung über eine bifunktionale Verbrückungsgruppe gebunden ist.

26. Teilchen nach Anspruch 25, wobei die Verbrückungsgruppe eine funktionelle Gruppe wie in den Ansprüchen 16 oder 17 definiert umfasst, bevorzugt ein Polyamin mit einer Amingruppe, gebunden an die äußerste Beschichtung, und eine andere Amingruppe oder Gruppen, gebunden an eine Einheit, welche eine reaktive Maleimidyl- oder Sulfhydrylgruppe aufweist, wobei das Polyamin aus Ethylendiamin, 1,3-Diaminopropan, 1,4-Cyclohexandiamin, 1,4-Cyclohexendiamin, 1,4-Phenylendiamin, Diethylentriamin und Aminodextranen ausgewählt ist.

27. Teilchen nach einem der Ansprüche 23 bis 26, wobei die Sulfhydrylgruppen auf der biologischen Substanz natürlich vorhanden sind oder durch Modifikation einer Aminogruppe oder Gruppen, die natürlich auf der biologischen Substanz vorhanden sind, unter Verwendung von 2-Iminothiolanhydrochlorid erzeugt worden sind, wobei die Maleimidylgruppen durch Modifikation einer Aminogruppe oder Gruppen auf der biologischen Substanz unter Verwendung eines Maleimidyl-enthaltenden Reagenzes erzeugt worden sind.

28. Verfahren zur Herstellung kollodialer Teilchen nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Beschichten des Kerns mit (i) einer alkaligehärteten Gelatine vom Typ B mit einer Gelstärke nach Bloom in dem Bereich von 60 bis 225; (ii) einer säuregehärteten Gelatine vom Typ A mit einer Gelstärke nach Bloom in dem Bereich von 60 bis 300 oder (iii) einem Aminodextran;

(b) Beschichten des Produkts aus den Schritten (a)(i) oder (a)(ii) mit einem Aminodextran;

(c) entweder (i) kein Vernetzen der Beschichtung des Produkts aus Schritt (a)(iii), wenn das Aminodextran kovalent an den Kern gebunden ist, oder (ii) Vernetzen der oder jeder Beschichtung des Produkts aus den Schritten (a)(iii) oder (b) mit einem chemischen Vernetzungsmittel;

(d) Blockieren jeglicher vorliegender freier, nicht reagierter, funktioneller Gruppen des Vernetzungsmittels durch Reaktion der funktionellen Gruppen mit einem Polyamin, wobei mindestens eine Aminogruppe des Polyamins unreagiert verbleibt, und

(e) Waschen des Produkts von Schritt (d) oder (c)(i).

29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Produkt von Schritt (e) mit mindestens einer Verbindung umgesetzt wird, ausgewählt aus:

(i) einem Reagenz, welches in dem Produkt mit seitenständigen Sulfhydrylgruppen resultiert,

(ii) einem Reagenz, welches in dem Produkt mit seitenständigen Maleimidylgruppen resultiert, und

(iii) einem Reagenz, welches in dem Produkt mit seitenständigen biologischen Substanzen resultiert, vorzugsweise wie in einem der Ansprüche 16 bis 18 oder 23 definiert.

30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, wobei das Polyamin wie nach Anspruch 26 definiert ist.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei in Schritt (a), wenn die Kernsubstanz eine magnetische Substanz ist, die Kernsubstanz mit einer Gelatine vom Typ B beschichtet wird, und wenn die Kernsubstanz eine Polymerverbindung ohne aminreaktive funktionelle Oberflächengruppen ist, die Kernsubstanz mit einer Gelatine vom Typ A beschichtet wird, und wenn die Kernsubstanz eine Polymersubstanz mit aminreaktiven funktionellen Gruppen ist, die Kernsubstanz mit einem Aminodextran beschichtet wird, und in Schritt (c)(i) das Aminodextran kovalent an die aminreaktiven Gruppen auf der Kernoberfläche gebunden wird.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 31, wobei der Kern metallisch ist und das Verfahren in Schritt (a)

(i) das Herstellen metallischer Kernteilchen in einer Gelatine, bevorzugt in einer Gelatine vom Typ B, oder

(ii) das Adsorbieren einer Gelatine als erste Beschichtung an vorgeformte metallische Teilchen und das Adsorbieren eines Aminodextrans auf der Oberfläche der Gelatine beschichteten Teilchen als zweite Beschichtung oder

(iii) das Adsorbieren einer Gelatine als erste Beschichtung auf vorgeformte metallische Teilchen und das Anbinden eines Aminodextrans an die Gelatine als zweite Beschichtung mittels einer Kondensationsreaktion umfasst,

wobei das Verfahren weiter nach Waschen gegebenenfalls das Derivatisieren der resultierenden Teilchen durch Umsetzung mit einem bifunktionalen Verbrückungsreagenz zum Einbringen seitenständiger funktioneller Gruppen umfasst, wobei die funktionellen Gruppen bevorzugt wie nach Anspruch 29 definiert sind.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die resultierenden Teilchen mit einem bifunktionalen Verbrückungsmittel umgesetzt werden.

34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Gelatine eine Gelatine vom Typ B ist und worin (iii) des Anspruchs 32 durch Mischen des Kernmaterials mit einer 1%igen (Gewicht/Volumen) wässrigen Gelatinelösung durchgeführt wird, wobei die Umsetzung mit dem bifunktionalen Verbrückungsreagenz in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung bei Umgebungstemperatur für 0,5 bis 1,5 Stunden durchgeführt wird, um Teilchen mit reaktiven terminalen Maleimidyl- oder Sulfhydrylgruppen, gebunden an die Teilchenoberfläche, herzustellen, wobei das Verfahren weiter die folgenden Schritte umfasst:

(i) Herstellen eines Antikörpers zur Bindung an die Teilchen durch Erzeugung reaktiver Substituenten, welche aus Sulfhydrylgruppen und Maleimidylgruppen ausgewählt sind, auf dem Antikörper;

(ii) Umsetzen der Teilchen und des Antikörpers durch Mischen für 1 bis 3 Stunden, wobei die reaktiven Substituenten auf dem Antikörper an die funktionellen Gruppen auf den Teilchen gebunden werden, und Abtrennen der resultierenden Antikörper-enthaltenden Teilchen von dem Reaktionsmedium und Waschen mit gepufferter Kochsalzlösung;

(iii) Blockieren nicht reagierter Gruppen, die auf dem Produkt des vorstehenden Schrittes (ii) vorhanden sind, und

(iv) Abtrennen und Waschen der Antikörper-enthaltenden Teilchen mit einer Lösung von etwa 1% Bovine Serum Albumin in 0,1%igem Natriumazid in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, Lagern der gewaschenen Teilchen in der Lösung bei etwa 4ºC für 8 bis 16 Stunden, erneutes Waschen der Teilchen und Lagern bis zur benötigten Verwendung.

35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei (ii) des Anspruchs 32 durch Waschen der Gelatine beschichteten Teilchen mit einer Lösung eines Aminodextrans, Lagern der Teilchen für bis zu 6 Monate vor Suspendieren der Teilchen in einer Aminodextran-Beschichtungslösung durchgeführt wird, wobei das Verfahren vor der Umsetzung der Teilchen mit dem bifunktionalen Verbrückungsreagenz weiter die folgenden Schritten umfasst:

(i) Mischen der Teilchensuspension mit einer Lösung von Glutaraldehyd für etwa eine Stunde, wobei die Gelatine/Aminodextran-Oberfläche vernetzt wird;

(ii) Zugeben von Ethylendiamin zu der Suspension und Mischen für 1 bis 4 Stunden,

(iii) Zugeben von Natriumborhydrid zu der Suspension und Mischen,

(iv) Abtrennen der Teilchen von der Suspension und Waschen mit einer 0,2 M wässrigen NaCl;

(v) Umsetzen der Teilchen vom vorstehenden Schritt (iii) oder (iv) mit Ethylendiamin in einer 0,2 M wässrigen NaCl-Lösung, die 1-Ethyl-3-(3- diethylaminopropyl)carbodiimid enthält, unter Mischen bei Umgebungstemperatur und

(vi) Abtrennen der Teilchen und Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 31, wobei der Kern eine polymere Substanz ist, die aminreaktive funktionelle Gruppen aufweist oder nicht, wobei das Verfahren weiter umfasst:

(A) Beschichten einer Gelatine, bevorzugt einer Gelatine vom Typ A, oder eines Aminodextrans auf die Kernoberfläche entweder durch:

(i) Adsorbieren der Gelatine oder des Aminodextrans auf der Kernoberfläche oder

(ii) kovalentes Anbinden des Aminodextrans an den Kern durch Umsetzung der Aminodextran-Amingruppen mit den aminreaktiven Gruppen auf dem Kern;

(B) (i) Vernetzen der Gelatine- oder Aminodextranbeschichtung des Schritts (A)(i) mittels eines chemischen Vernetzungsmittels oder (ii) Nichtvernetzen oder selektives Vernetzen der Aminodextranbeschichtung aus Schritt (A)(ii), wenn vorhanden, durch ein chemisches Vernetzungsmittel.