DE69401359T2

DE69401359T2 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung eines analyten in einer probe

Info

Publication number: DE69401359T2
Application number: DE69401359T
Authority: DE
Inventors: Bruno F-69160 Tassin-La-Demi-Lune Colin; Michel F-69290 Saint-Genis-Les-Ollieres Goudard; Alain F-69130 Ecully Theretz
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1993-09-20
Filing date: 1994-09-20
Publication date: 1997-04-30
Anticipated expiration: 2014-09-21
Also published as: ES2096486T3; ATE147166T1; EP0720743B1; FR2710410B1; CA2172041A1; WO1995008769A1; FR2710410A1; CA2172041C; DE69401359D1; EP0720743A1; US5773307A

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung eines ggf. in einer Probe enthaltenen Analyten.
Erfindungsgemäß wird unter der Bestimmung eines Analyten die Detektion und/oder die quantitative Analyse jeglicher insbesondere chemischer, biochemischer oder biologischer Substanz verstanden.
Der zu bestimmende Analyt kann, ohne Beschränkung darauf, ein Antigen, ein Hapten, ein Antikörper, ein Peptid, ein Nukleinsäurefragment (DNA oder RNA), ein Enzym, ein Substrat sein, unter der Bedingung, daß der Analyt einen Liganden enthält, der zumindest eine Erkennungsstelle aufweist, die zu einer spezifischen Bindung an einen bestimmten Anti-Liganden geeignet ist.
In der Patentanmeldung EP-0 339 623 ist ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe beschrieben, in dem:
i) die Probe in eine flussige Phase gebracht wird, wobei der Analyt einen Liganden enthält, der zumindest eine für einen Anti-Liganden spezifische Erkennungsstelle aufweist
ii) zumindest ein reaktives Agens bereitgestellt wird, das Metallpartikel in Suspension in flüssiger Phase enthält, die eine Größe von einigen Nanometern aufweisen, und die von der flüssigen Phase nicht magnetisch oder elektromagnetisch trennbar sind, wobei jedes Partikel einen Metallkern aufweist, auf dem direkt oder indirekt zumindest ein Anti-Ligand fixiert ist
iii) die Probe und das reaktive Agens, ggf. mit einem weiteren reaktiven Agens, insbesondere durch Inkubation in Kontakt gebracht werden, um metallische Aggregate zu erhalten
iv) die metallischen Aggregate in ein Magnetfeld gebracht werden, um die metallischen Aggregate zu sammeln
v) die gesammelten metallischen Aggregate durch Lichtbeugung detektiert werden, um ein Signal zu erhalten, das der Masse an Metall der Aggregate entspricht, und mit der ursprünglich in der Probe enthaltenen Menge des Analyten korreliert.
Das dem Dokument EP-A-0 339 623 entsprechende Verfahren weist den Nachteil auf, sich eines besonders komplizierten Mittels zur Detektion der durch das Magnetfeld gesammelten metallischen Aggregate zu bedienen, da in der Praxis eine Quelle für monochromatisches, kohärentes Licht (Laser), ein Detektor für das gebeugte Licht und eine Verarbeitung für das erhaltene Lichtsignal notwendig sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, das sich einer viel einfacheren Detektionvorrichtung bedient, und das es erlaubt, die Masse an Metall der gesammelten metallischen Aggregate prazise mit der in der Probe enthaltenen Menge des Analyten zu korrelieren.
Erfindungsgemäß wird die Masse an Metall der Aggregate mit Hilfe eines magnetischen oder magnetisierbaren Meßfühlers detektiert, der das zum Sammeln der metallischen Aggregate dienende Feld erzeugt, wobei der Meßfühler in der Umgebung der Probe plaziert wird und einer Verlagerung oder einer Kraft unter der Wirkung der gesammelten metallischen Aggregate ausgesetzt wird, um ein Verlagerungs- oder Kraftsignal zu erhalten, das der Masse an Metall der Aggregate entspricht.
Wohlgemerkt wird unter magnetischem Meßfühler gleichfalls jeder elektromagnetische Meßfühler oder ähnliches verstanden.
Die Ausdrücke Ligand und Anti-Ligand, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beziehen sich auf jegliche biologische Moleküle, die einen Liganden/Anti-Liganden- Komplex ausbilden können, wie bspw. Antigen/Antikörper-Komplexe, Antikörper/Hapten-Komplexe, Hormon/Rezeptor-Komplexe, Protein/Antikörper-Komplexe, Biotin/Streptavidin-Komplexe, Lectin/Zucker-Komplexe, Komplexe zwischen Chelator/cheliertem Molekül, Oligonukleotid/Oligonukleotid-Hybride, Oligonukleotid/Nukleinsäure-Hybride, Enzym/Subtrat-Komplexe; es versteht sich, daß es sich in gleicher Weise um ein DNA- oder RNA-Fragment handeln kann, wenn der Ligand ein Nukleinsäurefragment ist.
Erfindungsgemäß werden unter Antikörpern monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, Antikörperfragmente und Antikörper, die durch genetische Rekombination erhalten wurden, verstanden.
Unter Partikeln, die in flüssiger Phase nicht magnetisch oder elektromagnetisch trennbar sind, werden Partikel verstanden, die in Abwesenheit eines magnetischen oder elektromagnetischen Feldes nicht sedimentieren können, und die, wenn sie in Anwesenheit eines magnetischen oder elektromagnetischen Feldes nicht sedimentiert sind, und die nach einem Größenkriterium ausgewählt sind, um nicht von diesem Feld angezogen zu werden.
Das Messen der Masse an Metall der metallischen Aggregate kann während oder nach dem Inkontaktbringen der Probe mit dem reaktiven Agens durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß kann der magnetische Meßfühler bspw. ein Magnet sein, der fest mit der Waagschale einer Waage verbunden ist, und die Masse an Metall der metallischen Aggregate wird durch negatives Wiegen gemessen, d.h. durch Messen der Gewichtsverringerung der Waagschale.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird folgendes vorgesehen:
- ein primäres reaktives Agens, das metallische Partikel in Suspension in flüssiger Phase enthält, die nicht magnetisch von der flüssigen Phase trennbar sind, wobei jedes Partikel einen Metallkern aufweist, auf dem direkt oder indirekt zumindest ein Anti-Ligand fixiert ist, der zur Reaktion mit einer Erkennungsstelle des Liganden des Analyten geeignet ist
- ein sekundäres reaktives Agens, das metallische Partikel in Suspension in flüssiger Phase enthält, die nicht magnetisch von der flüssigen Phase trennbar sind, wobei jedes Partikel einen Metallkern aufweist, auf dem direkt oder indirekt zumindest ein weiterer Anti-Ligand fixiert ist, der zur Reaktion mit einer weiteren Erkennungsstelle des Liganden des Analyten geeignet ist.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält der Ligand des Analyten zumindest zwei identische oder unterschiedliche Erkennungsstellen für Anti-Liganden des reaktiven Agens, die genügend weit voneinander entfernt sind, um ein und denselben Liganden mit zwei Anti-Liganden zu verbinden.
In einer weiteren Ausführung weist der Anti-Ligand des reaktiven Agens zwei Rezeptorstellen für den Liganden des Analyten auf, die genügend weit voneinander entfernt sind, um ein und denselben Anti-Liganden mit zwei Liganden zu verbinden.
In einer weiteren Ausführung des Verfahrens weist der Anti- Ligand des reaktiven Agens zumindest zwei Rezeptorstellen und der Ligand des Analyten zumindest zwei Erkennungsstellen auf, die jeweils spezifisch für die beiden Rezeptorstellen des reaktiven Agens sind.
In einer besonderen Ausführung sind das primäre und das sekundäre reaktive Agens identisch und der Ligand des Analyten weist zumindest zwei identische Erkennungsstellen auf.
Wenn die primären und sekundären reaktiven Agenzien identisch sind, kann das primäre reaktive Agens einen zweiten Anti-Liganden aufweisen, der von dem ersten verschieden ist, und der dazu geeignet ist, an eine Erkennungsstelle des Liganden des Analyten zu binden, die von der durch den ersten Anti- Liganden erkannten Stelle verschieden ist.
Zu einer Bestimmung des Analyten durch Kompetition wird ein weiteres reaktives Agens, ein sogenannter Kompetitor, eingebracht, der Partikel in Suspension in flüssiger Phase enthält, die von der flüssigen Phase nicht magnetisch trennbar sind, wobei jedes Partikel einen Metallkern aufweist, auf dem direkt oder indirekt ein weiterer Ligand fixiert ist, der spezifisch von dem Anti-Liganden des reaktiven Agens erkannt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, enthaltend:
i) einen Behälter zur Aufnahme einer zu bestimmenden Probe in flüssiger Phase, wobei der Analyt einen Liganden enthält, der zumindest eine für einen Anti-Liganden spezifische Erkennungsstelle aufweist
ii) mit zumindest einem reaktives Agens, das metallische Partikel in Suspension in flüssiger Phase enthält, die von der flüssigen Phase nicht magnetisch trennbar sind, wobei jedes Partikel einen Metallkern aufweist, auf dem direkt oder indirekt zumindest ein Anti-Ligand fixiert ist, der zumindest eine Rezeptorstelle für einen Liganden aufweist
iii) die Probe, das reaktive Agens und ggf. ein weiteres reaktives Agens, die in dem Behälter insbesondere durch Inkubation in Kontakt gebracht werden, um metallische Aggregate zu erhalten
iv) ein magnetisches Mittel, das ein magnetisches Feld aufbaut, in das die metallischen Aggregate gebracht werden, um letztere zu sammeln
v) ein Mittel zur Detektion der gesammelten metallischen Aggregate, um ein Signal zu erhalten, das der Masse an Metall der Aggregate entspricht, und das mit der ursprünglichen in der Probe enthaltenen Menge des Analyten korreliert,
wobei das Mittel zur Detektion der Masse an Metall, das einen magnetischen oder magnetisierbaren Meßfühler aufweist, der das magnetische Mittel gemäß iv) enthält, in der Umgebung der Probe plaziert ist, und einer Verlagerung oder einer Kraft unter Einwirkung der gesammelten metallischen Aggregate ausgesetzt wird, um ein Verlagerungs- oder Kraftsignal zu erzeugen, das der Masse an Metall der Aggregate entspricht.
In einer besonderen Ausgestaltung ist der Meßfühler fest mit der Waagschale einer Waage verbunden, die ein negatives Wiegesignal erzeugt, das der Gewichtsverringerung der Waagschale und der Masse an Metall der Aggregate entspricht.
Beispielsweise ist der Metallkern der Partikel des reaktiven Agens ausgewählt unter den Materialien, die intrinsisch magnetisch oder magnetisierbar sind, wie bspw. komplexe Salze und Oxide, Boride, Eisensulfide, Kobalt, Nickel und Elemente der seltenen Erden, die eine erhöhte magnetische Suszeptibilität aufweisen, wie bspw. Hamatit und Ferrite. Der Metallkern der Partikel enthält reine Metalle oder Legierungen, die eines oder mehrere dieser Elemente enthalten. Der Metallkern ist vorzugsweise so ausgewghlt, daß er frei von Restmagnetismus ist, und seine mittlere Größe liegt im Bereich von 5 bis 30 nm, insbesondere im Bereich von 10 bis 20 nm. Der Metallkern kann 5 bis 10 Gew.-% insbesondere 25 bis 65 Gew.-% der unlöslichen Partikel ausmachen.
Die Partikel können zusätzlich zu dem Metallkern eine Hülle aufweisen. Die Zusammensetzung der Hülle ist in dem Maße nicht kritisch, in dem sie die Bindung der Liganden und Anti-Liganden möglich macht, und in dem sie dazu geeignet ist, Interaktionen mit dem Metallkern einzugehen. Beispielsweise kann die Hülle ein natürliches, chemisch modifiziertes oder nicht-modifiziertes Polymer sein, bspw. ein Polysaccharid wie Agarose, Dextran und Derivate der Zellulose wie bspw. die Carboxymethylzellulose; ein Protein wie bspw. Gelatine und ein Albuminpolymer; ein synthetisches, chemisch modifiziertes oder nicht-modifiziertes Polymer wie bspw. Acrylsäuren oder Methacrylsäuren.
Die mittlere Größe der Partikel des reaktiven Agens liegt im Bereich von 20 bis 100 nm, insbesondere im Bereich von 50 bis 70 nm.
Das oder die reaktiven Agenzien werden mit einer flüssigen Probe gemischt, von der angenommen wird, daß sie den Analyten, und damit den Liganden enthält, und bspw. einer Inkubation ausgesetzt. Das Inkontaktbringen der Probe und des reaktiven Agens wird bei einem bestimmten pH-Wert durchgeführt, der abhangig von der Natur des zu detektierenden Liganden ist. Obwohl das Inkontaktbringen bei einer großen Bandbreite von Temperaturen zwischen 2 und 95ºC durchgeführt werden kann, ist die vorteilhafterweise ausgewählte Temperatur Raumtemperatur oder eine Temperatur, die im Bereich von 37 bis 40ºC liegt. Die Zeit des Inkontaktbringens wird in Abhängigkeit der Art der quantitativen Analyse bestimmt, gemäß den an sich bekannten gangigen Arbeitsbedingungen.
In der Regel wird ein Puffer verwendet, um den gewünschten pH-Wert aufrechtzuerhalten. Die Pufferlösung, die verwendet werden kann, kann ausgewählt werden unter einem Phosphorsäure puffer oder einem Trispuffer etc. In bestimmten Fällen werden Salze, Proteine oder Detergenzien zu dem Gemisch hinzugegeben, um unspezifische Reaktionen zu vermeiden.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der beiliegenden Zeichnung im Anhang und der folgenden Beispiele erläutert.
Die Zeichnung enthält die Figuren 1 bis 4, in denen:
Figur 1 eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe gemäß der Erfindung zeigt,
Figuren 2, 3 und 4 Kurven zeigen, die den als arbiträre magnetische Einheiten ausgedrückten negativen Gewichten (in auf der Waage abgelesenen µg) als Funktion der Zeit für Konzentrationen an Antiferritin-Antikörpern von jeweils 100 µg, 25 µg und 10 µg je mg an metallischen Partikeln entsprechen. Für jede Konzentration wurden drei Verdünnungen getestet, 1/5 (a), 1/10 (b) und 1/20 (c), und für jede Verdünnung wurden drei Versuche durchgeführt: ein Blindwert (in den Kurven durch ein ausgefülltes Quadrat repräsentiert), einen Test mit 10 µl Ferritin (in den Kurven durch ein unausgefülltes Quadrat repräsentiert), und einen Versuch mit 50 µl Ferritin (in den Kurven durch eine ausgefüllte Raute repräsentiert).
Gemäß Figur 1 besteht eine erfindungsgemäße Vorrichtung (1) aus einer handelsüblichen Standard-Präzisionswaage vom Typ Mettler MT5, wobei unter der oberen Scheibe (2) ein Magnet (3) plaziert ist, der einen Durchmesser von 13 mm und eine Höhe von 5 mm aufweist, und wobei der Magnet fest mit der Waagschale (4) der Waage unter Vermittlung eines vertikalen, nicht-magnetischen Stabes (5) verbunden ist. Ein Behälter (6), der die zu bestimmende Probe aufnimmt, liegt auf einem Aluminiumblatt, das über dem Magneten plaziert ist, ohne jedoch Kontakt mit ihm zu haben. Der Abstand zwischen dem Magneten und dem Behälter beträgt 1 mm. Die Probe und das reaktive Agens (7) werden in dem Behälter (6) in Kontakt gebracht.

BEISPIEL 1: Bestimmung von Ferritin

a) Synthese von Fe&sub3;O&sub4;/Dextran T40-Partikeln (50 %)

14 Gramm Dextran T40 (Mw = 40.000, Pharmacia) werden zu 14 ml Wasser gegeben, und man läßt das Dextran bei Raumtemperatur auflösen, um eine erste Lösung zu bilden.
Eine zweite Lösung wird mit 3 Gramm FeCl&sub3;, 6H&sub2;O (Mw = 270,30) und 1,3 Gramm FeCl&sub2;, 4H&sub2;O (Mw = 198,81) in 20 ml Wasser hergestellt.
Die zwei Lösungen werden in einen doppelwandigen 250 ml- Reaktor eingebracht, der mit einem Rührmotor, der auf ungefähr 200 bis 250 upm eingestellt ist, mit einem Glasrührer und einem Tropftrichter, der eine 7,5-%ige NH&sub4;OH-Lösung (v/v) enthält, ausgestattet ist.
Bei Raumtemperatur wird die 7,5-%ige NH&sub4;OH-Lösung (v/v) Tropfen für Tropfen bis zu einem endgültigen pH-Wert im Bereich von 10 bis 11 zugefügt. Der Reaktor wird für ungefähr 60 Minuten auf 70ºC gebracht. Am Ende der Reaktion wird die Lösung wiedergewonnen und extensiv gegen 5 l destilliertes Wasser dialysiert, dann wird sie über Quarzwolle futriert. Die Lösung wird danach dreimal bei 600 upm für 5 Minuten zentrifugiert.
Um das Dextran zu entfernen, das nicht reagiert hat, werden die Partikel auf eine 33 x 2,5 cm Sephacryl S300 HR-Säule (Pharmacia) aufgebracht, die zuvor mit einem Puffer aus 0,1 M Acetat, 0,15 M NaCl, 0,05 % NaN&sub3;, bei pH 6,5, äquilibriert wurde.
Die gewonnenen metallischen Partikel haben einen äußeren Durchmesser im Bereich von 20 bis 900 nm, vorzugsweise im Bereich von 50 bis 70 nm, mit einer Dextranschicht. Sie werden bei +4ºC aufgewahrt.

b) Präparation der Antiferritin-Antikörper tragenden Partikel

Die Partikel werden dreimal gegen einen PBS-Puffer (0,15 M, 2 Liter, pH 6,8), jeweils für 2, 4 Stunden und eine Nacht dialysiert. Diese Partikel werden lichtgeschützt für ungefähr 2 Stunden durch Zugabe von Natriumperjodat (0,1 M) bei einer Endkonzentration im Reaktionsansatz von 10 rim oxidiert. Die Partikel werden danach erneut zweimal gegen eine NaCl-Lösung (0,15 M, 2 Liter) jeweils für ungefähr 4 Stunden und eine Nacht dialysiert. Der pH wird durch Zugabe von NaHCO&sub3; auf ungefähr 8 eingestellt.
Zu der Lösung mit den metallischen Partikeln werden 100 µg Antiferritin-Antikörper zugegeben (Bambou 8, von der Firma CLONATEC hergestellt). Das Gemisch wird bei 25ºC unter mildem Rühren von 5 Stunden bis zu einer Nacht inkubiert. Das so gebildete Gemisch wird durch Zugabe einer Natriumborhydridlösung (mit einer Endkonzentration von 20 mM im gesamten Reaktionsansatz) und unter leichtem Rühren für ungefähr 30 Minuten reduziert. Das Gemisch wird dreimal gegen 2 Liter eines Natriumphosphatpuffers (0,05 M) -0,15M NaCl, pH 7,5, für ungefähr 2 Stunden dialysiert. Die fertige Lösung enthält 2,25 g an metallischen Partikeln je ml Lösung, 10 bis 100 µg Anti-Ferritin je mg Partikel.

c) Bestimmung von Ferritin

Die Lösungen wurden wie nachstehend beschrieben getestet. Die Lösungen mit 2,25 mg Partikeln je ml und jeweils 10, 25 und 100 µg Antiferritin/mg Partikel werden jeweils nach der Verdünnung auf ein Fünftel, ein Zehntel und ein Zwangzigstel mit Hilfe der in Figur 1 beschriebenen Vorrichtung getestet.
500 µl jeder verdünnten Lösung werden jeweils in zwei Glasröhrchen gegeben, zu denen jeweils 10 und 50 µl Ferritin (2.000 mg/ml) zugegeben werden. Die Lösungen werden gegen einen Blindwert ohne Ferritin getestet. Die magnetische Anziehungskraft wird im Zeitverlauf gemessen. Die Werte sind Werte aus dem negativen Abwiegen, die in arbiträren magnetischen Einheiten angegeben werden.
Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen aufgeführt:
Konzentrationen der Antiferritin-Antikörper: 100 µg/mg Partikel Verdünnung 1/5 Verdünnung 1/10 Verdünnung 1/20
Konzentration an Antiferritin-Antikörpern: 25 µg/mg Partikel Verdünnung 1/5 Verdünnung 1/10 Verdünnung 1/20
Konzentration an Antiferritin-Antikörpern: 10 µg/mg Partikel Verdünnung 1/5 Verdünnung 1/10 Verdünnung 1/20

Beispiel 2: Bestimmung von Listeria-Bakterien in einer biologischen Probe

a) Die in diesem Beispiel verwendeten metallischen Partikel wurden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll hergestellt.
b) Herstellung von Partikeln, die zumindest einen gegen Listeria gerichteten Antikörper, im folgenden Ac Anti-L benannt, tragen.
Die gemäß a) in Beispiel 1 synthetisierten Partikel werden durch Zugabe von Natriumperjodat (0,1 M) oxidiert.
Nach 45-minütigem Rühren werden die Partikel unter Lichtschutz für 4 Stunden gegen 0,15 M NaCl dialysiert.
Zu der die metallischen Partikel enthaltenen Lösung, deren Konzentration 1 mg an Partikeln je mg des reaktiven Agens beträgt, werden 10 µg/ml an Ac Anti-L zugegeben; der pH wird durch Zugabe von NaHCO&sub3; auf ungefähr 8 eingestellt.
Das Gemisch wird unter leichtem Rühren für 20 Stunden inkubiert. Das so gebildete Gemisch wird durch Zugabe einer Natriumborhydrid-Lösung bei einer Konzentration von 12 x 10&supmin;³ Molen NaBH&sub4; je mg Partikel unter leichtem Rühren für 45 Minuten reduziert. Das Gemisch wird die ganze Nacht gegen einen 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit 0,5 M NaCl bei pH 7,5 dialysiert.
Die fertige Lösung enthält 0,415 mg an metallischen Partikeln je ml des reaktiven Agens, 15,4 µg Ac an Anti-L je mg der Partikel, also ungefähr 6,4 µg an Ac Anti-L je ml des reaktiven Agens.
c) Bestimmung der Listeria-Bakterien
Das reaktive Agens wird auf einer Herz/Hirn-Bouillon mit der Referenz: L. INNO ATCC, 410A 4, Lot/Ch-b 390853 getestet.
Die Bestimmung wird wie in Beispiel 1 auf einer METTLER MT5-Waage unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Behälter: Glasröhrchen mit 10 mm Durchmesser, und 40 mm Höhe,
Magnet: 13 mm Durchmesser und 5 mm Höhe, Norden zeigt nach oben
Abstand Magnet-Röhrchen: 1 mm (ungefähr)
Es wurde eine erste, T2 genannte Lösung getestet, die 500 µl des in b) beschriebenen reaktiven Agens und 10 µl der Bouillon enthält, und zwar nach Rühren und Inkubation, danach wird eine zweite, T3 genannte Lösung, die 500 µl des in b) beschriebenen reaktiven Agens enthält und als Kontrolle dient, getestet.
Die in der folgenden Tabelle aufgeführten Ergebnisse entsprechen den Werten der Messung der magnetischen Anziehungskraft, die zu den Zeiten T&sub0; und T&sub0;&sbplus;&sub4; Stunden abgelesen wurden, wobei die Zeit T&sub0; die Zeit zu Beginn der Reaktion ist, d.h. die Zeit des Positionierens des Behälters über den Magneten.
Die magnetische Anziehungskraft der metallischen Aggregate in der Probe T2 beträgt also -12.000, sie wird mit der Bakterienkonzentration mit Hilfe einer Normalkurve korreliert.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, in dem:

i) die Probe in eine flüssige Phase gebracht wird, wobei der Analyt einen Liganden enthält, der zumindest eine für einen Anti-Liganden spezifische Erkennungsstelle aufweist

ii) zumindest ein reaktives Agens bereitgestellt wird, das metallische Partikel in Suspension in flüssiger Phase enthält, die von der flüssigen Phase nicht magnetisch oder elektromagnetisch trennbar sind, wobei jedes Partikel einen Metallkern aufweist, auf dem direkt oder indirekt zumindest ein Anti-Ligand fixiert ist

iii) die Probe und das reaktive Agens insbesondere durch Inkubation, und gegebenenfalls mit einem weiteren reaktiven Agens in Kontakt gebracht werden, um metallische Aggregate zu erhalten

iv) die metallischen Aggregate in ein Magnetfeld gebracht werden, um die metallischen Aggregate zu sammeln

v) die gesammelten metallischen Aggregate detektiert werden, um ein Signal zu erhalten, das der Masse an Metall der Aggregate entspricht und das mit der ursprünglich in der Probe enthaltenen Menge des Analyten korreliert

dadurch gekennzeichnet, daß die Masse an Metall der metallischen Aggregate mit Hilfe eines magnetischen oder magnetisierbaren Meßfühlers detektiert wird, der das Feld gemäß iv) erzeugt, und der in der Umgebung der Probe plaziert ist, und der einer Verlagerung oder einer Kraft unter der Wirkung der gesammelten metallischen Aggregate ausgesetzt ist, um ein Verlagerungs- oder Kraftsignal zu erhalten, das der Masse an Metall der Aggregate entspricht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der magnetische Meßfühler fest mit der Waagschale einer Waage verbunden ist, und daß die Masse an Metall durch negatives Wiegen, d.h. durch Messung der Gewichtsverringerung der Waagschale, gemessen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

- ein primäres reaktives Agens bereitgestellt wird, das metallische Partikel in Suspension in flüssiger Phase enthält, die nicht magnetisch von der flüssigen Phase trennbar sind, wobei jedes Partikel einen Metallkern aufweist, auf dem direkt oder indirekt zumindest ein Anti-Ligand fixiert ist, der zur Reaktion mit einer Erkennungsstelle des Liganden des Analyten geeignet ist, und daß

- ein sekundäres reaktives Agens bereitgestellt wird, das metallische Partikel in Suspension in flüssiger Phase enth;lt, die nicht magnetisch von der flüssigen Phase trennbar sind, wobei jedes Partikel einen Metallkern aufweist, auf dem direkt oder indirekt zumindest ein weiterer Anti-Ligand fixiert ist, der zur Reaktion mit einer weiteren Erkennungsstelle des Liganden des Analyten geeignet ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand des Analyten zumindest zwei Erkennungsstellen für den Anti-Liganden des reaktiven Agens aufweist, die genügend weit voneinander entfernt sind, um ein und denselben Liganden mit zwei Anti-Liganden zu verbinden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand des Analyten zumindest zwei identische Erkennungsstellen für den Anti-Liganden des reaktiven Agens aufweist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Anti-Ligand des reaktiven Agens zumindest zwei Rezeptorstellen für den Liganden des Analyten aufweist, die genügend weit voneinander entfernt sind, um ein und denselben Anti- Liganden mit zwei Liganden zu verbinden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Anti-Ligand des reaktiven Agens zumindest zwei Rezeptorstellen aufweist, und daß der Ligand des Analyten zumindest zwei Erkennungsstellen aufweist, die jeweils spezifisch für die zwei Rezeptorstellen des reaktiven Agens sind.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 3 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre reaktive Agens und das sekundäre reaktive Agens identisch sind.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Analyt durch Kompetition bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiteres reaktives Agens, ein sogenannter Kompetitor vorgesehen ist, der Partikel in Suspension in flüssiger Phase enthält, die von der flüssigen Phase nicht magnetisch trennbar sind, wobei jeder Partikel einen Metallkern aufweist, auf dem direkt oder indirekt ein weiterer Ligand fixiert ist, der spezifisch von dem Anti-Liganden des reaktiven Agens erkannt wird.

10. Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, enthaltend:

i) einen Behälter zur Aufnahme einer zu bestimmenden Probe in flüssiger Phase, wobei der Analyt einen Liganden enthält, der zumindest eine für einen Anti-Liganden spezifische Erkennungsstelle aufweist,

ii) zumindest ein reaktives Agens, das metallische Partikel in Suspension in flüssiger Phase enthält, die von der flüssigen Phase nicht magnetisch trennbar sind, wobei jedes Partikel einen Metallkern aufweist, auf dem direkt oder indirekt zumindest ein Anti-Ligand fixiert ist, der zumindest eine Rezeptorstelle für den Liganden aufweist

iii) wobei die Probe, das reaktive Agens und ggf. ein weiteres reaktives Agens in dem Behälter insbesondere durch Inkubation in Kontakt gebracht werden, um metallische Aggregate zu erhalten

iv) ein magnetisches Mittel, das ein magnetisches Feld erzeugt, in das die metallischen Aggregate eingebracht werden, um letztere zu sammeln

v) ein Mittel zur Detektion der gesammelten metallischen Aggregate, um ein Signal zu erhalten, das der Masse an Metall der Aggregate entspricht, und das mit der ursprünglich in der Probe enthaltenenen Menge des Analyten korreliert,

dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Detektion der Masse an Metall einen magnetischen oder magnetisierbaren Meßfühler aufweist, der das magnetische Mittel gemäß iv) enthält, der ferner in der Umgebung der Probe plaziert ist, und der einer Verlagerung oder einer Kraft unter Einwirkung der gesammelten metallischen Aggregate ausgesetzt wird, um ein Verlagerungsoder Kraftsignal zu erhalten, das der Masse an Metall der Aggregate entspricht.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßfühler fest mit einer Waagschale (4) einer Waage verbunden ist, die ein negatives Wiegesignal erzeugt, das der Gewichtsverringerung der Waagschale entspricht und das die Masse an Metall der Aggregate darstellt.