JPS6055265A - 磁性粒子を用いた抗原、抗体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 を測定する方法に関するものである。

生体内等の微量成分の測定方法としては抗原抗体反応を
利用した免疫化学的方法が一般的であり、そのなかでも
放射性同位元素を標識物質とするラジオイムノアッセイ
と酵素を標識物質とする酵素免疫測定法とが広く利用さ
れている。

しかしながら、ラジオイムノアッセイは、放射性物質を
使用するところから、放射線による人体障害や公害の問
題があること、放射性同位元素が自然崩壊するため標識
された抗原や抗体を長期保存できないこと、測定に特殊
な設備や測定機器を要することなどの問題があった。ま
た、酵素免疫測定法は測定感度がラジオイムノアッセイ
に及ばないこと、測定操作が比較的煩゛雑なこと、標識
に用いる酵素によっては測定試料である全血あるいは血
清の影響を受け測定精度が低下することなどの問題があ
った。

本発明者らは測定感度が高く、特異性にすぐれ、操作が
簡単で上述の欠点のない測定方法を開発すべく鋭意研究
を重ねた結果、磁性体を標識物質に用いる方法を案出し
、この方法が上記の目的に適合するものであることを見
出して本発明を完成するに至った。

以下、本発明の内容を詳細に説明する。

本発明の方法は、測定対象である抗原と反応する抗体を
固定化した固定化物に、測定対象である抗原と、該固定
化物に固定化された抗体と反応する抗原を固定化した磁
性体含有粒子とを、接触せしめ、固定化物とこの固定化
物に結合しなかった前記の磁性体含有粒子とを分離し、
分離された固定化物又は磁性体含有粒子の磁性を測定す
ることを特徴とする抗原、の測定方法と、この方法にお
いて抗原と抗体を入れ替えた方法と、これらの方法のう
ち接触工程の固定化物と磁性体含有粒子を入れ替えた方
法の４つの態様がある。

測定対象である抗原及び抗体の種類は限定されるもので
はないが、例えば、抗原としてはソゴキシン、テオフィ
リン、フェニトイン力どの合成医薬品、被ニジリン、ア
ミカシン、ケ８ンタマイシンなどの抗生物質、インシュ
リン、ＴＳＨ，Ｔ４、プロスタグランジン、ＩｇＧ、２
−フェトプロティン、グリコリピッド類、ＨＢ８抗原、
ガン抗原などを含む。抗体の例としては、これらの抗原
に対する抗体、各種病原菌に対する抗体などを含む。

抗原又は抗体を固定した固定化物の担体の材質は目的と
する抗体又は抗原を固定できるものであればよい。すな
わち、抗体又は抗原を化学結合によって固定化する場合
には、−Ｍ（２、−ＣＯＯＨｌ−ＣＨＯｌ−ＯＨ、−８
Ｈなどの官能基を有する合成高分子、例えば６−６ナイ
ロン、６ナイロン、アミノ化ポリスチレンなど、あるい
は天然高分子、例えばデキストラン、カルｄ？キノセル
ロースなトラ用いることができる。一方、物理吸着によ
って固定化する場合には、ポリスチレン、カオリン、セ
ラミックスなどを用いることができる。担体の形状は、
要は未反応の磁性体含有粒子と容易（（分離できればよ
く、微細粒子を除く任意の形態をとることができる。形
状の例としては、膜、棒、薄板などを挙げることができ
る。

一方、磁性体含有粒子は鉄、コバルト、ニッケル、これ
らの化合物、合金等の強磁性体を含むものである。強磁
性体は粒子中に均一に分散させるためにコロイド状の微
粒子がよく、例えばフェリコロイド（タイホー工業（株
）製）は適当である。

磁性体含有粒子は抗原又は抗体を固定化しうるものでな
ければならない。粒径は０．１〜１００μｍ程度、特に
１〜１０μｍ程度が通常好ましい。このような磁性体含
有粒子の例としては、前記の強磁性体を含有せしめたマ
イクロカシセル、ポリスチレンラテックスなどの各種ラ
テックス類、ポリアクリルアミドダル及びゼラチン粒子
などを挙げることができる。

ゼラチン粒子は、ゼラチン、水溶性多糖類、メタリン酸
塩及び強磁性体微粒子を含む混合溶液を攪拌しつつそこ
に酸を加えてｐＨ２，５〜６０に調整し、その後アルデ
ヒド系架橋剤を作用せしめて不溶化することによって製
造することができる。

ゼラチンは酸性ゼラチンが好ましい。水溶性多糖類は増
粘剤または糊料として使用しうるものであり、多糖類の
誘導体及び塩も含まれる。例としては、アラビアゴム、
カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、
寒天、カラダーナンなどを挙げることができるが、特に
アラビアゴムが好適である。メタリン酸塩は例えば三メ
タリン酸す］・リウム、ヘキサメタリン酸ナトリウムの
如きものである。

ＰＨ調整前の溶液におけるこれら各物質の濃度としては
、ゼラチン０．０１〜５％程度、好ましくは００５〜１
％程度、水溶性多糖類０．０１〜５係程度、好ましくは
００５〜１係程度、そして強磁性体微粒子０．００００
０１〜１５条程度である。メタリン酸塩はゼラチン乾燥
重量の３〜１５％程度を含有させるようにするのがよい
。各物質はこれらの濃度範囲において、所望の粒子の粒
径および物性に応じて適宜定めればよい。

ＰＨ調整前の溶液にはそのほかのものとして、親水性有
機溶媒、界面活性剤、着色剤などを適宜加える。

このような溶液を調製する過程は問うところではなく、
例えば強磁性体微粒子を除く各々を温水に溶解してから
混合してもよく、各々を一緒に溶解してもよい。しかし
ながら、各物質の溶解を容易にするために親水性有機溶
媒はあとから加えるのがよく、また水溶性多糖類には不
溶成分も少量含まれていることが多いところから、別途
に溶解して添加するのがよい。一方、ゼラチンは等電点
以下のＰＨでは水溶性多糖類と反応して白濁を生ずるの
で酸性ゼラチンを用いる場合にはアルカリを加えて溶液
のＰＨを少なくともその付近にまで高めておくのがよい
。しかしながら、この白濁は生じた後でもアルカリを添
加することによって消すことができる。いずれにせよ、
溶液は酸の添加を開始する甘えには強磁性体微粒子以外
には懸濁物のない状態にしておかなければならない。強
磁性体微粒子はこのような溶液を調製する任意の段階で
所定量を添加し、懸濁させればよい。

溶液の温度はゼラチンのダル化温度以上でなければなら
ない。このダル化温度はゼラチンの濃度等によって異な
るが通例２５〜３０℃程度である。

良好な粒子形成の観点から溶液の温度は特に３５〜５０
℃程度がよい。

次に、この溶液を攪拌しながら酸を加えてＰＨ２５〜６
．０に調整する。この工程は粒子を生成させるところで
ある。均一な粒子を形成させるために、３５〜５０℃に
加温を続け、適度に攪拌しながら酸を滴下していくのが
よい。ｐＨ２，５〜６，０の範囲における至適のＰＨは
原料溶液の組成および目的とする粒径によって異なるの
で予め実験を行なって定めるのがよい。たとえば２〜１
０μｍ程度の粒径にする場合至適のＰＨは４．０〜５．
５の範囲にある。このｐＨ調整に使用する酸は特に限定
されるものではなく無機酸でも有機酸でもよいが、なる
べくおだやかなものがよく、たとえば酢酸などが好適で
ある。

本工程で生成した粒子は系の温度をゼラチンのダル化温
度以下に下げても消失しないので母液との平衡関係は々
い。

酸の添加後は生成した粒子の凝集を防止するために速か
に粒子分散液を冷却するのがよい。そして、液温か１０
℃以下になったところでアルデヒド系架橋剤を添加して
粒子を不溶化する。この架橋剤の添加量はゼラチン乾燥
重量の０１〜２００チ程度であり、添加後は一夜程度放
置して架橋反応を充分に行なわせる。架橋剤の例として
は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、グリオキ
ザール、クロトンアルデヒド、アクロレイン、アセトア
ルデヒドなどを挙げることができるが、特にグルタルア
ルデヒドが好適である。

アルデヒド系架橋剤で処理後は粒子を遠心分離あるいは
磁力を利用する等して回収し、必要により洗浄する。洗
浄液は粒子分散のために用いた界面活性剤と同じものを
同濃度で含む水で２〜３回行なえばよい。

この粒子は架橋をより完全にするだめにホルマリン処理
するのがよい。処理条件は間接凝集反応の感作血球に用
いる赤血球の処理条件と同一でよい。

これらの固定化物の担体及び磁性体含有粒子の一方には
測定対象である抗原又は抗体と反応する抗体又は抗原を
固定化し、もう一方にはこの固定化した抗体又は抗原と
反応する抗原又は抗体を固定化する。この固定化した抗
体又は抗原と反応する抗原又は抗体は測定対象と同一で
あってもよいが、測定対象あるいは固定化物の抗原が２
以上の抗原決定基を有している場合には異なっている場
合もある。

固定化方法としては、固定化物の担体に化学結合させる
場合にはこの担体と抗原又は抗体との双方の官能基を考
慮して決定すればよく、例えばアミ７基相互間を結合さ
せる場合には、ソイノンアネート法、グルタルアルデヒ
ド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多く
知られている。

また、アミン基とカルボキシル基との間を結合させる方
法としては、カルボキシル基をサクシンイミトエステル
化する方法のほかカル？ノイミト法、ウッドワード試薬
法等が知られており、アミン基と糖鎖を架橋する過ヨウ
素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）もある。チオール基を利
用する場合には、例えばモラ一方の側のカルがキシル基
をサクシンイミドエステル化してこれにシスティンを反
応すせテチオール基を導入し、チオール基反応性二価架
橋試薬を用いて双方を結合することができる。フェニル
基を利用する方法としてはノアゾ化法、アルキル化法な
どがある。結合方法はこれらの例示に限られるものでは
なく、このほか例えばｒ　Ｍｅｔｈｏｄｉｎ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊあるいは「酵素抗体測定法
」等の放置に記載されている方法のなかから適宜選択し
て利用することができる。一方、物理吸着を行なう場合
には担体を必要によ）酸洗浄等で活性化し、公知の方法
で吸着させればよい。

磁性体含有粒子に固定化する方法は間接凝集反応に用い
る血球に抗原あるいは抗体を感作する方法に従って行な
えばよく、例えば、タンニン酸、ポルマリン、グルタル
アルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビスーノアソ化ペ
ンツ・ノン、トルエン−２，４−ノイソ／アナートなど
を用いて固定化すればよい。

抗体又は抗原を固定化した固定化物に測定対象である抗
原又は抗体及び抗原又は抗体を固定化した磁性体含有粒
子（以下、固定化粒子という。）を接触させる方法は酵
素免疫測定法、ラジオイムノアッセイなどの場合と同様
に行なえばよい。接触させる順序としては、まず測定対
象である抗原又は抗体を含有する試料を接触させたのち
、試料を分離し、次に固定化粒子を接触させてもよく、
あるいは試料と固定化粒子を共存させてもよい。

すなわち、酵素免疫測定法の場合には、固相法、二抗体
法、ホモジニアスＥＩＡ、サンドイツチ法など各種の方
法が知られているが本発明の方法における前記の接触は
これらのいずれの方法で行なってもよい。

これらの接触を行なった後は、固定化物と、この固定化
物に結合しなかった固定化粒子を分離する。分離は固定
化粒子の懸濁液から固定化物を引き上げるだけでよい。

そのほか、液相法による二抗体法のように固定化物の凝
集塊をつくってこれを遠心分離する方法もある１、 分離した固定化物に結合している固定化粒子は必要によ
シ物理的あるいは化学的手段で固定することができる。

例えば、固定化物あるいは固定化粒子の担体に熱可塑性
樹脂を用いて結合粒子を熱溶着させるが如きである。

分離された固定化物又は固定化粒子の磁性を測定する方
法は磁気ヘッドあるいは圧電素子を利用すればよい。

本発明の測定方法は抗原、抗体の種類を問わす測定しう
るものであシ、従来のラジオイムノアッセイあるいは酵
素免疫測定法に匹敵する測定感度を有する。そして、測
定操作が簡単であシ、安全であるなど従来のラジオイム
ノア、セイ及び酵素免疫法の種々の欠点を排除した優れ
た方法である。

磁性体含有ゼラチン粒子製造例、等電点がＰＨ９である
酸性ゼラチン４ｇを４０℃の温水に１．　ＯＯｍｇにな
るように溶解し、１０チの水酸化ナトリウム溶液を用い
てＰＨ９に調整した。アラビアゴム４ｇを１００　ｍｌ
になるように水に溶解し、不溶物を炉別しだ後４０℃に
加温した。

このようにして得られたゼラチン溶液２５ｍ７！とアラ
ビアゴム溶液２５ｍ１を混合し、この混合液をあらかじ
め４０℃に加温した３０容量チのエチルアルコール溶液
１５０ｍ１に注ぎ入れ、よく攪拌した。これに１０チヘ
キサメタリン酸ナトリウム溶Ｉ６８ｍ（ｉ、１０％アル
キルスルホマレイン酸（商品名デモールＥｐ、　花王石
鹸（株）製）溶液１．　ｍｌ、及び平均粒径１５０久の
フェリコロイドＷ−３５（商品名、タイホー工業（株）
製）６０μｍ３　（Ｆｅ５２■含有）を加えてよく攪拌
した。

次いで、４０℃に保ちながら１０容量チの酢酸溶液を滴
下してｐＨ４，７に調整し、粒子を生成させた。

とのＰｌ（調整によって得られた粒子分散液を氷冷して
５℃にしてからゲルタールアルデヒド０．６５μを加え
、よく攪拌後この温度で一夜装置した。

それからこの粒子分散液を２００Ｏｒｐｍで１０分間遠
心分離して粒子ペレットとじて回収した。この粒子を０
．００５％デモールＥｐ溶液に懸濁して遠心分離する洗
浄操作を３回繰返してから、４容量係ホルマリン溶液に
分散し、５℃で１週間放置した。

実施例１ （１）　固定化物の調製 ｐＨ８，９のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液１００ｍ１にアク
リルアマイド５．２．９　、β−ノメヂルーアミノゾロ
ピオニトリル０．０５ｍ１及び過硫酸アンモニウム０．
０５ｇを溶解した。

この溶液を真空デシケータ内で脱気した後浅底容器（１
０ｃｒｎＸ１．０ｃｒｎＸ０．５ｃＴｓ）内に気泡が混
入しないように入れた。室温にて３〜４時間放置してア
クリルアマイドをダル化させた後、プロワ−で送風して
乾燥させた。得られた乾燥膜を容器から剥離して８０℃
のオーブンで１時間加熱し、膜厚約５０μｍのポリアク
リルアミド膜担体を得た。

この膜を５　ｗｎ　Ｘ　１０　ｍｍの長方形にカットし
、スティック状のポリエステルフィルム（５ｍｍＸ５０
ｍ）の先端に膜担体の半分の部分を接着剤で接着した。

２５チグルタールアルデヒド液をＰ＋１７．２の０．１
５Ｍ　ＩＪン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ　）で０．１
％に希釈した。その１　ｍｌを小試験管にとシ、前記の
ポリエステルフィルムに接着した膜担体１枚を浸漬して
３７℃で１夜放置した。

得うれたゲルタールアルデヒド活性化膜担体を生理食塩
水で洗浄した後、ｐＨ７，２のＰＢＳで１００倍に希釈
した抗ヒトα−フェトゾロテイン特異抗体１　ｍｌｌ中
に浸漬し、３７℃で３時間加温した。

こうして得られた抗ヒトα−フェトゾロティン抗体固定
化スティックを生理食塩水で洗浄し、凍結乾燥して保存
した。

（２）　固定化粒子の調製 前記の製造例で得られた磁性体含有ゼラチン粒子を２．
５％になるように５ｐｐｍのタンニン酸を含むｐＨ７，
２ＰＢＳに分散し、全量をＩＱｍｌとした。この分散液
を３７℃で１０分間加温後、磁性体含有ゼラチン粒子を
遠心分離して生理食塩水で遠心洗浄した。

１００倍に希釈した］、　Ｏｍｌの抗α−７工トデロテ
イン特異抗体溶液にこの磁性体含有ゼラチン粒子を加え
、３７℃で１時間加温して抗α−フェＩ・プロティン特
異抗体を磁性体含有ゼラチン粒子に固定化した。

この固定化粒子を生理食塩水で洗浄して、１条ＢＳＡを
含むｐＨ７，２ＰＢＳに全量が１０ｍ１になるように浮
遊させた。

（３）　α−フェトプロティンの測定 小試験管にｐＨ７，２の５０　ｍＭ　’）ン酸ナトリウ
ム緩衝液４５０μｌ及びα−フェトプロティン標準液５
０μｌ又は血清検体希釈液５０　Ｉｌｌを入れ、３７℃
に加温した。これに（１）項で得た固定イヒステイ、７
りを入れ、３７℃で３０分間加温した。

固定化スティックを引き上げて（２）項で１得た固定化
粒子の１条分散液１ｍ１！に浸漬し、３７℃で３０分間
加温した。この固定化ステイｙりを生理食塩水に浸漬し
て洗浄し、軽く水を切って７５為ら第１図に示す構造を
有する磁気ヘッド上に置き、一定速度で移動させて磁気
へ、ドの出力をデソタル信号で記録した。

α−フェトプロティン量と相対結合量との関係を第２図
に示す。

尚、第１図の磁気ヘッドは、図に示すように、コア１に
２つの巻線２，３が巻回されており、巻線２は励磁コイ
ルであって一定の直流電流を供給する電源４に接続され
ている。巻線３は検出コイルであって増巾器５に接続さ
れておシ、この増巾器はデジタル表示するカウンター６
に接続されている。７は固定化ステインクの膜担体部分
であシ、８はそこに結合した固定化粒子である。

実施例２ （１）　固定化物の調製 １％ゼラチンゾル１００Ｍにセルロースフ９ウタ９−（
ＫＣフロック５０Ｗ１山陽国策・ぐルア’（鵬ｆｆ）１
ｇを加え、よく攪拌して、真空デシケータ内で脱気した
。これを実施例１と同じ容器に入れてフ゛ロワーで風乾
して乾燥膜を得た。

１５ワツトの紫外線ランプから３０ｔ−ｒｎの距離にこ
のゼラチン膜を置き、４００μｗ／ｃｍ２の紫外線強度
で１０分間照射して膜を架橋した。

この膜を５　ｒｔａｎ　Ｘ　５　ｔｔａｎの大きさに力
、ｌ・し、５晒Ｘ３００ｍｍのポリエステルフィルム上
Ｋ　］　Ｏｒａｍ　間隔に接着剤で貼付した。

０．５チグルタールアルデヒドＰＨ７，２ＰＢＳ溶液３
０ｍ１を５０　ｍｌのビーカーに入れ、前記の膜貼着フ
ィルムを浸漬して３７℃で一夜放置した。この膜貼着フ
ィルムを取り出して生理食塩水で洗浄後、生理食塩水で
１００倍に希釈した抗ＨＢ、特異抗体液３０ｍ１に浸漬
し、３７℃で３時間反応させた。

こうして得られた抗旧８特異抗体固定化膜を生理食塩水
で洗浄し、凍結乾燥して保存した。

（２）固定化粒子の調製 オリーブ油１０．９にフェリコロイド（タイホー工業（
鉛製）２ｇを加えてよく混合した。これを４０℃に加温
しであるゼラチン水溶液３０．９に加え、ホモミキサー
で乳化した。エマルゾョンを４０℃に保ちながら１０％
アラビヤゴム水溶液３０ｇを加え、ホモミキサーで攪拌
しながら酢酸を滴下してｐＨ４，Ｑとした。

エマルゾョンを水溶に入れて５℃に冷却し、３７チホル
マリン１　ｍｌを加えて５℃で一夜放置した。

１０％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ９とし、３７
℃の恒温槽で１時間加温した。これを２００Ｏｒｐｍで
１０分間遠心し、粒径約６μｍの磁性マイクロカプセル
を得た。

この磁性マイクロカプセルをｐＨ７，２ＰＢＳに５−に
なるように浮遊させた。その５　ｒｎｌを試験管にとっ
て、０．５’％のゲルタールアルデヒド溶液５　ｍｌ、
　ヲ加え、３７℃で一夜加温した。続いて、生理食塩水
で遠心洗浄した後０．００３％ＨＢ８抗原液１０ｍ１を
加え、３７℃で３時間反応させた。

こうして得られたＨＢ８抗原固定化粒子を生理食塩水で
洗浄後、１％ＢＳＡを含むｐＨ７，２ＰＢＳに浮遊させ
、全量を５　ｍｌとしだ。

（３）　ＨＢ８抗原の測定 ｐＨ７，２ＰＢＳ　４００μ１１各濃度のＨＢ、抗原標
準液又は血清検体希釈液１００μｌ及びＨＥ８抗原固定
化粒子分散液５００μ４をノにイロン）チーープに入れ
、３７℃で１０分間加温した。この混合液１００μｌを
マイフロピＶ　ｙ＋・でとシ、ポリエステルフィルム上
に貼付した抗ＨＢｓ特異抗体固定化膜上に滴下した。

３７℃の胛部器内で３０分間反応させた後生理食塩水に
浸漬して洗浄した。

軽く水を切っ−Ｃから前記の磁気ヘッドを用いて固定化
膜に結合した磁性マイクロカプセル量を連続的に測定し
た結果、出力信号のパルス数とＩ−Ｔ、Ｂ　ｓ抗原量に
ついて第３図に示すように良好な標準曲線が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法において磁性を測定する装置の一
例の概要を示す説明図である。第２図は本発明の方法に
より得られたα−フェトプロティン量と磁性体含有粒子
の相対結合量との関係を示すものであわ、第３図はＨＢ
８抗原量と磁性体含有粒子の相対結合量との関係を示す
ものである。 特許出願人　富士レビオ株式会社 代　理　人　弁理士　１）中　政　浩

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 測定対象である抗原又は抗体と反応する抗体又は抗原を
   固定化した固定化物に、測定対象である抗原又は抗体と
   、該固定化物に固定化された抗体又は抗原と反応する抗
   原又は抗体を固定化した磁性体含有粒子とを、接触せし
   め、固定化物とこの固定化物に結合しなかった前記の磁
   性体含有粒子とを分離し、分離された固定化物又は磁性
   体含有粒子の磁性を測定することを特徴とする抗原又は
   抗体の測定方法