JPS6223826B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、抗原抗体反応用マイクロカプセル試
薬の製造法に関するものである、更に詳しくは、
抗原抗体反応用として高感度で、しかも、非特異
的凝集（non−specific agglutination）を起しに
くい安定なマイクロカプセル試薬の製造法に関す
るものである。 従来、抗原抗体反応を高感度でしかも簡便に行
なう方法として、抗原もしくは抗体を、水不溶性
の担体に担持させ、抗原抗体反応にもとづく凝集
状態を肉眼で観察する免疫学的凝集法が広く用い
られている。抗原もしくは抗体を担持する担体と
しては、ニワトリ、ワニ、羊等の動物の赤血球が
用いられ、これを利用して、高感度でしかも操作
が簡便である受身赤血球凝集反応（Passive
Haemagglutination、PHA）が一般に行われてい
るが、特に近年、マイクロタイターシステムとし
て抗原もしくは抗体を、非常に能率よく簡単に半
定量する方法が実用されている。しかしこの方法
は、担体として用いる赤血球が動物由来のため、
担体の赤血球自身が抗原性を持ち、しばしば特異
的凝集の原因となり、目的とする抗原抗体反応へ
悪影響を及ぼすことがあり、また、動物の個体差
にもとづいて、性能がばらついたり、経時変質を
起し易く、また、コスト高である等の欠点があ
る。 一方、ポリスチレンラテツクスを担体とする
（ラテツクス凝集反応）方法も実用されており、
前述の動物に由来する欠点は除かれているもの
の、反面、受身血球凝集反応に比べ、感度が低い
ばかりでなく、抗原もしくは抗体との結合が強固
でないため、長期保存性が悪かつたり、また、抗
原抗体反応によらない自然凝集反応を起し易いな
どの欠点がある。 特開昭55−94636号には、壁表面に抗原もしく
は抗体を結合せしめたマイクロカプセルを使用し
て、抗原抗体凝集反応により検体中の抗体もしく
は抗原を検出する方法が提案されている。 特開昭55−94636号の対象は、従来、抗原抗体
凝集反応用に使用されてきた前述の赤血球やラテ
ツクスなどの免疫物質担持用の担体の代りに、マ
イクロカプセルを使用するもので、こうした担体
としてマイクロカプセルを使用する場合、マイク
ロカプセルの芯物質を適宜選択して、所望の比重
0.8〜1.20、好ましくは1.07〜1.16のマイクロカプ
セルを、所望の大きさ0.1〜30ミクロン、好まし
くは、0.5〜10ミクロンで作成することができる
から、抗原抗体凝集反応による検体中の種々の抗
体もしくは抗原の検出において、一般的について
極めて著しい感度や精度の向上が認められた。 しかし、免疫反応に用いる抗原もしくは抗体の
中には、感作しにくいものがあり、そのような抗
原もしくは抗体をも利用できる試薬を製造する方
法が要請されていた。 今、本発明者等は、マイクロカプセルに抗原も
しくは抗体を結合する際、反応液のPHを酸性領域
に調整し、このPH域で負の電気を帯びたマイクロ
カプセルを用いたところ、その壁表面に抗原もし
くは抗体を極めて容易に結合せしめることがで
き、高感度で安全な試薬を作る方法を見出した。
特開昭55−94636号で提案されたマイクロカプセ
ルは、酸性領域では０又は正に帯電している。 本発明の負の電気を帯びたマイクロカプセル
は、その芯に用いる油性物質中に負の電気を帯び
た物質を共存させることにより、或いはまた、マ
イクロカプセルの壁および／あるいは壁表面に負
の電気を帯びた物質を存在させることにより、実
現することができる。 本発明において、負の電気を帯びたマイクロカ
プセルを作製する際に使用する負電気を帯びた物
質としては、側鎖に陰イオン基を有する高分子物
質を挙げることができ、陰イオン基としては、例
えば、硫酸基、スルホン酸基、カルボン酸基、マ
レイン酸基および各々の塩を含むものが挙げられ
るが、側鎖に電気的に強い陰性基をもつものであ
れば、前記のものに限定されるものではない。使
用できる高分子物質の具体例としては、ポリビニ
ル硫酸エステル、ポリビニルスルホン酸エステ
ル、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、
無水マレイン酸共重合体ポリマー（例えば、無水
マレイン酸／メチルビニルエーテル共重合体、無
水マレイン酸／イソブチレン共重合体、無水マレ
イン酸／エチレン共重合体、無水マレイン酸／ス
チレン共重合体）および各々の塩が挙げられる。 これらの物質の添加量は、芯を形成する油性物
質に対して重量比で２％〜50％の範囲が一般的で
ある。 本発明によるマイクロカプセルは、個々の粒子
が著しい負の電気を帯びているので、静電反発に
より、粒子の凝集を妨げるので安定であり、抗原
抗体反応によらない非特異的凝集を起しにくい。
そのため、マイクロカプセル粒子の壁表面に比較
的高濃度の抗原もしくは抗体を結合することが可
能で、その結果、微量の抗体もしくは抗原に鋭敏
に反応して免疫学的凝集反応を生じ、極めて高い
感度が実現される。 本発明におけるマイクロカプセルの壁材として
は、抗原又は抗体を活性を失なわしめることなく
化学的に結合しうるもので、カプセル化が可能な
ものであればとくに限定されない。たとえば、ア
ミノ基又はイミノ基を有する壁材として、蛋白質
（たとえばコラーゲン、ゼラチン、カゼインな
ど）やポリアミノ酸、ポリアクリルアミド、ポリ
アミド、ポリウレタン、ポリウレア、メラミン等
の樹脂；水酸基を有する壁材として、セルロース
及びその誘導体（たとえば、メチルセルロース、
エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース
など）、アラビヤゴム、デンプン等が挙げられ
る。 カプセルの芯物質となる油性物質としては、天
然鉱物油、動物油、植物油及び合成油が挙げられ
る。これら芯物質は、表面がカプセル壁で完全に
おおわれるため、抗原や抗体への直接の影響はな
いと思われるが、生化学的に活性なものは、避け
た方が好ましい。 鉱物油の例として、石油、ケロシン、ガソリ
ン、ナフサ、パラフイン油があり、動物油の例で
は、魚油、ラード油、がある。植物油の例は、落
花生油、亜麻仁油、大豆油、ひまし油及びとうも
ろこし油等がある。合成油の例としては、ビフエ
ニル化合物（例；イソプロピルビフエニル、イソ
アミルビフエニル）、ターフエニル化合物（例；
OLS−2153635）、ナフタレン化合物（例；ジイ
ソプロピルナフタレン、US−4003589）、アルキ
ル化ジフエニルアルカン（例；２・４−ジメチル
ジフエニルメタン、SU−3836383）、フタル酸化
合物（例；ジエチルフタレート、ジブチルフタレ
ート、ジオクチルフタレート）等が挙げられる。 本発明に用いるカプセル内芯物質は、上記のも
のに限定されるわけではない。 芯物質には、前述の負の電気を帯びた物質を共
存させる外、凝集反応のコントラストを向上させ
るために油溶性着色染料を添加して着色してもよ
い。ここに、油溶性着色染料としては格別限定さ
れるものではないが、たとえば、カラー・インデ
ツクス、12010、12150、12715、12716、13900、
26100、26105、26110、26125、27291、45170、
60505等が用いられる。 本発明のマイクロカプセルの芯物質に、アイソ
トープ、螢光物質、磁気物質、紫外線吸収物質等
のいわゆる標識物質を添加することもできる（特
開昭56−79255号参照）。 本発明に用いるカプセルの製造方法は、とくに
限定されるものではなく、既知の方法を用いるこ
とができ、たとえば、近藤朝士著「マイクロカプ
セル」日刊工業新聞社（昭和45年）、近藤 保、
小石真純著「マイクロカプセル」三共出版株式会
社（昭和52年）等に記載されている。 本発明に用いるマイクロカプセルの比重は芯物
質を適宜選択して0.80〜1.20の範囲で変更して作
製したものが有用であり、また平均粒子サイズと
しては、0.1〜30μ好ましくは、0.5〜10μの範囲
で作製したものが有用である。しかしながら、こ
れらに限定されなくともよい。 またマイクロカプセルの平均粒子サイズは0.1
〜30μ、好ましくは0.5〜10μの範囲内にあるこ
とが望ましい。 本発明で用いるマイクロカプセルの負の帯電量
を測定する方法としては、ゼータ電位測定法、色
素吸着法、コロイド滴定法等がある（寺山宏編
著、「がんの細胞膜」南江堂（昭和53年刊20〜59
頁）。 これらの方法のうち、この分野で最も広く適用
されている代表的方法は、ゼータ電位測定法であ
るが、この測定方法によれば、本発明で用いるマ
イクロカプセルは、−20ｍＶより卑のゼータ電位
であるような負の電気を帯びている。 本発明において、マイクロカプセルに抗原もし
くは抗体を結合させる方法としては、多官能化合
物を用いる従来より知られた種々の処理方法が用
いられる（千畑一郎著「固定化酵素」講談社（昭
和50年）等参照）。用いる化合物としては、たと
えば、ジアルデヒドであるグルタルアルデヒド、
水溶性カルボジイミドとして、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リニル−４−エチル）カルボジイミドメチル−ｐ
−トルエンスルホン酸、イソオキサゾリウム塩で
あるＮ−エチル−５−フエニルイソオキサゾリウ
ム−3′−スルホン酸、イミドエステルであるジエ
チルマロンイミデイト、（トルエン−２・４−ジ
イソシアネート、アルキルクロロホルメート）、
ハロニトロベンゼンであるｐ・p′−ジフルオロ−
ｍ・m′−ジニトロフエニルスルホンなどが挙げ
られるが、とくに限定されるものではない。 本発明のマイクロカプセルの壁表面に結合して
抗原抗体反応を起させることの可能な免疫学的に
活性な物質としては、ホルモン、薬物代謝産物お
よび特異蛋白質の他に、ビールス、細菌、細胞お
よび人起源の抗原および抗体を含む広汎な種々の
物質を挙げることができる。 本発明の方法を実施するには、３つの態様があ
る。第一の方法は、マイクロカプセル壁表面に、
先づ、多官能化合物を結合せしめ、次いで、酸性
溶液中で、これに抗原もしくは抗体を反応させる
ことにより、多官能化合物を介してマイクロカプ
セル壁と抗原もしくは抗体を結合させる方法、第
二の方法は、先づ抗原もしくは抗体と多官能化合
物とを反応させ、次いで、酸性溶液中でマイクロ
カプセル壁と結合せしめる方法、第三の方法は、
抗原もしくは抗体と多官能化合物およびマイクロ
カプセルとを、酸性溶液中に共存させ、抗原もし
くは抗体とマイクロカプセル壁との反応を同時に
行なわせる方法である。 本発明によりマイクロカプセル壁表面に抗原も
しくは抗体を結合する方法を、具体的に以下説明
する。 マイクロカプセルの固形成分濃度が１〜3wt％
になるように生理的食塩水で稀釈し、架橋剤、例
えば、グルタルアルデヒドをマイクロカプセルの
固形成分に対して0.1〜50wt％の範囲で添加し、
室温〜65℃で５〜60分間インキユベートして、マ
イクロカプセル壁表面の官能基と反応させる。残
存架橋剤を遠心分離による洗滌で取除き、分散液
を酸性域、好ましくは、PH3.0〜5.5にする。抗原
もしくは抗体をマイクロカプセルの固形成分に対
して、0.1〜25wt％の範囲で添加し、37℃で30〜
120分間インキユベートしてマイクロカプセル壁
に結合しているグルタルアルデヒドの残されてい
る官能基と反応せしめる。残存抗原もしくは抗体
を遠心分離による洗滌で取除き、また一方、マイ
クロカプセル壁に結合し、且つ、未反応のグルタ
ルアルデヒドの官能基をグリシン溶液を用いてつ
ぶす。 本発明の方法により得られた診断試薬は、凝集
反応の感度が極めて高いこと、非特異的凝集反応
が起りにくいこと、長期保存に耐えること、工業
的に品質のそろつたものが容易に生産し得るこ
と、適用できる抗原もしくは抗体が非常に広範で
あることなどの特徴を有し、診断医学上非常に有
用なものである。 以下実施例により本発明を更に詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例 １ (1) マイクロカプセルＡの調製 ポリスチレンスルホン酸ソーダ（スルホン化
度100％、分子量50万）の５％水溶液25ｇ中
に、油溶性赤色染料アイゼン・スピロン・レツ
ド（保士谷化学製）0.1ｇを含有するジイソプ
ロピルナフタレン11.8ｇ、塩素化パラフイン
（塩素化度50％）13.2ｇの混合物（比重1.10）
を乳化し、平均油滴サイズ６μｍのエマルジヨ
ンを作成した。一方、メラミン1.5ｇと37％の
ホルムアルデヒド水溶液2.5ｇ及び水21ｇから
なる混合水溶液を60℃30分間加熱溶解し、これ
を上記エマルジヨンに添加混合する。この混合
液を、1N−塩酸でPH6.0に調整後、60℃で約２
時間反応させる。反応後、20％カセイソーダで
PH9.0に調整し、マイクロカプセルを作製し
た。上記マイクロカプセル液を生理食塩水で３
回遠沈洗滌して、残存ホルムアルデヒド等を除
去し、生理食塩水で固形分が10％になるように
分散した。 (2) マイクロカプセルＢの調製 無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重
合体（GANTREZ−AN−139、分子量約
25000、ゼネラルアニリンアンドフイルム社
製）10％水溶液25ｇに、尿素2.5ｇとレゾルシ
ン0.25ｇ及び塩化アンモニウム0.3ｇを添加
し、撹拌溶解した。これに、油溶性赤色染料ア
イゼン・スピロン・レツド（保士谷化学製）
0.1ｇを含有するジイソプロピルナフタレン
11.8ｇ、塩素化パラフイン（塩素化度50％）
13.2ｇの混合物（比重1.10）を混合乳化し、油
滴サイズが６μｍになるように調製した。乳化
液のPHを4.0に調整後、更に37％ホルマリン水
溶液6.7ｇを加え、60℃で２時間加熱した。加
熱後、20％カセイソーダ水溶液でPHを9.0に調
整し、マイクロカプセル液を得た。生理食塩水
で３回遠沈洗滌後、生理食塩水で固形分が10％
になるように分散した。 (3) マイクロカプセルＣの調製 マイクロカプセルＢの無水マレイン酸−メチ
ルビニルエーテル共重合体の代りに、ポリビニ
ルアルコール（ケン化度90％、重合度500）の
10％水溶液25ｇを用いて、同様にマイクロカプ
セルを作製した。 (4) マイクロカプセルＤの調製 酸処理ゼラチン５ｇとアラビアゴム５ｇを40
℃の温水40ｇに溶解し、マイクロカプセルＡに
使用したと同じ比重1.10の混合油50ｇをその中
に乳化し、平均油適サイズ6.0μｍのエマルジ
ヨンを作る。このエマルジヨンに40℃の水213
ｇを添加し、次いで酢酸によりPHを4.6に調節
する。系を10℃に冷却後、硬膜のため37％ホル
ムアルデヒド水溶液２ｇを添加した、更に、カ
ルボキシメチルセルローズ（重合度220）の10
％水溶液40ｇを添加した後、10％カセイソーダ
水溶液でPH10に調整し、50℃まで昇温して１時
間撹拌放置した。こうして作製したゼラチン壁
マイクロカプセル液を生理食塩水で３回遠沈洗
滌し、残存ホルムアルデヒドなどを除去後、生
理食塩水で固形分が10％になるように分散し
た。 (5) マイクロカプセルＥの調製 マイクロカプセルＢの処方条件で、無水マレ
イン酸−メチルビニルエーテル共重合体の10％
水溶液を５ｇ用いて、同様にマイクロカプセル
を作製した。 ゼータ電位の測定 協和科学(株)製ZPOM−METERを用いて、上記
のようにして調整したマイクロカプセルＡ〜Ｅの
ゼータ電位を測定した。 水晶製細管に10cm隔てて電極をもつ電気泳動測
定セルに被験液を入れ、50Vの一定電圧を加え、
マイクロカプセルの動きを顕微鏡視野で観察し、
100μｍの間を粒子が移動する時間を測定し、次
の式から電気泳動度を求めた。 Ｖ（電気泳動度） ＝移動距離（０．０１cm）／移動時間（秒）／電位勾
配（５０Ｖ／１０cm） ゼータ電位と電気泳動度Ｖは次の関係にあり、
測定液の粘度、誘電率を一定として、Ｖの値から
計算した。 ゼータ電位（ｍＶ）＝４π（液体の粘度）／（液体の誘
導率） ×（電気泳動度cm²／Ｖ・ｓｅｃ）＝14.13×10⁴×Ｖ マイクロカプセルは、1/100モル濃度のリン酸
二水素カリウム溶液（PH4.6）で固形成分濃度が
0.04％になるように稀釈して用いた。 実施例１で調製したマイクロカプセルＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄ、Ｅのゼータ電位の値を第１表に示した。

【表】 マイクロカプセルＡ、Ｂ、Ｅは−20ｍＶ 卑なゼータ電位をもつ。 マイクロカプセルＣ、Ｄは、PH4.6の溶液中で
は100μｍの標線間隔を粒子が移動するのに15秒
以上を要する場合は、実際上ほぼ静止していると
みなせる。この場合の粒子のゼータ電位が−19ｍ
Ｖである。 実施例 ２ FITC標識抗ヒトIgGの感作 実施例１で調製したマイクロカプセルＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄ、Ｅを、それぞれ1.5ｇづつ分取し、10ml
の生理食塩水に分散し、それぞれグルタルアルデ
ヒド100μを混合し、室温で１時間反応させ
た。反応後生理食塩水を用いて遠心洗滌し、リン
酸−クエン酸緩衝液（PH4.2）10mlに分散した。 次に、螢光物質FITC（フルオレセイン・イソ
チオシアネート）で標識した抗ヒトIgG（ヤギ）
（医学生物学研究所製）１％溶液を、生理食塩水
で25倍に稀釈し、その１mlをグルタルアルデヒド
処理したマイクロカプセルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅそ
れぞれ２mlに添加し、37℃で１時間インキユベー
トした。更に、４℃にて15分間放置した。 その後遠心分離し、上清をサンプリングし、日
立螢光分光光度計650型を用いて、相対螢光強度
を測定した。励起光波長Ex＝480nｍ、放射光測
定波長Em＝520nｍであつた。感作に用いた稀釈
抗ヒトIgGの溶液を生理食塩水で１：２稀釈を行
ない、この螢光強度に対する各マイクロカプセル
感作後の上清の螢光強度の百分率を求めた。

【表】 マイクロカプセルＡ、Ｂ、Ｅでは添加した抗ヒ
トIgGの大部分が遠沈した沈渣側にあり、マイク
ロカプセルＣ、Ｄではその大部分が上清中に残存
し、マイクロカプセルに結合していない。 更に、0.2％グリシン含有生理食塩水を用いて
２回洗滌し、２mlの３％牛血清アルブミン含有の
0.15Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS、PH＝7.2）に
分散して、IgGの検出試薬とした。 かくして、作製した検出試薬100μをとり、
生理食塩水２mlで稀釈し、日立螢光分光光度計で
相対螢光強度を測定した。一方、検量線を作成し
て、マイクロカプセルに結合した抗ヒトIgGの量
を検量線を用いて定量し、添加した抗ヒトIgGに
対する百分率を求めた。

【表】 第３表に示す結果からわかるように、マイクロ
カプセルＡ、Ｂには、添加した抗ヒトIgGの約1/
３が、又、Ｅには約1/4がマイクロカプセルに結合
している。マイクロカプセルＣ、Ｄには、抗ヒト
IgGは殆んど結合していない。 次に、抗ヒトIgGを感作したマイクロカプセル
試薬について、マイクロタイター法を用いて、ヒ
トIgGとの免疫学的凝集反応を行わせた。明らか
な凝集を認めた管を陽性とし、ヒトIgGの最高稀
釈倍数を求め、それをもつて抗体価とした。 ヒトIgG（ICN Pharmaceuticals Inc.製、
GAMMA GLOBULIN HUMAN FR II）の１％
生理食塩水溶液、および、コントロールとして、
正常兎血清を0.15Mリン酸緩衝生理食塩水
（PBS、PH＝7.2）を用いて20倍に稀釈して得られ
たその稀釈液25μを、マイクロプレートの各管
孔に、PBSで２倍間隔に稀釈して、倍数稀釈列を
作成した。 次に、前記方法で作成した抗ヒトIgGを感作し
たマイクロカプセルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを、それ
ぞれ25μづつドロツパーで採取し、マイクロプ
レートの稀釈列の各管孔に滴下し、マイクロプレ
ートを５分間振動し、抗原抗体反応を進めて後、
４℃に一夜静置した。翌朝、管底凝集像を観察
し、次の抗体価を得た。

【表】 マイクロカプセルＡ、Ｂ、Ｅでは、ヒトIgGと
特異的な凝集反応を生じた。一方、Ｃでは非特異
的凝集を生じ、Ｄではすべて沈降し、陰性パター
ンを示した。 マイクロカプセルＤでは両稀釈列共に沈降し、
陰性パターンを示した。 以上の如く、ポリスチレンスルホン酸ソーダ或
いは無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重
合体といつた側鎖に陰イオン基を含む高分子物質
の存在の下でマイクロカプセルを調製したＡ、
Ｂ、Ｅは、ゼータ電位がPH3.5〜5.5の範囲で−20
ｍＶより卑な電位で、負電気を帯びており、抗ヒ
トIgGを感作することができ、IgGの検出試薬を
作成することができたが、上記側鎖に陰イオン基
を含む高分子物質を使用していないマイクロカプ
セルＣおよびＤでは、PH3.5〜5.5の範囲でゼータ
電位はほぼ０で、負電荷を殆んどもたず、抗ヒト
IgGを感作できなかつた。 実施例 ３ トレポネーマ・パリダム（ニコルス株）の感作 実施例２と同じく、マイクロカプセルＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄをグルタルアルデヒド処理した分散液のPH
は5.3であつた。 トレポネーマ・パリダム（ニコルス株）
（Treponema pallidum（Nichols strain）を、家
兎精巣内に接種し、精巣内で増殖させ、接種して
から８〜12日後精巣を採取し、細切して2.2％ク
エン酸ナトリウム溶液に浸して菌体を浸出させ、
分画遠心法により、10⁸匹／mlになるように集菌
した。集菌した菌体を、20KHzの音波破砕器
（大岳製作所製）で、10分間破砕処理を行ない、
12000r.p.m.で遠心分離した沈渣を、生理食塩水
で原料の10倍に稀釈した。その２mlをとり、グル
タルアルデヒド処理したマイクロカプセルそれぞ
れ２mlと混合し、37℃１時間インキユベートし
た。４℃にて15時間放置後、0.2％グリシン含有
生理食塩水で２回洗滌し、２mlの３％牛血清アル
ブミン含有の0.15Mリン酸緩衝生理食塩水
（PBS）に再分散し、血清中の梅毒の抗体を検査
する試薬をえた。 次に、FTA−ABSテスト及びTPHAテストに
陽性を示す梅毒患者血清と、陰性を示す健康ヒト
血清を、それぞれ0.15Mリン酸緩衝生理食塩水
（PBS）で10倍に稀釈したものを用い、その25ml
をとり、マイクロプレート上で、PBSによる倍数
稀釈列を作成した。次に、トレポネーマ・パリダ
ム（ニコルス株）の菌体破砕成分を感作したマイ
クロカプセルを、それぞれ25μづつドロツパー
で採取し、マイクロプレートの各被検血清の稀釈
列の管孔に滴下し、マイクロプレートを５分間振
動し、抗原抗体反応を進めて後、４℃にて一夜静
置し、翌朝管底凝集像を観察した。 マイクロカプセルＡ、Ｂ共に、健康ヒト血清で
は凝集は起らず、梅毒患者血清では、共に2560倍
稀釈の管孔まで明瞭な凝集像がみられた。 しかし、マイクロカプセルＣ、Ｄでは健康ヒト
血清で凝集が起らないが、梅毒患者でも凝集は起
らなかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酸性溶液中で負に帯電したマイクロカプセル
   の壁表面に抗原または抗体を化学的に結合させる
   ことを特徴とする免疫反応応用マイクロカブセル
   試薬の製造法。 ２ 化学的結合を、側鎖に陰イオン基を含む高分
   子物質の存在下で行うことを特徴とする特許請求
   の範囲１による免疫反応応用マイクロカブセル試
   薬の製造法。 ３ 側鎖に陰イオン基を含む高分子物質の存在下
   で調製されたマイクロカプセルの壁表面にトリポ
   ネーマ属菌由来の抗原を化学的に結合せしめるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲２による免疫反応
   応用マイクロカブセル試薬の製造法。