JPH0317303B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は磁性体を標識物質として抗原及び抗体
を測定する方法に関するものである。

生体内等の微量成分の測定方法としては抗原抗
体反応を利用した免疫化学的方法が一般的であ
り、そのなかでも放射性同位元素を標識物質とす
るラジオイムノアツセイと酵素を標識物質とする
酵素免疫測定法とが広く利用されている。

しかしながら、ラジオイムノアツセイは、放射
性物質を使用するところから、放射線による人体
障害や公害の問題があること、放射性同位元素が
自然崩壊するため標識された抗原や抗体を長期保
存できないこと、測定に特殊な設備や測定機器を
要することなどの問題があつた。また、酵素免疫
測定法は測定感度がラジオイムノアツセイに及ば
ないこと、測定操作が比較的煩雑なこと、標識に
用いる酵素によつては測定試料である全血あるい
は血清の影響を受け測定精度が低下することなど
の問題があつた。

本発明者らは測定感度が高く、特異性にすぐ
れ、操作が簡単で上述の欠点のない測定方法を開
発すべく鋭意研究を重ねた結果、磁性体を標識物
質に用いる方法を案出し、この方法が上記の目的
に適合するものであることを見出して本発明を完
成するに至つた。

以下、本発明の内容を詳細に説明する。

本発明の方法は、測定対象である抗原と反応す
る抗体を固定化した固定化物に、測定対象である
抗原と、該固定化物に固定化された抗体と反応す
る抗原を固定化した磁性体含有粒子とを、接触せ
しめ、固定化物とこの固定化物に結合しなかつた
前記の磁性体含有粒子とを分離し、分離された固
定化物又は磁性体含有粒子の磁性を測定する方法
において、前記の磁性体含有粒子がゼラチン、水
溶性多糖類、メタリン酸イオン及び粒径が50〜
500Åの強磁性体微粒子を含み、ゼラチンが架橋
された球形であつて親水性かつ不溶性の粒子であ
ることを特徴とする抗原の測定方法と、この方法
において抗原と抗体を入れ替えた方法と、これら
の方法のうち接触工程の固定化物と磁性体含有粒
子を入れ替えた方法の４つの態様がある。

測定対象である抗原及び抗体の種類は限定され
るものではないが、例えば、抗原としてはジゴキ
シン、テオフイリン、フエニトインなどの合成医
薬品、ペニシリン、アミカシン、ゲンタマイシン
などの抗生物質、インシユリン、TSH、T4、プ
ロスタグランジン、IgG、２−フエトプロテイ
ン、グリコリピツド類、HB_s抗原、ガン抗原など
を含む。抗体の例としては、これらの抗原に対す
る抗体、各種病原菌に対する抗体などを含む。

抗原又は抗体を固定した固定化物の担体の材質
は目的とする抗体又は抗原を固定できるものであ
ればよい。すなわち、抗体又は抗原を化学結合に
よつて固定化する場合には、−NH₂、−COOH、−
CHO、−OH、−SHなどの官能基を有する合成高
分子、例えば６−６ナイロン、６ナイロン、アミ
ノ化ポリスチレンなど、あるいは天然高分子、例
えばデキストラン、カルボキシセルロースなどを
用いることができる。一方、物理吸着によつて固
定化する場合には、ポリスチレン、カオリン、セ
ラミツクスなどを用いることができる。担体の形
状は、要は未反応の磁性体含有粒子と容易に分離
できればよく、微細粒子を除く任意の形態をとる
ことができる。形状の例としては、膜、棒、薄板
などを挙げることができる。

一方、磁性体含有粒子は鉄、コバルト、ニツケ
ル、これらの化合物、合金等の強磁性体を含むも
のである。強磁性体は粒子中に均一に分散させる
ためにコロイド状の微粒子がよく、例えばフエリ
コロイド（タイホー工業(株)製）は適当である。磁
性体含有粒子は抗原又は抗体を固定化しうるもの
でなければならない。粒径は１〜10μｍ程度が通
常好ましい。このような磁性体含有粒子にはゼラ
チン粒子を用いる。

ゼラチン粒子は、ゼラチン、水溶性多糖類、メ
タリン酸塩及び強磁性体微粒子を含む混合溶液を
撹拌しつつそこに酸を加えてPH2.5〜6.0に調整
し、その後アルデヒド系架橋剤を作用せしめて不
溶化することによつて製造することができる。

ゼラチンは酸性ゼラチンが好ましい。水溶性多
糖類は増粘剤または糊料として使用しうるもので
あり、多糖類の誘導体及び塩も含まれる。例とし
ては、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロー
ス、アルギン酸ナトリウム、寒天、カラゲーナン
などを挙げることができるが、特にアラビアゴム
が好適である。メタリン酸塩は例えば三メタリン
酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウムの如
きものである。

PH調整前の溶液におけるこれら各物質の濃度と
しては、ゼラチン0.01〜５％程度、好ましくは
0.05〜１％程度、水溶性多糖類0.01〜５％程度、
好ましくは0.05〜１％程度、そして強磁性体微粒
子0.000001〜15％程度である。メタリン酸塩はゼ
ラチン乾燥重量の３〜15％程度を含有させるよう
にするのがよい。各物質はこれらの濃度範囲にお
いて、所望の粒子の粒径および物性に応じて適宜
定めればよい。

PH調整前の溶液にはそのほかのものとして、親
水性有機溶媒、界面活性剤、着色剤などを適宜加
える。

このような溶液を調製する過程は問うところで
はなく、例えば強磁性体微粒子を除く各々を温水
に溶解してから混合してもよく、各々を一緒に溶
解してもよい。しかしながら、各物質の溶解を容
易にするために親水性有機溶媒はあとから加える
のがよく、また水溶性多糖類には不溶成分も少量
含まれていることが多いとことから、別途に溶解
して添加するのがよい。一方、ゼラチンは等電点
以下のPHでは水溶性多糖類と反応して白濁を生ず
るので酸性ゼラチンを用いる場合にはアルカリを
加えて溶液のPHを少なくともその付近にまで高め
ておくのがよい。しかしながら、この白濁は生じ
た後でもアルカリを添加することによつて消すこ
とができる。いずれにせよ、溶液は酸の添加を開
始するまえには強磁性体微粒子以外には懸濁物の
ない状態にしておかなければならない。強磁性体
微粒子はこのような溶液を調製する任意の段階で
所定量を添加し、懸濁させればよい。

溶液の温度はゼラチンのゲル化温度以上でなけ
ればならない。このゲル化温度はゼラチンの濃度
等によつて異なるが通例25〜30℃程度である。良
好な粒子形成の観点から溶液の温度は特に35〜50
℃程度がよい。

次に、この溶液を撹拌しながら酸を加えてPH
2.5〜6.0に調整する。この工程は粒子を生成させ
るところである。均一な粒子を形成させるため
に、35〜50℃に加温を続け、適度に撹拌しながら
酸を滴下していくのがよい。PH2.5〜6.0の範囲に
おける至適のPHは原料溶液の組成および目的とす
る粒径によつて異なるので予め実験を行なつて定
めるのがよい。たとえば２〜10μｍ程度の粒径に
する場合至適のPHは4.0〜5.5の範囲にある。この
PH調整に使用する酸は特に限定されるものではな
く無機酸でも有機酸でもよいが、なるべくおだや
かなものがよく、たとえば酢酸などが好適であ
る。

本工程で生成した粒子は系の温度をゼラチンの
ゲル化温度以下に下げても消失しないので母液と
の平衡関係はない。

酸の添加後は生成した粒子の凝集を防止するた
めに速かに粒子分散液を冷却するのがよい。そし
て、液温が10℃以下になつたところでアルデヒド
系架橋剤を添加して粒子を不溶化する。この架橋
剤の添加量はゼラチン乾燥重量の0.1〜200％程度
であり、添加後は一夜程度放置して架橋反応を充
分に行なわせる。架橋剤の例としては、グルタル
アルデヒド、ホルムアルデヒド、グリオキザー
ル、クロトンアルデヒド、アクロレイン、アセト
アルデヒドなどを挙げることができるが、特にグ
ルタルアルデヒドが好適である。

アルデヒド系架橋剤で処理後は粒子を遠心分離
あるいは磁力を利用する等して回収し、必要によ
り洗浄する。洗浄液は粒子分散のために用いた界
面活性剤と同じものを同濃度で含む水で２〜３回
行なえばよい。

この粒子は架橋をより完全にするためにホルマ
リン処理するのがよい。処理条件は間接凝集反応
の感作血球に用いる赤血球の処理条件と同一でよ
い。

これらの固定化物の担体及び磁性体含有粒子の
一方には測定対象である抗原又は抗体と反応する
抗体又は抗原を固定化し、もう一方にはこの固定
化した抗体又は抗原と反応する抗原又は抗体を固
定化する。この固定化した抗体又は抗原と反応す
る抗原又は抗体は測定対象と同一であつてもよい
が、測定対象あるいは固定化物の抗原が２以上の
抗原決定基を有している場合には異なつている場
合もある。

固定化方法としては、固定化物の担体に化学結
合させる場合にはこの担体と抗原又は抗体との双
方の官能基を考慮して決定すればよく、例えばア
ミノ基相互間を結合させる場合には、ジイソシア
ネート法、グルタルアルデヒド法、ジフルオロベ
ンゼン法、ベンゾキノン法等数多く知られてい
る。また、アミノ基とカルボキシル基との間を結
合させる方法としては、カルボキシル基をサクシ
ンイミドエステル化する方法のほかカルボジイミ
ド法、ウツドワード試薬法等が知られており、ア
ミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法
（Nakane法）もある。チオール基を利用する場
合には、例えばもう一方の側のカルボキシル基を
サクシンイミドエステル化してこれにシステイン
を反応させてチオール基を導入し、チオール基反
応性二価架橋試薬を用いて双方を結合することが
できる。フエニル基を利用する方法としてはジア
ゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこ
れらの例示に限られるものではなく、このほか例
えば「Method in Immunochemistry」あるいは
「酵素抗体測定法」等の成書に記載されている方
法のなかから適宜選択して利用することができ
る。一方、物理吸着を行なう場合には担体を必要
により酸洗浄等で活性化し、公知の方法で吸着さ
せればよい。

磁性体含有粒子に固定化する方法は間接凝集反
応に用いる血球に抗原あるいは抗体を感作する方
法に従つて行なえばよく、例えば、タンニン酸、
ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビツクア
ルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジジン、トルエン
−２，４−ジイソシアナートなどを用いて固定化
すればよい。

抗体又は抗原を固定化した固定化物に測定対象
である抗原又は抗体及び抗原又は抗体を固定化し
た磁性体含有粒子（以下、固定化粒子という。）
を接触させる方法は酵素免疫測定法、ラジオイム
ノアツセイなどの場合と同様に行なえばよい。接
触させる順序としては、まず測定対象である抗原
又は抗体を含有する試料を接触させたのち、試料
を分離し、次に固定化粒子を接触させてもよく、
あるいは試料と固定化粒子を共存させてもよい。
すなわち、酵素免疫測定法の場合には、固相法、
二抗体法、ホモジニアスEIA、サンドイツチ法な
ど各種の方法が知られているが本発明の方法にお
ける前記の接触はこれらのいずれの方法で行なつ
てもよい。

これらの接触を行なつた後は、固定化物と、こ
の固定化物に結合しなかつた固定化粒子を分離す
る。分離は固定化粒子の懸濁液から固定化物を引
き上げるだけでよい。そのほか、液相法による二
抗体法のように固定化物の凝集塊をつくつてこれ
を遠心分離する方法もある。

分離した固定化物に結合している固定化粒子は
必要により物理的あるいは化学的手段で固定する
ことができる。例えば、固定化物あるいは固定化
粒子の担体に熱可塑性樹脂を用いて結合粒子を熱
溶着させるが如きである。

分離された固定化物又は固定化粒子の磁性を測
定する方法は磁気ヘツドあるいは圧電素子を利用
すればよい。

本発明の測定方法は抗原、抗体の種類を問わず
測定しうるものであり、従来のラジオイムノアツ
セイあるいは酵素免疫測定法に匹敵する測定感度
を有する。そして、測定操作が簡単であり、安全
であるなど従来のラジオイムノアツセイ及び酵素
免疫法の種々の欠点を排除した優れた方法であ
る。

磁性体含有ゼラチン粒子製造例、等電点がPH９
である酸性ゼラチン４ｇを40℃の温水に100mlに
なるように溶解し、10％の水酸化ナトリウム溶液
を用いてPH９に調整した。アラビアゴム４ｇを
100mlになるように水に溶解し、不溶物を別し
た後40℃に加温した。

このようにして得られたゼラチン溶液25mlとア
ラビアゴム溶液25mlを混合し、この混合液をあら
かじめ40℃に加温した30容量％のエチルアルコー
ル溶液150mlに注ぎ入れ、よく撹拌した。これに
10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液0.8ml、10
％アルキルスルホマレイン酸（商品名デモール
Ep、花王石鹸(株)製）溶液１ml、及び平均粒径150
ÅのフエリコロイドＷ−35（商品名、タイホー工
業(株)製）60μ（Fe5.2mg含有）を加えてよく撹拌
した。

次いで、40℃に保ちながら10容量％の酢酸溶液
を滴下してPH4.7に調整し、粒子を生成させた。

このPH調整によつて得られた粒子分散液を氷冷
して５℃にしてからグルタールアルデヒド0.65ｇ
を加え、よく撹拌後この温度で一夜静置した。そ
れからこの粒子分散液を2000rpmで10分間遠心分
離して粒子ペレツトとして回収した。この粒子を
0.005％デモールEp溶液に懸濁して遠心分離する
洗浄操作を３回繰返してから、４容量％ホルマリ
ン溶液に分散し、５℃で１週間放置した。

実施例 １ (1) 固定化物の調製 PH8.9のトリス−EDTA緩衝液100mlにアクリ
ルアマイド5.2ｇ、β−ジメチル−アミノプロ
ピオニトリル0.05ml及び過硫酸アンモニウム
0.05ｇを溶解した。

この溶液を真空デシケータ内で脱気した後浅
底容器（10cm×10cm×0.5cm）内に気泡が混入
しないように入れた。室温にて３〜４時間放置
してアクリルアマイドをゲル化させた後、ブロ
ワーで送風して乾燥させた。得られた乾燥膜を
容器から剥離して80℃のオーブンで１時間加熱
し、膜厚約50μｍのポリアクリルアミド膜担体
を得た。

この膜を５mm×10mmの長方形にカツトし、ス
テイツク状のポリエステルフイルム（５mm×50
mm）の先端に膜担体の半分の部分を接着剤で接
着した。

25％グルタールアルデヒド液をPH7.2の
0.15Mリン酸緩衝生理食塩溶液（PBS）で0.1
％に希釈した。その１mlを小試験管にとり、前
記のポリエステルフイルムに接着した膜担体１
枚を浸漬して37℃で１夜放置した。

得られたグルタールアルデヒド活性化膜担体
を生理食塩水で洗浄した後、PH7.2のPBSで100
倍に希釈した抗ヒトα−フエトプロテイン特異
抗体１ml中に浸漬し、37℃で３時間加温した。

こうして得られた抗ヒトα−フエトプロテイ
ン抗体固定化ステイツクを生理食塩水で洗浄
し、凍結乾燥して保存した。

(2) 固定化粒子の調製 前記の製造例で得られた磁性体含有ゼラチン
粒子を2.5％になるように5ppmのタンニン酸を
含むPH7.2PBSに分散し、全量を10mlとした。
この分散液を37℃で10分間加温後、磁性体含有
ゼラチン粒子を遠心分離して生理食塩水で遠心
洗浄した。

100倍に希釈した10mlの抗α−フエトプロテ
イン特異抗体溶液にこの磁性体含有ゼラチン粒
子を加え、37℃で１時間加温して抗α−フエト
プロテイン特異抗体を磁性体含有ゼラチン粒子
に固定化した。

この固定化粒子を生理食塩水で洗浄して、１
％BSAを含むPH7.2PBSに全量が10mlになるよ
うに浮遊させた。

(3) α−フエトプロテインの測定 小試験管にPH7.2の50mMリン酸ナトリウム
緩衝液450μ及びα−フエトプロテイン標準
液50μ又は血清検体希釈液50μを入れ、37
℃に加温した。これに(1)項で得た固定化ステイ
ツクを入れ、37℃で30分間加温した。

固定化ステイツクを引き上げて(2)項で得た固
定化粒子の１％分散液１mlに浸漬し、37℃で30
分間加温した。この固定化ステイツクを生理食
塩水に浸漬して洗浄し、軽く水を切つてから第
１図に示す構造を有する磁気ヘツド上に置き、
一定速度で移動させて磁気ヘツドの出力をデジ
タル信号で記録した。

α−フエトプロテイン量と相対結合量との関
係を第２図に示す。

尚、第１図の磁気ヘツドは、図に示すよう
に、コア１に２つの巻線２，３が巻回されてお
り、巻線２は励磁コイルであつて一定の直流電
流を供給する電源４に接続されている。巻線３
は検出コイルであつて増巾器５に接続されてお
り、この増巾器はデジタル表示するカウンター
６に接続されている。７は固定化ステイツクの
膜担体部分であり、８はそこに結合した固定化
粒子である。

実施例 ２ (1) 固定化物の調製 １％ゼラチンゾル100mlにセルロースパウダ
ー（KCフロツク50W、山陽国策パルプ(株)製）
１ｇを加え、よく撹拌して、真空デシケータ内
で脱気した。これを実施例１と同じ容器に入れ
てブロワーで風乾して乾燥膜を得た。

15ワツトの紫外線ランプから30cmの距離にこ
のゼラチン膜を置き、400μW／cm²の紫外線強
度で10分間照射して膜を架橋した。

この膜を５mm×５mmの大きさにカツトし、５
mm×300mmのポリエステルフイルム上に10mm間
隔に接着剤で貼付した。

0.5％グルタールアルデヒドPH7.2PBS溶液30
mlを50mlのビーカーに入れ、前記の膜貼着フイ
ルムを浸漬して37℃で一夜放置した。この膜貼
着フイルムを取り出して生理食塩水で洗浄後、
生理食塩水で100倍に希釈した抗HB_s特異抗体
液30mlに浸漬し、37℃で３時間反応させた。

こうして得られた抗HB_s特異抗体固定化膜を
生理食塩水で洗浄し、凍結乾燥して保存した。

(2) 固定化粒子の調製 オリーブ油10ｇにフエリコロイド（タイホー
工業(株)製）２ｇを加えてよく混合した。これを
40℃に加温してあるゼラチン水溶液30ｇに加
え、ホモミキサーで乳化した。エマルジヨンを
40℃に保ちながら10％アラビヤゴム水溶液30ｇ
を加え、ホモミキサーで撹拌しながら酢酸を滴
下してPH4.0とした。

エマルジヨンを氷溶に入れて５℃に冷却し、
37％ホルマリン１mlを加えて５℃で一夜放置し
た。10％水酸化ナトリウム溶液を加えてPH９と
し、37℃の恒温槽で１時間加温した。これを
2000rpmで10分間遠心し、粒径約6μｍの磁性マ
イクロカプセルを得た。

この磁性マイクロカプセルをPH7.2PBSに５
％になるように浮遊させた。その５mlを試験管
にとつて、0.5％のグルタールアルデヒド溶液
５mlを加え、37℃で一夜加温した。続いて、生
理食塩水で遠心洗浄した後0.003％HB_s抗原液
10mlを加え、37℃で３時間反応させた。

こうして得られたHB_s抗原固定化粒子を生理
食塩水で洗浄後、１％BSAを含むPH7.2PBSに
浮遊させ、全量を５mlとした。

(3) HB_s抗原の測定 PH7.2PBS400μ、各濃度のHB_s抗原標準液
又は血清検体希釈液100μ及びHB_s抗原固定
化粒子分散液500μをパイロツトチユーブに
入れ、37℃で10分間加温した。この混合液
100μをマイクロピペツトでとり、ポリエス
テルフイルム上に貼付した抗HB_s特異抗体固定
化膜上に滴下した。

37℃の孵卵器内で30分間反応させた後生理食
塩水に浸漬して洗浄した。

軽く水を切つてから前記の磁気ヘツドを用い
て固定化膜に結合し磁性マイクロカプセル量を
連続的に測定した結果、出力信号のパルス数と
HB_s抗原量について第３図に示すように良好な
標準曲線が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法において磁性を測定する
装置の一例の概要を示す説明図である。第２図は
本発明の方法により得られたα−フエトプロテイ
ン量と磁性体含有粒子の相対結合量との関係を示
すものであり、第３図はHB_s抗原量と磁性体含有
粒子の相対結合量との関係を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 測定対象である抗原又は抗体と反応する抗体
   又は抗原を固定化した固定化物に、測定対象であ
   る抗原又は抗体と、該固定化物に固定化された抗
   体又は抗原と反応する抗原又は抗体を固定化した
   磁性体含有粒子とを、接触せしめ、固定化物とこ
   の固定化物に結合しなかつた前記の磁性体含有粒
   子とを分離し、分離された固定化物又は磁性体含
   有粒子の磁性を測定する方法において、前記の磁
   性体含有粒子がゼラチン、水溶性多糖類、メタリ
   ン酸イオン及び粒径が50〜500Åの強磁性体微粒
   子を含み、ゼラチンが架橋された球形であつて親
   水性かつ不溶性の粒子であることを特徴とする抗
   原又は抗体の測定方法。