JPS6332146B2

JPS6332146B2 -

Info

Publication number: JPS6332146B2
Application number: JP4621181A
Authority: JP
Inventors: Mikio Ikeda; Takayuki Tomizawa
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 1981-03-31
Filing date: 1981-03-31
Publication date: 1988-06-28
Also published as: JPS57160465A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗原または抗体の感作あるいは酵素の
固定などに広く利用し得る新規な人工担体の製造
法に関する。抗原、抗体反応を利用する臨床検査
等の分野において、抗原または抗体を、ある適当
な大きさの粒子（以下担体と呼ぶ）に吸着もしく
は結合させ、それぞれに対応する抗体または抗原
によつて凝集を起させる方法は受身凝集反応と呼
ばれ、被検液中の抗体や抗原の高感度に検出でき
るので、いろいろの疾患の血清学的診断や血液学
的診断に広く用いられる。この反応に用いられる担体としては、ポリスチ
レンラテツクス、カオリン、炭末などの非生物学
的粒子と、動物赤血球や細菌菌体のような生物学
的粒子とがある。一般に、非生物学的担体は、化
学的に安定で、それ自身抗原活性を有しないなど
の利点はあるが抗原または抗体が密に吸着されに
くく、たとえば凍結乾燥などによつて抗原または
抗体が、担体から遊離してしまうため、止むなく
液体で冷暗所に保存するという手段が取られ、従
つて長期の保存ができない。また炭末、カオリン
は一定の大きさの担体を選出することが困難であ
り、ポリスチレンラテツクスは一定の大きさの担
体を選出し得たとしても、反応の媒質として望ま
しい中性域では、自然凝集（非特異凝集）をおこ
す危険を含む。一方生物学的担体である動物赤血球や細菌菌体
は、それぞれ大きさが一定である利点はあるもの
の、生物の種類によつて粒子の大きさは定まつて
おり、目的に応じた任意の大きさの粒子を得るこ
とはできない。たとえば動物赤血球は、大きさの
一定した最も入手し易い担体であるが、粒径が約
６〜8μと概して大きいためこれに抗原を感作し
たものは、対応する担体との結合が弱く、大きな
凝集塊を作りえず、スライド法には不適当であ
る。また赤血球は血球表面に固有の抗原を有して
おり、抗体との間の交差反応（いわゆる非特異凝
集反応）を起こし、目的とする凝集反応に誤りを
与える可能性があり、さらに赤血球の生物学的、
化学的および物理的特性値が、動物の個体間でバ
ラツキ常に一定品質の血球を得ることは難しいと
いう欠点がある。本発明者らは、受身凝集反応の担体として、動
物赤血球に代わる新規な人工担体の開発を主目的
として、種々研究を重ねた結果、水溶性多糖類、
ゼラチンおよびポリメタリン酸ナトリウムを含む
均一透明な混合液を、28℃〜60℃でかきまぜなが
ら特定のPHに調整することによつて生じた球状粒
子体を、界面活性剤を用いて分散させ、アルデヒ
ド系架橋剤で不溶化することによつて、抗原活性
を有せず、均質な分散性のより親水性粒子が得ら
れること、さらにこの球状粒子は、受身凝集反応
の凍結乾燥可能な担体として実用しうることを知
り、本発明を完成した。すなわち本発明者らは、
さきに水溶性多糖類、ゼラチン、ポリメタリン酸
ナトリウムおよび親水性有機溶媒の４成分を原料
とする人工担体の製法を発明したが（特開昭57―
153658号）、さらに研究を進めた結果、ゼラチン
および水溶性多糖類の特定の濃度範囲において
は、親水性有機溶媒を用いることなく、所望の人
工担体を製造し得ることを知り、本発明を完成し
たものである。本発明方法は、本来マイクロカプ
セル化の技術であるコンプレツクスコアセルベー
シヨン法を応用した、芯物質を含まない球状粒子
の製造法であり、原料の種類と配合および粒子生
成時の系のPHを適宜選択すれば、得られる粒子の
大きさを任意に制御できるという大きな利点を有
する。また本発明においては親水性有機溶媒を用
いる必要がないので、人工担体を安価に製造でき
るばかりでなく、製造上高価な防爆設備を要しな
いなど工業生産上の利点も大きい。次に本発明を詳述する。まず、水溶性多糖類、
ゼラチンおよびメタリン酸ナトリウムを混合し、
粒子生成原液を調製する。本発明に使用するゼラチンは、通常市販のゼラ
チンでよいが、特に酸性ゼラチンが好ましい。ま
た本発明書中に使用される用語“水溶性多糖類”
とは通常増粘剤または糊料として使用し得る多糖
類またはその誘導体もしくは塩を意味する。たと
えばアラビアゴム、カルボキシメチルセルロー
ス、アルギン酸ナトリウム、寒天、カラゲーナン
などが使用されるが特にアラビアゴムが好適であ
る。本発明に使用し得るポリメタリン酸ナトリウ
ムとは、化学式（NaPO₃）_oで表わされる物質を
意味する。たとえば“メタリン酸ナトリウム”
（和光純薬製）又は“ヘキサメタリン酸ナトリウ
ム”（和光純薬製）として市販されている試薬が、
本発明にいうポリメタリン酸ナトリウムとして用
い得る。粒子生成原液の組成は、水溶性多糖類
0.01％〜2.0％、好ましくは0.05〜0.5％、ゼラチ
ン0.01％〜2.0％、好ましくは0.05％〜0.5％、ポ
リメタリン酸ナトリウムはゼラチン乾燥重量の
0.5〜20％（特に指定なき場合の％表示は重量％）
の範囲で用いられ、所望の粒子の粒径および物性
に応じて適宜定めればよい。これら３成分の混合
液は28℃〜60℃に加温された状態で、均一、透明
な溶液となつていなければならない。液性が酸性
側では濁ることがあるので、この場合はアルカリ
を加え白濁を消しておくことが必要である。また
不溶物は必要に応じて過または遠心分離により
除去する。次いで、以上のようにして調製した粒子生成原
液を28℃〜60℃、好ましくは38℃〜40℃に加熱
し、かきまぜながら滴下し、ゼラチンと水溶性多
糖類の混合比、ポリメタリン酸ナトリウムの添加
量、および目的とする粒径の大きさによつて定ま
る特定のPH値（PH2.5〜6.0）に調整する。たとえ
ば、抗原感作用担体として好適な2μ〜10μの粒子
を生成させるためのPHは通常3.0〜5.0の範囲であ
る。本工程に使用する酸は、無機酸でも有機酸で
もよいが、特に酢酸が好ましい。本工程で生成し
た粒子は系の温度をゼラチンのゲル化温度以下に
下げても消失しないので、母液との平衡関係はな
く、本来の意味のコアセルベートとは別意のもの
である。また、粒子はほとんどの場合負に帯電し
ており、その表面には溶液中の陽イオンが配向
し、いわゆる電気二重層を形成し、粒子の安定な
分散を促している。本発明においては、さらに長期間にわたる粒子
の安定な分散状態を保持するために、少量の界面
活性剤を添加する。界面活性剤としては、アルキ
ルスルホコハク酸、アルキルスルホマレイン酸、
アルキル硫酸エステル、ポリオキシエチレンアル
キルエーテル硫酸エステルなどの陰イオン界面活
性剤、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエ
チレンアルキルフエニルエーテル、ポリエチレン
グリコール脂肪酸エステルなどの非イオン界面活
性剤が用いられる。これら界面活性剤の使用量
は、陰オン界面活性剤については、粒子分散液中
の濃度として0.005％〜0.05％、非イオン界面活
性剤の場合は、0.05％〜0.5％程度である。つぎに、粒子分散液にゼラチン乾燥重量の0.1
％〜14％のアルデヒド系架橋剤を添加し（分散液
中の濃度0.001％〜2.0％）、室温あるいは10℃以
下の低温、好ましくは４℃前後で一夜放置し、前
工程で生成した粒子を不溶化する。本発明に用い
るアルデヒド系架橋剤としてはグルタルアルデヒ
ド、ホルマリン、グリオキザール、クロトンアル
デヒド、アクロレイン、アセトアルデヒドなどが
使用しうるが特にグルタルアルデヒドが好適であ
る。ついで不溶化された粒子を遠心分離により回
収し、前工程とほぼ同濃度の界面活性剤を含む水
で２〜３回洗浄する。このようにして得られた本発明品の担体粒子
は、無色半透明であるので、これを受身凝集反応
の担体として用いる場合には、凝集像の判定を容
易にするために、染色することが望ましい。本粒
子の染色には、たとえば食用赤色３号、ローダミ
ン、ローズベンガル、ポンソー3R、ボルドーＳ、
フクシン、エオシンおよびニユートラルレツドな
どの赤色色素、あるいはクリスタルバイオレツ
ト、トルイジンブルーおよびメチレンブルーなど
の青色色素が用いられる。染色は、これらの色素
の0.01％〜0.5％溶液に、本発明品を一夜浸漬す
ることによつて行われる。別法として、これらの
色素をあらかじめ粒子生成原液に添加しておいて
もよい。第二工程で架橋が不十分な場合には、リン酸緩
衝液などの塩類溶液中では膨潤することがあるの
で、抗原感作のようなリン酸緩衝液中での処理を
含む用途に用いるときは、さらに架橋を導入し、
膨潤を防ぐ必要がある。この目的のためには、再
度、通常赤血球の固定化に用いられる条件でホル
マリン処理を行う。この処理により塩類溶液中で
の膨潤防止とともに、ホルマリンの殺菌効果によ
つて、長期保存に耐える担体が得られる。このようにして得られた本発明品の粒子に対す
る抗原（または抗体）の感作は、動物赤血球を担
体とした場合の常法に従えばよい。たとえば本粒
子をタンニン酸処理した後、超音波処理をした梅
毒トレポネーマ病原体を吸着させ、マイクロタイ
ター法による受身凝集反応を行つたが、動物赤血
球を担体として用いた場合と全く同じ成績が得ら
れた。また、凍結乾燥をした本発明品の抗原感作
粒子も受身凝集反応において、抗原感作動物赤血
球と同等の性能を有していた。本発明の効果は、従来受身凝集反応の担体とし
て、実用化されている動物赤血球、細菌菌体、ポ
リスチレンラテツクスなどに代わり、これらより
優れた新規な担体を提供し得たことであり、現在
最も賞用されている動物赤血球と同等の性能を有
し、かつ(1)抗原活性を有しないこと、(2)目的に合
つた任意の粒径の粒子が得られること、(3)化学
的、物理的に均質安定であること、(4)容易かつ安
価に大量生産ができることなど、動物赤血球にな
い幾多の利点を有し、非生物系の合成担体と比較
しても、親水性ゲルであるために、抗原または抗
体との結びつきが強固であり、凍結乾燥しても感
作した抗原または抗体が分離することなく、長期
保存に耐えるという大きな利点を有する。さらに本発明品は、単に臨床検査薬分野の受身
凝集反応用感作担体としての用途のみでなく、蛋
白質、多糖類としての反応性、親水性を有し、均
一な粒径を有する均質、安定な粒子として医薬、
食品、固定化酵素など他の技術分野への広い応用
が考えられる。たとえば近年食品工業、医薬品工
業において固定化酵素がひろく用いられている
が、本発明によるゼラチン―アラビアゴム粒子は
ジアゾカツプリング法により、容易に酵素を固定
化できるので、酵素の新規な粒子状固定化担体と
しても有用である。以下実例によつて本発明を具体的に説明する。実施例１等電点がPH９であるゼラチン（酸性ゼラチン）
５ｇを40℃の温水500ｇに溶解し、10％の水酸化
ナトリウム溶液を用いてPHを９に調整した。５ｇ
のアラビアゴムを水500ｇに溶解し、不溶物を
別した後40℃に加温する。両液を混合し、これに
10％のヘキサメタリン酸ナトリウム（和光純製
薬）溶液４mlを加え、かきまぜながら10容量％酢
酸溶液を滴下して、PHを4.6に調整する。次いで
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル
（ニツコールTO―10M、日光ケミカルズ(株)、登
録商標）2.5ｇを加えよくかきまぜる。粒子分散
液の濃度を室温まで下げてから、グルタルアルデ
ヒド0.1ｇを加え、約１時間撹拌した後一夜放置
する。この分散液を2000r.p.mで10分間遠心分離
し、不溶化した粒子をペレツトとして回収する。
0.2容量％の上記界面活性剤溶液に再分散し、３
回洗浄を行う。次いで粒子を0.05％のローズベン
ガル溶液中に一夜浸漬することにより赤色に染色
した。染色した粒子を８％ホルマリン液中に４℃
で一夜放置し、さらに架橋を強めた。このように
して18ｇの担体が得られたが、その粒径はおおむ
ね均一であり、約5μであつた。この担体粒子に常法に従つてタンニン酸処理を
施し、超音波処理した梅毒トレポネーマ病原体を
感作し、マイクロタイター法によつて受身凝集反
応を行なつたところ表―１に示すような結果を得
た。なお対照としてヒツジ赤血球を担体とした梅毒
トレポネーマ感作赤血球凝集反応（TPHA）を
行つた。その結果を併せて表―１に示す。

【表】また、梅毒トレポネーマ病原体を感作した本粒
子をスライド法によつて凝集反応を行つたとこ
ろ、表―２に示すように、本粒子は著しく凝集し
たが対照として用いたヒツジ赤血球は、全く凝集
を起さなかつた。

【表】実施例２ゼラチンとアラビヤゴムの濃度を種々変えて実
施例１に準じた方法で、粒子を製造した。その結
果を表―３に示す。ゼラチンとアラビヤゴム濃度が0.6％以上では
粒子の粒径は大きくない、均一性に欠ける。また
0.9％以上では粒子は生成後著しく凝集した。

【表】実施例３実施例１に記載された方法で、アラビアゴムの
代りに、カルボキシセルロース（CMC）を用い、
PH4.76で粒子を生成させ、不溶化し、担体を回収
した。粒径は約6μであつた。

Claims

【特許請求の範囲】

１ゼラチン、水溶性多糖類、及びポリメタリン
酸ナトリウムを含む水溶液を、28℃〜60℃に加温
し透明になるようにPHを調整した溶液を、かきま
ぜながら酸によつてPH2.5〜6.0に再調整し、所望
の大きさの粒子を生成せしめる第一工程と、この
粒子を陰イオンまたは非イオン界面活性剤で分散
させ、アルデヒド系架橋剤によつて不溶化する第
二工程とからなる人工担体の製造法。