JPS6332148B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗原とは抗体の感作あるいは酵素の固
定などに広く利用しうる新規な人工担体の製法の
改良に関する。抗原、抗体反応を利用する臨床検
査等の分野において、抗原または抗体をある適当
な大きさの粒子を担体としてそれに吸着もしくは
結合させ、それぞれに対応する抗体または抗原の
存在によつてこの感作された担体の凝集を起させ
る方法は間接受身凝集反応と呼ばれている。そし
て、この間接受身凝集反応は被検液中の抗体や抗
原を高感度に検出できるので、いろいろの疾患の
血清学的診断や血液学的診断に広く用いられてい
る。 この反応に用いられる担体としては、ポリスチ
レンラテツクス、カオリン、炭末などの非生物学
的粒子と、動物赤血球、細菌菌体のような生物学
的粒子とがある。一般に非生物学的粒子の担体
は、化学的に安定で、それ自身抗原活性を有しな
いなどの利点はあるが、抗原あるいは抗体が密に
吸着されにくいという欠点がある。たとえば、保
存のために凍結乾燥すると抗原や抗体が担体から
遊離してしまうのである。そのために、やむなく
液体中で冷暗所に保存するという手段がとられて
いるが、その結果長期間保存することができな
い。また、非生物学的担体のうち、炭末とカオリ
ンは一定の大きさの粒子を選出することが困難で
あり、ポリスチレンラテツクスは反応の媒質とし
て望ましい中性域では非特異凝集である自然凝集
をおこす危険がある。 一方、生物学的担体である動物赤血球や細菌菌
体はそれぞれの大きさが一定であるという利点は
あるものの、生物の種類によつて粒子の大きさは
定まつており、目的に応じた任意の大きさの粒子
を得ることはできない。たとえば、動物赤血球は
大きさの一定した最も入手しやすい担体であるが
血球表面に固有の抗原を有しており、抗体との間
で非特異凝集反応である交差反応を起こして目的
とする凝集反応に誤まりを与える可能性がある。
さらに、赤血球の生物学的、化学的および物理的
特性値が動物の個体間でばらついてしまつて常に
一定品質の血球を入手することが難しいという欠
点ががある。 本発明者らはこれらの欠点のないすぐれた担体
を開発すべく種々検討の結果、ゼラチン、水溶性
多糖類、およびポリメタリン酸ナトリウムを含
み、水とアルコール等の混合物を溶媒とする溶液
を撹拌下でPH調整することによつて粒子を析出さ
せ、この粒子をアルデヒド系架橋剤で処理して不
溶化すれば、従来の欠点を尽く解消したすぐれた
担体が得られることを見出し、この内容を既に特
許出願した（特開昭57―153158号）。この方法に
おいては生成した粒子の凝集を防止するためにPH
調整後に界面活性剤を添加していたが、本発明者
らはその後さらに研究を進めた結果、酸の添加に
よつて粒子が生成したのちに速かに冷却すれば界
面活性剤を添加しなくても界面活性剤を添加した
場合に匹敵する好収率で担体粒子が得られること
を見出し、これに基いて本発明を完成するに到つ
た。すなわち本発明は、ゼラチン、水溶性多糖
類、ポリメタリン酸ナトリウム、親水性有機溶
媒、および水を含み、温度がゼラチンのゲル化温
度以上である溶液を、撹拌しつつ酸を加えてPH
2.5〜6.0に調整し、その後アルデヒド系架橋剤を
作用せしめて不溶化する人工担体の製法におい
て、前記酸の添加によつて粒子が生成したのちこ
の粒子分散液を10℃以下に冷却し、10℃以下の温
度で前記架橋剤を作用せしめることを特徴とする
人工担体の製法に関するものである。 本発明に使用するゼラチンは通常は市販品をそ
のまま用いればよい。市販品のなかでは酸性ゼラ
チンが好ましい。 水溶性多糖類は増粘剤または糊料として使用し
うるものであり、多糖類の誘導体および塩も含ま
れる。例としては、アラビアゴム、カルボキシメ
チルセルロース、アルギン酸ナトリウム、寒天、
カラゲーナンなどを挙げることができるが、特に
アラビアゴムが好適である。 ポリメタリン酸ナトリウムは化学式（NaPO₃）
_oで表わされる物質であり、たとえば四メタリン
酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウムの如
きものである。 親水性有機溶媒としては、低級アルコール、た
とえばメチルアルコール、エチルアルコール、プ
ロピルアルコール等、およびアセトンなどを用い
ることができる。 そのほかのものとしては、担体を着色する場合
には、着色剤を粒子形成前に溶液に加えておくの
がよい。着色を必要とする例としては、本発明品
を間接受身凝集反応の担体として用いる場合を挙
げることができる。すなわち、本発明品は通常は
無色不透明であるところから、これを着色するこ
とによつて凝集像の判定を容易にすることができ
る。着色剤としては、たとえば食用赤色３号、ロ
ーダミン、ローズベンガル、ポンソー3R、ボル
ドーＳ、フクシン、エオシン、およびニユートラ
ルレツドなどの赤色色素、あるいはクリスタルバ
イオレツト、トルイジンブルーおよびメチレンブ
ルーなどの青色色素等を用いうる。しかしなが
ら、リアクテイブ・レツド、ダイレクト・ブルー
などの反応性染料で着色すれば色落ちしないこと
から、反応性染料が特に好適である。着色剤以外
にも目的に応じ種々の物質を添加してもよいこと
はいうまでもない。 PH調整前の溶液におけるこれら各物質の濃度と
しては、ゼラチン0.01〜２％程度、好ましくは
0.05〜1.0％程度、水溶性多糖類0.01〜２％程度、
好ましくは0.05〜1.0％程度、そして親水性有機
溶媒は４〜25容量％程度である。ポリメタリン酸
ナトリウムはゼラチン乾燥重量の0.5〜20％程度
を含有させるようにするのがよい。各物質はこれ
らの濃度範囲において、所望の粒子の粒径および
物性に応じて適宜定めればよい。着色剤を添加す
る場合には、通常は0.005〜0.5％程度であるが、
反応性染料を用いればゼラチン乾燥重量の１〜５
％程度で足りる。 このような溶液を調製する過程は問うところで
はなく、例えば各々を温水に溶解してから混合し
てもよく、各々を一緒に溶解してもよい。しかし
ながら、各物質の溶解を容易にするために親水性
有機溶媒はあとから加えるのがよく、また水溶性
多糖類には不溶成分も少量含まれていることが多
いところから、別途に溶解して添加するのがよ
い。一方、ゼラチンは等電点以下のPHでは水溶性
多糖類と反応して白濁を生ずるので酸性ゼラチン
を用いる場合にはアルカリを加えて溶液のPHを少
なくともその付近にまで高めておくのがよい。し
かしながら、この白濁は生じた後でもアルカリを
添加することによつて消すことができる。いずれ
にせよ、溶液は酸の添加を開始するまえには白濁
のない状態にしておけなければならない。 溶液の温度はゼラチンのゲル化温度以上でなけ
ればならない。この温度はゼラチンの濃度等によ
つて異なるが通例25〜30℃程度である。良好な粒
子形成の観点から特に35〜50℃程度がよい。 次に、この溶液を撹拌しながら酸を加えてPH
2.5〜6.0に調整する。この工程は粒子を生成させ
るところである。均一な粒子を形成させるため
に、35〜50℃に加温を続け、適度に撹拌しながら
酸を滴下していくのがよい。PH2.5〜6.0の範囲に
おける至適のPHは原料溶液の組成および目的とす
る粒径によつて異なるので予め実験を行なつて定
めるのがよい。たとえば得られた粒子を抗原感作
用担体に用いる場合には２〜10μ程度の粒径にす
るのがよく、その場合至適のPHは4.0〜5.5の範囲
にある。このPH調整に使用する酸は特に限定され
るものではなく無機酸でも有機酸でもよいが、な
るべくおだやかなものがよく、たとえば酢酸など
が好適である。 本工程で生成した粒子は系の温度をゼラチンの
ゲル化温度以下に下げても消失しないので母液と
の平衡関係はない。また、粒子はほとんどの場合
負に帯電しており、その表面には溶液中の陽イオ
ンが配向していていわゆる電気二重層を形成して
いる。そして、このことが粒子の安定な分散を促
しているのである。 本発明においては酸を添加して粒子を生成させ
たのちに粒子生成液をゲル化温度以下に冷却し、
そのことによつて界面活性剤の添加を不要にした
ところに特徴がある。冷却は酸の添加終了後速か
に行なうのがよい。添加終了後室温に放置してお
くと粒子が互いに衝突して凝集がはじまつてしま
う。温度はゲル化温度以下であるが、５℃以下に
することが好ましい。粒子生成後は粒子をアルデ
ヒド系架橋剤で不溶化するのであるが、その間も
粒子分散液をゲル化温度以下に保つ必要がある。
但し、粒子の再分散が容易になる程度に不溶化が
進行するまでこの温度に保てばよい。 アルデヒド系架橋剤の添加量はゼラチン乾燥重
量の0.1〜200％程度であり、添加後は一夜程度放
置して架橋反応を充分に行なわせる。架橋剤の例
としては、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒ
ド、グリオキザール、クロトンアルデヒド、アク
ロレイン、アセトアルデヒドなどを挙げることが
できるが、特にグルタルアルデヒドが好適であ
る。 アルデヒド系加橋剤で処理後は粒子を遠心分離
等で回収して洗浄する。洗浄は0.001〜0.01％程
度の陰イオン系界面活性剤水溶液または0.01〜
0.1％の非イオン系界面活性剤水溶液を用いて２
〜３回行なえばよい。 このようにして得られた担体を種々の用途に供
すればよいが、架橋が不充分な場合には塩類溶液
中で膨潤することがある。そこでこのような用途
に用いる場合にはアルデヒド系架橋剤で処理して
膨潤を防止するのがよい。例えば、抗原を感作す
る場合にはリン酸緩衝液中で行なうので、赤血球
を固定化する条件でホルマリン処理する。この処
理によつて膨潤を防止するとともにホルマリンの
殺菌効果によつて長期間の保存に耐える担体が得
られる。 本発明の担体は抗原、抗体、酵素などを巾広く
固定することもできる。たとえば、抗原とは抗体
を感作する場合には動物赤血球を担体として行な
う常法に準じて行えばよい。 本発明の担体は間接受身凝集反応の担体として
従来最もすぐれているとされていた動物赤血球と
同等な性能を有し、さらに化学的、物理的に均質
かつ安定であり、抗原活性がなく任意の粒径のも
のを容易かつ安価に大量生産できるなど動物赤血
球にない幾多の利点を有するものである。そし
て、本発明は先願発明に比し、粒子生成後この粒
子を不溶化するまでの時期を冷却することによつ
て界面活性剤を不要にしたものである。従つて、
本発明はたとえば界面活性剤の存在を嫌うような
用途に担体を用いる場合に特に威力を発揮する。 以下、実施例及び担体の使用例を示す。なお、
本明細書において特に記載がなければ％は重量％
を表わしている。 実施例 １ 等電点がPH９であるゼラチン４ｇを40℃の温水
に100mlになるように溶解し、10％の水酸化ナト
リウム溶液を用いてPH９に調整した。アラビアゴ
ム４ｇを100mlになるように水に溶解し、不溶物
を別後40℃に加温した。 上記のゼラチン溶液50mlおよびアラビアゴム溶
液50mlを混合し、これに30容量％エチルアルコー
ル溶液300ml、10％ヘキサメタリン酸ナトリウム
溶液1.6ml、および１％リアクテイブレツド溶液
６mlを加えてよく撹拌し、全体を40℃に加温し
た。 次いで、この混合液を撹拌しながら10容量％の
酢酸溶液を滴下してPH5.0に調整した。 PH調整により生成した粒子分散液を氷浴中でた
だちに５℃まで冷却し、グルタルアルデヒド1.3
ｇを加えた。そして、よく撹拌した後５℃で一夜
静置した。それからこの粒子分散液を2000rpmで
10分間遠心分離して粒子をペレツトとして回収し
た。この粒子を0.005％のアルキルスルホマレイ
ン酸（デモールE_p、花王石鹸(株)登録商標）溶液
に懸濁して遠心分離する洗浄操作を３回繰返して
から４容量％ホルマリン溶液に分散し、５℃で１
週間静置した。 こうして得られた担体粒子の収量は6.4ｇであ
り、得られた粒子の75％は３〜6μの範囲にあつ
た。 実施例 ２ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、まずアラビアゴム４ｇのかわりにカ
ルボキシメチルセルロース１ｇを、そして１％リ
アクテイブレツド溶液６mlのかわりに１％ダイレ
クトブルー溶液1.5mlを用いた。それから、添加
量についてもゼラチン、10％ヘキサメタリン酸ナ
トリウム溶液、およびグルタルアルデヒドをいず
れも４分の１にした。また、酢酸滴下終了PHを
4.6にした。 このようにして得られた担体粒子の収量は4.5
ｇであり、得られた粒子の95％が0.8〜1.5μの範
囲にあつた。 実施例 ３ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、ゼラチン溶液を50mlから40mlにし、
そしてアラビアゴム溶液を50mlから60mlにした。
それから、10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液
を1.6mlから1.2mlに、１％リアクテイブレツド６
mlを１％ダイレクトブルー4.8mlに、そしてグル
タルアルデヒドを1.3ｇから1.0ｇにそれぞれ変え
た。また、酢酸滴下終了PHを4.6とした。 本例で得られた担体粒子の収量は7.8ｇであり、
得られた粒子の90％が１〜2μの範囲にあつた。 実施例 ４ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、ゼラチン溶液を50mlから60mlにし、
アラビアゴム溶液を50mlから40mlに変えた。それ
から、10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液を
1.6mlから２mlに、１％リアクテイブレツド６ml
を１％ダイレクトブルー7.2mlに、そしてグルタ
ルアルデヒドを1.3ｇから1.8ｇにそれぞれ変え
た。また、酢酸滴下終了PHを4.8とした。 本例で得られた担体粒子の収量は9.6ｇであり、
得られた粒子の75％が３〜6μの範囲にあつた。 使用例 １ 実施例１で得られた担体粒子を濃度が１％にな
るようにPH7.2のリン酸塩緩衝生理食塩水（以下、
PBSと略記する。）に分散し、その５mlを5ppm
のタンニン酸を含むPH7.2のPBS5mlと混合した。 混合液を37℃で15分間加温後遠心分離して、生
理食塩水で充分洗浄してから１％になるようにPH
7.2のPBS5mlに分散した。一方、高純度に精製し
たストレプトキナーゼを32U／mlになるようにPH
7.2のPBSに溶解した。 タンニン酸処理粒子分散液５mlとストレプトキ
ナーゼ溶液５mlとを混合し、37℃で30分間加温し
た。その後、粒子を遠心分離して生理食塩水で３
回洗浄し、濃度が５％になるように分散用メデイ
ウムに分散して凍結乾燥した。 このようにして得られたストレプトキナーゼ固
定化粒子の力価をマイクロプレート法によつて求
めた。結果を下表に示す。 【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ゼラチン、水溶性多糖類、ポリメタリン酸ナ
   トリウム、親水性有機溶媒、および水を含み、温
   度がゼラチンのゲル化温度以上である溶液を、撹
   拌しつつ酸を加えてPH2.5〜6.0に調整し、その後
   アルデヒド系架橋剤を作用せしめて不溶化する人
   工担体の製法において、前記酸の添加によつて粒
   子が生成したのちこの粒子分散液をゲル化温度以
   下に冷却し、ゲル化温度以下の温度で前記架橋剤
   を作用せしめることを特徴とする人工担体の製
   法。