RU2415434C2 - Способ получения эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза - Google Patents
Способ получения эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза Download PDFInfo
- Publication number
- RU2415434C2 RU2415434C2 RU2008108339/15A RU2008108339A RU2415434C2 RU 2415434 C2 RU2415434 C2 RU 2415434C2 RU 2008108339/15 A RU2008108339/15 A RU 2008108339/15A RU 2008108339 A RU2008108339 A RU 2008108339A RU 2415434 C2 RU2415434 C2 RU 2415434C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- brucellosis
- red blood
- blood cells
- producing
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза. Сущность изобретения включает способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) посредством приготовления формалинизированных эритроцитов, с их последующей сенсибилизацией антигеном, при том, что после выращивания бактериальную массу в количестве 50-60 млрд микробных клеток в 1 мл инактивируют обработкой 2%-ной концентрацией детергента вторичного алкилсульфата натрия, из расчета 0,75-10 мл антигена на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов и выдерживают в течение 2 часов при 45°С. Преимущество изобретения заключается в повышении специфичности диагностикума. 3 табл.
Description
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, а именно к получению биологических препаратов.
Известен «Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе», в котором формалинизированные эритроциты для повышения адсорбционных свойств их рецепторов предварительно до сенсибилизации обрабатываются новым детергентом - додецилсульфатом натрия при оптимальном режиме 1%-ной концентрации при 50-60°С в течение 30 минут.
Трехсуточную агаровую культуру бруцелл штамма 19 смывают 12%-ным раствором хлорида натрия, фильтруют через четыре слоя марли, доводят концентрацию бруцелл до 80-100 млрд микробных клеток в 1 мл. Устанавливают pH 8,0-9,0 и подвергают автоклавированию при 1 атмосфере (10°С) в течение 20-30 минут. Взвесь бруцелл остужают до температуры 18-25°С и подвергают центрифугированию при 8-10 тыс. оборотов в минуту. Полученный экстракт используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов. Предварительно до сенсибилизации формалинизированные эритроциты обрабатываются детергентом - додецилсульфатом натрия в 1%-ной концентрации при температуре 50-60°С в течение 30 минут. Сенсибилизацию эритроцитов, обработанных детергентом, проводят при 37-38°С в течение 16-18 часов. (Патент №2283498, 2006 г. Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт РАСХН, авторы Юсупов О.Ю., Хаиров С.Г., Шумилов К.В., Климанов А.И., Ощепков В.Г., Дектяренко Л.В., Скляров О.Д., Дугричилова М.О.)
Недостатком данного способа является то, что при серологическом исследовании в РНГА с применением антигена, приготовленного по указанному способу из благополучных по бруцеллезу хозяйств, часть животных дает неспецифические реакции в низких титрах в пределах 1:25, 1:50 и 1:100, а иногда спонтанно агглютинируют сенсибилизированные эритроциты с физиологическим раствором, что дало нам основание усовершенствовать данный способ получения эритроцитарного антигена для РНГА (см. табл.1).
Таблица 1 | |||||||
Результаты сравнительного испытания специфичности антигенов в РНГА в благополучных по бруцеллезу хозяйствах | |||||||
Животные | Исследованы антигеном | Количество | Реагировали с эритроцитарными антигенами в РНГА | ||||
Отр. | 1:25 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | |||
Коровы | Аналогом | 50 | 40 | 5 | 3 | 2 | - |
Новым | 50 | 50 | - | - | • | - | |
Овцематки | Аналогом | 70 | 64 | 4 | 1 | 1 | - |
Новым | 70 | 70 | - | - | - | - |
Целью изобретения является повышение высокой специфичности и активности антигена.
Эта цель достигается тем, что для обработки взвеси бруцелл используют новый стандарт вторичного алкилсульфата натрия (СТО 05807999-007-2006), отечественный детергент, выпускаемый под коммерческим названием «Прогресс».
Пример. Бруцеллы штамма 19, выращенные на мясопептонном печеночном глюкозоглицериновом агаре, смывают с питательной среды стерильным 12%-ным раствором хлорида натрия, полученную суспензию доводят до концентрации 50-60 млрд микробных клеток в 1 мл (по бруцеллезному стандарту мутности) 12%-ным раствором хлорида натрия и автоклавируют при температуре 120°С в течение 20 минут.
После установления стерильности, чистоты, типичности культуру бакмассы подогревают до 45°С, в нее добавляют 2% вторичного алкилсульфата натрия СТО 05807999-007 2006. Затем взвесь бруцелл с детергентом помещают в водяную баню при 45°С в течение 40-45 минут и периодически через каждые 5-10 минут перемешивают. Полученную взвесь бруцелл - антиген (корпускулярный, автоклавированный) используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана.
Формалинизацию эритроцитов проводят по способу Вайнбаха в нашей модификации, которая заключается в том, что формалинизацию эритроцитов проводят в течение 16-18 часов вместо 24 и встряхивают их в Шуттель-аппарате не постоянно, как это рекомендует автор, а через каждые 30 минут в течение 1,5-2 минут. Это дало возможность значительно сократить время подготовки и получить максимальный выход эритроцитов без признаков гемолиза и склеивания, которые наблюдались иногда при постоянном встряхивании их в течение 24 часов. Сокращение времени формалинизации эритроцитов до 16-18 часов с периодическим встряхиванием способствовало также лучшей сохранности эритроцитов. При этом не снижались их сорбционные свойства, а срок хранения увеличивался.
Подготовленные таким способом эритроциты сохраняют свою стабильность и адсорбционные свойства в течение двух и более лет при условии хранения при температуре 4-6°С.
Титрация оптимальной дозы бруцеллезного антигена
Для каждой серии формалинизированных эритроцитов титруют оптимальную дозу каждой серии бруцеллезного антигена. Предварительно антиген (взвесь бруцелл 50-60 млрд м.к. в 1 мл) подогревают до температуры 45°С в водяной бане, добавляют 2% нового стандарта вторичного алкилсульфата натрия СТО 05807999-007-2006 и выдерживают в течение 40-45 минут при периодическом перемешивании. Титрацию антигена проводят в пробирках, для чего на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов, подогретых так же до 45°С, добавляют 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 мл антигена (корпускулярный, автоклавированный) с детергентом. Штатив с пробирками встряхивают и вносят в водяную баню на 2 часа при 45°С. Отмывают сенсибилизированные эритроциты от избытка антигена три раза физиологическим раствором. Пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5-6 минут, надосадочную жидкость удаляют, к осадку эритроцитов добавляют физиологический раствор в соотношении 10 к одному. Эту операцию проводят еще дважды. После последнего центрифугирования в пробирки вносят по 4 мл физиологического раствора с целью получения 2,5%-ной взвеси эритроцитов. Взвесь эритроцитов гомогенизируют путем встряхивания пробирок. Полученную взвесь эритроцитов используют для постановки РНГА. Для испытания антигена применяют стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус и негативной сыворотки крови. Из стандартного образца сыворотки готовят разведения в физиологическом растворе 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400. Все разведения сыворотки прогревают в водяной бане при 60-62°С в течение 30 минут. После чего в каждую лунку (полистироловой пластины) с разведенной сывороткой вносят по 0,05 мл (по одной капле) взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Затем содержимое пластинки тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 2,5-3 часа, после чего проводят учет реакций.
За оптимальную дозу антигена принимают ту, которая в РНГА дала четкие результаты со стандартного образца сывороткой антибруцелла абортус в разведении 1:1600, с оценкой в четыре креста.
Пример. Результаты проверки специфичности и активности антигена, полученного при обработке взвеси бруцелл 2%-ным новым стандартом вторичного алкилсульфата натрия (СТО 05807999-007-2006) и эритроцитов, сенсибилизированных разными дозами антигена, даны в таблице 2.
Таблица 2 | |||||||||||
Результаты титрации антигена и проверки специфичности и активности бруцеллезного эритроцитарного антигена | |||||||||||
К-во антигена на 1 мл 10% взвеси эритроцитов | Титры РНГА | С физ. раствором | |||||||||
Со стандартным образцом антибруцелла абортус | С негативной сывороткой | ||||||||||
1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:3200 | 1:6400 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | ||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
0,5 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | - | - | - | - | - | - |
1,0 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++ | - | - | - | - | - |
1,5 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++ | - | - | - | - | - |
2,0 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++ | - | - | - | - | - |
2,5 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | + | - | - | - | - |
3,0 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | + | - | - | - | - |
3,5 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | + | - | - | - | - |
4,0 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | + | - | - | - | - |
Из приведенных в таблице 2 данных видно, что антиген, изготовленный путем обработки взвеси бруцелл новым стандартом вторичного алкилсульфата натрия, повышает специфичность и активность эритроцитарного антигена. Наиболее оптимальной для обработки бакмассы бруцелл является 2%-ная концентрация вторичного алкилсульфата натрия. Наименьшей дозой антигена (сенситина), позволяющей получить эритроцитарный антиген с высокой активностью и специфичностью, является 0,75-1,0 мл его на 1 мл 10%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана.
Изготовление опытной серии бруцеллезного эритроцитарного антигена для РНГА, для чего в бакмассу добавляют 2% детергента и подогревают до 45°С, выдерживают в водяной бане в течение 40-45 минут. После этого полученный антиген (корпускулярный, автоклавированный) используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана. Предварительно оптимальную сенсибилизирующую дозу антигена определяют путем его титрации (см. титрации антигена), для чего на 1 мл 10%-ных эритроцитов добавляют 0,75-1,0 мл антигена, выдерживают в водяной бане (45°С) в течение двух часов и периодически через каждые 5-10 минут перемешивают. Затем отмывают сенсибилизированные эритроциты от избытка антигена три раза физиологическим раствором путем центрифугирования при 1000-1500 об/мин в течение 10-15 минут, надосадочную жидкость удаляют, к осадку эритроцитов добавляют физиологический раствор в соотношении 1:10. Эту процедуру проводят еще дважды. После этого в осадок эритроцитов добавляют физраствор с таким расчетом, чтобы получить 5%-ную взвесь эритроцитов, добавляют в качестве консерванта 0,2-0,3% формальдегида и проверяют его специфичность и активность в РНГА. После этого готовый препарат помещают в холодильник при 4-6°С.
Таким образом, обработка бакмассы бруцелл 2%-ной концентрацией нового стандарта вторичного алкилсульфата натрия и сенсибилизация эритроцитов барана, из расчета 0,75-1,0 мл антигена на 1,0 мл 10%-ной взвеси эритроцитов позволяет получить высокоспецифичный и высокоактивный (по сравнению с аналогом) бруцеллезный эритроцитарный антиген для РНГА и значительно упрощает способ изготовления указанного препарата (Табл.3).
Таблица 3 | |||
Результаты сравнительного испытания активности бруцеллезных эритроцитарных антигенов для РНГА, приготовленных различными способами | |||
Сыворотки крови | К-во проб | Положительная РНГА | |
С эритроцитарным антигеном Прикаспийского ЗНИВИ | С эритроцитарным антигеном Прикаспийского ЗНИВИ (аналог) | ||
Крупного рогатого скота | 297 | 48 (16,2%) | 46 (15,5%) |
Овец | 315 | 28 (8,9%) | 25 (7,9%) |
Свиней | 76 | 13 (17%) | 12 (15%) |
Claims (1)
- Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при диагностике бруцеллеза, включающий изготовление формалинизированных эритроцитов барана с их последующей сенсибилизацией бруцеллезным антигеном, отличающийся тем, что антиген для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов инактивируют путем обработки бактериальной массы, полученной после выращивания бруцелл в количестве 50-60 млрд микробных клеток в 1 мл, 2%-ным детергентом вторичным алкил сульфатом натрия и сенсибилизируют формалинизированные эритроциты инактивированным антигеном из расчета 0,75-1,0 мл антигена на 1 мл 10% взвеси эритроцитов и выдерживают в течение 2 ч при 45°С.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008108339/15A RU2415434C2 (ru) | 2008-03-03 | 2008-03-03 | Способ получения эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008108339/15A RU2415434C2 (ru) | 2008-03-03 | 2008-03-03 | Способ получения эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008108339A RU2008108339A (ru) | 2009-09-10 |
RU2415434C2 true RU2415434C2 (ru) | 2011-03-27 |
Family
ID=41166115
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008108339/15A RU2415434C2 (ru) | 2008-03-03 | 2008-03-03 | Способ получения эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2415434C2 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2493871C1 (ru) * | 2012-05-11 | 2013-09-27 | Государственное научное учреждение Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук | Способ получения эритроцитарного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) с целью индикации бруцелл в патматериале |
RU2667121C2 (ru) * | 2016-10-31 | 2018-09-14 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт" | Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) |
-
2008
- 2008-03-03 RU RU2008108339/15A patent/RU2415434C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Непрямые или пассивные реакции гемагглютинации, в кн. КЭБОТ Е., МАЙЕР М. Экспериментальная иммунохимия. - М.: Медицина, с.124-130. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2493871C1 (ru) * | 2012-05-11 | 2013-09-27 | Государственное научное учреждение Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук | Способ получения эритроцитарного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) с целью индикации бруцелл в патматериале |
RU2667121C2 (ru) * | 2016-10-31 | 2018-09-14 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт" | Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2008108339A (ru) | 2009-09-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6872516B2 (en) | Methods of producing carbon-13 labeled biomass | |
CN104258386B (zh) | 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合 | |
RU2415434C2 (ru) | Способ получения эритроцитарного антигена для серологической диагностики бруцеллеза | |
Alam et al. | Effects of Chitosan-oligosaccharide on diarrhoea in Hanwoo calves. | |
CN107099504A (zh) | 一种造血干细胞培养基 | |
Bradbury et al. | The influence of pH of the culture medium on the sensitivity of Mycoplasma gallisepticum antigens for use in certain serological tests | |
RU2240822C2 (ru) | Способ получения противотуляремийной гипериммунной сыворотки и способ получения диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового сухого | |
RU2549434C2 (ru) | Способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки | |
RU2667121C2 (ru) | Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) | |
RU2361610C1 (ru) | Способ получения бруцеллезного антигена из штамма brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для ра, рск и рдск, бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (рбп) и бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (кр) с молоком, способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки и диагностические наборы | |
CN101732732B (zh) | 牛型结核菌素标准物质及其制备方法 | |
RU2714305C1 (ru) | Способ изготовления бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) | |
Sari et al. | Effect of the hyperosmotic infiltration method on immune response in tilapia vaccinated with Streptococcus agalactiae | |
RU2539827C1 (ru) | Способ получения бруцеллезного l-антигена | |
RU2283498C1 (ru) | Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе | |
RU2411041C2 (ru) | Способ получения r-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) | |
CN109182255A (zh) | 一种非动物源性树鼩精子体外获能液及其应用 | |
RU2226397C2 (ru) | Средство для разведения сухих противобруцеллезных вакцин | |
RU2484481C1 (ru) | Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе | |
RU2268748C2 (ru) | Способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в l-форме | |
RU2593712C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК БРУЦЕЛЛ ИЗ ШТАММА Brucella abortus 19 ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНЫХ АНТИГЕНОВ, БРУЦЕЛЛЕЗНЫЕ АНТИГЕНЫ (ТРИ ВАРИАНТА), СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ И ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ (ТРИ ВАРИАНТА) | |
CN109453371A (zh) | 一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗及其生产方法 | |
CN113930380B (zh) | 一种促进栖粪杆菌增殖的方法 | |
RU2754465C1 (ru) | Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) при клостридиозах животных | |
RU2642316C1 (ru) | Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100304 |