RU2539827C1

RU2539827C1 - Способ получения бруцеллезного l-антигена

Info

Publication number: RU2539827C1
Application number: RU2013139894/10A
Authority: RU
Inventors: Любовь Николаевна Гордиенко; Тамара Гавриловна Попова; Елена Владимировна Куликова; Галина Михайловна Гайдуцкая; Наталья Борисовна Еланцева
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2015-01-27

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения антигена для диагностики бруцеллеза. Способ получения бруцеллезного L-антигена осуществляют следующим образом. Культивируют штамм Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки при 20-22°C в течение 2-3 суток. Полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5% фенолизированным физиологическим раствором, инактивируют при 85-90°C в течение 60 минут. Взвесь центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд. м.к. Полученный антиген титруют, стандартизируют по специфичности и активности. Используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза. Изобретение позволяет в сократить сроки приготовления антигена и увеличить выход бактериальной массы. 4 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, иммунологии, биотехнологии, а именно к технологии получения антигена для диагностики бруцеллеза.

Диагностика и специфическая профилактика бруцеллеза несовершенна, в связи с многообразием форм микроорганизма и его способностью к внутриклеточному паразитированию, что приводит к недоступности выявления заболевания существующими методами диагностики, которые в основном базируются на использовании антигенов из S-форм бруцелл (Наставление по диагностике бруцеллеза, 2004 г.) [1].

Каждая существующая форма (S- R- L-) микроорганизма при посеве на питательные среды имеет свои особенности, которые четко обозначены только для S-формы (Наставление по диагностике бруцеллеза, 2004 г.) [1].

Известен способ получения L-субкультур B. abortus (Базиков И.A. «L-трансформация бруцелл», 1989 г.), включающий использование среды, содержащей в основе полужидкий триптический перевар бычьих сердец, 10-20% сахарозу, 0,05-5% сульфат магния, 0,01-1% натрия хлорид, 15-25% лошадиную сыворотку, 1% глицерин, 0,01-0,03% налидиксовую кислоту, а в качестве трансформирующего агунта бициллин-3 от 50 до 20000 ЕД /мл и глицерин от 0,1%о до 3%. Однако полученные по данному способу L-субкультуры бруцелл отличаются сниженными, а иногда и полностью утраченными антигенными свойствами. Антисыворотка, полученная с помощью данных L-субкультур бруцелл, была недостаточно специфична, так как агглютинировала исходные бактериальные S-формы в разведении 1:320. Антисыворотка была предложена для бактериологической диагностики бруцеллеза [2].

Известен способ получения L-субкультур - «Способ получения L-субкультур штамма brucella abortus И-206» (патент №2263142 от 2003.07.14). Способ предусматривает пассирование бруцелл штамма Brucella abortus И-206 на питательной среде, содержащей: агар-агар - 1,2; натрия хлорид - 0,1; магния сульфат - 0,05; сахароза - 10; глицерин - 1,0; нормальная лошадиная сыворотка - 10; печеночный настой - остальное, где бициллин-3 добавляют в питательную среду в нарастающих концентрациях от 10 до 9000 ЕД/мл среды. Данный способ позволяет получить L-субкультуры бруцелл при конечной концентрации бициллина-3 2000 ЕД/мл среды получают L-субкультуры бруцелл, которые при однократном внутривенном введении кроликам вызывают выработку специфических агглютининов, выявляемых в реакции агглютинации в титре 1:1600 [3]. Культивирование бруцелл L-форме происходит с применением бициллина-3 в нарастающих концентрациях от 10 до 9000 ЕД/мл среды - это длительный процесс. А получение даже небольшого количества бактериальной массы использовалось для получения гипериммунной сыворотки, которую применяли в бактериологической диагностике бруцеллеза.

Наиболее близким техническим решением является способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в L-форме, для получения которой использовали культуры из штамма В. abortus 19 в L-форме путем трансформации исходной типичной культуры вакцинного штамма Brucella abortus 19 (S-форма) культивированием на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) (МППГГА) с добавлением нормальной лошадиной сыворотки 10-15% и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток, антиген получают путем инактивации полученной культуры нагреванием при температуре 85-90°С в течение 60 мин и трехкратно внутривенно вводят кроликам в возрастающих дозах с интервалом 72 часа [4]. Недостатком данного способа является длительный процесс приготовления антигена, целью данного изобретения ставилось получение стабильной L-культуры, и использовался антибиотик-стрептомицин, который задерживает рост микроорганизмов и переход его в исходную S-форму, выход бактериальной массы неважен, так как при введении культуры в организм экспериментального животного вырабатываются антитела (сыворотка), которую и используют для бактериологической диагностики бруцеллеза.

Техническим результатом изобретения является сокращение сроков получения бруцеллезного L-антигена, повышение выхода готовой продукции, использование антигена в комплексе серологических исследований при диагностике бруцеллеза, а именно в реакции агглютинации (РА) для выявления дополнительных больных животных с латентной формой бруцеллеза.

Заявленный технический результат достигается тем, что способ получения бруцеллезного L-антигена включает культивирование штамма Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки, инактивации взвеси при температуре 85-90°C в течение 60 минут, культивирование проводят при 20-22°C в течение 2-3 суток, полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5% фенолизированным физиологическим раствором, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд. м.к., полученный антиген титруют 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, стандартизуют по специфичности и активности, используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза. Антиген признается годным для диагностических целей в разведении 1:20.

Предлагаемый способ приготовления бруцеллезного L-антигена в 2 раза сокращает сроки его изготовления и повышает выход бактериальной массы для приготовления антигена в 3 раза. Антиген используют в комплексе серологических исследований при диагностике бруцеллеза, а именно в PA для выявления дополнительных больных животных с латентной формой бруцеллеза.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Культуру из штамма Brucella abortus 19 в L-форме засевают в пробирки с плотной питательной средой, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1)5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл, при 37-38°C в течение 4-5 суток. Микробную взвесь Brucella abortus 19 L смывают физиологическим раствором (0,85% NaCl), готовят одно миллиардную смесь (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Затем методом последовательных разведений выбирают концентрацию, чтобы в 1 мл находилось 100 м.к. [5].

Для исследования берут 7 температурных режимов: 18°C, 20°C, 22°C, 25°C, 30°C, 35°C, 37°C. На каждый режим готовят по 4 чашки Петри со средой, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки. В первый вариант в среду добавляют стрептомицин, во второй вариант без стрептомицина. И в каждую чашку Петри вносят по 100 м.к. культуры Brucella abortus 19 L, которые выдерживают в разных температурных режимах, рост культуры Brucella abortus 19 L проверяют на чашках Петри визуально ежедневно в течение 5 суток (табл.1).

При разных температурных режимах в средах со стрептомицином и без него культуры В. abortus 19 L на чашках Петри росли по-разному. При температуре 20°C, 22°C на средах без антибиотика на 2-3 сутки выросло колоний в 3 раза больше, чем со стрептомицином. При температуре 37°C только на 5-е сутки выросло колоний одинаковое количество со стрептомицином и без него, количество колоний было меньше, чем в первом примере.

В предложенном способе получения бруцеллезного L-антигена на 2-3 сутки при температуре 20-22°C отмечался максимальный рост бактериальной массы. Культивирование B. abortus 19 L при температуре 20-22°C в 2 раза сокращает сроки приготовления антигена и в 3 раза выход бактериальной массы.

Таблица 1
Зависимость роста культуры B. abortus 19 L от температурного режима в течение 5 суток
Температура	Сутки (1-5)	Среда со стрептомицином, на чашках Петри				Среда без антибиотика на чашках Петри
18°C		1	2	3	4	1	2	3	4
	1	25	22	20	18	52	53	55	49
	2	28	30	32	30	54	55	58	55
	3	50	52	50	52	72	75	70	68
	4	52	53	52	53	81	82	83	82
	5	67	65	53	54	83	82	84	85
20°C	1	22	21	22	21	75	74	75	76
	2	24	28	25	30	100	99	101	100
	3	47	44	50	52	151	150	149	150
	4	50	49	51	53	200	201	199	271
	5	66	62	53	54	270	269	271	270
22°C	1	23	21	20	21	76	75	74	77
	2	25	27	24	27	135	140	138	135
	3	46	42	48	47	155	158	158	156
	4	51	47	53	53	200	205	206	210
	5	67	68	60	59	269	272	273	270
25°C	1	26	24	24	23	70	66	69	65
	2	29	31	32	30	74	69	72	73
	3	50	51	50	52	88	89	85	86
	4	55	54	53	55	104	109	107	108
	5	66	65	60	59	150	145	146	148
30°C	1	45	46	42	43	46	48	50	51
	2	60	67	66	65	69	69	68	70
	3	78	72	71	74	89	91	93	94
	4	84	83	88	81	100	106	ПО	116
	5	90	89	88	85	120	118	117	118
35°C	1	46	47	48	50	29	33	31	30
	2	68	70	66	75	77	74	73	72
	3	85	82	80	86	93	98	92	96
	4	95	97	94	94	99	100	101	100
	5	106	107	109	108	111	106	113	110
37°C	1	48	49	50	51	28	32	30	33
	2	69	69	68	70	75	74	76	77
	3	89	89	85	84	99	98	98	97
	4	99	98	97	98	100	99	100	101
	5	109	110	111	110	110	108	112	110

Пример 2. Специфичность L-антигена проверяли в соответствующих серологических реакциях с применением S- и R-бруцеллезных сывороток из коммерческих диагностических наборов и негативной (N-) сыворотки крови здоровых животных. Антиген для реакции агглютинации (РА) из бруцелл в L-форме дает положительную реакцию только с L-бруцеллезными сыворотками (табл.2, 3, 4).

Таблица 2
Результаты реакции агглютинации (PA) L-бруцеллезного антигена с бруцеллезными (S-,R-) и негативной (N-) сыворотками
Разведение L-бруцеллезного антигена	Наименования и разведения бруцеллезных			сывороток
Разведение L-бруцеллезного антигена	S-(1:10)	R-(1:10)	N-(1:10)	L-(l:10)
1:5	отр	отр	отр	++
1:10	отр	отр	отр	+++
1:20	отр	отр	отр	++++
1:40	отр	отр	отр	++++

Из таблицы видно, что в перекрестных реакциях с гетерологичными (S-и R-) сыворотками получены отрицательные, а с гомологичными (L-) сыворотками - положительные результаты.

Из приведенных выше данных следует, что предлагаемый бруцеллезный L- антиген, обладает строгой специфичностью в отношении S, R и N сывороток и диагностической активностью. Рабочая концентрация микробных клеток L-антигена 50-60 млрд.

Пример 3. Производственное испытание бруцеллезного L-антигена проводили на поголовье северных оленей в стадах с различной эпизоотической характеристикой по бруцеллезу общей численностью 4400 голов, в том числе в неблагополучных по бруцеллезу -1005 головы.

Специфичность L-антигена определяли на поголовье северных оленей, благополучных по бруцеллезу (табл.3).

Таблица 3
Результаты серологических исследований на бруцеллез северных оленей в благополучных стадах
Год исследования	Район ЯНАО	Исследовано животных (голов)	Из них положительно реагирующих		При этом с антигенами
			Из них положительно реагирующих		S	R	L
			гол.	%	S	R	L
2010	Ямальский	3000	0	0	-	-	-
2011	Ямальский	1000	0	0	-	-	-
2012	Ямальский	400	0	0
Итого		4400	0	0

Приведенные данные подтверждают, что антиген, полученный из L-культур, обладает специфичностью и проявляет диагностическую активность в реакции агглютинации (PA) с сыворотками, несодержащими S-, R-, L-антитела.

В очагах бруцеллезной инфекции находятся животные - носители не только S-, но и L-форм возбудителя, которые не регистрируются коммерческими S-антигенными диагностикумами, а дополнительно выявляются предлагаемым L-антигеном (табл.4).

Таблица 4
Результаты серологических исследований на бруцеллез северных оленей из неблагополучных стад
Год исследования	Район ЯНАО	Исследовано животных (голов)	Из них положительно реагирующих		При этом с антигенами
			Из них положительно реагирующих		S	L
			голов	%	S	L
2008	Надымский	184	2	1,0	2	-
2009	Тазовский	379	3	0,8	3	-
2010	Надымский	315	48	31,5	22	26
2011	Надымский	127	4	3,1	2	2
Итого		1005	57	-	29	28
% от числа исследованных		-			2,8	2,7

Из таблицы видно, что из 1005 исследованных голов выявлено положительно реагирующих - 57 голов, что составило 5,5% от общего числа исследованных животных, в том числе известным S- антигеном выявлено 2,8% животных (29 голов), а предлагаемый L-антиген позволил дополнительно выявить 2,7% (28 голов) животных-бруцеллоносителей с персистенцией возбудителя в L-форме.

Таким образом, предлагаемый бруцеллезный L-антиген, используемый в реакции агглютинации (PA), обладает строгой специфичностью в отношении S-, R- и N-сывороток, диагностической активностью, повышает эффективность и достоверность диагностики бруцеллеза на 50,0%. Может быть использован для диагностики бруцеллеза у животных-бруцеллоносителей с персистенцией измененных L-форм возбудителя.

Изобретение позволяет сократить в 2 раза сроки приготовления антигена за счет изменения температурного режима при выращивании Brucella abortus 19 в L-форме и увеличить выход бактериальной массы в 3 раза, полученный антиген может быть использован в PA, в комплексе серологических исследований на бруцеллез для выявления дополнительных больных животных с латентной формой инфекции, что позволит повысить эффективность и достоверность диагностики бруцеллеза на 50%.

ЛИТЕРАТУРА

1. Наставление по диагностике бруцеллеза животных. - М., 2004. - 62 с.

2. Базиков И.А. Л-трансформация бруцелл / Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций: тезисы докл. областной научн. конф. молод. ученых, 17-20 октября 1989 г., Ростов-на-Дону, 1989, стр.5-8.

3. Патент RU №2263142 C2, 7C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:00, «Способ получения L-субкультур штамма Brucellaabortus И-206», опубликовано 2005.10.27.

4. Патент RU №2268748 C2, A61K 39/40, C12N 1/20, G01N 33/531, опубл. 27.01.2006.

5. Альтон Дж., Джонс Л.М. Методы лабораторных исследований по бруцеллезу / ФАО / ВОЗ, Женева, 1968. - 86 с.

Claims

Способ получения бруцеллезного L-антигена, включающий культивирование штамма Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки, инактивация взвеси при температуре 85-90°C в течение 60 минут, отличающийся тем, культивирование проводят при 20-22°C в течение 2-3 суток, полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5% фенолизированным физиологическим раствором, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд. м.к., полученный антиген титруют, стандартизируют по специфичности и активности и используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза.