JPS6329223B2

JPS6329223B2 -

Info

Publication number: JPS6329223B2
Application number: JP3785581A
Authority: JP
Inventors: Mikio Ikeda; Takayuki Tomizawa
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 1981-03-18
Filing date: 1981-03-18
Publication date: 1988-06-13
Also published as: JPS57153658A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗原または抗体の感作あるいは酵素の
固定などに広く利用し得る新規な人工担体の製造
法に関する。抗原、抗体反応を利用する臨床検査
等の分野において、抗原または抗体を、ある適当
な大きさの粒子（以下担体と呼ぶ）に吸着もしく
は結合させ、それぞれに対応する抗体または抗原
によつて凝集を起させる方法は受身凝集反応と呼
ばれ、被検液中の抗体や抗原を高感度に検出でき
るので、いろいろの疾患の血清学的診断や血液学
的診断に広く用いられている。この反応に用いられる担体としては、ポリスチ
レンラテツクス、カオリン、炭末などの非生物学
的粒子と、動物赤血球や細菌菌体のような生物学
的粒子とがある。一般に、非生物学的担体は、化
学的に安定で、それ自身抗原活性を有しないなど
の利点はあるが抗原または抗体が密に吸着されに
くく、たとえば凍結乾燥などによつて抗原または
抗体が、担体から遊離してしまうため、止むなく
液状で冷暗所に保存するという手段が取られ、従
つて長期の保存ができない。また炭末、カオリン
は一定の大きさの担体を選出することが困難であ
り、ポリスチレンラテツクスは一定の大きさの担
体を選出し得たとしても、反応の媒質として望ま
しい中性域では、自然凝集（非特異凝集）をおこ
す危険を含む。一方生物学的担体である動物赤血球や細菌菌体
は、それぞれ大きさが一定である利点はあるもの
の、生物の種類によつて粒子の大きさは定まつて
おり、目的に応じた任意の大きさの粒子を得るこ
とはできない。たとえば動物赤血球は、大きさの
一定した最も入手し易い担体であるが、粒径が約
６〜8μと概して大きいためこれに抗原を感作し
ものは、対応する抗体との結合が弱く、大きな凝
集塊を作りえず、スライド法には不適当である。
また赤血球は血球表面に固有の抗原を有してお
り、抗体との間の交差反応（いわゆる非特異凝集
反応）を起こし、目的とする凝集反応に誤りを与
える可能性があり、さらに赤血球の生物学的、化
学的および物理的特性値が、動物の個体間でバラ
ツキ常に一定品質の血球を得ることは難しいとい
う欠点がある。本発明者らは、受身凝集反応の担体として、動
物赤血球に代わる新規な人工担体の開発を主目的
として、種々研究を重ねた結果、水溶性多糖類、
ゼラチン、メタリン酸ナトリウムおよび親水性有
機溶媒を含む均一透明な混合液を、28℃〜60℃で
かきまぜながら特定のPHに調整することによつて
生じた球状粒子体を、界面活性剤を用いて分散さ
せ、アルデヒド系架橋剤で不溶化することによつ
て、抗原活性を有せず、均質な分散性のよい親水
性粒子が得られること、さらにこの球状粒子は、
受身凝集反応の凍結乾燥可能な担体として実用し
うることを知り、本発明を完成した。本発明方法
は、本来マイクロカプセル化の技術であるコンプ
レツクスコアセルベーシヨン法を応用した、芯物
質を含まない球状粒子の製造法であり、原料の種
類と配合および粒子生成時の系のPHを適宜選択す
れば、得られる粒子の大きさを任意に制御できる
という大きな利点を有する。次に本発明を詳述する。まず、水溶性多糖類、
ゼラチン、メタ燐酸ナトリウムおよびC₁〜C₃の
低級アルコールもしくはアセトンを混合し、粒子
生成原液を調製する。本発明に使用するゼラチンは、通常市販のゼラ
チンでよいが、特に酸性ゼラチンが好ましい。ま
た本明細書中に使用される用語“水溶性多糖類”
とは通常増粘剤または糊料として使用し得る多糖
類またはその誘導体もしくは塩を意味する。たと
えばアラビアゴム、カルボキシメチルセルロー
ス、アルギン酸ナトリウム、寒天、カラゲーナン
などが使用されるが特にアラビアゴムが好適であ
る。本発明に使用し得るメタリン酸ナトリウムと
は、化学式（NaPO₃）_oで表わされる物質を意味
する。たとえば“メタリン酸ナトリウム”（和光
純薬製）又は“ヘキサメタリン酸ナトリウム”
（和光純薬製）として市販されている試薬が、本
発明にいうメタ燐酸ナトリウムとして用い得る。
また親水性有機溶媒としては、メチルアルコー
ル、エチルアルコール、プロピルアルコール、ア
セトンなどが用いられるが、特にメチルアルコー
ルおよびエチルアルコールが望ましい。粒子生成
原液の組成は、水溶性多糖類0.05％〜2.0％、好
ましくは0.1％〜1.0％、ゼラチン0.05％〜2.0％、
好ましくは0.1％〜1.0％、親水性有機溶媒４％〜
25％、メタリン酸ナトリウムはゼラチン乾燥重量
の0.5〜20％（有機溶媒のみは容量％、他は重量
％）の範囲で用いられ、所望の粒子の粒径および
物性に応じて適宜定めればよい。これら４成分の
混合液は28℃〜60℃に加温された状態で、均一、
透明な溶液となつていなければならない。液性が
酸性側では濁ることがあるので、この場合はアル
カリを加え白濁を消しておくことが必要である。
また不溶物は必要に応じて過または遠心分離に
より除去する。次いで、以上のようにして調製した粒子生成原
液を28℃〜60℃、好ましくは38℃〜40℃に加熱
し、かきまぜながら酸を滴下し、ゼラチンと水溶
性多糖類の混合比、メタリン酸ナトリウムの添加
量、および目的とする粒径の大きさによつて定ま
る特定のPH値（PH2.5〜6.0）に調整する。たとえ
ば、抗原感作用担体として好適な2μ〜10μの粒子
を生成させるためのPHは通常4.0〜5.5の範囲であ
る。本工程に使用する酸は、無機酸でも有機酸で
もよいが、特に酢酸が好ましい。本工程で生成し
た粒子は系の温度をゼラチンのゲル化温度以下に
下げても消失しないので、母液との平衡関係はな
く、本来の意味のコアセルベートとは別意のもの
である。また、粒子はほとんどの場合負に帯電し
ており、その表面には溶液中の陽イオンが配向
し、いわゆる電気二重層を形成し、粒子の安定な
分散を促している。本発明においては、さらに長期間にわたる粒子
の安定な分散状態を保持するために、少量の界面
活性剤を添加する。界面活性剤としては、アルキ
ルスルホコハク酸、アルキルスルホマレイン酸、
アルキル硫酸エステル、ポリオキシエチレンアル
キルエーテル硫酸エステルなどの陰イオン界面活
性剤、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエ
チレンアルキルフエニルエーテル、ポリエチレン
グリコール脂肪酸エステルなどの非イオン界面活
性剤が用いられる。これら界面活性剤の使用量
は、陰イオン界面活性剤については、粒子分散液
中の濃度として0.005％〜0.05％、非イオン界面
活性剤の場合は、0.05％〜0.5％程度である。つぎに、粒子分散液にゼラチン乾燥重量の0.1
％〜200％のアルデヒド系架橋剤を添加し（分散
液中の濃度0.001％〜2.0％）、室温あるいは10℃
以下の低温、好ましくは４℃前後で一夜放置し、
前工程で生成した粒子を不溶化する。本発明に用
いるアルデヒド系架橋剤としてはグルタルアルデ
ヒド、ホルマリン、グリオキザール、クロトンア
ルデヒド、アクロレイン、アセトアルデヒドなど
が使用しうるが特にグルタルアルデヒドが好適で
ある。ついで不溶化された粒子を遠心分離により
回収し、前工程とほぼ同濃度の界面活性剤を含む
水で２〜３回洗浄する。このようにして得られた本発明品の担体粒子
は、無色半透明であるので、これを受身凝集反応
の担体として用いる場合には、凝集像の判定を容
易にするために、染色することが望ましい。本粒
子の染色には、たとえば食用赤色３号、ローダミ
ン、ローズベンガル、ポンソー3R、ボルドーＳ、
フクシンエオシンおよびニユートラルレツドなど
の赤色色素、あるいはクリスタルバイオレツト、
トルイジンブルーおよびメチレンブルーなどの青
色色素が用いられる。染色は、これらの色素の
0.01％〜0.5％溶液に、本発明品を一夜浸漬する
ことによつて行われる。別法として、これらの色
素をあらかじめ粒子生成原液に添加しておいても
よい。第二工程で架橋が不十分な場合には、リン酸緩
衝液などの塩類溶液中では膨潤することがあるの
で、抗原感作のようなリン酸緩衝液中での処理を
含む用途に用いるときは、さらに架橋を導入し、
膨潤を防ぐ必要がある。この目的のためには、再
度、通常赤血球の固定化に用いられる条件でホル
マリン処理を行う。この処理により塩類溶液中で
の膨潤防止とともに、ホルマリンの殺菌効果によ
つて、長期保存に耐える担体が得られる。このようにして得られた本発明品の粒子に対す
る抗原（または抗体）の感作は、動物赤血球を担
体とした場合の常法に従えばよい。たとえば本粒
子をタンニン酸処理した後、超音波処理をした梅
毒トレポネーマ病原体を吸着させ、マイクロタイ
ター法による受身凝集反応を行つたが、動物赤血
球を担体として用いた場合と全く同じ成績が得ら
れた。また、凍結乾燥をした本発明品の抗原感作
粒子も受身凝集反応において、抗原感作動物赤血
球と同等の性能を有していた。なお、本発明の粒
子の電気泳動度を測定したところ、25℃における
PH7.2の0.15Mリン酸塩緩衝生理食塩水における
電気泳動度は−1.1〜−0.8μｍ／sec／Ｖ／cmにあ
つた。本発明の効果は、従来受身凝集反応の担体とし
て、実用化されている動物赤血球、細菌菌体、ポ
リスチレンラテツクスなどに代わり、これらより
優れた新規な担体を提供し得たことであり、現在
最も賞用されている動物赤血球と同等の性能を有
し、かつ(1)抗原活性を有しないこと、(2)目的に合
つた任意の粒径の粒子が得られること、(3)化学
的、物理的に均質安定であること、(4)容易かつ安
価に大量生産ができることなど、動物赤血球にな
い幾多の利点を有し、非生物系の合成担体と比較
しても、親水性ゲルであるために、抗原または抗
体との結びつきが強固であり、凍結乾燥しても感
作した抗原または抗体が分離することなく、長期
保存に耐えるという大きな利点を有する。さらに本発明品は、単に臨床検査薬分野の受身
凝集反応用感作担体としての用途のみでなく、蛋
白質、多糖類としての反応性、親水性を有し、均
一な粒径を有する均質、安定な粒子として医薬、
食品、固定化酵素など他の技術分野への広い応用
が考えられる。たとえば近年食品工業、医薬品工
業において固定化酵素がひろく用いられている
が、本発明によるゼラチン−アラビアゴム粒子は
ジアゾカツプリング法により、容易に酵素を固定
化できるので、酵素の新規な粒子状固定化担体と
しても有用である。以下実例によつて本発明を具体的に説明する。実施例１等電点がPH９であるゼラチン（以下Ｇと略称）
15ｇを40℃の温水485ｇに溶解し、10重量％の水
酸化ナトリウム溶液を用いてPHを９に調整した。
15ｇのアラビアゴム（以下Ａと略称）を水485ｇ
に溶解し、不溶物を別した後、40℃に加温し
た。上記Ｇ溶液60容量部と、Ａ溶液40容量部から
なる混合液750ｇを、あらかじめ40℃に加温した
30容量％のエチルアルコール溶液2250mlに注ぎ入
れよくかきまぜる。これに10重量％のヘキサメタ
リン酸ナトリウム溶液12ｇを加えた後、10容量％
酢酸溶液を滴下してPHを4.9とした。次いでポリ
オキシエチレンフエニルエーテル（エマルゲンＡ
−60、花王石鹸(株)登録商標）7.5ｇを少しづつ加
え、よくかきまぜた。粒子分散液の温度を室温ま
で下げてから、グルタルアルデヒド0.2ｇを加え、
約１時間撹拌した後、一夜静置した。この分散液
を2000r.p.mで、５分間遠心分離し、不溶化した
粒子をペレツトとして回収した。0.2容量％の上
記界面活性剤溶液に再分散し、粒子を洗浄する。
洗浄はさらに２回行う。次いで粒子は0.05重量％
のローズベンガル溶液中に一夜浸漬することによ
り赤色に染色した。染色された粒子を８％ホルマ
リン液中に４℃で一夜放置し、さらに架橋を強め
た。このようにして得られた担体粒子の大きさは、
おおむね均一であり、粒径は約10μであつた。こ
の担体粒子の電気泳動度を測定した。装置には米
国ペン・ケン社（Pen Ken Inc.）製のレーザ
ー・ジー・システム3000（Laser Zee
system3000）を用い、25℃で測定を行なつた。
測定方法としては、この粒子をPH7.2の0.15Mリ
ン酸塩緩衝生理食塩水中に懸濁して直径１mmで長
さが20mmの円筒状電気泳動セルに入れ、１ｍ当り
1048Vの電圧勾配をかけて泳動速度を測定した。
その結果、この粒子の電気泳動度は−0.970μｍ／
sec／Ｖ／cmであつた。この担体粒子に常法に従
つてタンニン酸処理をほどこし、超音波処理した
梅毒トレポネーマ病原体を感作し、マイクロタイ
ター法によつて受身凝集反応を行つたところ、表
１に示すような結果を得た。なお対照としてヒツ
ジ赤血球を担体とした梅毒トレポネーマ感作赤血
球凝集反応（TPHA）を行つた。その結果をあ
わせて表−１に示す。

【表】実施例２ PH９に等電点をもつゼラチン（酸性ゼラチン）
10ｇを40℃の温水490ｇに溶解し、10重量％の水
酸化ナトリウム溶液でPH９に調整した。アラビア
ゴム10ｇに水490ｇを加えて溶解し、不溶物を
別した後、40℃に加温する。上記両溶液を等量づ
つ混合した後750ｇを40℃の20容量％エチルアル
コール溶液2250ｇに加えた。40℃で撹拌を続けな
がら、10重量％のメタリン酸ナトリウム（和光純
薬製）溶液６ｇを加え、次いで10容量％の酢酸溶
液を滴下し、PH4.6とした。陰イオン界面活性剤
アルキルスルホマレイン酸（デモールEP.花王石
鹸(株)、登録商標）1.5ｇを徐々に加え、実施例１
に準じて粒子を不溶化し、0.2％のボルドＳ溶液
で赤色に染色した。本例で得られた粒子の粒径は
約5μであつた。実施例３実施例２において得たゼラチン溶液と、アラビ
アゴム溶液のそれぞれ30容量部と70容量部とより
なる溶液750ｇを用い、実施例２に準じて本粒子
を作製した。なおメタリン酸ナトリウムとして
は、10重量％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液３
ｇを添加し、粒子生成反応終了時のPHは4.17であ
つた。本例で得られた粒子の粒径は約2μであつ
た。実施例４酸性ゼラチン３ｇを40℃の温水300mlに溶解し、
10重量％の水酸化ナトリウム溶液でPH９に調整
後、温水を加え、400mlとする。カルボキシメチ
ルセルロース３ｇを400mlの水に溶解し、不溶物
を別後40℃に加温する。ゼラチン溶液400mlと
カルボキシメチルセルロース溶液400mlとを混合
し、これにエチルアルコール150ml、0.6重量％ヘ
キサメタリン酸ナトリウム溶液50mlを加え、全体
を40℃に加温した。次いで上記混合液に撹拌しな
がら、10容量％の酢酸溶液を滴下して、PHを4.8
に調整し、粒子を生成させた。つぎに、ポリオキ
シエチレンフエニルエーテル（エマルゲンＡ−
60）２ｇを少しづつ加え、よくかき混ぜる。粒子
分散液の温度を室温まで下げ、グルタールアルデ
ヒド30mgを加え、約１時間撹拌した後一夜静置
後、2000r.p.m10分間遠心分離し、不溶化した粒
子13ｇをペレツトとして回収した。これらの粒子
の粒径は約5μであつた。実施例５ 15ｇの酸性ゼラチンを40℃の温水235ｇに溶解
し、10重量％の水酸化ナトリウム溶液を加えて、
PH９とした。15ｇのアラビアゴムに水235ｇを加
えて溶解し、不溶物を別後40℃に加温した。両
液をよく混合し、40℃に加温してある20容量％メ
チルアルコール1500ｇに加えた。これにヘキサメ
タリン酸ナトリウム1.2ｇを溶解し、よくかきま
ぜる。次いで10容量％酢酸溶液を滴下してPH4.76
とすると、粒径約5μの粒子が生成した。実施例
１に準じて界面活性剤により分散させ、グルタル
アルデヒド0.2ｇにより不溶化し、遠心分離して
約80ｇの粒子をペレツトとして回収した。実施例６メチルアルコールの代りにノルマルプロピルア
ルコールを用い、その他は実施例５に準じて担体
を製造した。粒子はPH4.58で生成し、粒径は約
10μであつた。実施例７実施例５に記載された方法で、メチルアルコー
ルの代りに、アセトンを用い、PH4.69で粒子を生
成させ、不溶化して担体を回収した。粒径は約
15μであつた。

Claims

【特許請求の範囲】１水溶性多糖類、ゼラチンおよびメタリン酸ナ
トリウムを含み、アルデヒド系架橋剤により架橋
され不溶化された粒子状人工担体。２水溶性多糖類、ゼラチンおよびメタリン酸ナ
トリウムの混合物に低級アルコール（C₁〜C₃）
およびアセトンのうち一種または二種以上を添加
し、28℃〜60℃に加温し、透明になるようにPHを
調整した溶液をかきまぜながら酸によつてPH2.5
〜6.0に再調整し、所望の大きさの粒子を生成せ
しめる第一工程と、この粒子を陰イオンまたは非
イオン界面活性剤で分散させ、アルデヒド系架橋
剤によつて不溶化する第二工程とからなる人工担
体の製法。