CN113474450A - 产生工程化细胞的方法以及所述工程化细胞的组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开文本提供将用于细胞疗法的T细胞如原代CD4+T细胞和/或CD8+T细胞基因工程化的方法，所述方法不涉及扩增所述细胞。在特定方面，如与可替代的工程化方法，如涉及扩增细胞的方法相比，所提供的方法在缩短的时间量内成功产生表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞的组合物，如含有工程化T细胞的群体的组合物。在某些方面，所提供的方法在从开始刺激或激活所述细胞的方法时起4天内成功产生适用于细胞疗法的工程化T细胞的组合物。在一些方面，所得工程化细胞组合物由如下细胞群构成，所述细胞群比通过其他手段如通过涉及扩增细胞的方法产生的工程化T细胞组合物分化程度更低，消耗更少且更强效。还提供通过所提供的方法产生的T细胞的组合物及其用于治疗受试者的用途。

Description

产生工程化细胞的方法以及所述工程化细胞的组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年8月9日提交的标题为“产生工程化细胞的方法以及所述工程化细胞的组合物(Processes for Generating Engineered Cells and CompositionsThereof)”的美国临时申请号62/716,981、2018年10月5日提交的标题为“产生工程化细胞的方法以及所述工程化细胞的组合物(Processes for Generating Engineered Cellsand Compositions Thereof)”的美国临时申请号62/742,249、2019年1月29日提交的标题为“产生工程化细胞的方法以及所述工程化细胞的组合物(Processes for GeneratingEngineered Cells and Compositions Thereof)”的美国临时申请号62/798,433、2019年5月2日提交的标题为“产生工程化细胞的方法以及所述工程化细胞的组合物(Processesfor Generating Engineered Cells and Compositions Thereof)”的美国临时申请号62/842,402和2019年6月13日提交的标题为“产生工程化细胞的方法以及所述工程化细胞的组合物(Processes for Generating Engineered Cells and Compositions Thereof)”的美国临时申请号62/861,308的优先权，将这些申请的内容通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是连同电子格式的序列表一起提交的。序列表以2019年8月5日创建的名为735042017440SeqList.txt的文件提供，其大小为93,105字节。将所述序列表的电子格式的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本提供将用于细胞疗法的T细胞如原代CD4+T细胞和/或CD8+T细胞基因工程化的方法，所述方法不涉及扩增所述细胞。在特定方面，如与可替代的工程化方法，如涉及扩增细胞的方法相比，所提供的方法在缩短的时间量内成功产生表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞的组合物，如工程化T细胞的群体。在某些方面，所提供的方法在从开始刺激或激活所述细胞的方法时起4天内成功产生适用于细胞疗法的工程化T细胞的组合物。在一些方面，所得工程化细胞组合物由如下细胞群构成，所述细胞群比通过其他手段如通过涉及扩增细胞的方法产生的工程化T细胞组合物分化程度更低，消耗更少且更强效。还提供通过所提供的方法产生的T细胞的组合物及其用于治疗受试者的用途。
背景技术
多种细胞疗法方法可用于治疗疾病和病症。细胞疗法方法包括涉及用重组受体(如嵌合抗原受体)基因工程化的免疫细胞(如T细胞)的方法。然而，在一些情况下，一些用于产生基因工程化细胞组合物的现有方法可能费时或者成功完成所需的时间量可能会变化。在某些情况下，一些现有方法可能得到细胞群在体内具有低效力或持久性的组合物。需要用于制造和/或工程化此类细胞疗法的改进方法，包括以提供更有效的过程和/或改进的细胞组合物产品。
发明内容
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在以下时间进行：(i)在开始暴露于所述刺激试剂之后24小时与120小时之间、或1天与5天之间、或约1天与约5天之间(包含端值)的时间；(ii)在基因组中检测到整合载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前的时间；(iii)在收获时活细胞的总数是受刺激的群体的总活细胞数量的大于或大于约三倍、两倍或者相同或大致相同之前的时间；和/或(iv)在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD3+T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，CD27+CCR7+所占百分比大于或大于约60％时的时间；从而产生工程化细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述输入组合物包含至少300x106个活原代T细胞。在某些实施方案中，所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含至少300x106个活原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在以下时间进行：(i)在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间、或2天与5天之间、或约2天与约5天之间(包含端值)的时间；(ii)在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前的时间；(iii)在收获时活细胞的总数是受刺激的群体的总活细胞数量的大于或大于约三倍、两倍或者相同或大致相同之前的时间；和/或(iv)在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD3+细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％时的时间；从而产生工程化细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述收获是在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定iVCN之前的时间进行。在某些实施方案中，当所述iVCN达到峰值并保持不变或者在容许误差内不变，持续大于24小时或一天或者大于约24小时或约一天的时间段时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。在特定实施方案中，当所述转化的细胞的群体的二倍体基因组中iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为或为约1.0或者在其容许误差内时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。在一些实施方案中，所述收获是在所述转化的细胞的群体中整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于0.8时的时间进行。
在一些实施方案中，在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD3+细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％时的时间收获T细胞。在某些实施方案中，所述幼稚样T细胞包含CD27+CCR7+T细胞。
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间、或2天与5天之间、或约2天与约5天之间(包含端值)的时间进行，其中在收获时，所述转化的细胞的群体的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约0.4个拷贝/二倍体基因组与2.0个拷贝/二倍体基因组之间；从而产生工程化细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约2.0个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。在某些实施方案中，所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约1.5个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。在特定实施方案中，所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约1.0个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。在一些实施方案中，所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约0.75个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。在某些实施方案中，所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约0.5个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间(包含端值)、或2天与5天之间、或约2天与约5天之间(包含端值)的时间进行，其中在收获时，在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样细胞所占百分比大于或大于约60％；从而产生工程化细胞的组合物。
在一些实施方案中，在所提供方法中收获时，在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约60％。在特定实施方案中，中枢记忆T细胞是CCR7+CD45RA-。
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间(包含端值)、或2天与5天之间、或约2天与约5天之间(包含端值)的时间进行，其中在收获时，在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样细胞和/或中枢记忆细胞所占百分比大于或大于约60％，从而产生工程化细胞的组合物。
在一些实施方案中，在收获时：在所述群体的总重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，如占所述群体中总重组蛋白表达T细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，在收获时：在所述群体的总重组蛋白表达CD4+T细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，如占所述群体中总重组蛋白表达CD4+细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，在收获时：在所述群体的总重组蛋白表达CD8+T细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，如占所述群体中总重组蛋白表达CD8+细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞包含CCR7+CD45RA+。在特定实施方案中，所述幼稚样T细胞包含CD27+CCR7+细胞。
在一些实施方案中，在收获时：在所述群体的总重组蛋白表达细胞中，CD27+CCR7+所占百分比大于或大于约60％，如占所述群体中总重组蛋白表达T细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，在收获时：在所述群体的总重组蛋白表达CD4+T细胞中，CD27+CCR7+所占百分比大于或大于约40％，如占所述群体中总重组蛋白表达CD4+细胞的大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，在收获时：在所述群体的总重组蛋白表达CD8+T细胞中，CD27+CCR7+所占百分比大于或大于约40％，如占所述群体中总重组蛋白表达CD8+细胞的大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在一些实施方案中，在收获时：在所述群体的总重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约60％，如占所述群体中总重组蛋白表达T细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，在收获时：在所述群体的总重组蛋白表达CD4+T细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约40％，如占所述群体中总重组蛋白表达CD4+细胞的大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，在收获时，在所述群体的总重组蛋白表达CD8+T细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约40％，如占所述群体中总重组蛋白表达CD8+细胞的大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞包含CCR7+CD45RA+。在特定实施方案中，所述幼稚样T细胞包含CD27+CCR7+细胞。在特定实施方案中，中枢记忆T细胞是CCR7+CD45RA-。
在一些实施方案中，在所述引入之后且在所述收获之前，所述方法还包括将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时或4天。在特定实施方案中，所述孵育是在约37℃的温度下进行。在某些实施方案中，在所述引入之后，所述孵育进行长达72小时或3天。在特定实施方案中，在所述引入之后，所述孵育进行长达48小时或2天。在一些实施方案中，在所述引入之后，所述孵育进行长达24小时或一天。在某些实施方案中，所述孵育进行至少18小时。在特定实施方案中，所述孵育是在静态条件下进行。在特定实施方案中，静态条件是不涉及培养基的离心、振荡、旋转、摇摆或灌注(例如，连续或半连续灌注)的条件。
在特定实施方案中，所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后96小时或4天内进行。在一些实施方案中，所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后72小时或3天内进行。在某些实施方案中，所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后48小时或2天内进行。
在特定实施方案中，所述暴露和所述引入中的一者或两者是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。在一些实施方案中，所述孵育是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。在某些实施方案中，所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行。
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，所述条件包括一种或多种重组细胞因子的存在，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行；(c)将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时或4天，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行；以及(c)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间或2天与5天之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述一种或多种重组细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种重组细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种重组细胞因子包括在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；和/或在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种重组细胞因子是或包含重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15。例如，在一些情况下，所述一种或多种重组细胞因子包括在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；以及在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。
在一些实施方案中，所述暴露和所述引入中的一者或两者是在无血清培养基中进行。
在某些实施方案中，所述刺激试剂包含(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。在特定实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂中的一种或两种包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂包含抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，所述刺激试剂包含抗CD3抗体和抗CD28抗体。
在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂存在于或附着于固体支持物的表面上。在某些实施方案中，所述固体支持物是或包含珠。在特定实施方案中，珠与细胞的比率小于3:1。
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含珠的刺激试剂，所述珠附着有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中珠与细胞的比率小于3:1，并且所述暴露是在一定条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间或2天与5天之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。
在一些实施方案中，珠与细胞的比率为或为约1:1。在某些实施方案中，所述珠上附着有抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段。
在特定实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂可逆地结合在包含多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的表面上。
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，所述寡聚颗粒试剂可逆地结合有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中所述暴露是在一定条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间或2天与5天之间(包含端值)的时间进行，从而产生工程化细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述暴露是用一定量的刺激试剂，如包含多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂进行，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.1μg与20μg之间，包含端值。
本文提供一种用于刺激T细胞的方法，所述方法包括将包含T细胞的输入组合物暴露于一定量的刺激试剂，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.1μg与20μg之间，包含端值，所述刺激试剂包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂，其中所述暴露是在一定条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体。在一些实施方案中，所述输入组合物包含原代T细胞。
本文提供一种用于刺激T细胞的方法，所述方法包括将包含T细胞的输入组合物暴露于一定量的刺激试剂，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.1μg与20μg之间，包含端值，所述刺激试剂包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂，所述寡聚颗粒试剂附着有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中所述暴露是在一定条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体。在一些实施方案中，所述输入组合物包含原代T细胞。
在一些实施方案中，在所述引入之后且在所述收获之前，所述方法还包括将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时或4天。在一些实施方案中，所述孵育是在约37℃的温度下进行。在某些实施方案中，在所述引入之后，所述孵育进行长达72小时或3天。在特定实施方案中，在所述引入之后，所述孵育进行长达48小时或2天。在一些实施方案中，在所述引入之后，所述孵育进行长达24小时或一天。在特定实施方案中，所述孵育是在静态条件下进行。在特定实施方案中，静态条件是不涉及培养基的离心、振荡、旋转、摇摆或灌注(例如，连续或半连续灌注)的条件。
在某些实施方案中，所述收获是在开始将所述输入组合物暴露于所述刺激剂之后96小时或4天内进行。在特定实施方案中，所述收获是在开始将所述输入组合物暴露于所述刺激剂之后72小时或3天内进行。在一些实施方案中，所述收获是在开始将所述输入组合物暴露于所述刺激剂之后48小时或2天内进行。
在某些实施方案中，所述暴露和所述引入中的一者或两者是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。
在一些实施方案中，所述孵育是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。在特定实施方案中，所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行。
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含珠的刺激试剂，所述珠附着有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中珠与细胞的比率小于3:1，并且所述暴露是在包括一种或多种重组细胞因子的存在的条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行；(c)将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时或4天，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行；以及(d)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间或2天与5天之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，所述寡聚颗粒试剂附着有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中所述暴露是在包括一种或多种重组细胞因子的存在的条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行；(c)将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时或4天，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行；以及(d)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间或2天与5天之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述暴露于包含多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒刺激试剂是用一定量的刺激试剂进行，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.4μg与8μg之间，包含端值。在某些实施方案中，所述暴露是用一定量的刺激试剂进行，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.8μg与4μg之间，包含端值。在特定实施方案中，所述暴露是用一定量的刺激试剂进行，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞为或为约0.8μg。
在一些实施方案中，所述一种或多种重组细胞因子是人重组细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种重组细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15。例如，在一些情况下，所述一种或多种重组细胞因子包括在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；和/或在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。在某些实施方案中，所述一种或多种重组细胞因子是或包含重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15。例如，在一些情况下，所述一种或多种重组细胞因子包括在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；以及在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。在特定实施方案中，所述暴露和所述引入中的一者或两者是在无血清培养基中进行。在一些实施方案中，所述孵育是在无血清培养基中进行。
在某些实施方案中，所述刺激试剂是如下试剂：其中一级药剂和二级药剂，如抗CD3和抗CD28抗体或其抗原结合片段，存在于或附着于珠的表面上。在某些实施方案中，珠与细胞的比率为从或从约2:1至0.5:1。在特定实施方案中，珠与细胞的比率为或为约1:1。在一些实施方案中，所述珠包含大于或大于约3.5μm但不超过约9μm或不超过约8μm或不超过约7μm或不超过约6μm或不超过约5μm的直径。在某些实施方案中，所述珠包含为或约4.5μm的直径。在一些实施方案中，所述珠是惰性的。在特定实施方案中，所述珠是或包含聚苯乙烯表面。在一些实施方案中，所述珠是顺磁性的或超顺磁性的。例如，在一些情况下，所述珠是受磁场吸引的珠。在一些实施方案中，在所述收获之前，所述方法还包括在所述孵育之后或期间将所述细胞暴露于磁场，从而从所述细胞去除所述刺激试剂。
在一些实施方案中，所述刺激试剂是如下试剂：其中一级药剂和二级药剂，如抗CD3和抗CD28抗体或其抗原结合片段，可逆地结合至包含多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂。在某些实施方案中，所述链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子结合至或能够结合至生物素、抗生物素蛋白、生物素类似物或突变蛋白、抗生物素蛋白类似物或突变蛋白和/或其生物活性片段。在特定实施方案中，参考在SEQ ID NO:61所示氨基酸序列中的在链霉亲和素中的位置，在对应于位置44至47的序列位置，所述多个链霉亲和素突变蛋白分子各自包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47。
在一些实施方案中，所述多个链霉亲和素突变蛋白分子各自包含：a)SEQ ID NO:62、63、68、75-77或80-83中任一个所示的氨基酸序列；b)如下氨基酸序列：其与SEQ ID NO:62、63、68、75-77或80-83中任一个展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，并且含有对应于Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47的氨基酸序列，和/或可逆地结合至生物素、生物素类似物或链霉亲和素结合肽；或者c)a)或b)的功能片段，其可逆地结合至生物素、生物素类似物或链霉亲和素结合肽。在某些实施方案中，所述多个链霉亲和素突变蛋白分子包含SEQ ID NO:63或68所示的氨基酸序列。
在特定实施方案中，可逆地结合在寡聚颗粒试剂表面上的所述一级药剂和所述二级药剂各自包含链霉亲和素结合肽。在一些实施方案中，所述链霉亲和素结合肽选自Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:64)、Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:73)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:65)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:66)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:67)。
在某些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂中的一种或两种包含抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，所述一种或多种药剂是或包含单价抗体片段。在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂中的一种或两种是或包含Fab。
在一些实施方案中，所述寡聚颗粒试剂包含：大于60nm、大于70nm、大于80nm、或大于90nm的半径。在一些实施方案中，所述寡聚颗粒试剂包含：在50nm与150nm之间、在75nm与125nm之间、在80nm与115nm之间、或在90nm与110nm之间(包含端值)的半径；或90nm±15nm或95nm±20-25nm的半径。
在一些实施方案中，所述寡聚颗粒试剂包含以下分子量：至少5x107g/mol、或至少1x108g/mol；和/或_在5x107g/mol与5x108g/mol之间、在1x108g/mol与5x108g/mol之间、或在1x108g/mol与2x108g/mol之间。
在某些实施方案中，所述寡聚颗粒试剂包含至少500个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、至少1,000个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、至少1,500个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、或至少2,000个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体；和/或；在1,000个与20,000个之间的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、在1,000个与10,000个之间的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、或在2,000个与5,000个之间的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述孵育的至少一部分之后或期间将物质添加至所述细胞，其中所述物质能够逆转所述一级药剂和所述二级药剂(如抗CD3和抗CD28抗体或其抗原结合片段)与所述寡聚颗粒试剂之间的键。在某些实施方案中，所述物质是自由结合配偶体和/或是竞争剂。在特定实施方案中，所述物质的存在终止或减少所述一级药剂和所述二级药剂在所述T细胞中诱导或调节的信号。在一些实施方案中，所述物质是或包含链霉亲和素结合肽、生物素或生物活性片段、或者生物素类似物或生物活性片段。在某些实施方案中，所述物质是或包含链霉亲和素结合肽，并且所述链霉亲和素结合肽选自Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:64)、Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:73)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:65)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:66)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:67)。在一些实施方案中，所述物质是或包含生物素或生物活性片段、或者生物素类似物或生物活性片段。
在某些实施方案中，所述物质是在开始暴露于包含寡聚颗粒的所述刺激试剂之后在或在约42小时与120小时之间(包含端值)添加。在某些实施方案中，所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒试剂之后在或在约48小时与120小时之间或在或在约2天与5天之间(包含端值)添加。在特定实施方案中，所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒试剂之后在或在约72小时与96小时之间或在或在约3天与4天之间添加。在一些实施方案中，所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒试剂之后48小时或2天或者约48小时或约2天添加。在某些实施方案中，所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒试剂之后72小时或3天或者约72小时或约3天添加。在特定实施方案中，所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒试剂之后96小时或4天或者约96小时或约4天添加。
在一些实施方案中，所述物质是在所述孵育之后且在所述收获之前添加。在某些实施方案中，所述物质是在所述孵育的至少一部分期间添加，并且其中所述孵育在添加所述物质之后继续进行。在特定实施方案中，在添加所述物质之后，在缺少重组细胞因子的基础培养基的存在下进行所述孵育。
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于对于每106个细胞在或在约0.02μg与8μg之间的包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，所述寡聚颗粒试剂附着有：(i)与CD3特异性结合的一级药剂，和(ii)特异性结合CD28的二级药剂，其中所述暴露是在具有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在具有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行；(c)将所述转化的细胞的群体在静态条件下孵育24小时与96小时之间或一天与4天之间，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，并且在所述孵育的至少一部分期间添加包含生物素或其生物活性片段、任选地D-生物素，或者生物素类似物或其生物活性片段的物质；以及(d)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后72小时与96小时之间、或3天与4天之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述输入组合物包含至少300x106个活原代T细胞。在一些实施方案中，所述输入组合物中原代T细胞的数量是为或约450x106个活原代T细胞、为或约500x106个活原代T细胞、为或约550x106个活原代T细胞、为或约600x106个活原代T细胞、为或约700x106个活原代T细胞、为或约800x106个活原代T细胞、为或约900x106个活原代T细胞、或者为或约1,000x106个活原代T细胞，或者任何前述值之间的任何值。在某些实施方案中，所述输入组合物包含或包含为或约600x106个活原代T细胞。在特定实施方案中，所述输入组合物中细胞的数量是多达900x106个活原代T细胞，或者为或为约900x106个活原代T细胞。
在一些实施方案中，所述输入组合物中的原代T细胞包括原代CD3+T细胞，或者包括原代CD4+T细胞和/或原代CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述输入组合物中的细胞是例如通过选择或分离从受试者的生物样品富集的。在一些实施方案中，所述原代T细胞富含从生物样品分离或选择的原代CD3+T细胞，如通过对CD3+T细胞基于免疫亲和力的选择。在一些实施方案中，所述原代T细胞富含从生物样品分离或选择的原代CD4+T细胞，如通过对CD4+T细胞基于免疫亲和力的选择。在一些实施方案中，所述原代T细胞是从生物样品分离或选择的富集的原代CD8+T细胞，如通过对CD8+T细胞基于免疫亲和力的选择。在一些实施方案中，所述原代T细胞是从生物样品分离或选择的富集的原代CD4+和富集的原代CD8+T细胞，如通过对CD4+T细胞和CD8+T细胞基于免疫亲和力的选择。
在特定实施方案中，所述输入组合物包含比率在1.5:1与2.0:1之间的CD4+与CD8+细胞。在一些实施方案中，所述输入组合物包含比率在1.2:1与0.8:1之间的CD4+与CD8+细胞。在一些实施方案中，所述比率是为或约1:1的CD4+与CD8+T细胞。
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于对于每106个细胞在或在约0.4μg与8μg之间的包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，所述寡聚颗粒试剂附着有：(i)与CD3特异性结合的一级药剂，和(ii)特异性结合CD28的二级药剂，其中所述输入组合物包含比率在2:1与1:2之间的CD4+与CD8+T细胞并且包含至少300x106个作为CD4+和CD8+T细胞的原代T细胞，并且其中所述暴露是在包含重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在具有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行；(c)将所述转化的细胞的群体在静态条件下孵育在或在约24小时至72小时之间、或者在或在约一天至3天之间，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行；并且在所述孵育的至少一部分期间添加包含生物素或其生物活性片段、任选地D-生物素，或者生物素类似物或其生物活性片段的物质，其中所述添加是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与72小时之间或2天与3天之间(包含端值)的时间进行；以及(d)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后72小时与96小时之间或3天与4天之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，所述原代T细胞包含比率为或为约1:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒试剂之后48小时或2天或者约48小时或约2天添加。在某些实施方案中，所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒试剂之后72小时或3天或者约72小时或约3天添加。在特定实施方案中，所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒试剂之后96小时或4天或者约96小时或约4天添加。
本文提供一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含至少300x106个原代T细胞的输入组合物暴露于包含顺磁珠的刺激试剂，珠与细胞的比率为从或从约2:1至0.5:1，其中所述珠是包含聚苯乙烯涂层和为或为约4.5μm的直径的惰性顺磁珠，所述珠附着有：(i)抗CD3抗体或其抗原结合片段和抗CD28抗体或其抗原结合片段，其中所述输入组合物包含比率在2:1与1:2之间的CD4+与CD8+T细胞并且包含至少300x106个作为CD4+和CD8+T细胞的原代T细胞，并且其中所述暴露是在包含重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在具有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行；(c)将所述转化的细胞的群体在静态条件下孵育48小时与72小时之间、或2天与3天之间，包含端值，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行；(d)在所述孵育之后，将所述细胞暴露于磁场以从所述细胞去除所述刺激试剂，然后收获所述T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后72小时与96小时之间、或约3天与4天之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，所述原代T细胞包含比率为或为约1:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞。
在一些实施方案中，所述输入组合物中原代T细胞的数量是为或约450x106个活原代T细胞、为或约500x106个活原代T细胞、为或约550x106个活原代T细胞、为或约600x106个活原代T细胞、为或约700x106个活原代T细胞、为或约800x106个活原代T细胞、为或约900x106个活原代T细胞、或者为或约1,000x106个活原代T细胞，或者任何前述值之间的任何值。在某些实施方案中，所述输入组合物包含或包含为或约600x106个活原代T细胞。在特定实施方案中，所述输入组合物中细胞的数量是多达900x106个活原代T细胞，或者为或为约900x106个活原代T细胞。
在一些实施方案中，所述孵育的至少一部分是在包含重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行。在某些实施方案中，所述孵育是在缺少重组细胞因子的基础培养基中进行。在特定实施方案中，在所述引入之后，所述孵育进行或进行约24小时或者进行或进行约一天。在一些实施方案中，在所述引入之后，所述孵育进行或进行约48小时或者进行或进行约2天。在某些实施方案中，在所述引入之后，所述孵育进行或进行约72小时或者进行或进行约3天。
在一些实施方案中，在暴露于所述刺激试剂之前，所述方法包括从生物样品富集CD3+T细胞，其中所述富集包括在封闭系统中选择呈CD3+的细胞，从而产生选择的群体。在一些情况下，所述富集是第一选择，并且针对呈CD3+的细胞对细胞和所述第一选择进行进一步选择，以进一步富集所述选择，从而产生第二选择的群体。在一些实施方案中，所述输入组合物包含所富集的CD3+细胞。在一些实施方案中，所述输入组合物包含从第一选择富集的CD3+细胞。在一些实施方案中，所述输入组合物包含从第二选择富集的CD3+细胞。
在某些实施方案中，所述富集细胞包括基于免疫亲和力的选择。在一些实施方案中，所述基于免疫亲和力的选择是通过使细胞与固定在或附着至亲和色谱基质上的抗体接触来实现，所述抗体能够与所述细胞上的细胞表面标记特异性结合。在一些实施方案中，所述基于免疫亲和力的选择是CD3+T细胞的阳性选择。在某些实施方案中，所述方法还包括在使样品中的细胞与亲和色谱基质接触之后，洗脱已经与所述抗体结合的细胞，从而从所述基质回收选择的细胞。
在一些实施方案中，在暴露于所述刺激试剂之前，所述方法包括从生物样品富集CD4+或CD8+T细胞，其中所述富集包括：(a)在封闭系统中进行第一选择，所述第一选择包括从含有原代人T细胞的样品富集(i)CD4+细胞和(ii)CD8+细胞中的一种，所述富集从而产生第一选择的群体和未选择的群体；以及(b)在所述封闭系统中进行第二选择，所述第二选择包括从所述未选择的群体富集(i)CD4+细胞和(ii)CD8+细胞中的另一种，所述富集从而产生第二选择的群体，其中所述富集产生CD4+T细胞和CD8+T细胞的单独富集群体，其中所述单独富集群体各自包含来自所述第一选择的群体或所述第二选择的群体中的一个的细胞，并且其中所述输入组合物包含来自CD4+T细胞的富集群体和CD8+T细胞的富集群体中的一个或多个的细胞。
在一些实施方案中，组合CD4+T细胞与CD8+T细胞的所述单独富集群体，从而产生所述输入组合物。在某些实施方案中，所述组合是在所述封闭系统中进行，任选地其中所述封闭系统是自动化的。在特定实施方案中，在所述第一选择和/或所述第二选择中富集细胞包括基于细胞表面标记的表达进行阳性选择或阴性选择。在一些实施方案中，在所述第一选择或所述第二选择中富集细胞包括基于一种或多种细胞表面标记的表达进行多个阳性或阴性选择步骤，以富集CD4+或CD8+细胞。
在某些实施方案中，在所述第一选择和/或所述第二选择中富集细胞包括基于免疫亲和力的选择。在一些实施方案中，所述基于免疫亲和力的选择是通过使细胞与固定在或附着至亲和色谱基质上的抗体接触来实现，所述抗体能够与所述细胞上的细胞表面标记特异性结合，以实现CD4+或CD8+细胞的阳性或阴性选择。在某些实施方案中，所述方法还包括在使样品中的细胞与所述第一选择和/或第二选择中的亲和色谱基质接触之后，洗脱已经与所述抗体结合的细胞，从而从所述基质回收选择的细胞。在特定实施方案中，从所述生物样品富集CD4+或CD8+T细胞包括：(a)通过基于CD4的表面表达进行阳性选择来富集所述CD4+细胞；(b)通过基于CD8的表面表达进行阳性选择来富集所述CD8+细胞。在一些实施方案中，所述或(a)和(b)两者。
在一些实施方案中，在亲和色谱基质上基于免疫亲和力的选择是使用如下抗体来进行，所述抗体还包含能够与固定在所述基质上的结合试剂形成可逆键的一种或多种结合配偶体，所述抗体借此在所述接触期间与所述色谱基质可逆地结合。在此类实施方案中，表达由所述基质上的抗体特异性结合的细胞表面标记的细胞能够通过破坏所述结合试剂与所述结合配偶体之间的可逆结合而从所述基质进行回收。在一些实施方案中，所述结合配偶体选自生物素、生物素类似物和能够与所述结合试剂结合的肽，并且所述结合试剂选自链霉亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、抗生物素蛋白和抗生物素蛋白类似物或突变蛋白。在一些实施方案中，所述结合配偶体包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；和/或所述结合试剂是包含SEQ ID NO:75、80、76或63所示氨基酸序列的链霉亲和素突变蛋白。在一些实施方案中，在使样品中的细胞与亲和色谱基质接触之后，用于富集细胞的方法包括应用竞争试剂以破坏所述结合配偶体与所述结合试剂之间的键，从而从所述基质回收选择的细胞。在一些实施方案中，所述竞争试剂是生物素或生物素类似物。在一些实施方案中，所述一个或多个选择中的所述一种或多种抗体与细胞表面标记结合的解离速率常数(k解离)大于或大于约3x10-5sec-1。在一些实施方案中，所述一个或多个选择中的所述一种或多种抗体对所述细胞表面标记的亲和力为解离常数(Kd)在约10-3至10-7范围内或者在约10-7至约10-10范围内。在一些实施方案中，所述一个或多个选择的色谱基质填充于分离容器中，所述分离容器是柱。
在一些实施方案中，在暴露于所述刺激试剂之前，从生物样品富集CD4+或CD8+T细胞，其中所述富集包括使所述样品的细胞在一定条件下与孵育组合物中与CD4特异性结合的第一免疫亲和试剂和与CD8特异性结合的第二免疫亲和试剂接触，所述免疫亲和试剂借此分别与所述样品中的细胞表面上的CD4和CD8分子特异性结合；并且回收与所述第一免疫亲和试剂和/或所述第二免疫亲和试剂结合的细胞，从而产生包含CD4+细胞和CD8+细胞的富集组合物，并且其中所述输入组合物包含含有CD4+细胞和CD8+细胞的所述富集组合物的细胞。在一些实施方案中，所述免疫亲和试剂各自包含抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述免疫亲和试剂固定在珠的外表面上。在特定实施方案中，所述珠是磁珠。在一些实施方案中，回收与所述第一免疫亲和试剂或所述第二免疫亲和试剂结合的细胞包括使所述细胞暴露于磁场。
在某些实施方案中，所述生物样品包含从受试者、任选地人受试者获得的原代T细胞。在某些实施方案中，所述生物样品是或包含全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。在一些实施方案中，所述生物样品是在所述富集之前已经预先低温冷冻的单采术或白细胞单采术产物。
在特定实施方案中，所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后为或为约48小时或者为或为约2天进行。在一些实施方案中，所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后为或为约72小时或者为或为约3天进行。在某些实施方案中，所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后为或为约48小时或者为或为约2天进行。
在特定实施方案中，所述收获是在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定iVCN之前的时间进行。在一些实施方案中，所述收获是在所述转化的细胞的群体中整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于0.8时的时间进行。在某些实施方案中，所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约2.0个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
在一些实施方案中，所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约1.5个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。在某些实施方案中，所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约1.0个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。在特定实施方案中，所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约0.75个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。在一些实施方案中，所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约0.5个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。在某些实施方案中，收获细胞包括通过冲洗或洗涤细胞来去除细胞碎片。在特定实施方案中，在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样细胞所占百分比大于或大于约60％时的时间收获所述细胞。在一些实施方案中，在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约60％时的时间收获所述细胞。在一些实施方案中，在收获时：在所述群体的总重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，如占所述群体中总重组蛋白表达T细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，在收获时，在所述群体的总重组蛋白表达CD4+T细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，如占所述群体中总重组蛋白表达CD4+细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，在收获时，在所述群体的总重组蛋白表达CD8+T细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，如占所述群体中总重组蛋白表达CD8+细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞包含CCR7+CD45RA+。在特定实施方案中，所述幼稚样T细胞包含CD27+CCR7+细胞。
在一些实施方案中，在收获时，在所述群体的总重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约60％，如占所述群体中总重组蛋白表达T细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，在所述群体的总重组蛋白表达CD4+T细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约60％，如占所述群体中总重组蛋白表达CD4+细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，在所述群体的总重组蛋白表达CD8+T细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约60％，如占所述群体中总重组蛋白表达CD8+细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞包含CCR7+CD45RA+。在特定实施方案中，所述幼稚样T细胞包含CD27+CCR7+细胞。在特定实施方案中，中枢记忆T细胞是CCR7+CD45RA-。
在某些实施方案中，所述方法还包括配制输出组合物的细胞以供冷冻保存和/或施用至受试者。在一些实施方案中，所述细胞是在药学上可接受的赋形剂的存在下进行配制。在特定实施方案中，所述输出组合物的细胞是在冷冻保护剂的存在下进行配制。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含DMSO。在一些情况下，DMSo可以防止在冷冻过程期间形成细胞内晶体。
在一些实施方案中，所述输出组合物的细胞是在容器、任选地小瓶或袋中进行配制。在某些实施方案中，所述重组蛋白是能够与靶抗原结合的重组受体，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在特定实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
在一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。在某些实施方案中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在某些实施方案中，所述重组蛋白是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在特定实施方案中，所述重组蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述重组受体是抗BCMACAR。在某些实施方案中，所述重组蛋白是抗CD19 CAR。
在特定实施方案中，所述嵌合抗原受体包含：包含抗原结合结构域、间隔子和/或铰链区的细胞外结构域、跨膜结构域，以及包含共刺激信号传导区的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，包含抗原结合结构域的所述细胞外结构域包含scFv。在某些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在特定实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
在某些实施方案中，所述无血清培养基包含：基础培养基中0.5mM至5mM的二肽形式的L-谷氨酰胺；0.5mM至5mM L-谷氨酰胺；以及至少一种蛋白质，其中所述培养基不含血清。
在一些实施方案中，缺少一种或多种重组细胞因子的所述基础培养基包含L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述L-谷氨酰胺是以约0.5mM至约5mM的浓度存在。在一些实施方案中，所述L-谷氨酰胺是以约2mM的浓度存在。
在一些实施方案中，缺少一种或多种重组细胞因子的所述基础培养基不含血清。
在一些实施方案中，基础培养基还包含选自白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选地人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种的至少一种蛋白质。
在一些实施方案中，本文所述的任何方法可以使用例如用于将编码重组蛋白的异源多核苷酸引入细胞(例如，T细胞)中的基因工程化的非病毒方法来进行。本文所述方法的任何所提供实施方案可以使用用于将编码重组蛋白的异源多核苷酸引入原代T细胞中以供制造细胞疗法的非病毒方法来进行。在特定方面，所述非病毒方法是促进将编码重组受体的多核苷酸或其部分整合至细胞基因组中的方法。可以使用各种非病毒引入方法，包括如本文所述的任何非病毒引入方法。
在一个方面，本文提供一种包含通过本文所提供的任何方法产生的工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是治疗组合物。本文提供一种通过本文所提供的任何方法产生的治疗性T细胞组合物。
在一些实施方案中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是幼稚样T细胞或者是对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是中枢记忆T细胞或者是对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞，或者是对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是CD27+CCR7+T细胞。
在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞对选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7的T细胞激活标记呈表面阳性；和/或对选自CD25、CD45RO、CD56、CD62L、KLRG1的标记呈表面阴性；和/或具有CD95的低表达；和/或具有CD95的低表达；和/或对选自IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的细胞因子的细胞内表达呈阴性。
在一些实施方案中，在幼稚样T细胞上表达的所述标记选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞包括CD27+CCR7+T细胞，其中所述组合物中至少70％、80％、85％或90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞包括CD27+CCR7+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％、85％或90％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞包括CD27+CCR7+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％、85％或90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％、85％或90％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。
在一些实施方案中，所述组合物中至少20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是中枢记忆T细胞或者对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是中枢记忆T细胞或者对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。
在一些实施方案中，平均而言，在通过本文所公开的方法产生的多种T细胞组合物中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是幼稚样T细胞或者是对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在一些实施方案中，平均而言，在通过本文所公开的方法产生的多种T细胞组合物中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是中枢记忆T细胞或者是对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在一些实施方案中，平均而言，在通过本文所公开的方法产生的多种T细胞组合物中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞，或者是对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在一些实施方案中，平均而言，在通过本文所公开的方法产生的多种T细胞组合物中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是CD27+CCR7+T细胞。在任何前述实施方案中，平均而言，在通过本文所公开的方法产生的多种T细胞组合物中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞可以是CD4+T细胞和CD8+T细胞。在任何前述实施方案中，平均而言，在通过本文所公开的方法产生的多种T细胞组合物中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞可以是CD3+T细胞。
在一个方面，本文提供一种治疗性T细胞组合物，其包括表达重组受体的CD4+T细胞和表达重组受体的CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。
在一些实施方案中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是幼稚样T细胞或者是对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少60％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中30％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中40％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中50％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中60％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中70％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。
在一个方面，本文提供一种治疗性T细胞组合物，其包括表达重组受体的CD4+T细胞和表达重组受体的CD8+T细胞，其中所述组合物中至少20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是中枢记忆T细胞或者对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是中枢记忆T细胞或者对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。
在一些实施方案中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是中枢记忆T细胞或者是对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少25％的总受体+/CD8+细胞是中枢记忆T细胞或者对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少60％的总受体+/CD4+细胞是中枢记忆T细胞或者对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少65％的总受体+/CD8+细胞是中枢记忆T细胞或者对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少60％的总受体+/CD4+细胞是中枢记忆T细胞或者对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是中枢记忆T细胞或者对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中65％的总受体+/CD4+细胞是中枢记忆T细胞或者对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是中枢记忆T细胞或者对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中70％的总受体+/CD4+细胞是中枢记忆T细胞或者对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。
在一个方面，本文提供一种治疗性T细胞组合物，其包括表达重组受体的CD4+T细胞和表达重组受体的CD8+T细胞，其中所述组合物中至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。
在一些实施方案中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞，或者是对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少65％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少70％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少75％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少75％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。
在一些实施方案中，所述幼稚样T细胞对选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7的T细胞激活标记呈表面阳性；和/或对选自CD25、CD45RO、CD56、CD62L、KLRG1的标记呈表面阴性；和/或具有CD95的低表达。在一些实施方案中，在幼稚样T细胞上表达的所述标记选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。在一些实施方案中，所述受体+/CD4+T细胞或者作为幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的受体+/CD4+T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。在一些实施方案中，其中所述受体+/CD4+T细胞或者作为幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的受体+/CD4+T细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述受体+/CD8+T细胞或者作为幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的受体+/CD8+T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。在一些实施方案中，所述受体+/CD8+T细胞或者作为幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的受体+/CD8+T细胞是CD27+CCR7+。
在一个方面，本文提供一种治疗性T细胞组合物，其包括表达重组受体的CD4+T细胞和表达重组受体的CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
在一个方面，本文提供一种治疗性T细胞组合物，其包括表达重组受体的CD4+T细胞和表达重组受体的CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约60％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约40％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约65％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约45％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、或者至少或至少约85％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约50％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、或者至少或至少约65％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约75％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约55％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约80％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约60％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约85％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约65％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约70％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少60％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少40％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少60％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中其中至少95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少70％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少80％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少80％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
在一些实施方案中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是CD27+CCR7+。
在一些实施方案中，所述组合物中受体+/CD4+T细胞与受体+/CD8+T细胞的比率在约1:3与约3:1之间。在一些实施方案中，所述组合物中受体+/CD4+T细胞与受体+/CD8+T细胞的比率在约1:2与约2:1之间。在一些实施方案中，所述组合物中受体+/CD4+T细胞与受体+/CD8+T细胞的比率是为或约1:1。
在一些实施方案中，所述组合物包括一个或多个单位剂量的细胞。在一些实施方案中，所述单位剂量包括在或在约1x104个与50x106个之间的T细胞。
在一些实施方案中，所述重组蛋白是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。在一些实施方案中，所述重组受体能够与靶蛋白结合，所述靶蛋白与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，其中所述重组蛋白是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，其中所述重组蛋白包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。在一些实施方案中，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段在一些实施方案中是单链片段。在一些实施方案中，所述片段包括通过柔性接头连接的抗体可变区。在一些实施方案中，所述片段包括scFv。
在一些实施方案中，所述重组蛋白包括细胞内信号传导区。在一些实施方案中，其中所述细胞内信号传导区包括细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包括初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包括CD3链的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CD3链是CD3-ζ(CD3ζ)链或其信号传导部分。
在一些实施方案中，所述重组蛋白还包括设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区之间的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区还包括共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域包括T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域包括CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
在一些实施方案中，所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞对于所述受试者是自体的。在一些实施方案中，所述T细胞对于所述受试者是同种异体的。
在一些实施方案中，所述组合物包括药学上可接受的赋形剂。在特定实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述组合物还包含冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂是DMSO。
在某些实施方案中，所述组合物中总T细胞、总CD4+T细胞或总CD8+T细胞、其重组蛋白表达细胞的至少60％是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中总重组蛋白表达细胞的至少65％、70％、80％、90％或95％是CD27+CCR7+，所述组合物中重组蛋白表达CD4+T细胞的至少65％、70％、80％、90％或95％是CD27+CCR7+，或者所述组合物中重组蛋白表达CD8+T细胞的至少65％、70％、80％、90％或95％是CD27+CCR7+。
在一个方面，本文提供一种制品，其包含本文提供的方法的组合物或本文提供的组合物，以及用于将所述输出组合物施用至受试者的说明书。
在某些实施方案中，所述受试者患有疾病或病症。在一些实施方案中，所述重组受体特异性识别或特异性结合至与所述疾病或病症相关或者在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原。
在一个方面，本文提供一种治疗患有或怀疑患有疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的来自本文所提供的任何组合物的T细胞。
在某些实施方案中，T细胞的所述剂量是作为单一剂量施用至所述受试者，或者是在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更久的时间段内仅施用一次。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含在为或约1x104个与50x106个之间(包含端值)的T细胞。在特定实施方案中，T细胞的所述剂量包含少于50x106个T细胞、10x106个T细胞、5x106个T细胞、1x106个T细胞、0.5x106个T细胞、或1x105个T细胞。在某些实施方案中，T细胞的所述剂量包含或包含约20x106个T细胞。在一些实施方案中，其中T细胞的所述剂量包含或包含约10x106个T细胞。
在某些实施方案中，T细胞的所述剂量包含或包含约2x106个T细胞。在特定实施方案中，T细胞的所述剂量包含或包含约1x106个T细胞。
在一些实施方案中，T细胞的所述剂量的T细胞是总T细胞、总活T细胞、总活重组受体表达T细胞、总活重组受体表达CD4+T细胞、或总活重组受体表达CD8+T细胞。在某些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在特定实施方案中，所述疾病或病症是骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，所述疾病或病症是B细胞恶性肿瘤和/或是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
附图说明
图1A和图1B显示来自三种不同供体的T细胞的WST代谢测定的结果，所述T细胞与在不同批次的寡聚试剂上多聚化的抗CD3/抗CD28一起孵育。图1A概述与平均流体动力学半径为36nm或101nm的含有在寡聚骨架上多聚化的抗CD3/抗CD28的参考批次相比，所测试所有批次的WST代谢活性(合并的)。单独测试批次和参考试剂的来自不同供体的T细胞的平均WST代谢活性显示于图1B中。
图2A和图2B描绘细胞总数(TNC)(图2A)和活细胞的百分比(活力)(图2B)，从通过用于产生含有CAR+T细胞的T细胞组合物的以下过程产生的细胞组合物进行评估：扩增过程(扩增的)，以及涉及基于珠的刺激试剂(珠)、基于珠的刺激试剂和在基础培养基中孵育(珠-基础培养基)或寡聚刺激试剂(寡聚物)的非扩增过程。显示来自在刺激(Stim)、转导(Trans)、孵育(Inc)、收获(收集)、细胞配制(Form)和冷冻保存(Cryo)步骤中收集的样品的结果。
图3展示示例性抗BCMA CAR T细胞的细胞溶解活性，从通过以下过程产生的细胞组合物进行评估：扩增过程(扩增的)，以及涉及以下的非扩增过程：(a)基于珠的刺激试剂(珠)，(b)基于珠的刺激试剂和在基础培养基中孵育(珠-基础培养基)，或者(c)寡聚刺激试剂(寡聚物)，每种示例性抗BCMA CAR T细胞在与BCMA表达靶细胞系(RPMI-8226)一起孵育时效应子与靶标的比率为27:1、9:1、3:1或1:1。
图4A-图4D描绘来自通过以下过程产生的CAR+T细胞组合物的结果：扩增过程，以及涉及以下的非扩增过程：(a)基于珠的刺激试剂(珠)，(b)基于珠的刺激试剂和在基础培养基中孵育(珠-基础培养基)，或者(c)寡聚刺激试剂(寡聚物)。图4A描绘对CCR7和CD27两者呈阳性的CD4+和CD8+T细胞的百分比。图4B描绘CD4+CAR+T细胞中CCR7+CD27+细胞的百分比。图4C描绘CD8+CAR+T细胞中CCR7+CD27+细胞的百分比。图4D展示在制造过程期间的不同天数通过扩增过程从代表性供体产生的CCR7+CD27+细胞的百分比，所述天数包括在第1天激活(d1 AMAT)、在第2天转导(d2 XMAT)、以及在开始培育之后的不同时间(d4 INOC+2、d6INOC+4、d7 INOC+5)。
图5A-图5F描绘在用工程化CAR-T细胞组合物治疗之后，体内小鼠异种移植肿瘤模型中的肿瘤负荷，所述工程化CAR-T细胞组合物通过以下过程产生：扩增过程，以及涉及以下的非扩增过程：(a)基于珠的刺激试剂(珠)，(c)寡聚刺激试剂(寡聚物)，或者(d)在基础培养基中孵育的基于珠的刺激试剂(珠-基础培养基)，各自在50天的时间段内与仅肿瘤或模拟转导对照相比较。图5A描绘每组的肿瘤负荷均值。图5B-图5F展示所评估的每个治疗组中单独小鼠的结果：图5B(对照)，图5C(扩增过程)，图5D(非扩增寡聚物过程)，图5E(非扩增珠过程)和图5F(非扩增珠过程，基础培养基)。
图6A-图6E描绘在模拟转导对照(图6A)或用工程化CAR-T细胞组合物治疗之后的所选天数，体内小鼠异种移植肿瘤模型中肿瘤负荷的代表性生物发光图像，所述工程化CAR-T细胞组合物通过以下过程产生：扩增过程(扩增的)(图6B)，以及涉及以下的非扩增过程：寡聚刺激试剂(寡聚物)(图6C)，基于珠的刺激试剂(珠)(图6D)，或者在基础培养基中孵育的基于珠的刺激试剂(珠-基础培养基)(图6E)，各自在50天的时间段内。
图7描绘在用工程化CAR-T细胞组合物治疗之后33天，从经受异种移植肿瘤的小鼠收集的每μL血液中T细胞和CAR+T细胞的总数量，所述工程化CAR-T细胞组合物通过以下过程产生：扩增过程(扩增的)，以及涉及以下的非扩增过程：(a)寡聚刺激试剂(寡聚物)，(b)基于珠的刺激试剂(珠)，或者(c)在基础培养基中孵育的基于珠的刺激试剂(珠-基础培养基)；以及总T细胞群内CAR+T细胞的百分比。将细胞用对截短的受体替代标记具有特异性的试剂染色，并通过流式细胞术进行分析。
图8A和图8B描绘从抗CD19 CAR-T细胞组合物定量的活总细胞的百分比和细胞总数，所述抗CD19 CAR-T细胞组合物用编码抗CD19CAR的慢病毒转导并且使用扩增过程(扩增的)或非扩增(非扩增的)过程使用抗CD3/抗CD28 Fab缀合的链霉亲和素突变蛋白寡聚物作为刺激剂来产生。
图9A和图9B描绘在与CD19表达细胞共培养期间，抗CD19CAR-T细胞的总细胞数的活力。图9A显示来自使用扩增或非扩增过程产生的抗CD19 CAR-T细胞组合物的活细胞的百分比和CAR+T细胞的总数量。图9B显示来自从T细胞产生的抗CD19 CAR-T细胞组合物的活细胞的百分比和CAR+T细胞的总数量，所述T细胞在选择后直接进行刺激(未冷冻的)或者在刺激前进行冷冻保存(冷冻的)。
图10显示含有使用扩增过程或非扩增过程产生并在刺激前冷冻保存的细胞的抗CD19 CAR+T细胞组合物的细胞溶解活性。在解冻后第0天、第1天、第3天或第6天，以10:1的效应子与靶细胞比率将细胞与CD19表达细胞共培养。
图11A和图11B描绘使用扩增过程(扩增的)或非扩增过程(非扩增的)产生并且在长期刺激下培养的抗CD19 CAR-T细胞，所述长期刺激涉及与被工程化以表达CD19的HEK细胞以5:1的效应子与靶细胞比率在缺少另外的重组细胞因子的培养基中共培养。图11A描绘在长期刺激中的不同时间点评估的活抗CD19 CAR-T细胞的数量。ND-不可检测。图11B描绘来自样品的阳性染色的细胞的百分比，所述样品在第11天和第19天从长期刺激培养物收集，并用针对表面蛋白(包括CD25、CD69、PD-1、LAG-3、TIM-3、CD45RA和TIGIT)的抗体以及针对CAR表达的替代标记进行染色。
图12A-图12C显示来自小鼠的体内肿瘤小鼠模型的结果，所述小鼠在第0天注射1x106、0.5x106或0.25x106个使用扩增过程(扩增的)或非扩增过程(非扩增的)产生的抗CD19 CAR-T细胞或PBS对照。图12A描绘对肿瘤存在的定量，所述肿瘤存在被测量为肿瘤相关生物发光信号的平均辐射亮度，以及在研究期间的不同时间点收集的血液样品中肿瘤细胞的百分比。图12B描绘在研究期间的不同时间点收集的血液样品中总T细胞和CAR-T细胞两者的百分比。图12C描绘在注射后长达60天中小鼠的存活百分比。
图13A-图13B描绘通过以下过程产生的工程化T细胞(EC)组合物：涉及旋转接种的基于珠的刺激试剂和在静态孵育下持续18-30小时的扩增过程(第1组)，以及涉及以下的非扩增过程：旋转接种和在基础培养基中孵育96小时的寡聚刺激试剂(第4组)、旋转接种和在基础培养基中孵育72小时的基于珠的刺激试剂(第2组)、在基础培养基中孵育72小时的寡聚刺激试剂(第5组)、在基础培养基中孵育48小时的基于珠的刺激试剂(第3组)以及未刺激的冷冻保存的T细胞组合物(CMAT)。图13A描绘CD4+CAR+T细胞中CCR7+CD27+细胞的百分比。图13B描绘CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞的百分比。
图14显示在各种效应子与靶标的比率(E:T)下，通过以下过程产生的工程化T细胞组合物对K562-BCMA靶细胞的细胞溶解活性(特异性裂解％)：涉及旋转接种的基于珠的刺激试剂和在静态孵育下持续18-30小时的扩增过程(第1组)，以及涉及以下的非扩增过程：旋转接种和在基础培养基中孵育72小时的基于珠的刺激试剂(第2组)、旋转接种和在基础培养基中孵育48小时的基于珠的刺激试剂(第3组)、旋转接种和在基础培养基中孵育96小时的寡聚刺激试剂(第4组)、旋转接种和寡聚刺激试剂和在基础培养基中孵育72小时(第5组)，以及使用模拟空载体的过程(第6组，模拟)。在48、72和96小时的时间段内，每4小时通过显微镜检查依据红色荧光信号的损失来评估细胞溶解活性，并且针对每次培养开始时的细胞计数进行归一化。虚线表示杀伤的EC50。
图15A-图15C描绘在长期刺激测定中的活性，所述测定涉及将通过以下过程产生的T细胞组合物与缀合有重组BCMA Fc融合蛋白的顺磁珠一起连续孵育6天：涉及旋转接种的基于珠的刺激试剂和在静态孵育下持续18-30小时的扩增过程(1)，以及涉及以下的非扩增过程：旋转接种和在基础培养基中孵育72小时的基于珠的刺激试剂(2)、旋转接种和在基础培养基中孵育48小时的基于珠的刺激试剂(3)、旋转接种和在基础培养基中孵育96小时的寡聚刺激试剂(4)、旋转接种和寡聚刺激试剂和在基础培养基中孵育72小时(5)，以及使用模拟空载体的过程(第6组，模拟)。图15A显示在长期刺激的过程期间观察到的活细胞的总数量。图15B显示不同T细胞组合物的扩增，如定量为在孵育的第1天至第6天测量的总活细胞的曲线下面积。图15C显示在长期刺激的过程期间的不同时间点观察到的从不同工程化过程产生的T细胞中的活细胞百分比(活力％)。
图16A-图16C描绘长期刺激后的细胞因子谱，所述长期刺激涉及将图15A-图15C中描绘的T细胞组合物与缀合有重组BCMA Fc融合蛋白的顺磁珠一起连续孵育6天。图16A显示在长期刺激第0天针对细胞因子TNFa、IFN-g和IL-2染色呈阳性的CD4/CAR+和CD8/CAR+T细胞的百分比。图16B显示在长期刺激第6天针对细胞因子TNFa、IFN-g和IL-2染色呈阳性的CD4/CAR+和CD8/CAR+T细胞的百分比。图16C显示来自细胞因子的累积水平的多功能得分和IL-2包含性(IL-2inclusive)得分，如在CD8+细胞中所确定，通过以供体缩放来归一化。
图17A显示在产生治疗组合物的过程中的倍增数与对CD27+呈阳性的CD4+CAR+细胞的百分比之间的相关性。
图17B显示治疗输出T细胞组合物(例如，药物产品)中的中枢记忆/幼稚样CD4+T细胞的百分比与达到收获标准的群体倍增数之间的关系(Spearmanρ：-0.54；p值：<0.001)。对于治疗输出T细胞组合物(例如，药物产品)中的CD8+T细胞观察到类似结果。
图17C显示对于产生过程的扩增步骤期间的高(0.35x10^6个细胞/mL)和低(0.05x10^6个细胞/mL)接种密度，达到收获标准的群体倍增数。图17D显示随产生过程的扩增步骤期间的接种密度而变化的输出治疗组合物中CD27+CAR+CD8+T细胞的百分比。图17E显示处理持续时间对输出T细胞组合物中TCM细胞的量的影响。
图18A-图18D显示被施用CAR+T细胞组合物的受试者的Kaplan-Meier存活曲线，所述受试者被分为所施用的组合物在CD4+CAR+T细胞中(图18A是无进展存活，图18C是反应持续时间)和在CD8+CAR+T细胞中(图18B是无进展存活，图18D是反应持续时间)含有的CCR7+CD27+CAR+T细胞的百分比高于或低于某一阈值水平的组。
图18E显示具有CD8+/CAR+T细胞的“高”或“低”群体倍增(PDL)数的患者的基于最佳分割对数秩检验的PFS曲线。低PDL是指<6PDL，并且>6PDL是指高PDL。
图18F显示源自非霍奇金淋巴瘤患者的富集的CD4+(左图)和CD8+(右图)输入组合物中CD27+CD28+T细胞的百分比。
图18G显示富集的CD4+输入组合物中效应记忆T细胞的百分比与达到收获标准所需群体倍增数之间的关系(Spearmanρ：0.43；p值：<0.001)。对于富集的CD8+输入组合物观察到类似结果。
图19A和图19B展示用三种不同治疗剂量的抗BCMA CAR+T细胞组合物治疗的小鼠的肿瘤负荷：高(2x106)、中(4x105)和低(8x104)，所述抗BCMA CAR+T细胞组合物是通过扩增过程以及涉及基于珠的(珠)或寡聚(寡聚物)刺激试剂的非扩增过程来产生，其中在所述过程的第5天(D5；图19A)或第4天(D4；图19B)收获细胞。对照是仅注射肿瘤细胞的小鼠(肿瘤无TX)以及注射肿瘤细胞和模拟转导的T细胞组合物的小鼠(模拟)。
图20A-图20D显示在施用通过扩增(扩增的)过程以及涉及基于珠的刺激试剂(珠)或寡聚刺激试剂(寡聚物)的非扩增过程产生的抗BCMA CAR+T细胞组合物后5天(图20A)、13天(图20B)、19天(图20C)或26天(图20D)从小鼠收集的每μL血液中T细胞和CAR+T细胞的总数量，并且与包括仅肿瘤细胞(肿瘤无TX)以及肿瘤细胞和模拟转导的T细胞组合物(模拟)的对照相比较。
图21显示在通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)分离高于15kb、17.5kb或20kb的阈值的高分子量DNA级分之前(凝胶前；标准载体拷贝数(VCN)测定)或之后(整合载体拷贝数(VCN)测定)如通过微滴式数字PCR(ddPCR)评估的拷贝数。使用特异性扩增一部分整合转基因序列、包装质粒(编码水疱性口炎印第安纳型病毒G蛋白的病毒包装质粒(VSVg))或基因组对照(编码核糖核酸酶P蛋白亚基p30的基因(RRP30))的引物评估拷贝数。在来自转导细胞的样品中或在加标了CAR质粒和VSVg质粒的未转导的对照中进行评估。将每个基因的拷贝数针对二倍体基因组数量(cp/二倍体基因组；使用对作为参考的白蛋白基因具有特异性的引物)或每50ng的基因组DNA进行归一化。
图22A-图22B描绘对于Jurkat T细胞(图22A)或从人受试者分离的原代T细胞(图22B)，在不同时间点(在转导前(“之前”)，在转导后5分钟、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时和96小时，或者在工程化过程完成时即“完成”)，转基因序列的如通过标准载体拷贝数(VCN)测定评估的拷贝数(未经受PFGE的基因组DNA样品，高分子量和低分子量DNA两者)以及整合拷贝数(在PFGE之后的高分子量DNA样品中)，所述细胞用含有编码CAR的转基因序列的慢病毒制剂进行转导。将每个基因的拷贝数针对二倍体基因组数量进行归一化(cp/二倍体基因组；使用对作为参考的白蛋白基因具有特异性的引物)。
图23A显示在使用来自两名不同人受试者(供体A和供体B)的原代T细胞的示例性非扩增T细胞组合物制造过程的第3天、第4天或第5天评估的整合拷贝数，所述原代T细胞通过与以下一起孵育来进行刺激：(1)抗CD3/抗CD28抗体缀合的顺磁珠(“珠”)，(2)浓度为4.0μg/106个细胞的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂，或者(3)浓度为0.8μg/106个细胞的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂，在转导后在不含血清或生长因子的基础培养基(“基础”)或含有IL-2、IL-5和IL-15的无血清培养基(“完全”)中进行孵育。图23B描绘如通过iVCN确定的拷贝数与CAR表达细胞的百分比(如通过流式细胞术所得的CD3+细胞中CD3+/激活的Cas3-/CAR+细胞的百分比所确定)之间的相关性。
图24A-图24E描绘在各种示例性扩增或非扩增T细胞组合物制造过程期间，如通过标准VCN(未进行PFGE)和iVCN(进行PFGE)所评估的每个二倍体基因组的拷贝数(图24A)、整合转基因的分数(图4B)、非整合转基因的分数(图24C)、每个二倍体基因组的非整合转基因拷贝数(图24D)和每个CAR+细胞的整合拷贝数(图24E)，所述制造过程采用不同的刺激试剂和收集时间，如表E9中所示。
图25描绘在用于将来自不同供体的原代T细胞工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的示例性工程化过程中的不同时间点期间，如通过标准VCN(未进行PFGE)和iVCN(进行PFGE)所评估的每个二倍体基因组的拷贝数、非整合转基因拷贝数、非整合转基因的分数和整合转基因的分数。所评估的时间点包括扩增过程的第0天至第8天，包括在解冻材料时(TMAT；第0天)、在激活时(AMAT；第1天)、在转导时(XMAT；第2天)或在开始培育后的不同时间(inoc+1至inoc+6；表示所述过程的第3-8天)。
图26显示工程化(CMAT)前分离的CD4+和CD8+T细胞组合物的T细胞克隆性以及工程化后CD4+和CD8+治疗CAR+T细胞组合物的T细胞克隆性(应用香农指数(Shannonindex))。
图27显示在不同浓度的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的存在下和/或在不同培养基组成的存在下，所产生的细胞组合物的表型差异。显示在突变蛋白试剂与培养基组成的各种组合下，指示效应记忆CD45RA+细胞(CCR7-CD45RA+；EMRA)、幼稚样T细胞(CCR7+CD45RA+；幼稚)、效应记忆(CCR7-CD45RA-；EM)和中枢记忆(CCR7+CD45RA-；CM)的CD8+CAR+T细胞的百分比。
图28显示使用非扩增过程和作为对照的扩增过程，来自三名不同供体的原代T细胞的工程化组合物中同时对CCR7和CD27染色呈阳性的CD4+CAR+和CD8+CAR+T细胞的百分比。
图29显示使用非扩增过程和作为对照的扩增过程，来自三名不同供体的原代T细胞的工程化组合物中指示效应记忆CD45RA+细胞(CCR7-CD45RA+；EMRA)、幼稚样T细胞(CCR7+CD45RA+；幼稚)、效应记忆(CCR7-CD45RA-；EM)和中枢记忆(CCR7+CD45RA-；CM)的CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞的百分比。
图30A-图30D显示在化合物63的存在或不存在下将T细胞与抗CD3/抗CD28寡聚刺激试剂一起孵育对mTor信号传导和活力和生长动力学的示例性作用。图30A显示依据记忆子集，活CD8+T细胞中的pS6表达。图30B显示依据如所指示的治疗，总CD8 T细胞的平均荧光强度(mfi)。图30C-图30D分别显示在开始刺激(“输入”)后随培养时间(如通过天数所指示；d1等)变化的活力和总T细胞数。
图31A-图31F显示冷冻保存的CAR-T细胞的示例性功能和表型特性，所述CAR-T细胞是使用采用在化合物63的存在或不存在下与抗CD3/抗CD28寡聚刺激试剂一起孵育的方法来产生。图31A显示在解冻时半胱天冬酶的细胞内表达。图31B-图31D分别显示依据CD27和/或CCR7的子集表达，CD8 CAR-T细胞和CD4 CAR-T细胞表型谱。图31C-图31E分别显示在用携带抗原的靶标刺激的CD8 CAR-T细胞和CD4 CAR-T细胞中，细胞内IL-2、IFNγ或TNF(左图)或者IL-2和/或IFNγ或TNF的组合(右图)。图31F显示对于用抗CAR珠刺激的CAR-T细胞，12天中的扩增和存活(左图)以及通过曲线下面积计算的总扩增度量(右图)。
图32A-图32C显示对于使用取自3名供体的冷冻保存的单采术(CrAPH)或冷冻保存的T细胞选择材料(CMAT)的过程，每个处理步骤的示例性活力(图32A)、总活有核细胞(图32B)和累积下游产率(图32C)。D5_HRPO、D5_WPRO、D5_FPRO分别是指第5天收获的细胞产物、第5天洗涤的细胞产物、和第5天配制的细胞产物(例如，配制的药物产品)。
图32D-图32F显示在收获时(第4天或第5天)来自3名供体的被处理的冷冻保存的(CrAPH)或新鲜单采术(CMAT)样品中细胞表型的示例性平均百分比。图32D-图32F显示CD3+aCas3-细胞的CAR+细胞(图32D，顶部图)、aCas3-CD4+细胞的CAR+细胞(图32D，底部左图)、aCas3-CD8+细胞的CAR+细胞(图32D，底部右图)、CD3+aCas3-细胞的收获产物(HRPO)总有核CAR+细胞(图32E)、aCas3-CD4+细胞的CAR+CD25+细胞(图32F，左图)和aCas3-CD8+细胞的CAR+CD25+细胞(图32F，右图)的示例性平均百分。
图33显示aCas3-CD4+CAR+细胞(上图)和aCas3-CD8+CAR+细胞(下图)的示例性记忆表型谱，所述细胞是以从刺激开始0、16、24或48小时的刺激孵育时间产生的。
图34A-图34B显示对于使用不同供体类型(参考、患者)的扩增和非扩增工程化过程，通过流式细胞术确定的细胞表型的示例性定量。将细胞工程化以表达示例性抗CD19CAR(CD19)、示例性抗BCMA CAR(BCMA)，或者进行模拟转导(模拟)。图34A显示活CD45+细胞的CD3+CD8+和CD3+CD4+细胞的百分比(左图)，以及CD45+细胞的CD8+CAR+和CD4+CAR+细胞的百分比(右图)。图34B显示CD4+CAR+细胞与CD+CAR+细胞的比率以及CD4+细胞与CD8+细胞的比率。
图35显示通过扩增或非扩增工程化过程产生的来自不同供体类型(参考、患者)的细胞组合物的倍数扩增。将细胞工程化以表达示例性抗CD19 CAR(CD19)或示例性抗BCMACAR(BCMA)。
图36A-图36B显示使用不同供体类型(参考、患者)从扩增和非扩增工程化过程得到的细胞表型的示例性百分比。将细胞工程化以表达示例性抗CD19 CAR(CD19)、示例性抗BCMA CAR(BCMA)，或者进行模拟转导(模拟)。图36A-图36B显示aCAS-CD8+CAR+和aCAS-CD4+CAR+细胞的CD45RA+CCR7+细胞(图36A，左上图)、aCAS-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞的CD45RA-CCR7+细胞(图36A，右上图)、aCas-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞的CD45RA-CCR7-细胞(图36A，左下图)、aCAS-C D8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞的CD45RA+CCR7-细胞(图36A，右下图)以及aCAS-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞的CD27+CCR7+细胞(图36B)的示例性百分比。
图37A-图37B显示对于供体匹配的扩增和非扩增工程化过程如所指示通过流式细胞术确定的细胞表型的示例性定量，其中将细胞工程化以表达示例性抗CD19 CAR(CD19CAR T)或示例性抗BCMA CAR(BCMA CAR T)。
图38-图39显示在用抗ID抗体进行长期CAR依赖性刺激后，从非扩增或扩增过程产生的细胞随时间变化的总活细胞的数量和曲线下面积(AUC)。图38显示被工程化以表达抗CD19 CAR的细胞的总活细胞计数和AUC。图39显示被工程化以表达抗BCMA CAR的细胞的总活细胞计数和AUC。
图40A-图40B显示在以不同效应子与靶标的比率进行慢性刺激之前(图40A)和之后(图40B)，通过非扩增或扩增过程工程化的抗CD19 CAR T细胞的细胞溶解潜力。
图41显示在慢性刺激之前和之后，通过非扩增或扩增过程工程化且表达IL-2、IFNγ、TNF和IL-2/IFNγ/TNF的CAR+CD4+和CAR+CD8+细胞的示例性百分比，通过流式细胞术测量。
图42A(左图)显示在用从非扩增和扩增匹配供体工程化过程产生的抗BCMA CAR-T细胞组合物治疗后，随时间变化的肿瘤负荷。图42A(右图)显示每组从BLI的曲线下面积(AUC)计算的从第-1天(治疗前)至治疗后第50天的肿瘤生长。
图42B显示对于从非扩增和扩增匹配供体工程化过程产生的细胞，随天数变化的每μL血液的抗BCMA CAR-T细胞的绝对计数。
图43A显示在用较高(上图)和较低(下图)剂量的从非扩增和扩增匹配供体工程化过程产生的抗CD19 CAR-T细胞组合物治疗后，随天数变化的肿瘤负荷。
图43B显示用较高(上图)和较低剂量(下图)剂量的抗CD19CAR-T细胞治疗的每组从BLI的曲线下面积(AUC)计算的从第-1天(治疗前)至治疗后第50天的肿瘤生长。
图43C显示对于从非扩增和扩增匹配供体工程化过程产生的细胞，随天数变化的每μL血液的抗CD19 CAR-T细胞的绝对计数。
图44A-图44D显示在包括多种非扩增和扩增工程化过程的制造运行期间和之后，总活细胞(图44A)、活力(图44B)和表型(图44C和图44D)。
图45A显示在从来自不同人供体的原代T细胞产生的细胞组合物中，在如通过标准VCN(未进行PFGE)与iVCN(进行PFGE)所评估的总细胞中每个细胞的拷贝数之间的关系，所述原代T细胞已经使用扩增过程(○)或非扩增过程(●)工程化以表达CAR。图45B-图45C显示了如通过标准VCN(图45B)或iVCN(图45C)所评估的细胞组合物中每个细胞中的拷贝数与如通过流式细胞术评估的活CD45+细胞中表达CAR的CD3+细胞的百分比(CD3+CAR+％)所指示的CAR表面表达之间的关系。
具体实施方式
本文提供生成或产生工程化细胞如工程化T细胞的组合物的方法，所述工程化细胞表达重组蛋白，例如，重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，所述方法是或包括如下一个或多个步骤：在刺激条件下孵育所述细胞的输入群体(本文中也称为输入组合物)，如原代T细胞的群体，然后将编码重组蛋白的多核苷酸引入所述细胞中。在特定实施方案中，所述方法与在开始刺激输入组合物中的细胞之后的设定量的时间内，如在四天或更短时间内完成的过程结合使用。
不同过程可用于产生含有基因工程化T细胞群的组合物，包括用于产生表达CAR的工程化T细胞。然而，在特定方面，这些过程中的一些可能需要长时间或相对长时间来产生所述工程化细胞。另外，在各个方面，一些现有过程成功产生适合于细胞疗法的工程化T细胞所需的时间量可能变化，从而使得难以协调细胞疗法的该施用。在某些方面，这些过程中的一些所产生的细胞群可能包括相对高百分比或量的消耗的细胞、分化细胞或具有低效力的细胞。需要用于产生工程化T细胞的另外的方法。
在特定实施方案中，所提供的方法与有效地产生或生成适用于细胞疗法的工程化细胞的过程结合使用。在一些实施方案中，所提供的用于产生工程化细胞的过程含有用于刺激和基因工程化(例如，转化、转导或转染)T细胞以产生工程化T细胞的群体的一个或多个步骤，所述工程化T细胞的群体可以被收集或配制用作用于细胞疗法的组合物。在一些方面，本文所提供的过程成功产生工程化细胞而无需用于扩增细胞的任何另外的步骤，例如，无需扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的操作。在一些方面，所提供的方法产生的工程化T细胞具有如与从替代性过程，如涉及扩增细胞的那些过程产生的工程化T细胞组合物相比增强的效力。
在特定方面，所提供的过程的持续时间可以从输入细胞群或输入组合物的细胞(例如，T细胞)首次接触或暴露于刺激条件(例如，如本文例如在章节I-B中所述)时起测量，此时在本文中称为刺激(stimulation)或刺激(stimulating)的开始，并且本文中也称为暴露于刺激试剂，例如，如在开始暴露于刺激试剂时。在一些实施方案中，收获或收集含有工程化细胞的输出群体(本文中也称为输出组合物或称为工程化细胞例如工程化T细胞的组合物)所需时间的持续时间是从刺激开始时起测量。在特定实施方案中，所述过程的持续时间为、为约或小于120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、48小时、36小时或30小时。在特定实施方案中，所述过程的持续时间为、为约或小于5天、4天、3天、2天或一天。在特定实施方案中，所述工程化细胞，例如，输出组合物或群体的细胞比通过需要更长时间的过程工程化的细胞更强效、持久或幼稚样。在一些方面，所提供的过程的持续时间，例如，生成或产生T细胞的工程化群体所需的时间量比一些现有过程的持续时间短、短约或短至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天。在一些实施方案中，所提供过程的持续时间是替代性或现有过程的为、为约或小于75％、60％、50％、40％、30％、25％、15％或10％。
在某些实施方案中，对从生物样品分离、富集或选择的细胞(例如，CD3+、CD4+和/或CD8+T细胞)的群体进行所提供的过程。在一些方面，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时起，在如与其他方法或过程相比缩短的时间量内，产生或生成工程化T细胞的组合物。在一些实施方案中，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时至收集、收获或配制工程化T细胞(例如，用于冷冻保存或施用)时，在或在约10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天内，或者在或在约120小时、96小时、72小时或48小时内，产生或生成工程化T细胞，包括对生物样品或者富集、分离或选择的细胞进行冷冻保存和储存的任何或所有时间。
在某些实施方案中，通过所提供的过程产生或生成的工程化T细胞，例如，含有表达重组受体如嵌合抗原受体的T细胞的T细胞的输出组合物或群体，在用作用于细胞疗法的细胞时特别有效或强效。例如，在一些方面，从所提供的过程产生的含有工程化T细胞(例如，CAR+T细胞)的输出组合物具有比通过替代性现有过程生成或产生的工程化T细胞显著更高程度的效力和/或增殖能力。在一些方面，通过所提供的过程产生的含有工程化T细胞(例如，CAR+T细胞)的输出组合物具有比通过替代性或现有过程产生的工程化T细胞(例如，CAR+T细胞)增强的抗肿瘤或抗癌细胞活性。
特定实施方案考虑，通过所提供的过程(例如，在过程期间不包括或不需要扩增T细胞的过程)产生的工程化T细胞(例如，CAR+T细胞)的群体在一些方面会被预测为达不到所达到的高效力或功效程度。制造用于细胞疗法的T细胞的现有方法包括扩增细胞的过程或需要扩增细胞至例如阈值密度，例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程。某些实施方案考虑，扩增会被预测为在工程化T细胞中产生足量载体整合必需的，所述工程化T细胞会被预期是产生CAR+T细胞的强效或有效群体所需的。此处，已证实，缺少用于扩增的步骤或条件的过程(例如缺少扩增单元操作和/或不包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程)，例如，如在所提供的过程中，可以产生强效或有效的CAR+T细胞组合物。在一些方面，在载体(例如，病毒载体)的稳定整合之前收获、收集或配制的工程化细胞仍然得到CAR+T细胞的强效或有效组合物。在某些方面，通过所提供的方法产生的CAR+T细胞比从包括扩增的替代性过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程)产生或生成的CAR+T细胞更强效、持久或有效。某些实施方案考虑，该载体整合可以在收集、收获或配制细胞期间或甚至之后继续进行。
本文还提供产生或工程化T细胞群的过程，其包括用寡聚刺激试剂刺激细胞。用于在体外(如在外源生长因子不存在或外源生长因子量低的情况下)刺激T细胞的现有试剂是已知的(参见例如美国专利6,352,694B1和欧洲专利EP 0 700 430B1)。通常，此类试剂可以采用直径大于1μm的珠，例如，磁珠，将各种结合剂(例如抗CD3抗体和/或抗CD28抗体)固定在所述珠上。然而，在一些情况下，此类磁珠例如难以整合至用于在临床试验或治疗目的所需的条件下刺激细胞的方法中，因为必须确保在将所扩增的T细胞施用至受试者之前完全去除这些磁珠。在一些方面，例如通过将细胞暴露于磁场进行的这种去除可能降低可用于细胞疗法的活细胞的产率。在某些情况下，必须将此类试剂(例如，含有磁珠的刺激试剂)与细胞一起孵育最短时间量，以允许T细胞从刺激试剂充分脱离。
利用寡聚刺激试剂的所提供的过程克服了此类潜在限制。例如，在一些实施方案中，所提供的过程避免或降低在通过所述过程生成或产生的输出细胞中残留刺激试剂(例如，含有磁珠的试剂)的风险。在一些实施方案中，这也意味着，符合GMP标准的过程与其他方法(如其中必须进行另外的措施以确保最终工程化T细胞群不含珠的那些方法)相比更易于建立。在一些实施方案中，这在当前实施方案中可以通过以下方式容易地实现：添加物质，例如，竞争试剂，所述物质例如通过简单冲洗或洗涤细胞(例如通过离心)将寡聚刺激试剂从细胞解离。因此，在一些方面，如与基于珠的刺激试剂的去除或分离相比，如通过添加物质或竞争试剂将寡聚刺激试剂从细胞去除或分离几乎不导致或不导致细胞损失。在一些方面，寡聚刺激试剂去除或分离的时间安排不受限制或者所受限制小于基于珠的刺激试剂的去除或分离。因此，在一些方面，可以在所提供的过程期间的任何时间或阶段从细胞去除或分离寡聚刺激试剂。
在所提供的过程的一些方面，细胞用涉及孵育的过程进行转导或经受转导，所述孵育例如在基础培养基的存在下孵育引入了编码异源或重组蛋白(例如CAR)的病毒载体的T细胞。在某些方面，基础培养基不含另外的添加剂(例如，营养素、维生素或氨基酸)或任何另外的重组细胞因子或生长因子。在某些方面，基础培养基不含重组细胞因子或生长因子。在某些方面，基础培养基可以含有某些必需氨基酸，如L-谷氨酰胺，但是不含其他进一步另外的添加剂或重组细胞因子。在一些方面，例如，如与在补充的、完全的、含血清的或含有血清替代物的培养基的存在下孵育相比，在基础培养基的存在下孵育减少在工程化过程期间可能发生的分化。因此，在一些方面，例如，在转导或旋转接种后在基础培养基的存在下孵育增加分化程度更低的幼稚样细胞在输出组合物中的份额，所述输出组合物例如包含含有CAR+T细胞的细胞群的所产生的细胞组合物。
本文所提供的发现包括以下观察结果：减弱或减小的刺激，如使用减少量的通常用于刺激T细胞的刺激试剂，可以产生与通过涉及更强刺激条件或者更高量或浓度的刺激试剂的过程产生的CAR+T细胞一样或甚至更强效、持久或有效的工程化CAR+T细胞。例如，在一些实施方案中，如与使用更大量的寡聚刺激试剂的过程相比，用较低量或相对低量的寡聚刺激试剂刺激细胞可以增加所得工程化细胞群的效力、功效或持久性。此类实施方案考虑，即使在足够低至足以在所述过程期间和之后降低激活标记的表达或对激活标记呈阳性的细胞的份额的剂量下，此类作用也可以持续存在。
在特定实施方案中，所提供的方法不扩增细胞或者不含有其中将细胞扩增至阈值量或浓度的步骤。在一些方面，不依赖于扩增细胞以增加来自起始细胞群(例如，输入群体)的细胞的数量或浓度的方案不需要在细胞群之间可能变化的孵育或培育。例如，一些实施方案考虑，从不同受试者(如具有不同疾病或疾病类型的受试者)获得的细胞群可能以不同速率分裂或扩增。在某些方面，消除需要细胞扩增的可能多变的步骤允许严格控制整个过程的持续时间。在某些实施方案中，过程持续时间的可变性被降低或消除，这在一些方面可能允许改进对医生、患者与技术人员之间的安排和治疗的协调，以有利于自体细胞疗法。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，其并入程度如同将每个单独出版物通过引用单独并入一般。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.用于产生工程化细胞的过程
本文提供产生工程化细胞如工程化CD4+T细胞和CD8+T细胞的输出群体的方法，所述工程化细胞表达重组蛋白，例如，重组受体，如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，本文提供的方法与制造、生成或产生细胞疗法结合使用，并且可以与另外的处理步骤(如用于细胞的分离、分开、选择、激活或刺激、转导、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制的步骤)结合使用。在一些实施方案中，生成或产生工程化细胞(例如，工程化T细胞)的方法包括用于从受试者分离细胞、在刺激条件下孵育细胞和基因工程化细胞的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述方法包括按顺序进行的处理步骤，其中首先从生物样品分离(如选择或分开)输入细胞，例如原代CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞；在刺激条件下孵育，如通过转导或转染进行基因工程化以将编码重组受体的重组多核苷酸引入所述细胞中；然后收集、收获或填充至容器(例如，袋子或小瓶)中作为输出群体。在所述方法的一些方面，生物样品可以是冷冻保存的生物样品，如冷冻保存的单采术产物。在一些实施方案中，任选地在冷冻保存和储存细胞之后，将输出群体的细胞重新引入同一受试者体内。在一些实施方案中，工程化细胞的输出群体适用于疗法(例如，自体细胞疗法)中。
在特定实施方案中，所提供的方法与从初始或输入细胞群体产生表达重组受体的输出细胞群体结合使用。在某些实施方案中，所述输入群体是通过组合、混合和/或合并细胞来产生、生成和/或制备，所述细胞包括来自含有富集的T细胞、富集的CD3+T细胞、富集的CD4+T细胞和/或富集的CD8+T细胞的细胞群(下文中也分别称为富集的T细胞的群体、富集的CD3+T细胞的群体、富集的CD4+T细胞的群体和富集的CD8+T细胞的群体)。在一些实施方案中，所述输入细胞群体是CD3+T细胞的群体，例如，不进行CD4+和/或CD8+选择。在一些实施方案中，所述输入细胞群体是来自起始样品(如PBMC或白细胞单采术样品)的富含CD3+T细胞的群体，其中所述起始样品尚未经受CD4+和/或CD8+选择。在一些实施方案中，所述起始样品针对CD3进行选择，未进行针对另一种标记(例如，CD4和/或CD8)的任何先前、并行或后续选择，以产生富含CD3+T细胞的输入群体。在一些实施方案中，所述输入细胞群体富含CD3+T细胞，所述输入群体在经受所述制造过程的步骤如激活或刺激输入群体或工程化之前，未经受进一步选择，例如，CD4+和/或CD8+选择。在一些实施方案中，所述输入细胞群体是组合的、混合的和/或合并的CD4+和CD8+T细胞的群体。在某些实施方案中，所提供的方法与以下中的一个或多个结合使用：激活或刺激细胞，例如，输入群体的细胞；通过转导或转染将激活的或刺激的细胞基因工程化，例如，以引入编码重组蛋白的多核苷酸。在某些实施方案中，所述方法还可以与以下步骤结合使用：从生物样品分离或选择细胞以产生富集的T细胞的输入群体，所述生物样品如从受试者获取、收集和/或获得的生物样品。在特定实施方案中，所提供的方法可以与以下步骤结合使用：在已经对细胞进行孵育、激活、刺激、工程化、转导和/或培养之后，收获、收集和/或配制富集的T细胞的群体。
在某些实施方案中，所提供的方法不含导致细胞扩增的任何步骤、阶段或条件。在特定实施方案中，输入群体的细胞在经历用于产生工程化细胞群体的所提供方法时不发生扩增，所述输入群体例如富集的CD3+T细胞的起始群体(例如，不进行针对CD4和/或CD8标记的先前或并行选择)、CD4+T细胞的起始样品(例如，基本上不含CD8+T细胞)、CD8+T细胞的起始样品(例如，基本上不含CD4+T细胞)、或CD4+T细胞和CD8+T细胞的起始群体。在特定实施方案中，如与输入群体中细胞的量(如在刺激条件下培养开始时)相比，输出群体(例如，通过所提供的过程基因工程化的细胞的输出群体)的细胞是相同的、大致相同的、减少的或降低的。在一些方面，不依赖于扩增细胞以增加来自起始细胞群(例如，输入群体)的细胞的数量或浓度的方案不需要在细胞群之间可能变化的孵育或培育。例如，一些实施方案考虑，从不同受试者(如具有不同疾病或疾病类型的受试者)获得的细胞群可能以不同速率分裂或扩增。在某些方面，消除需要细胞扩增的可能多变的步骤允许严格控制整个过程的持续时间。
在一些实施方案中，所述方法与用于刺激细胞(如通过在刺激条件下孵育细胞)的一个或多个步骤结合使用。在一些方面，此类刺激条件是或包括将细胞与刺激试剂一起培养，所述刺激试剂例如本文如在章节I-B-1中所述的刺激试剂。在特定实施方案中，刺激设定或固定量的细胞，如以设定或固定浓度刺激。在某些实施方案中，将所述刺激(例如，在刺激条件下培养细胞)进行设定或固定量的时间，如2天以内的时间量，或进行18小时与30小时之间的时间量。在一些方面，将用刺激试剂刺激进行为或约20小时±4小时。
在某些实施方案中，本文所提供的方法与如通过本文例如在章节I-C中所述方法将异源或重组多核苷酸引入细胞中(例如，转导或转染细胞)结合进行。在特定实施方案中，在基因工程化细胞期间或之后，将细胞孵育例如足以允许编码重组蛋白的异源或重组多核苷酸整合或允许重组蛋白表达的时间量。在某些实施方案中，将细胞孵育设定或固定量的时间，如大于18小时或小于4天，例如，72小时±6小时的时间量。在任何所提供实施方案中，所述引入可以在已经用刺激试剂刺激细胞之后对所述细胞进行。在一些实施方案中，在从起始或开始刺激时起设定量的时间内，如在从将刺激试剂添加、培养或与细胞接触时起30小时内，起始或开始所述工程化步骤。在特定实施方案中，在将刺激试剂添加、培养或与细胞接触之后18小时与30小时之间，如20小时±4小时，起始或开始所述工程化步骤。
在一些实施方案中，一个或多个过程步骤至少部分是在无血清培养基中进行。在一些实施方案中，无血清培养基是定义的或明确定义的细胞培养基。在某些实施方案中，无血清培养基是受控培养基，其已经过处理，例如被过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些实施方案中，无血清培养基含有蛋白质。在某些实施方案中，无血清培养基可含有血清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、载体蛋白和/或附着因子。
在一些实施方案中，进行所提供的方法，使得用于临床用途(例如，用于过继细胞疗法)的细胞的制备中的一个、多个或所有步骤是在使细胞不暴露于非无菌条件的情况下进行。在一些实施方案中，对细胞进行分离、分开或选择、转导、洗涤、任选地激活或刺激和配制，都在封闭的无菌系统或装置中进行。在一些实施方案中，一个或多个步骤是在封闭系统或装置之外进行。在一些此类实施方案中，将细胞在无菌条件下从封闭系统或装置转移出去，如通过无菌转移转移到单独的封闭系统中。
在特定实施方案中，在用于产生表达重组受体的富集的T细胞的输出群体的过程的任何阶段或步骤之前、期间或之后，可以将富集的T细胞的群体收集、配制用于冷冻保护、冷冻(例如，冷冻保护)和/或储存在低于0℃、低于-20℃、或者为或低于-70℃或-80℃。在一些实施方案中，可以将细胞储存1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天以内的时间量，或1、2、3、4、5、6、7、8周以内的时间量，或至少1、2、3、4、5、6、7或8周的时间量，或超过8周。在储存后，可以将富集的T细胞的群体解冻，并且可以从所述过程中的同一点恢复处理。在一些实施方案中，在进一步处理(例如，在刺激条件下孵育)之前，对富集的T细胞的输入群体进行冷冻保护和储存。在特定实施方案中，在例如作为自体细胞疗法被施用至受试者之前，对富集的T细胞的培育和/或配制的群体进行冷冻保护和储存。
在某些实施方案中，本文所提供的方法与借此通过如下过程产生工程化细胞的过程结合使用，所述过程包括用于以下的步骤：刺激细胞，然后将编码重组受体(例如，CAR)的多核苷酸引入细胞中。在特定实施方案中，所述刺激进行18小时与30小时之间，如进行约24小时，并且随后进行多核苷酸的引入。在某些实施方案中，在开始引入多核苷酸之后3天内，收获或收集细胞，例如以进行配制用于冷冻保存或施用至受试者。在各种实施方案中，在开始于刺激条件下孵育之后4天内，收获或收集细胞，例如以进行配制用于冷冻保存或施用至受试者。
在特定实施方案中，在所述过程中的任何阶段或步骤，可以在群体保持在封闭系统中时，如在分离、孵育、工程化、培育和/或配制期间，对一部分细胞进行采样或收集，例如，可以从T细胞群(如富集的T细胞群)获取细胞。在某些实施方案中，可以分析此类细胞的标记、特征或特性，包括但不限于活力、细胞凋亡、激活、刺激、生长和/或消耗。在一些实施方案中，在富集的T细胞的群体保持在封闭系统中时，通过自动化过程对细胞进行采样或收集。在一些实施方案中，对采样或收集的细胞的分析是自动化的。在特定实施方案中，所述分析是在无菌条件下在封闭系统中进行。
在一些实施方案中，可以将通过所提供的方法产生和/或处理的细胞或细胞群与通过示例性和/或替代性过程处理或产生的细胞或细胞群进行比较。在某些实施方案中，所述替代性和/或示例性过程可以在一个或多个具体方面不同，但是在其他方面含有与示例性或替代性过程相比较的所提供方法的实施方案或方面的相似或相同的特征、方面、步骤、阶段、试剂或条件。例如，可以将通过所提供的方法产生的工程化细胞(例如，非扩增细胞的输出群体)与通过涉及扩增细胞的一个或多个步骤的过程产生的细胞相比较。在一些实施方案中，除非另有规定，否则所提供的方法和示例性或替代性过程将会在其他方面是相似和/或相同的，如具有相似或相同的用于分离、选择、富集、激活、刺激、工程化、转染、转导、培育和/或配制的步骤。在一些实施方案中，除非另有规定，否则所提供的方法和替代性过程从相同或相似类型的生物样品分离、选择和/或富集细胞，和/或处理细胞，和/或输入相同细胞类型的细胞。
还提供通过所述方法制备的细胞和群体，包括药用群体和配制品，以及用于进行所述方法的试剂盒、系统和装置。还提供通过所述方法制备的细胞和群体的使用方法，包括治疗方法，如用于过继细胞疗法的方法，以及用于施用至受试者的药用群体。
A.样品和细胞制备
在特定实施方案中，所提供的方法与从生物样品分离、选择或富集细胞以产生所富集细胞(例如，T细胞)的一个或多个输入群体结合使用。在一些实施方案中，所提供的方法包括从生物样品分离细胞或其群体，所述生物样品如获自或源自受试者的那些，所述受试者如患有特定疾病或病症或者需要细胞疗法或者将被施用细胞疗法的受试者。在一些方面，受试者是人，如作为需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中分离、处理和/或工程化细胞以用于所述过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接从受试者获取的组织、流体和其他样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括源自它们的被处理样品。
在一些方面，样品是血液或源自血液的样品，或者源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自它们的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除了红细胞和血小板以外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于后续的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺少钙和/或镁和/或多种或全部二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(如例如不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，洗涤含有细胞的样品(例如，单采术产物或白细胞单采术产物)，以去除在单采术或白细胞单采术期间添加的一种或多种抗凝剂，如肝素。
在一些实施方案中，将含有细胞的样品(例如，全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物)冷冻保存和/或冷冻保护(例如，冷冻)，然后在用于分离、选择、激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制细胞群和/或将配制的细胞群施用至受试者的任何步骤之前，将其解冻并任选地洗涤。
在一些实施方案中，在适于确保适当质量的方法中从受试者收集含有自体外周血单核细胞(PBMC)的样品以供制造。在一个方面，含有PBMC的样品源自分级分离的全血。在一些实施方案中，将来自受试者的全血通过白细胞单采术使用离心力并利用细胞表型之间的密度差异进行分级分离，此时优先富集自体单核细胞(MNC)，而其他细胞表型如红细胞在收集的细胞组合物中减少。在一些实施方案中，在MNC收集期间并行收集自体血浆，这在一些方面可以允许延长的白细胞单采术产物稳定性。在一个方面，将自体血浆添加至白细胞单采术产物以改进白细胞单采术产物基质的缓冲能力。在一些方面，进行处理以产生白细胞单采术产物的全血的总体积为或为约2L、4L、6L、8L、10L、12L、14L、16L、18L或20L，或者是任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，收集的自体血浆的体积为或为约10mL、50mL、100mL、150mL、200mL、250mL或300mL或更多，或者是任何前述值之间的体积。在一些实施方案中，在白细胞单采术收集完成的约48小时内，使白细胞单采术产物经受一种程序，例如，洗涤和配制用于过程中冷冻保存。在一些实施方案中，例如，在白细胞单采术收集完成的约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或48小时内，使白细胞单采术产物经受一个或多个洗涤步骤。在一些方面，所述一个或多个洗涤步骤去除白细胞单采术收集期间的抗凝剂、可能在白细胞单采术产物中积累的细胞废物、残余血小板和/或细胞碎片。在一些实施方案中，在所述一个或多个洗涤步骤期间进行一次或多次缓冲液交换。
在特定实施方案中，将单采术产物或白细胞单采术产物冷冻保存和/或冷冻保护(例如冷冻)，然后在进行如下所述的细胞选择或分离步骤(例如T细胞选择或分离步骤)之前进行解冻。在一些实施方案中，在使冷冻保存的和/或冷冻保护的单采术产物或白细胞单采术产物经受T细胞选择或分离步骤之后，在任何后续步骤(如激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制细胞群和/或将所配制的细胞群使用至受试者的步骤)期间或之间，不再进行冷冻保存和/或冷冻保护步骤。例如，在解冻并任选地洗涤用于下游过程(如T细胞激活/刺激或转导)之前，不再对选自解冻的冷冻保存的和/或冷冻保护的单采术产物或白细胞单采术产物的T细胞进行冷冻保存和/或冷冻保护。
在特定实施方案中，将单采术产物或白细胞单采术产物以以下密度在冷冻保存溶液或缓冲液中进行冷冻保存和/或冷冻保护(例如，冷冻)：为、为约或至少5x106个细胞/mL、10x106个细胞/mL、20x106个细胞/mL、30x106个细胞/mL、40x106个细胞/mL、50x106个细胞/mL、60x106个细胞/mL、70x106个细胞/mL、80x106个细胞/mL、90x106个细胞/mL、100x106个细胞/mL、110x106个细胞/mL、120x106个细胞/mL、130x106个细胞/mL、140x106个细胞/mL、或150x106个细胞/mL，或者任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，所述冷冻保存溶液或缓冲液是或含有例如任选地包含人血清白蛋白(HSA)的DMSO溶液，或其他合适的细胞冷冻介质。
在特定实施方案中，将冷冻保存的和/或冷冻保护的单采术产物或白细胞单采术产物存放(例如，在冷冻样品之前不进行T细胞选择)，这在一些方面可以允许更灵活地进行后续制造步骤。在一些方面，将冷冻保存的和/或冷冻保护的单采术产物或白细胞单采术产物等分至多个冷冻保存容器如袋子中，所述容器可以各自单独地或组合地用于产物处理中。例如，在单采术产物或白细胞单采术产物中活细胞的总数量小于15x109个细胞时，将冷冻保存的和/或冷冻保护的单采术产物或白细胞单采术产物等分至四个冷冻保存容器如袋子中。在一些实施方案中，在单采术产物或白细胞单采术产物中活细胞的总数量是15-30x109个细胞时，将冷冻保存的和/或冷冻保护的单采术产物或白细胞单采术产物等分至八个冷冻保存容器如袋子中。
在一个方面，在选择前存放细胞增加用于下游过程的细胞产率，并且较早存放细胞可能意味着，所述细胞更健康并且可能更易于符合制造成功的标准。在另一个方面，一旦解冻，就可以使冷冻保存的和/或冷冻保护的单采术产物或白细胞单采术产物经受一种或多种不同的选择方法。这种方式的优点尤其在于，增强用于治疗受试者的疾病或病症的细胞疗法的细胞的可用性、功效和/或其他方面，如在所述样品的供体和/或另一接受者中。
在一些实施方案中，在供体被诊断为患有疾病或病症之后的时间，在细胞选择之前或在不进行在先细胞选择的情况下(例如，不进行在先T细胞选择，如通过色谱进行选择)，收集样品(例如单采术或白细胞单采术样品)并进行冷冻保存和/或冷冻保护。在一些方面，冷冻保存的时间也在供体已经接受以下中的一种或多种之前：用于所述疾病或病症的任何初始治疗、用于所述疾病或病症的任何靶向治疗或针对治疗进行标记的任何治疗、或者除了辐射和/或化学疗法以外的任何治疗。在一些实施方案中，在疾病的初始治疗后疾病首次复发之后，以及在供体或受试者接受用于所述疾病的后续治疗之前，收集样品。所述初始和/或后续治疗可以是除了细胞疗法以外的疗法。在一些实施方案中，所收集的细胞可以用于初始和/或后续治疗后的细胞疗法中。在一个方面，在不进行在先细胞选择的情况下，冷冻保存的和/或冷冻保护的样品可以有助于降低前期费用，如与随机化临床试验中的非治疗患者相关的那些费用，所述患者可能发生交叉并且以后需要治疗。
在一些实施方案中，在疾病的二线治疗后疾病第二次复发后，以及在供体或受试者接受用于所述疾病的后续治疗之前的时间，在细胞选择前或在不进行在先细胞选择的情况下(例如，不进行在先T细胞选择，如通过色谱进行的选择)，收集样品(例如单采术或白细胞单采术样品)并进行冷冻保存和/或冷冻保护。在一些实施方案中，例如通过评估某些风险因子，将患者鉴定为可能在二线治疗后复发。在一些实施方案中，所述风险因子是基于疾病类型和/或遗传学，如双打击淋巴瘤、原发性难治性癌症、或激活的B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述风险因子是基于临床表现，如一线治疗之后的早期复发、或治疗之后的其他不良预后指数(例如，IPI(国际预后指数)>2)。
在一些实施方案中，在供体或受试者被诊断为患有疾病之前的时间，在细胞选择前或在不进行在先细胞选择的情况下(例如，不进行在先T细胞选择，如通过色谱进行的选择)，收集样品(例如单采术或白细胞单采术样品)并进行冷冻保存和/或冷冻保护。在一些方面，可以确定供体或受试者具有患上疾病的风险。在一些方面，供体或受试者可以是健康受试者。在某些情况下，在被认为没有患上疾病的风险或被诊断为未患疾病的情况下，供体或受试者可以选择存放或储存细胞，以免在生命的后期需要细胞疗法。在一些实施方案中，可以基于诸如以下等因素，认为供体或受试者具有患上疾病的风险：基因突变、基因异常、基因破坏、家族病史、蛋白质异常(如蛋白质产生和/或加工的缺陷)，以及可能增加患病风险的生活方式的选择。
在一些实施方案中，收集细胞作为预防药。
在一些实施方案中，将冷冻保存的和/或冷冻保护的细胞样品(例如单采术或白细胞单采术样品)，如尚未经受在先细胞选择(例如，不进行在先T细胞选择，如通过色谱进行的选择)的细胞样品储存或存放如下时间段：大于或等于12小时、24小时、36小时或48小时，或者大于或等于0.5天、一天、1.5天或两天。在一些实施方案中，将样品储存或存放如下时间段：大于或等于1周、2周、3周或4周。在一些实施方案中，将样品放置于长期储存或长期存放中。在一些方面，将样品储存如下时间段：大于或等于1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年或更久。
在一些实施方案中，将从供体获取的单采术或白细胞单采术样品在冷却的环境中运输到储存或处理设施，和/或在储存设施中低温储存，或在处理设施中进行处理。在一些实施方案中，在运输前处理样品，例如，通过选择T细胞，如CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞进行处理。在一些实施方案中，在运输之后且在低温储存样品之前进行这种处理。在一些实施方案中，在低温储存后解冻样品之后进行所述处理。
通过允许供体在所述供体及因此其细胞尚未经历疾病的广泛治疗时和/或在患上疾病或病症或其诊断之前的阶段储存其细胞，与在一轮或多轮治疗后收获的细胞相比，此类细胞可能具有用于细胞疗法的某些优点。例如，与已经历几轮治疗的细胞相比，在一轮或多轮治疗之前收获的细胞可能更健康，可能展现更高水平的某些细胞活性，可能生长更快，和/或可能更易接受基因操作。根据本文所述的实施方案的优点的另一个例子可以包括便利性。例如，通过在细胞疗法需要供体细胞之前收集、任选地处理和储存所述供体细胞，如果接受者以后需要所述细胞以及在接受者以后需要所述细胞时，将容易获得所述细胞。这可以增加单采术实验室容量，从而为技术人员安排单采术收集过程提供更高灵活性。
用于来自样品如单采术样品的细胞的低温储存和处理的示例性方法和系统可以包括WO 2018170188中所述的那些。在一些实施方案中，所述方法和系统涉及在患者需要细胞疗法之前收集单采术，然后使所述单采术样品经受冷冻保存，以供以后用于用重组受体(例如CAR)工程化细胞(例如T细胞)的过程中。在一些情况下，此类过程可以包括本文所述的那些。在一些实施方案中，从受试者收集单采术样品，并且在细胞群的后续T细胞选择、激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制和/或将所配制的细胞群施用至受试者之前进行冷冻保存。在此类例子中，在使样品经受一个或多个选择步骤(如本文所述的任何步骤)之前，将冷冻保存的单采术样品解冻。
在一些实施方案中，将冷冻保存的和/或冷冻保护的细胞样品(例如单采术或白细胞单采术样品)，如尚未经受在先细胞选择(例如，不进行在先T细胞选择，如通过色谱进行的选择)的细胞样品解冻，之后将其用于制造用于细胞疗法的细胞群(例如，含有CAR+T细胞的T细胞群)的下游过程中。在一些实施方案中，这种冷冻保存的和/或冷冻保护的细胞样品(例如单采术或白细胞单采术样品)与本文所提供的用于工程化T细胞疗法如CAR+T细胞疗法的过程结合使用。在特定例子中，在收获/配制步骤之前或期间不再进行冷冻保存步骤。
1.T细胞选择
在一些实施方案中，细胞或群体的选择、分离或富集包括一个或多个制备步骤和/或非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞洗涤、离心和/或在存在一种或多种试剂的情况下进行孵育，例如以去除不需要的组分，富集所需组分，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。在某些实施方案中，用于选择、分离和富集的方法、技术和试剂描述于例如WO 2013124474和WO2015164675中，所述申请通过引用以其整体特此并入。
在一些实施方案中，将冷冻保存的和/或冷冻保护的单采术产物或白细胞单采术产物解冻。在一些实施方案中，使解冻的细胞组合物经受稀释(例如，用无血清培养基)和/或洗涤(例如，用无血清培养基)，这在一些情况下可以去除或减少不需要或不期望的组分。在一些情况下，所述稀释和/或洗涤去除或减少解冻样品中所含冷冻保护剂(例如DMSO)的存在，所述冷冻保护剂原本可能在延长室温暴露后对细胞活力、产率、回收率造成负面影响。在一些实施方案中，所述稀释和/或洗涤允许将解冻的冷冻保存的产物培养基交换至无血清培养基中，例如本文在章节II中或在通过引用并入本文的PCT/US2018/064627中所述的无血清培养基。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有一种或多种补充剂的基础培养基(例如OpTmizerTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher))。在一些实施方案中，所述一种或多种补充剂不含血清。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有一种或多种另外的组分的基础培养基，所述另外的组分用于细胞(例如，T细胞)的维持、扩增和/或激活，如通过另外的补充剂(例如OpTmizerTMT细胞扩增补充剂(ThermoFisher))所提供。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含血清替代物补充剂，例如，免疫细胞血清替代物，例如，ThermoFisher(#A2596101)、CTSTM免疫细胞血清替代物、或Smith等人Clin TranslImmunology.2015年1月；4(1):e31中所述的免疫细胞血清替代物。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含游离形式的氨基酸，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，如GlutamaxTM(ThermoFisher)中的二肽。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含一种或多种重组细胞因子，如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15。
在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分包括将细胞与选择试剂一起孵育。与一种或多种选择试剂一起孵育，例如作为选择方法的一部分可以使用一种或多种选择试剂来进行，以用于基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中或细胞上的表达或存在来选择一种或多种不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的利用一种或多种选择试剂基于此类标记进行分离的方法。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致分离，所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，选择包括与一种或多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与特异性结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并分离已结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合至抗体或结合配偶体的那些细胞。
在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于亲和力的所需选择试剂混合。基于免疫亲和力的选择可以使用任何系统或方法进行，所述系统或方法使得在分离的细胞与特异性结合至细胞上的标记的分子(例如，固体表面(例如颗粒)上的抗体或其他结合配偶体)之间产生有利的能量相互作用。在一些实施方案中，方法是使用颗粒如珠(例如磁珠)进行，所述颗粒包被有对细胞的标记具有特异性的选择剂(例如抗体)。可以将颗粒(例如珠)与细胞在容器(如管或袋)中一起孵育或混合，同时振荡或混合，其中细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进能量上有利的相互作用。在其他情况下，所述方法包括选择细胞，其中所述选择的全部或一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。在某些实施方案中，所述分离或分开是使用以下文献中所述的系统、装置或设备来进行：国际专利申请公开号WO2009/072003、或US 20110003380A1，所述申请通过引用以其整体特此并入。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO2016/073602中所述的系统，所述申请通过引用以其整体特此并入。
在一些实施方案中，通过在离心室的空腔中实施此类选择步骤或其部分(例如，与抗体涂覆的颗粒(例如磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，例如各种溶液的体积、在处理期间溶液的添加及其时间安排，与其他可用方法相比，这可以提供多种优势。例如，在孵育期间减少空腔中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如珠试剂)的浓度，并由此增加溶液的化学势，而不影响空腔中的细胞总数。这又可以增强正在处理的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如，在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤，允许用户在孵育期间的一个或多个所需时间实现对溶液的搅动，这也可以改进所述相互作用。
在一些实施方案中，所述选择步骤的至少一部分是在离心室中进行的，其包括将细胞与选择试剂一起孵育。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于亲和力的所需选择试剂混合，所述量远少于根据制造商的说明书在管或容器中进行类似选择以用于选择相同数量的细胞和/或相同体积的细胞时通常采用的量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量是根据制造商的说明书在用于相同细胞数量和/或相同细胞体积的基于管或容器的孵育中进行细胞选择时所采用的一种或多种相同选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如，基于免疫亲和力的选择，将细胞在室的空腔中在群体中孵育，所述群体还含有选择缓冲液和选择试剂，如与位于需要富集和/或耗尽的细胞上但不在群体中的其他细胞上的表面标记特异性结合的分子，如抗体，所述分子任选地与支架如聚合物或表面偶联，所述支架例如珠，例如磁珠，如与对CD3、CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠。在一些实施方案中，如所描述的，将所述选择试剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转的管中进行选择时，对相同细胞数量或相同细胞体积实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以达到例如10mL至200mL试剂的孵育的目标体积，例如至少或约至少或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂单独添加至细胞。在一些实施方案中，选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进能量上有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。
在一些实施方案中，与选择试剂一起孵育的总持续时间为或为约5分钟至6小时，例如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转的存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如在样品或室壁或其他容器壁处的一定RCF下，所述RCF为或为约80g至100g(例如，为或为约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用如下重复间隔来进行：以这种低速旋转，之后是休息时间段，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，这个过程是在与所述室为整体的完全封闭的系统内进行的。在一些实施方案中，这个过程(并且在一些方面还有一个或多个另外的步骤，例如洗涤含有细胞的样品如单采术样品的预先洗涤步骤)以自动化方式进行，使得将细胞、试剂和其他组分在适当时间吸入所述室中和推出所述室并实现离心，以便使用自动化程序在单一封闭系统中完成洗涤和结合步骤。
在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，使所孵育的细胞经受分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在同一封闭系统中进行分离，其中将细胞与选择试剂一起进行孵育。在一些实施方案中，在与所述选择试剂一起孵育后，将所孵育的细胞(包括其中已经结合选择试剂的细胞)转移到系统中用于基于免疫亲和力来分离细胞。在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已结合试剂(例如抗体或结合配偶体)的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合试剂(例如抗体或结合配偶体)的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得专门鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于除了所需群体以外的细胞表达的标记来进行分离的情况下，阴性选择可以特别有用。
在一些实施方案中，所述处理步骤还包括如使用可进行基于亲和力的选择的系统或设备对孵育的细胞进行阴性和/或阳性选择。在一些实施方案中，通过以下方式进行分离：通过阳性选择富集特定细胞群，或通过阴性选择耗尽特定细胞群。在一些实施方案中，阳性或阴性选择是通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育完成的，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高水平表达(标记高)的一种或多种表面标记特异性结合。
分离无需导致特定细胞群或表达特定标记的细胞的100％富集或去除。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致全部此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，如之后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单一分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对阴性选择靶向的标记具有特异性)一起孵育。同样，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的各种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择各种细胞类型。在某些实施方案中，将分离步骤重复和/或进行超过一次，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择级分经受相同的分离步骤，例如重复的阳性或阴性选择。在一些例子中，将单一分离步骤重复和/或进行超过一次，例如以增加所选择的细胞的纯度和/或以进一步从阴性选择的级分中去除和/或耗尽阴性选择的细胞。在某些实施方案中，将一个或多个分离步骤进行两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或超过十次。在某些实施方案中，将一个或多个选择步骤进行和/或重复一次与十次之间、一次与五次之间或三次与五次之间。
例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术来分离T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD3+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)。在一些实施方案中，通过与特异性结合此类标记的一种或多种抗体或结合配偶体一起孵育来选择此类细胞。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体可以例如直接或间接地缀合至实现选择的固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)。例如，CD3+、CD28+T细胞可以使用CD3/CD28缀合的磁珠(例如，
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M-450CD3/CD28T细胞扩增器和/或
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珠)进行阳性选择。
在一些实施方案中，通过在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标记(如CD14)的阴性选择，从PBMC样品分离T细胞。在一些方面，使用CD3+选择步骤从起始样品如PBMC或白细胞单采术样品产生富含CD3+T细胞的群体，其中所述起始样品尚未经受基于另一种标记如CD4和/或CD8的阳性或阴性选择。在一些实施方案中，所述起始样品针对CD3进行选择，未进行针对另一种标记(例如，CD4和/或CD8)的任何先前、并行或后续选择，以产生富含CD3+T细胞的输入群体。在一些实施方案中，所述输入细胞群体富含CD3+T细胞，所述输入群体在经受所述制造过程的步骤如激活或刺激输入群体或工程化之前，未经受进一步选择，例如，CD4+和/或CD8+选择。在某些实施方案中，富含CD3+T细胞的输入群体中CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率在1:10与10:1之间、在1:5与5:1之间、在4:1与1:4之间、在1:3与3:1之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25之间、在1.2:1与1:1.2之间、在1.1:1与1:1.1之间、或约1:1或1:1。
在一些实施方案中，通过在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标记(如CD14)的阴性选择，从PBMC样品分离T细胞。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过针对在一种或多种幼稚样、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记进行的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体进一步分选为亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改进施用后的长期存活、扩增和/或移植物植入，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人,(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于针对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，分离富含TCM细胞的CD8+群体是通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞以及针对表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行。在一方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分经受基于CD14和CD45RA的表达的阴性选择以及基于CD62L的阳性选择。在一些方面，此类选择是同时进行的，并且在其他方面，是以任何顺序依序进行的。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。在一些实施方案中，对CD4+细胞群的选择和对CD8+细胞群的选择同时进行。在一些实施方案中，对CD4+细胞群的选择和对CD8+细胞群的选择以任一顺序依次进行。在一些实施方案中，用于选择细胞的方法可以包括如公开的美国申请号US20170037369中所述的那些，所述申请通过引用以其整体特此并入。在一些实施方案中，可以在选择之后组合所选择的CD4+细胞群和所选择的CD8+细胞群。在一些方面，可以将所选择的CD4+细胞群和所选择的CD8+细胞群在如本文所述的生物反应器袋中组合。
在特定实施方案中，使生物样品(例如PBMC或其他白细胞的样品)经受CD4+T细胞的选择，其中同时保留阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD8+T细胞选自阴性级分。在一些实施方案中，使生物样品经受CD8+T细胞的选择，其中同时保留阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD4+T细胞选自阴性级分。
在一些方面，使用基于CD8的阳性选择步骤从起始样品(如PBMC或白细胞单采术样品)产生富含CD8+T细胞的群体，其中所述起始样品尚未经受基于另一标记如CD3+和/或CD4+的选择。在一些实施方案中，保留来自CD8阳性选择步骤的阴性和阳性级分两者，并且使CD8阴性级分进一步经受基于CD4的阳性选择步骤，以产生富含CD4+T细胞的群体。在一些实施方案中，将来自富含CD8+T细胞的群体的细胞和来自富含CD4+T细胞的群体的细胞混合、组合和/或合并，以产生含有CD4+T细胞和CD8+T细胞的输入群体。在某些实施方案中，在刺激细胞(例如，在刺激条件下培养细胞，如章节I-B中所述)之前，将富含CD8+T细胞的群体和富含CD4+T细胞的群体合并、混合和/或组合。在某些实施方案中，所述合并、混合和/或组合的细胞或群体中CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率在1:10与10:1之间、在1:5与5:1之间、在4:1与1:4之间、在1:3与3:1之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25之间、在1.2:1与1:1.2之间、在1.1:1与1:1.1之间、或约1:1、或1:1。在某些实施方案中，将所述细胞或群体合并、混合和/或组合，以在合并、混合和/或组合的细胞组合物中具有比率为或为约1:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞。
在一些方面，使用基于CD4的阳性选择步骤从起始样品(如PBMC或白细胞单采术样品)产生富含CD4+T细胞的群体，其中所述起始样品尚未经受基于另一标记如CD3+和/或CD8+的选择。在一些实施方案中，保留来自CD4阳性选择步骤的阴性和阳性级分两者，并且使CD4阴性级分进一步经受基于CD8的阳性选择步骤，用于产生富含CD8+T细胞的群体。在一些实施方案中，将来自富含CD4+T细胞的群体的细胞和来自富含CD8+T细胞的群体的细胞混合、组合和/或合并，以产生含有CD8+T细胞和CD4+T细胞的输入群体。在某些实施方案中，在刺激细胞(例如，在刺激条件下培养细胞，如章节I-B中所述)之前，将富含CD4+T细胞的群体和富含CD8+T细胞的群体合并、混合和/或组合。在某些实施方案中，所述合并、混合和/或组合的细胞或群体中CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率在1:10与10:1之间、在1:5与5:1之间、在4:1与1:4之间、在1:3与3:1之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25之间、在1.2:1与1:1.2之间、在1.1:1与1:1.1之间、或约1:1、或1:1。在某些实施方案中，将所述细胞或群体合并、混合和/或组合，以在合并、混合和/或组合的细胞组合物中具有比率为或为约1:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞。
在一些实施方案中，分别使用特异性结合CD4的选择剂和特异性结合CD8的选择剂产生富含CD4+T细胞的群体和富含CD8+T细胞的群体。在一些实施方案中，CD4特异性选择剂和CD8特异性选择剂的能力相同或基本上相同，例如，可以使用单位体积或单位重量的选择剂(例如，ClinicMACS CD4选择试剂和CD8选择试剂)从相同数量的总细胞选择CD4或CD8细胞。在一些实施方案中，可以使用比具有相同或基本上相同的能力的CD8特异性选择剂更大量的CD4特异性选择剂。例如，CD4特异性选择剂和CD8特异性选择剂的体积或重量的比率可以为约5:1、4:1、3:1、2:1或1:5:1。
在特定例子中，PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后使阴性级分经受基于CD14和CD45RA或CD19的表达的阴性选择以及基于中枢记忆T细胞所特有的标记(如CD62L或CCR7)的阳性选择，其中所述阳性和阴性选择是以任何顺序来进行。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，可以将CD4+T辅助细胞分选为幼稚、中枢记忆和效应细胞。可以通过标准方法获得CD4+淋巴细胞。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、C D62L+或CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体结合至固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)，以允许分离细胞用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于以下文献中：Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis ResearchProtocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
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Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
在一些方面，将要分离的细胞的孵育的样品或群体与含有小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如，Dynalbeads或
Figure BDA0003008592730000682
珠))的选择试剂一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)特异性结合。
在一些实施方案中，磁粒或磁珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。用于磁分离方法中的许多熟知的磁响应材料是已知的，例如Molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，所述专利通过引用特此并入。还可以使用胶体大小的颗粒,如在Owen的美国专利号4,795,698和Liberti等人的美国专利号5,200,084中所述的那些，所述专利通过引用特此并入。
通常在如下条件下进行孵育，借此附着至磁粒或磁珠的抗体或结合配偶体或者与此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与样品内细胞上的细胞表面分子(如果存在)特异性结合。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁粒经由对一种或多种标记具有特异性的一抗的包被而附着至细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记细胞而不是珠，然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如，链霉亲和素)包被的磁粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒是与生物素化的一抗或二抗结合使用。
在一些方面，在如下程序中实现分离：其中将样品置于磁场中，并且其上附着有磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引至磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被吸引至磁体的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性与阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或使其经受进一步的分离步骤。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotech，加利福尼亚州奥本)进行的。磁激活细胞分选(MACS)(例如，CliniMACS系统)能够对具有附着于其上的磁化颗粒的细胞进行高纯度选择。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，附着至磁化颗粒的细胞被保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成这个第一洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非靶细胞并将其从异质性细胞群中耗尽。
在一些实施方案中，亲和试剂的次最佳产率浓度是低于在给定选择或富集中实现所结合细胞的最佳或最大产率所使用或需要的浓度的浓度，所述选择或富集涉及将细胞与所述试剂一起孵育以及回收或分离已经与所述试剂结合的细胞(例如，“产率”是与孵育中被所述试剂靶向、或者所述试剂对其具有特异性、或者具有标记(所述试剂对其具有特异性并且能够结合)的细胞的总数量相比，如此回收或选择的细胞的数量)。次最佳产率浓度通常是在这个过程或步骤中，在回收已经结合至所述试剂的细胞后，实现所结合细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)的少于全部(例如，不超过70％)产率的试剂的浓度或量。在一些实施方案中，不超过或不超过约50％、45％、40％、30％或25％产率是通过亲和试剂的次最佳浓度来实现。所述浓度可以表示为每个细胞的颗粒或表面的数量或质量和/或每个细胞的药剂(例如，抗体，如抗体片段)的质量数或分子数。在特定实施方案中，次最佳产率浓度足以达到或达到幼稚样CD4+T细胞与幼稚样CD8+T细胞的固定比率、受控比率和/或限定比率。
在一些实施方案中，例如，当以具有对CD4+和/或CD8+T细胞的亲和力的两种或更多种选择试剂中的每一种或者一或多种的次最佳产率浓度操作时，此类试剂中的一种或多种是以高于其他此类试剂中的一种或多种的浓度来使用，以使该试剂所识别的细胞类型的比率如与其他一种或多种试剂所识别的一种或多种细胞类型相比有所偏向。例如，根据期望以多大程度增加所述比率，与其他一种或多种试剂相比，与期望针对其偏向所述比率的标记特异性结合的试剂被包括的浓度(例如，每个细胞的药剂或质量)可以增加一半、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。
在一些实施方案中，当在次最佳范围内和/或用足以实现试剂饱和的细胞操作时，免疫亲和试剂的量与所富集细胞的近似产率成比例。在某些实施方案中，可以按常规方式确定免疫亲和试剂的适当的量或浓度，其取决于所产生的含有富集或选择的CD4+和CD8+T细胞的群体的所需比率。
在一些实施方案中，所述分开和/或分离步骤使用磁珠来进行，在所述磁珠中免疫亲和试剂如经由与链霉亲和素突变蛋白的肽配体相互作用可逆地结合，如WO 2015/164675中所述，所述专利通过引用以其整体特此并入。此类磁珠的例子是
Figure BDA0003008592730000701
在一些实施方案中，分离和/或步骤使用磁珠来进行，如可从Miltenyi Biotec商业购得的那些磁珠。
在一些实施方案中，对来自样品的CD4+和CD8+细胞的第一选择或富集是使用基于免疫亲和力的试剂来进行，所述试剂至少分别包括第一和第二亲和色谱基质，所述基质上固定有抗体。在一些实施方案中，第一选择和/或第二选择中的一个或两个可以采用多种亲和色谱基质和/或抗体，借此将用于相同选择(即第一选择或第二选择)的所述多种基质和/或抗体串联连接。在一些实施方案中，第一选择和/或第二选择中采用的一种或多种亲和色谱基质吸附或者能够选择或富集至少约50x106个细胞/mL、100x106个细胞/mL、200x106个细胞/mL或400x106个细胞/mL。在一些实施方案中，可以基于柱的直径和/或长度来调节吸附能力。在一些实施方案中，所选择或富集的群体的培养启动比率是通过以下方式来实现：假定基于例如用于选择细胞的一个或多个柱的吸附能力，选择足量基质和/或足够相对量以达到所述培养启动比率。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着至细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，颗粒保持附着至用于施用至患者的细胞。在一些实施方案中，从细胞去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性未标记抗体、可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，所述分离和/或选择得到富集的T细胞，例如，CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的一个或多个群体。在一些实施方案中，从单一生物样品分离、选择、富集或获得富集的T细胞的两个或更多个单独群体。在一些实施方案中，从自同一受试者收集、获取和/或获得的单独生物样品分离、选择、富集和/或获得单独群体。
在某些实施方案中，所述分离和/或选择得到富集的T细胞的一个或多个群体，所述群体包括至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或者为或为约100％的CD3+T细胞。在特定实施方案中，富集的T细胞的群体基本上由CD3+T细胞组成。
在某些实施方案中，所述分离和/或富集得到富集的CD4+T细胞的群体，所述群体包括至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或者为或为约100％的CD4+T细胞。在某些实施方案中，CD4+T细胞的输入群体包括小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。在一些实施方案中，富集的T细胞的群体基本上由CD4+T细胞组成。
在某些实施方案中，所述分离和/或富集得到富集的CD8+T细胞的群体，所述群体包括至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或者为或为约100％的CD8+T细胞。在某些实施方案中，CD8+T细胞的群体含有小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。在一些实施方案中，富集的T细胞的群体基本上由CD8+T细胞组成。
在一些实施方案中，在分离、选择和/或富集之后，将富集的T细胞的一个或多个群体冷冻，例如，冷冻保存和/或冷冻保护。在特定实施方案中，在分离、选择和/或富集之后，将富集的CD3+T细胞的群体冷冻，例如，冷冻保存和/或冷冻保护。在特定实施方案中，在分离、选择和/或富集之后，将富集的CD4+T细胞的群体冷冻，例如，冷冻保存和/或冷冻保护。在某些实施方案中，在分离、选择和/或富集之后，将富集的CD8+T细胞的群体冷冻，例如，冷冻保存和/或冷冻保护。在一些实施方案中，在孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染、培育、扩增、收获和/或配制细胞群的任何步骤之前，将富集的T细胞的一个或多个群体冷冻，例如，冷冻保存和/或冷冻保护。在特定实施方案中，在孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染、培育、扩增、收获和/或配制细胞群的任何步骤之前，将富集的CD3+T细胞的群体冷冻，例如，冷冻保存和/或冷冻保护。在特定实施方案中，在孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染、培育、扩增、收获和/或配制细胞群的任何步骤之前，将富集的CD4+T细胞的群体冷冻，例如，冷冻保存和/或冷冻保护。在一些实施方案中，在孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染、培育、扩增、收获和/或配制细胞群的任何步骤之前，将富集的CD8+T细胞的群体冷冻，例如，冷冻保存和/或冷冻保护。在一些实施方案中，在激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获和/或配制细胞群的任何步骤之前，将富集的T细胞的一个或多个群体，如富集的CD3+T细胞的群体冷冻，例如，冷冻保存和/或冷冻保护。在一些实施方案中，在激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获和/或配制细胞群的任何步骤之前，将富集的T细胞的一个或多个群体，如富集的CD4+T细胞和/或富集的CD8+细胞的群体冷冻，例如，冷冻保存和/或冷冻保护。在特定实施方案中，将一个或多个冷冻保护的输入群体例如在或在约-80℃下储存12小时与7天之间、24小时与120小时之间或2天与5天之间。在特定实施方案中，将一个或多个冷冻保护的输入群体在或在约-80℃下储存少于10天、9天、8天、7天、6天、或5天、4天、3天、2天、或1天的时间量。在一些实施方案中，将一个或多个冷冻保护的输入群体在或在约-70℃或-80℃下储存少于3天，如储存约2天。
a.选择剂或选择试剂
在某些方面，本文所提供的方法采用选择剂。在一些实施方案中，所述药剂是选择试剂。在一些实施方案中，所述选择剂与细胞表面上的分子如细胞表面分子结合。在一些情况下，细胞表面分子是选择标记。在一些实施方案中，所述选择剂能够与样品中的一种或多种细胞表达的选择标记特异性结合。
在一些实施方案中，细胞(例如靶细胞，例如，T细胞)在细胞表面上具有或表达分子，例如，选择标记，使得通过至少一种共有特异性分子的存在来限定要选择的细胞。在一些实施方案中，含有靶细胞的样品也可以含有缺乏所述分子(例如，选择标记)的另外的细胞。例如，在一些实施方案中，T细胞可以选自含有多个细胞类型(例如，红细胞或B细胞)的样品。
在一些方面，细胞表面分子(例如，选择标记)可以是限定所需细胞群或亚群的抗原，例如血细胞的群体或亚群，例如淋巴细胞(例如T细胞、T辅助细胞，例如，CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T辅助细胞，B细胞或自然杀伤细胞)、单核细胞或干细胞，例如，CD34阳性外周干细胞或者表达Nanog或Oct-4的干细胞。在一些实施方案中，所述选择标记可以是在T细胞或T细胞的子集的表面上表达的标记，如CD25、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA和/或CD45RO。T细胞的例子包括诸如以下的细胞：CMV特异性CD8+T-淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节T细胞(Treg)。Treg的说明性例子包括CD4 CD25 CD45RATreg细胞，并且记忆T细胞的说明性例子包括CD62L CD8+特异性中枢记忆T细胞。
在一些实施方案中，所述选择标记可以是CD4，并且选择剂特异性结合CD4。在一些方面，特异性结合CD4的选择剂可以选自抗CD4抗体、抗CD4抗体的二价抗体片段、抗CD4抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质性CD4结合分子。在一些实施方案中，抗CD4抗体如二价抗体片段或单价抗体片段(例如CD4 Fab片段)可以源自抗体13B8.2或13B8.2的保留与CD4的特异性结合的功能活性突变体。例如，抗体13B8.2的示例性突变体或m13B8.2描述于以下文献中：美国专利号7,482,000、美国专利申请号US2014/0295458或国际专利申请号WO2013/124474；以及Bes,C等人J Biol Chem 278,14265-14273(2003)。名为“ml3B8.2”的突变体Fab片段携带CD4结合鼠抗体13B8.2的可变结构域，以及含有重链的γ型恒定人CH1结构域和κ型恒定人轻链结构域的恒定结构域，如美国专利7,482,000中所述。在一些实施方案中，所述抗CD4抗体例如抗体13B8.2的突变体含有可变轻链中的氨基酸替代H91A、可变轻链中的氨基酸替代Y92A、可变重链中的氨基酸替代H35A和/或可变重链中的氨基酸替代R53A，其各自通过Kabat编号。在一些方面，与ml3B8.2中13B8.2 Fab片段的可变结构域相比，轻链中位置91(SEQ ID NO:102中的位置93)的His残基突变为Ala，并且重链中位置53(SEQ ID NO:101中的位置55)的Arg残基突变为Ala。在一些实施方案中，与抗CD4或其片段可逆结合的试剂可商业购自或源自可商业购得的试剂(例如目录号6-8000-206或6-8000-205或6-8002-100；IBA GmbH，哥廷根，德国)。在一些实施方案中，所述选择剂包含抗CD4 Fab片段。在一些实施方案中，所述抗CD4 Fab片段包含具有SEQ ID NO:101所示序列的可变重链和具有SEQ ID NO:102所示序列的可变轻链。在一些实施方案中，所述抗CD4 Fab片段包含具有SEQ ID NO:101所示序列的可变重链的CDR和具有SEQ ID NO:102所示序列的可变轻链的CDR。
在一些实施方案中，所述选择标记可以是CD8，并且选择剂特异性结合CD8。在一些方面，特异性结合CD8的选择剂可以选自抗CD8抗体、抗CD8抗体的二价抗体片段、抗CD8抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质性CD8结合分子。在一些实施方案中，抗CD8抗体如二价抗体片段或单价抗体片段(例如CD8 Fab片段)可以源自抗体OKT8(例如ATCCCRL-8014)或其保留与CD8的特异性结合的功能活性突变体。在一些实施方案中，与抗CD8或其片段可逆结合的试剂可商业购自或源自可商业购得的试剂(例如目录号6-8003或6-8000-201；IBA GmbH，哥廷根，德国)。在一些实施方案中，所述选择剂包含抗CD8 Fab片段。在一些实施方案中，所述抗CD8 Fab片段包含具有SEQ ID NO:104所示序列的可变重链和具有SEQ ID NO:105所示序列的可变轻链。在一些实施方案中，所述抗CD8 Fab片段包含具有SEQ ID NO:104所示序列的可变重链的CDR和具有SEQ ID NO:105所示序列的可变轻链的CDR。
在一些实施方案中，所述选择标记可以是CD3，并且选择剂特异性结合CD3。在一些方面，特异性结合CD3的选择剂可以选自抗CD3抗体、抗CD3抗体的二价抗体片段、抗CD3抗体的单价抗体片段和具有抗体样结合特性的蛋白质性CD3结合分子。在一些实施方案中，抗CD3抗体如二价抗体片段或单价抗体片段(例如CD3 Fab片段)可以源自抗体OKT3(例如ATCCCRL-8001；参见例如，Stemberger等人PLoS One.2012；7(4):e35798)或其保留与CD3的特异性结合的功能活性突变体。在一些实施方案中，与抗CD3或其片段可逆结合的试剂可商业购自或源自可商业购得的试剂(例如目录号6-8000-201、6-8001-100；IBA GmbH，哥廷根，德国)。在一些实施方案中，所述选择剂包含抗CD3 Fab片段。在一些实施方案中，所述抗CD3Fab片段包含具有SEQ ID NO:89所示序列的可变重链和具有SEQ ID NO:90所示序列的可变轻链。在一些实施方案中，所述抗CD3 Fab片段包含具有SEQ ID NO:89所示序列的可变重链的CDR和具有SEQ ID NO:90所示序列的可变轻链的CDR。
在任何上文例子中，二价抗体片段可以是(Fab)2'片段或二价单链Fv片段，而单价抗体片段可以选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。在任何上文例子中，具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子可以是适体、基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白、glubody、基于锚蛋白支架的蛋白质、基于结晶支架的蛋白质、adnectin和avimer。
2.通过色谱进行的T细胞选择
在一些实施方案中，细胞例如T细胞是通过色谱分离来分离、选择或富集，如通过柱色谱(包括亲和色谱或凝胶渗透色谱)进行。在一些实施方案中，所述方法采用与位于靶细胞(例如，要分离、选择或富集的细胞)表面上的受体分子结合的受体结合试剂。此类方法可被描述为(无痕)细胞亲和色谱技术(CATCH)，并且可以包括PCT申请号WO 2013124474和WO 2015164675中所述的任何方法或技术，所述申请通过引用以其整体特此并入。
在一些实施方案中，所述细胞(例如，靶细胞)在细胞表面上具有或表达受体分子，使得通过至少一种共有特异性受体分子的存在来限定要分离、选择或富集的细胞。在一些实施方案中，含有靶细胞的样品也可以含有缺乏所述受体分子的另外的细胞。例如，在一些实施方案中，T细胞是从含有多个细胞类型(例如，红细胞或B细胞)的样品分离、富集和/或选择。
在一些实施方案中，所述选择剂包含于色谱柱中，例如，直接或间接结合至色谱基质(例如，固定相)。在一些实施方案中，在将样品添加至柱时，所述选择剂存在于色谱基质(例如，固定相)上。在一些实施方案中，所述选择剂能够经由试剂例如选择试剂被间接结合至色谱基质(例如，固定相)。在一些实施方案中，所述选择试剂共价或非共价结合至柱的固定相。在一些实施方案中，所述选择试剂可逆地固定在色谱基质(例如，固定相)上。在一些情况下，所述选择试剂经由共价键固定在色谱基质(例如，固定相)上。在一些方面，所述选择试剂非共价地可逆地固定在色谱基质(例如，固定相)上。
在一些方面，将选择剂添加至样品。在一些方面，将受体结合试剂添加至样品。在某些实施方案中，所述受体结合试剂具有结合位点B，所述结合位点B与细胞(例如，靶细胞)表面上的受体分子(例如，CD3、CD4和/或CD8)特异性结合。在一些方面，受体结合试剂还包括结合配偶体C，其可以与选择剂如亲和力试剂的结合位点Z特异性可逆结合。
在某些方面，亲和力试剂还可以含有两个或更多个可以由结合配偶体C结合的结合位点Z，从而提供受体结合试剂的多聚化。本文所用的该亲和力试剂因此也可以是多聚化试剂。亲和力试剂可以例如是链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突变蛋白或其混合物。在一些方面，不同色谱基质与不同亲和力试剂偶联，并且可以在柱中分层，从而形成用于分离的多组分系统。
在某些实施方案中，将样品(例如，含有细胞和受体结合试剂的样品)加载至色谱基质上或与色谱基质接触，所述色谱基质含有附着的或固定的亲和力试剂。在特定方面，亲和力试剂具有多个结合位点Z，所述结合位点Z与受体结合试剂的结合配偶体C特异性结合。在某些方面，受体结合试剂通过结合配偶体C与结合位点Z之间的相互作用与亲和力试剂结合。因此，在一些实施方案中，细胞(例如，靶细胞)经由复合物固定在色谱基质上，所述复合物是由亲和力试剂的一个或多个结合位点Z和受体结合试剂的结合配偶体C形成的。在其他方面，细胞(例如，靶细胞)可以从样品耗尽，如通过从色谱基质冲洗、释放或洗涤剩余样品来进行。在特定方面，如在将所述样品添加至色谱基质之前，受体结合试剂可以被包括在含有细胞的样品中，或者可以将其施加至或接触色谱基质以供与附着的亲和力或多聚化试剂结合。
在一些方面，随后将竞争试剂加载至色谱柱上。在特定实施方案中，所述竞争试剂具有结合位点，所述结合位点能够与亲和力试剂的结合位点Z结合。在某些实施方案中，所述竞争试剂与亲和力试剂形成复合物，并且由此固定在色谱基质上。作为该竞争性结合的结果，受体结合试剂与亲和力试剂之间在结合配偶体C和结合位点Z的结合被置换。在特定实施方案中，将竞争试剂添加或加载至具有附着的复合物(其含有亲和力试剂、受体结合试剂和细胞(例如，靶细胞))的色谱基质，将所述细胞从色谱基质洗脱。在一些方面，受体结合试剂在结合位点B处对细胞的受体分子具有低亲和力，使得受体结合试剂在竞争试剂的存在下从细胞解离。因此，在一些实施方案中，从不含或基本上不含结合的受体结合分子的色谱基质洗脱细胞，例如靶细胞。
在一些实施方案中，在将样品添加至色谱柱(例如，固定相)时，所述选择剂可以存在(例如，直接结合至(例如，共价或非共价)或经由选择试剂间接结合)于色谱基质(例如，固定相)上。因此，在添加样品后，靶细胞可以被选择剂结合并固定在柱的色谱基质(例如，固定相)上。可替代地，在一些实施方案中，可以将选择剂添加至样品。按这种方式，选择剂与样品中的靶细胞(例如，T细胞)结合，然后可以将样品添加至包含选择试剂的色谱基质(例如，固定相)，其中已经与靶细胞结合的选择剂与选择试剂结合，从而将靶细胞固定在色谱基质(例如，固定相)上。在一些实施方案中，所述选择剂经由包含于选择剂中的如本文所述的结合配偶体C与如本文所述的选择试剂结合。
在一些实施方案中，两种或更多种选择剂如经由存在于选择试剂上的一个或多个结合位点Z与所述选择试剂缔合(如可逆或不可逆地结合)。在一些情况下，这导致选择剂彼此靠近排列，使得如果使具有(至少两个拷贝的)细胞表面分子(例如，选择标记)的靶细胞与能够结合特定分子(例如，选择标记)的选择剂接触，则可以发生亲合力效应。
在一些实施方案中，相同的(即具有相同的选择标记结合特异性)的两种或更多种不同选择剂可以可逆地结合至选择试剂。在一些实施方案中，可以使用至少两种不同选择剂，并且在一些情况下，可以使用结合至不同选择标记的三种或四种不同选择剂。在一些方面，所述至少两种选择剂中的每一种可以结合至不同分子(例如，选择标记)，如第一分子、第二分子等。在一些情况下，不同分子(例如，选择标记)如细胞表面分子可以存在于相同靶细胞上。在其他情况下，不同分子(例如，选择标记)如细胞表面分子可以存在于在同一细胞群中存在的不同靶细胞上。在一些情况下，第三、第四等选择剂可以与相同试剂缔合，其各自含有另一不同结合位点。
在一些实施方案中，所述两种或更多种不同选择剂含有相同的结合配偶体C。在一些实施方案中，所述两种或更多种不同选择剂含有不同的结合配偶体。在一些方面，第一选择剂可以具有结合配偶体C1，所述结合配偶体C1可以与存在于选择试剂上的结合位点Z1特异性结合，并且第二选择剂可以具有结合配偶体C2，所述结合配偶体C2可以与存在于选择试剂上的结合位点Z1或结合位点Z2特异性结合。因此，在一些情况下，选择试剂包含的多个结合位点Z包括结合位点Z1和Z2，它们分别能够可逆地结合至选择剂包含的结合配偶体C1和C2。在一些实施方案中，C1和C2相同，和/或Z1和Z2相同。在其他方面，多个结合位点Z中的一个或多个可以是不同的。在其他情况下，多个结合配偶体C中的一个或多个可以是不同的。熟练技术人员可以熟练地选择与含有结合位点Z的选择试剂相容的不同结合配偶体C的任何组合，只要每个结合配偶体C能够与结合位点Z之一相互作用(如特异性结合)。
在一些实施方案中，在结合配偶体C与结合位点Z之间形成的可逆键可能被竞争剂和/或游离结合剂破坏。在一些实施方案中，竞争剂和/或游离结合剂可以是生物素、生物素衍生物或类似物或者链霉亲和素结合肽，其能够与结合配偶体C竞争结合一个或多个结合位点Z。在一些实施方案中，结合配偶体C与竞争剂和/或游离结合剂是不同的，并且竞争剂和/或游离结合剂展现与结合配偶体的亲和力相比更高的对一个或多个结合位点Z的结合亲和力。在本文所提供的任何方法的特定方面，将竞争剂和/或游离结合剂添加至色谱柱的固定相以破坏选择剂与选择试剂的结合并不是使靶细胞(例如，T细胞)从色谱基质(例如，固定相)脱离所需的。
在一些实施方案中，样品的细胞(例如，靶细胞)可以从样品耗尽，如通过从色谱基质(例如，固定相)冲洗、释放或洗涤剩余样品来进行。在一些实施方案中，使用一个或多个(例如，2、3、4、5、6)个洗涤步骤从色谱基质(例如，固定相)去除未结合的细胞和碎片。在一些实施方案中，在进行一个或多个洗涤步骤之前，允许样品将基质渗透至少或约5、10、16、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100或120分钟。
在一些实施方案中，从第一色谱柱的洗脱物收集洗脱样品，其包括细胞(例如，靶细胞)、竞争试剂和受体结合试剂。在某些实施方案中，将洗脱样品加载至第二色谱柱上，所述第二色谱柱具有合适的固定相，所述固定相既是亲和色谱基质，同时也可以用作凝胶渗透基质。在特定实施方案中，所述亲和色谱基质上固定有亲和力试剂。在一些方面，受体结合试剂和竞争试剂结合至亲和力试剂上的结合位点Z，并由此固定在色谱基质上。因此，在某些方面，含有分离的靶细胞的洗脱样品耗尽了受体结合试剂和竞争试剂。因此，在一些方面，不含任何反应物的靶细胞现在处于用于进一步使用的条件中，例如，用于通过本文所述的任何方法进行处理。
在一些实施方案中，进行多轮细胞选择步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一选择步骤，如后续阳性或阴性选择。在某些实施方案中，用于选择、分离和富集的方法、技术和试剂描述于例如PCT申请号WO 2015164675中，所述申请通过引用以其整体特此并入。
在一些实施方案中，可以使用单一选择步骤从样品分离靶细胞(例如，CD3+T细胞)。在一些实施方案中，所述单一选择步骤可以在单一色谱柱上进行。在一些例子中，单一选择步骤可以耗尽同时表达多种标记的细胞。同样，可以同时对多种细胞类型进行阳性选择。在某些实施方案中，将选择步骤重复进行和/或进行多于一次，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受相同的选择步骤，如重复的阳性或阴性选择。在一些例子中，将单一选择步骤重复进行和/或进行多于一次，例如以增加所选细胞的纯度和/或从阴性选择的级分进一步去除和/或耗尽阴性选择的细胞。在某些实施方案中，将一个或多个选择步骤进行两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或超过十次。在某些实施方案中，将一个或多个选择步骤进行和/或重复一次与十次之间、一次与五次之间或三次与五次之间。
细胞选择可以使用一个或多个色谱柱来进行。在一些实施方案中，一个或多个色谱柱包括在封闭系统中。在一些实施方案中，所述封闭系统是自动化封闭系统，例如需要最少或不需要用户(例如，人)输入。在一些实施方案中，细胞选择是依序进行(例如，顺序选择技术)。在一些实施方案中，一个或多个色谱柱是依序排列。例如，第一柱的定向可以使得可以将所述柱的输出(例如，洗脱液)例如经由连接管道进给至第二色谱柱。在一些实施方案中，多个色谱柱可以依序排列。在一些实施方案中，细胞选择可以通过进行连续阳性和阴性选择步骤来实现，后一步骤使来自前一步骤的阴性和/或阳性级分经受进一步选择，其中整个过程在同一管或管道组中进行。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中实现第一选择以富集CD4+或CD8+群体中的一种，并且使用来自第一选择的未选择细胞作为第二选择的细胞来源，用于富集CD4+或CD8+群体中的另一种。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD4+或CD8+群体中的一种或两种的亚群，例如，中枢记忆T(TCM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中实现第一选择以富集CD3+群体，并且使用所选细胞作为第二选择的细胞来源，用于富集CD3+群体。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中在第一固定相上(例如，在第一色谱柱中)实现第一选择以富集CD3+群体，并且使用含有未结合细胞的流出物作为第二选择的细胞来源，用于在第二固定相上(例如，在第二色谱柱中)富集CD3+群体，其中所述第一和第二固定相依序排列。在一些实施方案中，所述选择是针对CD3+T细胞的阳性选择(例如，通过使用与细胞表面CD3特异性结合的抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+群体的亚群，例如，中枢记忆T(TCM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中实现第一选择以富集CD3+群体，并且使用所选细胞作为第二选择的细胞来源，用于富集CD4+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+CD4+群体的亚群，例如，中枢记忆T(TCM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中实现第一选择以富集CD3+群体，并且使用所选细胞作为第二选择的细胞来源，用于富集CD8+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+CD8+群体的亚群，例如，中枢记忆T(TCM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。考虑到在一些方面，T细胞的特定亚群(例如，CD3+细胞)，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)，是通过阳性或阴性顺序选择技术来选择。在一些实施方案中，细胞选择是平行进行(例如，平行选择技术)。在一些实施方案中，一个或多个色谱柱是平行排列。例如，两个或更多个柱的排列可以使得将样品经由管道同时加载至两个或更多个柱上，所述管道允许将样品施加至每个柱，而无需样品穿过第一柱。例如，使用平行选择技术，细胞选择可以通过例如在封闭系统中同时进行阳性和/或阴性选择步骤来实现，其中整个过程在同一管或管道组中进行。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受平行选择，其中将样品加载至两个或更多个色谱柱上，其中每个柱实现细胞群的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱单独实现CD3+、CD4+或CD8+群体的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱(包括亲和色谱或凝胶渗透色谱)独立实现相同细胞群的选择。例如，两个或更多个色谱柱可以实现CD3+细胞的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱(包括亲和色谱或凝胶渗透色谱)独立实现不同细胞群的选择。例如，两个或更多个色谱柱可以独立地实现CD3+细胞、CD4+细胞和CD8+细胞的选择。在一些实施方案中，可以例如使用顺序选择技术实现一次或多次进一步选择，以富集经由平行选择而选择的一个或所有细胞群的亚群。例如，可以针对中枢记忆T(TCM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞，进一步选择所选细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受平行选择，其中在两个或更多个柱上实现平行选择以富集CD3+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+群体的亚群，例如，中枢记忆T(TCM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受平行选择，其中在两个或更多个柱上独立地实现选择以富集CD3+群体和CD4+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+和CD4+群体的亚群，例如，中枢记忆T(TCM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受平行选择，其中实现平行选择以富集CD3+群体和CD8+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+和CD8+群体的亚群，例如，中枢记忆T(TCM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受平行选择，其中实现平行选择以富集CD4+群体和CD8+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD4+和CD8+群体的亚群，例如，中枢记忆T(TCM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。考虑到在一些方面，通过阳性或阴性平行选择技术来选择T细胞的特定亚群(例如，CD3+、CD4+、CD8+T细胞)，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞，例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。在一些实施方案中，顺序和平行选择技术可以组合使用。
通常，固定相(例如，选择树脂)的结合能力影响需要多少固定相来选择某个数量的靶部分，例如，靶细胞，如T细胞。可以使用结合能力(例如，每mL固定相(例如，选择树脂)可以固定的靶细胞的数量)来确定或控制在一个或多个柱上捕获的靶细胞的数量。可以使用一个或多个色谱柱进行本文公开的柱上细胞选择和刺激。在使用多个柱时，它们可以依序、平行或以其合适的组合来排列。因此，可以使用固定相(例如，选择树脂)的结合能力来标准化单柱方法中的试剂量或多柱方法中每个柱的试剂量。
在一些实施方案中，本文所用固定相的结合能力是在将过量靶细胞加载至固定相上时，在给定的溶剂和细胞浓度条件下，与固定相结合的靶细胞(例如，CD3+T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞)的最大数量。在一个方面，本文用于柱上细胞选择和刺激的固定相的结合能力是静态结合能力。在一些实施方案中，本文公开的固定相(例如，选择树脂)的静态结合能力的范围是每mL固定相在约5000万个与约1亿个之间的靶细胞。在一些实施方案中，固定相(例如，选择树脂)的静态结合能力是每mL固定相在约1000万与约2000万之间、在约2000万与约3000万之间、在约3000万与约4000万之间、在约4000万与约5000万之间、在约5000万与约6000万之间、在约6000万与约7000万之间、在约7000万与约8000万之间、在约8000万与约9000万之间、在约9000万与约1亿之间、在约1亿1000万与约1亿2000万之间、在约1亿2000万与约1亿3000万之间、在约1亿3000万与约1亿4000万之间、在约1亿4000万与约1亿5000万之间、在约1亿5000万与约1亿6000万之间、在约1亿6000万与约1亿7000万之间、在约1亿7000万与约1亿8000万之间、在约1亿8000万与约1亿9000万之间、或在约1亿9000万与约2亿之间的细胞。
在一些实施方案中，本文所用固定相的结合能力是在未结合靶细胞发生显著突破之前，在给定流动条件下与固定相结合的靶细胞(例如，CD3+T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞)的数量。在一个方面，本文用于柱上细胞选择和刺激的固定相的结合能力是动态结合能力，即，在样品应用期间，在填充色谱柱中，在操作条件下的结合能力。在一些实施方案中，动态结合能力是通过以下方式来确定：加载含有已知浓度的靶细胞的样品，并监测流出物，并且靶细胞将结合固定相至某个转折点(break point)，之后未结合靶细胞将流出柱。在一些实施方案中，本文公开的固定相(例如，选择树脂)的动态结合能力的范围是每mL固定相在约5000万个与约1亿个之间的靶细胞。在一些实施方案中，固定相(例如，选择树脂)的动态结合能力是每mL固定相在约1000万与约2000万之间、在约2000万与约3000万之间、在约3000万与约4000万之间、在约4000万与约5000万之间、在约5000万与约6000万之间、在约6000万与约7000万之间、在约7000万与约8000万之间、在约8000万与约9000万之间、在约9000万与约1亿之间、在约1亿1000万与约1亿2000万之间、在约1亿2000万与约1亿3000万之间、在约1亿3000万与约1亿4000万之间、在约1亿4000万与约1亿5000万之间、在约1亿5000万与约1亿6000万之间、在约1亿6000万与约1亿7000万之间、在约1亿7000万与约1亿8000万之间、在约1亿8000万与约1亿9000万之间、或在约1亿9000万与约2亿之间的靶细胞。
通常，色谱是流体色谱，通常是液相色谱。在一些方面，色谱可以以流通模式进行，其中在柱的含有色谱基质的一端上例如通过重力流动或通过泵施加含有细胞(例如，靶细胞)的流体样品，并且其中流体样品在柱的另一端存在柱。另外，色谱可以以“上下(up anddown)”模式进行，其中在柱的含有填充在移液管尖端内的色谱基质的一端上例如通过移液管施加含有要分离的细胞的流体样品，并且其中流体样品在柱的另一端进入并存在色谱基质/移液管尖端。可替代地，色谱还可以以分批模式进行，其中将色谱材料(固定相)与含有细胞的样品例如在振荡、旋转或流体样品的重复接触和去除(例如借助移液管)下一起孵育。
在一些方面，在本发明的背景下可以将任何材料用作色谱基质，只要所述材料适合于细胞的色谱分离。在特定方面，合适的色谱材料是至少无害的或基本上无害的，例如，当在用于细胞分离和/或细胞分开的所需条件下在填充色谱柱中使用时，对细胞活力无害。在一些方面，色谱基质保持在预定位置，通常在预定部位，而要分离的样品和其中包括的组分的位置发生改变。因此，在一些方面，色谱基质是“固定相”。
通常，相应色谱基质具有固相或半固相的形式，而含有要分离/分开的靶细胞的样品是流体相。用于实现色谱分离的流动相同样是流体相。色谱基质可以是颗粒材料(具有任何合适的大小和形状)或整体色谱材料，包括纸衬底或膜(参照实施例章节)。因此，色谱可以是柱色谱以及平面色谱两者。除了标准色谱柱以外，允许双向流动或移液管尖端的柱可以用于如本文所述的细胞的基于柱/基于流通模式的色谱分离。在一些方面，使用颗粒基质材料，并且颗粒基质材料可以例如具有约5μm至约200μm、或约5μm至约400μm、或约5μm至约600μm的平均粒径。在一些方面，使用平面色谱，并且基质材料可以是适合于平面色谱的任何材料，如常规的基于纤维素的或基于有机聚合物的膜(例如，纸膜、硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)或二氧化硅涂布的玻璃板。
在一些方面，色谱基质/固定相是无磁性材料或不可磁化材料。这种材料可以包括衍生的二氧化硅或交联的凝胶。交联的凝胶(其通常以珠形式来制造)可以基于天然聚合物，如交联的多糖。合适的例子包括但不限于琼脂糖凝胶或者一种或多种交联葡聚糖的凝胶。交联的凝胶也可以基于合成聚合物，即基于在自然界中不存在的聚合物类别。通常，用于细胞分离的色谱固定相所基于的这种合成聚合物是具有极性单体单元，且因此本身具有极性的聚合物。
合适的合成聚合物的说明性例子是聚丙烯酰胺、苯乙烯-二乙烯基苯凝胶、以及丙烯酸酯和二醇的共聚物或丙烯酰胺和二醇的共聚物。说明性例子是聚甲基丙烯酸酯凝胶，可作为
Figure BDA0003008592730000851
商业购得。另外的例子是乙二醇与甲基丙烯酸酯的共聚物，可作为
Figure BDA0003008592730000852
商业购得。在一些实施方案中，色谱固定相还可以包括天然和合成聚合物组分，如多糖与琼脂糖的复合物基质或复合物或共聚物(例如聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物)或多糖与N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的复合物基质或复合物或共聚物。葡聚糖与N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物的说明性例子是上文所提及的
Figure BDA0003008592730000853
系列材料。衍生的二氧化硅可以包括与合成或天然聚合物偶联的二氧化硅颗粒。此类实施方案的例子包括但不限于多糖接枝的二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮接枝的二氧化硅、聚氧化乙烯接枝的二氧化硅、聚(2-羟乙基天冬酰胺)二氧化硅和聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝的二氧化硅。
在一些实施方案中，例如在用于如本文所述的去除罐中时，本发明中采用的色谱基质是凝胶过滤(也称为尺寸排阻)基质。凝胶过滤的特征可以在于如下特性：其被设计为至少基本上不经历与要分离的细胞的相互作用。因此，凝胶过滤基质允许主要基于其大小来分离细胞或如本文所定义的其他生物学实体。相应色谱基质通常是如上文所提及的颗粒多孔材料。色谱基质可以具有一定的排阻极限，其通常依据一个分子量来定义，高于所述分子量的分子完全不能进入孔中。限定尺寸排阻极限的相应分子量可以选择为低于与要分离的靶细胞(或生物学实体)的重量对应的重量。在这种实施方案中，防止靶细胞进入尺寸排阻色谱基质的孔中。同样，作为亲和色谱基质的固定相可以具有孔，所述孔的大小小于所选靶细胞的大小。在说明性实施方案中，亲和色谱基质和/或凝胶过滤基质的平均孔径为0至约500nm。
样品中存在的其他组分如受体结合分子或竞争试剂的大小可以低于孔的排阻极限，并且这可以进入尺寸排阻色谱基质的孔中。在能够部分或完全进入孔体积中的此类组分中，较少进入孔体积中的较大分子通常将首先洗脱，而最小的分子最后洗脱。在一些实施方案中，尺寸排阻色谱基质的排阻极限被选择为低于靶细胞的最大宽度。因此，可进入孔体积中的组分通常将在尺寸排阻色谱基质中/上保持比靶细胞更长的时间。因此，可以在色谱柱的洗脱物中与样品的其他物质/组分分开收集靶细胞。因此，组分如受体结合试剂或(适用时)竞争试剂从凝胶过滤基质洗脱的时间点晚于靶细胞。如果凝胶渗透基质包含亲和力试剂(通常共价结合在所述基质上)，所述亲和力试剂包含能够结合样品中存在的试剂如受体结合试剂和/或竞争试剂的结合位点，例如结合位点Z，则这种分离作用将被进一步增强。受体结合试剂和/或竞争试剂将由亲和力试剂的结合位点Z结合，并由此固定在凝胶渗透基质上。这种方法通常在如本发明所用的去除罐中进行，并且在一些实施方案中，根据本发明的方法、组合和试剂盒包括和/或采用这种凝胶过滤基质。在相应方法中，因此基于大小来分离细胞。
本发明采用的色谱基质还可以包括磁性可吸引的物质，如一种或多种磁性可吸引的颗粒或铁磁流体。相应的磁性可吸引的颗粒可以包含多聚化试剂或亲和力试剂，其具有能够结合靶细胞的结合位点。磁性可吸引的颗粒可以含有反磁性、强磁性、顺磁性或超顺磁性材料。超顺磁性材料响应于磁场，其感应磁场不会导致永久磁化。仅举几例，基于氧化铁的磁性颗粒例如可以以
Figure BDA0003008592730000861
从Dynal Biotech商业购得，作为磁性微珠从Miltenyi Biotec商业购得，作为磁性多孔玻璃珠从CPG Inc.商业购得，以及从多个其他来源商业购得，如Roche Applied Science、BIOCLON、BioSource Interna tional Inc.、micromod、AMBION、Merck、Bangs Laboratories、Polyscience s或Novagen Inc.。基于超顺磁性Co和FeCo以及强磁性Co纳米晶体的磁性纳米颗粒已经例如由Hütten,A.等人描述(J.Biotech.(2004),112,47-63)。然而，在一些实施方案中，本发明采用的色谱基质没有任何磁性可吸引的物质。
在一些实施方案中，位于细胞表面(例如，靶细胞表面)上的受体分子可以是任何分子，只要它在根据本发明的方法中的色谱分离过程期间保持与细胞表面的共价或非共价结合。受体分子是受体结合试剂可以指向的分子。在一些实施方案中，受体是肽或蛋白质，如膜受体蛋白。在一些实施方案中，受体是脂质、多糖或核酸。作为蛋白质的受体可以是外周膜蛋白或整合膜蛋白。在一些实施方案中，它可以具有一个或多个跨膜结构域。在某些实施方案中，受体分子是免疫细胞的表面蛋白，例如，CD3、CD4或CD8。在一些实施方案中，受体分子可以是限定所需细胞群或亚群的抗原，所述细胞群或亚群例如血细胞的群体或亚群，例如淋巴细胞(例如T细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞)。
在一些实施方案中，受体结合试剂具有或含有结合位点B。在某些实施方案中，所述结合位点B是单价的。在一些方面，单价结合位点B是或含有单价抗体片段或具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性结合分子、适体或MHC分子。单价抗体片段的例子包括但不限于Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)，包括二价单链Fv片段。(重组)抗体片段的例子是Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、二价抗体片段如(Fab)2'片段、双抗体、三抗体(Iliades,P.等人,FEBS Lett(1997)409,437-441)、十抗体(Stone,E.等人,Journal of ImmunologicalMethods(2007)318,88-94)和其他结构域抗体(Holt,L.J.等人,Trends Biotechnol.(2003),21,11,484-490)。在一些实施方案中，受体分子结合试剂的一个或多个结合位点可以是二价蛋白质性人工结合分子，如二聚脂质运载蛋白突变蛋白，也称为“双运载蛋白(duocalin)”。在一些实施方案中，受体结合试剂可以具有单一第二结合位点，即，其可以是单价的。单价受体结合试剂的例子包括但不限于单价抗体片段、具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子或MHC分子。
合适的蛋白质性结合分子的又其他例子是EGF样结构域、Kringle结构域、纤连蛋白I型结构域、纤连蛋白II型结构域、纤连蛋白III型结构域、PAN结构域、G1a结构域、SRCR结构域、Kunitz/牛胰腺胰蛋白酶抑制剂结构域、淀粉酶抑肽、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域、车轴草(P型)结构域、von Willebrand因子C型结构域、过敏毒素样结构域、CUB结构域、甲状腺球蛋白I型重复序列、LDL受体A类结构域、Sushi结构域、Link结构域、凝血酶敏感蛋白I型结构域、免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白样结构域(例如，结构域抗体或骆驼重链抗体)、C型凝集素结构域、MAM结构域、von Willebrand因子A型结构域、生长调节素B结构域、WAP型四二硫核心结构域、F5/8C型结构域、血液结合素结构域、SH2结构域、SH3结构域、层粘连蛋白型EGF样结构域、C2结构域、“κ体(Kappabody)”(参照Ill.等人,Protein Eng(1997)10,949-57)，所谓的“微型抗体”(Martin等人,EMBO J(1994)13,5303-5309)、双抗体(参照Holliger等人,PNAS USA(1993)90,6444-6448)、所谓的“Janusis”(参照Traunecker等人,EMBO J(1991)10,3655-3659，或Traunecker等人,Int J Cancer(1992)增刊7,51-52)、纳米抗体、微体、affilin、亲和体(affibody)、打结素(knottin)、泛素、锌指蛋白、自发荧光蛋白或富亮氨酸重复蛋白。具有抗体样功能的核酸分子的例子是适体。适体折叠为限定的三维基序，并显示对给定靶结构的高亲和力。
在特定方面，受体结合蛋白含有结合配偶体C。在一些方面，包括在受体结合试剂中的结合配偶体C可能例如是基于烃的(包括聚合的)，并且包括氮基团、磷基团、硫基团、卡宾基团、卤素基团或拟卤素基团。它可以是醇、有机酸、无机酸、胺、膦、硫醇、二硫化物、烷烃、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、核酸、脂质、糖、寡糖或多糖。作为其他例子，它也可能是阳离子、阴离子、聚阳离子、聚阴离子、聚阳离子、电解质、聚电解质、碳纳米管或碳纳米泡沫。通常，这种结合配偶体具有比其他物质更高的对多聚化试剂的结合位点的亲和力。相应结合配偶体的例子包括但不限于冠醚、免疫球蛋白、其片段和具有抗体样功能的蛋白质性结合分子。
在一些实施方案中，包括在受体结合试剂中的结合配偶体C包括生物素，并且亲和力试剂包括可逆地结合至生物素的链霉亲和素类似物或抗生物素蛋白类似物。在一些实施方案中，包括在受体结合试剂中的结合配偶体C包括可逆地结合至链霉亲和素或抗生物素蛋白的生物素类似物，并且亲和力试剂包括可逆地结合至相应生物素类似物的链霉亲和素、抗生物素蛋白、链霉亲和素类似物或抗生物素蛋白类似物。在一些实施方案中，包括在受体结合试剂中的结合配偶体C包括链霉亲和素结合肽或抗生物素蛋白结合肽，并且亲和力试剂包括可逆地结合至相应链霉亲和素结合肽或抗生物素蛋白结合肽的链霉亲和素、抗生物素蛋白、链霉亲和素类似物或抗生物素蛋白类似物。
在一些实施方案中，包括在受体结合试剂中的结合配偶体可以包括链霉亲和素结合肽。在一些实施方案中，肽序列含有具有通式His-Pro-Xaa的序列，其中Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，如含有SEQ ID NO:78所示的序列。在一些实施方案中，肽序列含有SEQ ID NO:93所示的序列。在一些实施方案中，肽序列具有SEQ ID NO:79所示的通式，如SEQ ID NO:69所示。在一个例子中，肽序列是Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(也称为
Figure BDA0003008592730000881
示于SEQ ID NO:70中)。在一个例子中，肽序列是Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(也称为
Figure BDA0003008592730000882
II，示于SEQ ID NO:64中)，其描述于例如美国专利6,103,493中，并且可以商标
Figure BDA0003008592730000883
商业购得。链霉亲和素结合肽可能例如是单肽，如例如美国专利5,506,121中所述的
Figure BDA0003008592730000891
或者具有依序排列的两个或更多个单独结合分子的链霉亲和素结合肽，如国际专利公开案WO 02/077018或美国专利7,981,632中所述。
在一些实施方案中，受体结合试剂的结合配偶体C包括熟练技术人员已知为亲和标签的部分。在这种实施方案中，亲和力试剂包括已知与亲和标签结合的相应结合配偶体，例如抗体或抗体片段。作为已知亲和标签的几个说明性例子，包括在受体结合试剂中的结合配偶体可以包括二硝基苯酚或地高辛配基、寡聚组氨酸、多组氨酸、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)或硫氧还蛋白、钙调蛋白结合肽(CBP)、FLAG'肽、HA标签(例如，SEQ ID NO:94)、VSV-G标签(例如，SEQ ID NO:95)、HSV标签(例如，SEQ ID NO:96)、T7表位(例如，SEQ ID NO:97)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、单纯疱疹病毒糖蛋白D的序列的HSV表位(例如，SEQ ID NO:98)、所述序列的转录因子c-myc的“myc”表位(例如，SEQ ID NO:99)、V5标签(例如，SEQ ID NO:100)或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。在这种实施方案中，在亲和力试剂(在该情况下是抗体或抗体片段)的一个或多个结合位点与抗原之间形成的复合物可以通过添加游离抗原(即，游离肽(表位标签)或游离蛋白(如MBP或CBP))而被竞争性地破坏。亲和标签也可以是寡核苷酸标签。这种寡核苷酸标签可以例如用于与具有互补序列的寡核苷酸杂交，连接至或包括于亲和力试剂中。
合适的结合配偶体C的其他例子包括但不限于凝集素、蛋白质A、蛋白质G、金属、金属离子、次氮基三乙酸衍生物(NT A)、RGD基序、葡聚糖、聚乙烯亚胺(PEI)、氧化还原聚合物、糖蛋白、适体、染料、直链淀粉、麦芽糖、纤维素、几丁质、谷胱甘肽、钙调蛋白、明胶、多粘菌素、肝素、NAD、NADP、赖氨酸、精氨酸、苯甲脒、聚U或寡聚dT。已知凝集素如伴刀豆凝集素A可结合至多糖和糖基化蛋白质。染料的说明性例子是三嗪染料(如汽巴蓝F3G-A(CB)或汽巴红HE-3B)，其特异性结合NADH依赖性酶。通常，Green A结合Co A蛋白、人血清白蛋白和脱氢酶。在一些情况下，染料7-氨基放线菌素D和4',6-二脒基-2-苯基吲哚结合至DNA。通常，金属如Ni、Cd、Zn、Co或Cu的阳离子通常用于结合亲和标签，如含有寡聚组氨酸的序列，包括六组氨酸或His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-C ys标签(MAT标签)(SEQ ID NO:103)，以及N-甲基丙烯酰基-(L)-半胱氨酸甲基酯。
根据以WO 2013/011011公开的国际专利申请PCT/EP2012/063969(其全部内容出于所有目的通过引用并入本文)，受体结合试剂与靶细胞上的受体分子之间的结合的强度可能并非靶细胞经由受体结合试剂与亲和力试剂结合的可逆性不需要的。相反，不论所述结合的强度如何，意味着不管受体结合试剂经由结合位点B与受体分子之间的结合的解离常数(Kd)具有低亲和力(例如，在约10-3至约10-7M的Kd范围内)或具有高亲和力(例如，在约10-7至约1x10-10M的Kd范围内)，靶细胞都可以可逆地染色，只要受体结合试剂经由结合位点B与受体分子的结合的解离发生得足够快。就此而言，受体结合试剂经由结合位点B与受体分子之间的结合的解离速率常数(k解离)可以具有约3×10-5sec-1或更大的值(该解离速率常数是表征在受体结合试剂的结合位点B与靶细胞表面上的受体分子之间形成的复合物的解离反应的常数)。受体结合试剂的结合位点B与靶细胞表面上的受体分子之间的缔合反应的缔合速率常数(k缔合)可以具有任何值。为了确保受体分子与受体结合试剂之间的结合足够可逆，有利地选择结合平衡的k解离值具有如下值：约3×10-5sec-1或更大、约5×10-5sec-1或更大，如或如约1×10-4sec-1或更大、5×10-4sec-1或更大、1×10-3sec-1或更大、5×10-3sec-1或更大、1×10-2sec-1或更大、1×10-1sec-1或更大、或者5×10-1sec-1或更大。此处应注意，如本文所用的动力学和热力学常数的值涉及大气压即1.013巴和室温即25℃的条件。
在一些实施方案中，受体结合试剂具有能够与受体分子特异性结合的单一(单价)结合位点B。在一些实施方案中，受体结合试剂具有能够与受体分子结合的至少两个(即，多个结合位点B，包括三个、四个或也包括五个相同的结合位点B)。在这些实施方案中的任一个中，受体分子经由一个或多个结合位点B(中的每一个)的结合的k解离值可能为约3×10- 5sec-1或更大。因此，受体结合试剂可以是单价的(例如单价抗体片段或单价人工结合分子(蛋白质性或其他)，如基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白(也称为
Figure BDA0003008592730000901
))，或二价分子，如其中保留两个结合位点的抗体或片段，如F(ab')2片段。在一些实施方案中，受体分子可以是多价分子，如五聚IgE分子，前提是k解离率为3×10-5sec-1或更大。
在本发明的一些实施方案中，在分子水平上，并非受体结合试剂经由至少结合位点B与靶细胞上的受体分子的结合的k解离率(3×10-5sec-1或更大)提供生物材料经由本文所述的可逆细胞亲和色谱技术的(无痕)分离。相反，并且如例如美国专利7,776,562或国际专利申请WO02/054065中所述，受体分子与结合受体结合试剂的结合位点B之间的低亲和力结合与经由固定的亲和力试剂介导的亲合力效应一起允许靶细胞的可逆无痕分离。在这些实施方案中，在亲和力试剂的两个或更多个结合位点Z与至少两种受体结合试剂的结合配偶体C之间可以形成复合物，从而允许靶细胞的可逆固定和随后从亲和色谱基质洗脱(经由添加竞争剂，所述竞争剂将破坏在结合配偶体C与结合位点Z之间形成的结合(复合物)，这又导致受体结合试剂从靶细胞解离)。如上文所提及，这种低结合亲和力的特征可能是受体结合试剂经由结合位点B与靶细胞表面上的受体分子的结合的解离常数(KD)在约1.0×10-3M至约1.0×10-7M范围内。
3.输入组合物
在某些实施方案中，所提供的方法与产生或制备细胞的输入群体或组合物结合使用。在某些实施方案中，输入细胞组合物包括用于基因工程化的细胞(例如，将进行基因工程化或将经历用于产生基因工程化细胞的过程的细胞)的群体。在某些实施方案中，所述细胞将用编码重组受体的核酸进行治疗，与所述核酸接触，或者与所述核酸一起孵育。在某些实施方案中，输入组合物含有T细胞、活T细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和/或其亚群。
在一些实施方案中，细胞活力是用如下测定来评估：其可以包括但不限于染料摄取测定(例如，钙黄绿素AM测定)、XTT细胞活力测定和染料排除测定(例如，锥虫蓝、伊红或丙啶染料排除测定)。在特定实施方案中，活细胞具有一种或多种细胞凋亡标记(例如，膜联蛋白V或活性半胱天冬酶3)的阴性表达。在一些实施方案中，所述活细胞对一种或多种细胞凋亡标记的表达呈阴性，所述细胞凋亡标记可以包括但不限于半胱天冬酶或活性半胱天冬酶，例如，半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9或半胱天冬酶10；Bcl-2家族成员，例如，Bax、Bad和Bid；膜联蛋白V；或TUNEL染色。在特定实施方案中，所述活细胞是活性半胱天冬酶3阴性的。在某些实施方案中，所述活细胞是膜联蛋白V阴性的。
在一些实施方案中，输入组合物包含富集的CD3+T细胞(例如，活CD3+T细胞)的群体。在一些实施方案中，所述输入群体中至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或者为或为约100％的细胞是CD3+T细胞，例如，活CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述输入群体基本上由CD3+T细胞(例如，活CD3+T细胞)组成。
在某些实施方案中，所述输入群体是富含富集的CD4+T细胞和CD8+T细胞(例如，CD4+T细胞和CD8+T细胞)的细胞群。在特定实施方案中，所述输入群体是或包括至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或者为或为约100％的作为CD4+或CD8+T细胞的细胞。在一些实施方案中，所述输入群体基本上由CD4+和CD8+T细胞组成。
在某些实施方案中，所述输入群体是富集的CD4+T细胞的群体。在特定实施方案中，所述输入群体中至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或者为或为约100％的细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述输入群体基本上由CD4+T细胞组成。
在一些实施方案中，将来自富集的CD4+T细胞的群体的细胞与来自富集的CD8+T细胞的群体的细胞混合、组合和/或合并，以产生含有CD4+T细胞和CD8+T细胞的输入群体。在某些实施方案中，在刺激细胞(例如，在刺激条件下培养细胞，如章节I-B中所述)之前，将富集的CD4+T细胞和CD8+T细胞的群体合并、混合和/或组合。在某些实施方案中，在从生物样品分离、富集和/或选择CD4+和CD8+T细胞之后，将富集的CD4+和CD8+T细胞的群体合并、混合和/或组合。在特定实施方案中，在冷冻(例如冷冻保存)并解冻经富集CD4+和CD8+T细胞的群体之后将经富集CD4+和CD8+T细胞的群体组合、混合、和/或组合。
在某些实施方案中，通过将来自富集的CD4+细胞的群体的细胞与来自富集的CD8+细胞的群体的细胞混合、合并和/或组合来产生、生成或制备输入群体。在某些实施方案中，富集的CD4+T细胞的群体含有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％的CD4+T细胞。在特定实施方案中，富集的CD4+T细胞的群体含有100％的CD4+T细胞或含有约100％的CD4+T细胞。在某些实施方案中，富集的T细胞的群体包括或含有小于20％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述细胞群基本上由CD4+T细胞组成。在某些实施方案中，富集的CD8+T细胞的群体含有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％的CD8+T细胞，或者含有或含有约100％的CD8+T细胞。在某些实施方案中，富集的CD8+T细胞的群体包括或含有小于20％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述细胞群基本上由CD8+T细胞组成。
在某些实施方案中，将CD4+T细胞和CD8+T细胞以以下比率合并、混合和/或组合：在1:10与10:1之间、在1:5与5:1之间、在4:1与1:4之间、在1:3与3:1之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25之间、在1.2:1与1:1.2之间、在1.1:1与1:1.1之间、或约1:1或1:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞。在特定实施方案中，将活CD4+T细胞与活CD8+T细胞以以下比率合并、混合和/或组合：在1:10与10:1之间、在1:5与5:1之间、在4:1与1:4之间、在1:3与3:1之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25之间、在1.2:1与1:1.2之间、在1.1:1与1:1.1之间、或约1:1或1:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞。
在特定实施方案中，输入组合物具有为、为约或为至少50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106、700×106、800×106、900×106、1,000×106、1,100×106、或1,200×106的量的T细胞，如活T细胞、活CD3+T细胞、或混合的活CD4+和CD8+T细胞。在特定实施方案中，输入组合物具有为、为约或为至少50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106的量的CD4+T细胞，例如，活CD4+T细胞。在某些实施方案中，输入组合物具有为、为约或为至少50×106、100×106、150×106、200×106、250×106、300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106的量的CD8+T细胞，例如，活CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞的量是在同一组合物中合并、混合和/或组合在一起的活CD4+和CD8+T细胞的量。在此类实施方案中，CD4+和CD8+T细胞以以下比率存在：在1:3与3:1之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25之间、在1.2:1与1:1.2之间、在1.1:1与1:1.1之间、或约1:1或1:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞的量是以约1:1或1:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率合并、混合和/或组合在一起的活CD4+和CD8+T细胞的量。
在特定实施方案中，输入组合物具有在或在约300×106与600×106之间的量的T细胞，例如，活CD3+细胞，或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合)。在一些实施方案中，输入群体具有为或为约300×106的量，例如，活CD3+细胞，或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合)。在一些实施方案中，输入群体具有为或为约400×106的量，例如，活CD3+细胞或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合)。在一些实施方案中，输入群体具有为或为约500×106的量，例如，活CD3+细胞或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合)。在一些实施方案中，输入群体具有为或为约600×106的量，例如，活CD3+细胞或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合)。在一些实施方案中，输入群体具有为或为约700×106的量，例如，活CD3+细胞或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合)。在一些实施方案中，输入群体具有为或为约800×106的量，例如，活CD3+细胞或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合)。在一些实施方案中，输入群体具有为或为约900×106的量，例如，活CD3+细胞或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合)。在一些实施方案中，输入群体具有为或为约100×107的量，例如，活CD3+细胞或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合)。在一些实施方案中，输入群体具有为或为约110×107的量，例如，活CD3+细胞或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合)。在一些实施方案中，输入群体具有为或为约120×107的量，例如，活CD3+细胞或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合)。
在某些实施方案中，将CD4+T细胞和CD8+T细胞合并、混合和/或组合，使得输入组合物具有多达或多达约目标数量(2n)的T细胞，如活T细胞、活CD3+T细胞或混合的活CD4+和CD8+T细胞。在其中包含富集的CD4+T细胞的组合物含有至少n个CD4+T细胞并且包含富集的CD8+T细胞(例如，源自同一供体，例如，源自与CD4+T细胞组合物相同的来自供体的单采术或白细胞单采术样品)的组合物含有至少n个CD8+T细胞的某些实施方案中，将n个来自CD4+T细胞组合物的CD4+T细胞和n个来自CD8+T细胞组合物的CD8+T细胞合并、混合和/或组合(即以1:1的CD4+与CD8+的比率)，以产生含有目标数量(2n)的T细胞的输入组合物。在其中包含富集的CD4+T细胞的组合物含有不超过(例如，少于)n个CD4+T细胞并且包含富集的CD8+T细胞(例如，源自同一供体，例如，源自与CD4+T细胞组合物相同的来自供体的单采术或白细胞单采术样品)的组合物含有不超过(例如，少于)n个CD8+T细胞的某些实施方案中，将CD4+T细胞组合物的所有细胞和CD8+T细胞组合物的所有细胞合并、混合和/或组合以产生输入组合物。在这些实施方案中，输入组合物可以含有少于目标数量(2n)的T细胞。在其中包含富集的CD4+T细胞的组合物含有少于n个CD4+T细胞并且包含富集的CD8+T细胞(例如，源自同一供体，例如，源自与CD4+T细胞组合物相同的来自供体的单采术或白细胞单采术样品)的组合物含有超过n个CD8+T细胞或反之亦然的某些实施方案中，使用CD4+或CD8+T细胞组合物的细胞来补充替代性细胞类型，使得输入组合物含有多达目标数量(2n)的T细胞。在任何前述实施方案中，目标数量2n可以是300×106、350×106、400×106、450×106、500×106、550×106、600×106、700×106、800×106、900×106、1,000×106、1,100×106或1,200×106。
在某些实施方案中，将来自包含富集的CD4+T细胞的组合物的450×106个CD4+T细胞和来自包含富集的CD8+T细胞(例如，源自同一供体，例如，源自与CD4+T细胞组合物相同的来自供体的单采术或白细胞单采术样品)的组合物的450×106个CD8+T细胞合并、混合和/或组合，以产生含有900×106个CD4+和CD8+T细胞的输入组合物。在某些实施方案中，在包含富集的CD4+T细胞的组合物含有少于450×106个CD4+T细胞并且包含富集的CD8+T细胞(例如，源自同一供体，例如，源自与CD4+T细胞组合物相同的来自供体的单采术或白细胞单采术样品)的组合物含有少于450×106个CD8+T细胞时，将CD4+T细胞组合物的所有细胞和CD8+T细胞组合物的所有细胞合并、混合和/或组合以产生输入组合物。在某些实施方案中，在任一种所述组合物含有少于450×106个CD4+或CD8+细胞而另一种组合物含有超过450×106个CD8+细胞或CD4+细胞时，则将多达900×106个CD4+T细胞和CD8+T细胞组合以产生输入组合物。输入组合物中CD4+和CD8+T细胞的总数量可以低于900×106。换言之，可以使用包含富集的CD4+T细胞的组合物的细胞来补充包含富集的CD8+T细胞的组合物，或反之亦然，以产生包含多达目标数量(2n)的T细胞(例如，多达900×106个要经受刺激的T细胞)的输入组合物。
虽然在上文实施方案中，细胞选择、分离、分开、富集和/或纯化过程是在制备输入组合物的背景下讨论的，但应理解，本文公开的细胞选择、分离、分开、富集和/或纯化过程可以在任何后续步骤(例如，激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制和/或将配制的细胞群施用至受试者)期间、之前或之间以任何合适的组合和/或顺序使用。例如，T细胞选择、分离、分开、富集和/或纯化步骤可以在T细胞激活/刺激与T细胞转导之间进行。在另一例子中，T细胞选择、分离、分开、富集和/或纯化步骤可以在T细胞转导之后，但在收获之前、在收集之前和/或在配制细胞之前进行。在特定例子中，T细胞选择、分离、分开、富集和/或纯化步骤可以在即将收获细胞之前作为精制或澄清步骤来进行。在一些实施方案中，通过色谱进行的T细胞选择步骤在T细胞激活/刺激与T细胞转导之间进行。在一些实施方案中，通过色谱进行的T细胞选择步骤在T细胞转导之后，但在收获之前、在收集之前和/或在配制细胞之前进行。在一些实施方案中，通过色谱进行的T细胞选择步骤在即将收获细胞之前进行。
在一些实施方案中，在刺激细胞(例如，在刺激条件下培养细胞，如在章节I-B中所述)之前，使输入组合物经受一个或多个稀释和/或洗涤步骤，例如，用无血清培养基进行。在一些实施方案中，所述稀释和/或洗涤步骤允许将培养基更换为无血清培养基，如本文在章节II中或在PCT/US2018/064627中所述的无血清培养基，所述申请通过引用并入本文。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有一种或多种补充剂的基础培养基(例如OpTmizerTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher))。在一些实施方案中，所述一种或多种补充剂不含血清。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有一种或多种另外的组分的基础培养基，所述另外的组分用于细胞(例如，T细胞)的维持、扩增和/或激活，如通过另外的补充剂(例如OpTmizerTMT细胞扩增补充剂(ThermoFisher))所提供。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含血清替代物补充剂，例如，免疫细胞血清替代物，例如，ThermoFisher(#A2596101)、CTSTM免疫细胞血清替代物、或Smith等人Clin TranslImmunology.2015年1月；4(1):e31中所述的免疫细胞血清替代物。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含游离形式的氨基酸，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，如GlutamaxTM(ThermoFisher)中的二肽。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含一种或多种重组细胞因子，如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15。
在一些实施方案中，输入组合物是通过将从起始样品(如PBMC或白细胞单采术样品)产生的富含CD8+T细胞的群体与从所述起始样品产生的富含CD4+T细胞的群体混合、组合和/或合并来产生。在一些实施方案中，富含CD4+T细胞的群体是从CD8阴性级分产生的，所述CD8阴性级分是在从起始样品产生富含CD8+T细胞的群体的过程期间产生的。在特定实施方案中，输入组合物具有比率为或为约1:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞，并且在刺激细胞(例如，在刺激条件下培养细胞，如在章节I-B中所述)之前，经受一个或多个洗涤步骤，例如，使用本文在章节II中或在PCT/US2018/064627中所述的无血清培养基进行。在一些实施方案中，所述一个或多个洗涤步骤允许将培养基从含有白蛋白的PBS/EDTA缓冲液更换为无血清培养基，所述无血清培养基也用于细胞刺激。
B.刺激
在一些实施方案中，所提供的方法与刺激细胞(例如，在刺激条件下培养细胞)结合使用。在一些实施方案中，刺激条件包括激活或刺激和/或能够激活或刺激细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)中的信号，如从TCR和/或共受体产生的信号的条件。在一些实施方案中，刺激条件是或包括一个或多个用刺激试剂或在刺激试剂的存在下培养细胞的步骤，所述刺激试剂例如激活或刺激或者能够激活或刺激细胞中的信号的试剂。在一些实施方案中，刺激试剂刺激和/或激活TCR和/或共受体。在特定实施方案中，刺激试剂是本文提供的试剂，例如，如在章节I-B-1中所述。在某些实施方案中，在刺激条件下刺激或培养细胞群生成或产生刺激细胞的群体(本文中也称为受刺激的细胞群)。
在一些实施方案中，刺激输入群体(例如，本文如在章节I-A-3中所述的输入群体)的细胞。在某些实施方案中，在如通过本文例如在章节I-C中所述的方法、步骤或技术将异源或重组多核苷酸引入细胞中之前，对输入群体的细胞进行刺激或使其经受刺激。在特定实施方案中，来自输入群体的细胞先前已经冷冻(例如，冷冻保存)和储存，并且在刺激之前解冻和任选地洗涤。在特定实施方案中，输入群体的细胞是从组合物选择(例如，如章节I-A-1和章节I-A-2中所述)，所述组合物从冷冻保存的和/或冷冻保护的单采术产物或白细胞单采术产物解冻，并且输入群体的细胞在刺激之前未进行冷冻(例如，冷冻保存)和储存。
在特定方面，刺激(stimulation)(本文中也称为刺激(stimulating))的开始发生于输入细胞首次接触或暴露于刺激条件时。在一些实施方案中，认为在输入群体的细胞被首次刺激或暴露于激活或刺激和/或能够激活或刺激细胞中的信号，如从TCR和/或共受体产生的信号的条件时，开始刺激。在一些实施方案中，在输入细胞首次接触或暴露于刺激试剂(如本文例如在章节I-B-1中所述的刺激试剂)时，开始刺激。
在一些实施方案中，将刺激(例如，在刺激条件下培养细胞)进行为、为约或小于48小时、42小时、36小时、30小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时或12小时。在一些实施方案中，将刺激(例如，在刺激条件下培养细胞)进行20±4小时或者在或在约16小时与24小时之间。在特定实施方案中，将刺激(例如，在刺激条件下培养细胞)进行在或在约36小时与12小时之间、30小时与18小时之间，或者为或为约24小时或22小时。在一些实施方案中，将刺激(例如，在刺激条件下培养细胞)进行为、为约或小于2天或一天。
在特定实施方案中，对输入群体中为、为约或为至少50x106、100x106、150x106、200x106、250x106、300x106、350x106、400x106、450x106、500x106、550x106、600x106、700x106、800x106、900x106、或1,000x106的量的细胞进行刺激或使其经受刺激，例如，在刺激条件下培养。在特定实施方案中，进行刺激(例如，在刺激条件下培养)的输入群体的量是为或约50x106个细胞、为或约100x106个细胞、为或约150x106个细胞、为或约200x106个细胞、为或约250x106个细胞、为或约300x106个细胞、为或约350x106个细胞、为或约400x106个细胞、为或约450x106个细胞、为或约500x106个细胞、为或约550x106个细胞、为或约600x106个细胞、为或约700x106个细胞、为或约800x106个细胞、为或约900x106个细胞、或为或约1,000x106个细胞，或者任何前述值之间的任何值。在特定实施方案中，对输入群体中为或为约900x106的量的细胞进行刺激，例如，在刺激条件下培养。
在特定实施方案中，输入组合物以以下比率包含活CD4+T细胞和活CD8+T细胞：在1:10与10:1之间、在1:5与5:1之间、在4:1与1:4之间、在1:3与3:1之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25之间、在1.2:1与1:1.2之间、在1.1:1与1:1.1之间、或约1:1、或1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞。在特定实施方案中，输入组合物以约1:1或1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率包含活CD4+T细胞和活CD8+T细胞。在特定实施方案中，对输入群体为或为约450x106的量的CD4+细胞进行刺激，例如，在刺激条件下培养。在特定实施方案中，对输入群体中为或为约450x106的量的CD8+细胞进行刺激，例如，在刺激条件下培养。在特定实施方案中，对输入群体中为或为约450x106的量的CD4+T细胞和为或为约450x106的量的CD8+T细胞进行刺激，例如，在刺激条件下培养。
在某些实施方案中，以以下密度对所述细胞(例如，输入群体的细胞)进行刺激或使其经受刺激(例如，在刺激条件下如在刺激试剂的存在下培养)：为、为约或至少0.01x106个细胞/mL、0.1x106个细胞/mL、0.5x106个细胞/mL、1.0x106个细胞/mL、1.5x106个细胞/mL、2.0x106个细胞/mL、2.5x106个细胞/mL、3.0x106个细胞/mL、4.0x106个细胞/mL、5.0x106个细胞/mL、10x106个细胞/mL、或50x106个细胞/mL。在某些实施方案中，以为、为约或至少3.0x106个细胞/mL的密度对所述细胞(例如，输入群体的细胞)进行刺激或使其经受刺激(例如，在刺激条件下如在刺激试剂的存在下培养)。在某些实施方案中，输入的细胞是活细胞。
在一些实施方案中，用于刺激和/或激活的条件可以包括以下中的一种或多种：特定介质、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他被设计用于激活细胞的药剂))。
在特定实施方案中，刺激条件包括用一种或多种细胞因子和/或在一种或多种细胞因子的存在下培养细胞，例如，来自输入群体的细胞。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-2。
在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子的量或浓度是用国际单位(IU)测量和/或定量的。国际单位可以用于定量维生素、激素、细胞因子、疫苗、血液制品和类似的生物活性物质。在一些实施方案中，IU是或包括通过与具有特定重量和强度的国际参考标准(例如，针对IL-2的WHO第一国际标准(WHO 1st International Standard for Human IL-2)，86/504)相比的生物制剂效力的度量单位。国际单位是报告生物活性单位的唯一公认且标准化的方法，所述生物活性单位公开和源自国际合作研究工作。在特定实施方案中，可以通过与类似的WHO标准产品进行产品比较测试来获得细胞因子的群体、样品或来源的IU。例如，在一些实施方案中，将人重组IL-2、IL-7或IL-15的群体、样品或来源的IU/mg分别与WHO标准IL-2产品(NIBSC代码：86/500)、WHO标准IL-17产品(NIBSC代码：90/530)和WHO标准IL-15产品(NIBSC代码：95/554)进行比较。
在一些实施方案中，以IU/mg计的生物活性等同于(以ng/ml计的ED50)-1x106。在特定实施方案中，重组人IL-2或IL-15的ED50等同于使用CTLL-2细胞的细胞增殖的半最大刺激(XTT切割)所需的浓度。在某些实施方案中，重组人IL-7的ED50等同于PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖的半最大刺激所需的浓度。与IL-2的IU的测定和计算相关的细节论述于Wadhwa等人,Journal of Immunological Methods(2013),379(1-2):1-7；以及Gearing和Thorpe,Journal of Immunological Methods(1988),114(1-2):3-9中；与IL-15的IU的测定和计算相关的细节论述于Soman等人Journal of Immunological Methods(2009)348(1-2):83-94中。
在一些实施方案中，在如下浓度的细胞因子(例如，重组人细胞因子)的存在下对细胞(例如，输入细胞)进行刺激或使其经受刺激：在1IU/mL与1,000IU/mL之间、在10IU/mL与50IU/mL之间、在50IU/mL与100IU/mL之间、在100IU/mL与200IU/mL之间、在100IU/mL与500IU/mL之间、在250IU/mL与500IU/mL之间、或在500IU/mL与1,000IU/mL之间。
在一些实施方案中，在如下浓度的重组IL-2(例如，人重组IL-2)存在下对细胞(例如，输入细胞)进行刺激或使其经受刺激：在1IU/mL与500IU/mL之间、在10IU/mL与250IU/mL之间、在50IU/mL与200IU/mL之间、在50IU/mL与150IU/mL之间、在75IU/mL与125IU/mL之间、在100IU/mL与200IU/mL之间、或在10IU/mL与100IU/mL之间。在特定实施方案中，在如下浓度的重组IL-2存在下对细胞(例如，输入群体的细胞)进行刺激或使其经受刺激：为或为约50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mL、或100IU/mL。在一些实施方案中，在为或为约100IU/mL重组IL-2(例如，人重组IL-2)的存在下对细胞(例如，输入细胞)进行刺激或使其经受刺激。
在一些实施方案中，在如下浓度的重组IL-7(例如，人重组IL-7)存在下对细胞(例如，输入细胞)进行刺激或使其经受刺激：在100IU/mL与2,000IU/mL之间、在500IU/mL与1,000IU/mL之间、在100IU/mL与500IU/mL之间、在500IU/mL与750IU/mL之间、在750IU/mL与1,000IU/mL之间、或在550IU/mL与650IU/mL之间。在特定实施方案中，在如下浓度的IL-7存在下对细胞(例如，输入细胞)进行刺激或使其经受刺激：为或为约50IU/mL、100IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、250IU/mL、300IU/mL、350IU/mL、400IU/mL、450IU/mL、500IU/mL、550IU/mL、600IU/mL、650IU/mL、700IU/mL、750IU/mL、800IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、或1,000IU/mL。在特定实施方案中，在为或为约600IU/mL重组IL-7(例如，人重组IL-7)的存在下对细胞(例如，输入细胞)进行刺激或使其经受刺激。
在一些实施方案中，在如下浓度的重组IL-15(例如，人重组IL-15)存在下对细胞(例如，输入细胞)进行刺激或使其经受刺激：在1IU/mL与500IU/mL之间、在10IU/mL与250IU/mL之间、在50IU/mL与200IU/mL之间、在50IU/mL与150IU/mL之间、在75IU/mL与125IU/mL之间、在100IU/mL与200IU/mL之间、或在10IU/mL与100IU/mL之间。在特定实施方案中，在如下浓度的重组IL-15存在下对细胞(例如，输入群体的细胞)进行刺激或使其经受刺激：为或为约50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mL、或200IU/mL。在一些实施方案中，在为或为约100IU/mL重组IL-15(例如，人重组IL-15)的存在下对细胞(例如，输入细胞)进行刺激或使其经受刺激。
在特定实施方案中，在刺激条件下在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下对细胞(例如，来自输入群体的细胞)进行刺激或使其经受刺激。在一些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在某些实施方案中，在刺激条件下在重组IL-2、IL-7和IL-15的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激。在某些实施方案中，在刺激条件下在为或为约100IU/mL的重组IL-2、为或为约600IU/mL的重组IL-7和为或为约100IU/mL的重组IL-15的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激。
所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他被设计用于激活细胞的药剂))。
在一些方面，刺激是根据多种技术来进行，所述技术如以下文献中所述的那些：Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72–82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，刺激是在无血清培养基中进行。在一些实施方案中，无血清培养基是定义的和/或明确定义的细胞培养基。在某些实施方案中，无血清培养基是受控培养基，其已经过处理，例如被过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些实施方案中，无血清培养基含有蛋白质。在某些实施方案中，无血清培养基可含有血清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、载体蛋白和/或附着因子。
在一些实施方案中，刺激是在本文于章节II中或在PCT/US2018/064627中所述的无血清培养基中进行。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有一种或多种补充剂的基础培养基(例如OpTmizerTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher))。在一些实施方案中，所述一种或多种补充剂不含血清。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有一种或多种另外的组分的基础培养基，所述另外的组分用于细胞(例如，T细胞)的维持、扩增和/或激活，如通过另外的补充剂(例如OpTmizerTMT细胞扩增补充剂(ThermoFisher))所提供。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含血清替代物补充剂，例如，免疫细胞血清替代物，例如，ThermoFisher(#A2596101)、CTSTM免疫细胞血清替代物、或Smith等人ClinTransl Immunology.2015年1月；4(1):e31中所述的免疫细胞血清替代物。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含游离形式的氨基酸，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，如GlutamaxTM(ThermoFisher)中的二肽。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含一种或多种重组细胞因子，如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15。在一些实施方案中，在一种或多种刺激条件或刺激试剂存在下进行的刺激的至少一部分是在离心室的内部空腔中例如在离心旋转下进行，如在通过引用并入的国际公开号WO2016/073602中所述。在一些实施方案中，在离心室中进行的刺激的至少一部分包括与一种或多种试剂混合以诱导刺激和/或激活。在一些实施方案中，将细胞(如选择的细胞)与刺激条件或刺激剂在离心室中混合。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的一种或多种刺激条件或刺激剂混合，所述刺激条件或刺激剂远小于在细胞培养板或其他系统中进行类似刺激时通常使用的刺激条件或刺激剂。
在一些实施方案中，刺激通常在混合条件下进行，例如在旋转存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF为或为约80g至100g(例如，为或为约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，所述旋转是使用如下重复间隔来进行：以这种低速旋转，之后是休息时间段，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
在某些实施方案中，刺激是在静态条件(如不涉及培养基的离心、振荡、旋转、摇摆或灌注(例如，连续或半连续灌注)的条件)下进行。在一些实施方案中，在开始之前或之后不久，例如，在5、15或30分钟内，将细胞转移(例如，在无菌条件下转移)至容器如袋子或小瓶，并置于孵育器中。在特定实施方案中，将孵育器设定为、为约或至少16℃、24℃或35℃。在一些实施方案中，将孵育器设定为37℃、为约37℃或为37℃±2℃、±1℃、±0.5℃或±0.1℃。在特定实施方案中，在静态条件下的刺激是在置于孵育器中的细胞培养袋中进行。在一些实施方案中，所述培养袋由单一网状物聚烯烃透气性薄膜构成，从而使得单核细胞(如果存在)能够附着至袋表面。
1.刺激试剂
在特定实施方案中，刺激条件包括将细胞与刺激试剂一起孵育、培养和/或培育。在某些实施方案中，刺激试剂含有或包含珠。在某些实施方案中，刺激的开始发生于将细胞与刺激试剂一起孵育或接触时。在特定实施方案中，刺激试剂含有或包含寡聚试剂，例如链霉亲和素突变蛋白寡聚物。在特定实施方案中，刺激试剂激活和/或能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激试剂包括能够刺激或激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂，例如，配体。在一些实施方案中，如本文所考虑的药剂可以包括但不限于RNA、DNA、蛋白质(例如，酶)、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、碳水化合物、脂质、凝集素或对期望靶标具有亲和力的任何其他生物分子。在一些实施方案中，期望的靶标是T细胞受体和/或T细胞受体的组分。在某些实施方案中，期望的靶标是CD3。在某些实施方案中，期望的靶标是T细胞共刺激分子，例如CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。所述一种或多种药剂可以通过在本领域中已知和可用的各种方法直接或间接附着至珠上。所述附着可以是共价的、非共价的、静电的或疏水的，并且可以通过各种附着手段(包括例如化学手段、机械手段或酶促手段)来实现。在一些实施方案中，所述药剂是抗体或其抗原结合片段，如Fab。在一些实施方案中，生物分子(例如，生物素化的抗CD3抗体)可以通过直接附着至珠的另一种生物分子(例如，抗生物素抗体)间接附着至珠。
在一些实施方案中，刺激试剂含有一种或多种药剂(例如抗体)，所述一种或多种药剂附着至珠(例如顺磁珠)并且与细胞(例如T细胞)上的以下大分子中的一种或多种特异性结合：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54(ICAM-1)、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L(CD70)、4-1BB(CD137)、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R；IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDl la(LFA-1)、CD62L(L-选择素)、CD29/CD49d(VLA-4)、Notch配体(例如，δ样1/4、锯齿状1/2等)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7和CXCR3或其片段，包括这些大分子的相应配体或其片段。在一些实施方案中，附着至珠(例如顺磁珠)的药剂(例如抗体)与细胞(例如T细胞)上的以下大分子中的一种或多种特异性结合：CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA和/或CD45RO。
在一些实施方案中，附着至珠的一种或多种药剂是抗体。抗体可以包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2和Fv)。在一些实施方案中，刺激试剂是抗体片段(包括抗原结合片段)，例如，Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab')2片段。应理解，任何同种型的恒定区都可以用于本文考虑的抗体，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且此类恒定区可以从任何人类或动物物种(例如，鼠类物种)获得。在一些实施方案中，所述药剂是结合和/或识别T细胞受体的一种或多种组分的抗体。在特定实施方案中，所述药剂是抗CD3抗体。在某些实施方案中，所述药剂是结合和/或识别共同受体的抗体。在一些实施方案中，刺激试剂包含抗CD28抗体。
在一些实施方案中，在如下比率的刺激试剂与细胞的存在下对所述细胞(例如，输入群体的细胞)进行刺激或使其经受刺激：为或为约3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1、或0.2:1。在特定实施方案中，刺激试剂与细胞的比率为在2.5:1与0.2:1之间、在2:1与0.5:1之间、在1.5:1与0.75:1之间、在1.25:1与0.8:1之间、在1.1:1与0.9:1之间。在特定实施方案中，刺激试剂与细胞的比率为约1:1或为1:1。
在一些实施方案中，在以下的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激：每106个细胞为、为约或为至少0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、或10μg刺激试剂。在一些实施方案中，在每106个细胞为或为约4μg的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激。在特定实施方案中，在每106个细胞为或为约0.8μg的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激。在各种实施方案中，在每106个细胞为或为约0.8μg的存在下对细胞进行刺激或使其经受刺激。在特定实施方案中，在每106个细胞为或为约1.2μg的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激。在特定实施方案中，在每106个细胞为或为约1.8μg的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激。
a.珠试剂
在某些实施方案中，刺激试剂含有与能够激活和/或扩增细胞(例如，T细胞)的一种或多种药剂(例如，生物分子)缀合或连接的颗粒(例如，珠)。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂结合至珠。在一些实施方案中，珠是生物相容的，即由适合于生物学用途的材料构成。在一些实施方案中，珠对所培养的细胞(例如，所培养的T细胞)是无毒的。在一些实施方案中，珠可以是能够以允许药剂与细胞之间相互作用的方式附着药剂的任何颗粒。
在一些实施方案中，刺激试剂含有珠和直接与细胞表面上的大分子相互作用的一种或多种药剂。在某些实施方案中，珠(例如顺磁珠)经由对细胞上的一种或多种大分子(例如一种或多种细胞表面蛋白)具有特异性的一种或多种药剂(例如抗体)与细胞相互作用。在某些实施方案中，将珠(例如顺磁珠)用本文所述的第一药剂(例如一抗(例如抗生物素抗体)或其他生物分子)标记，然后添加第二药剂(例如二抗(例如，生物素化的抗CD3抗体)或其他第二生物分子(例如，链霉亲和素)，由此所述二抗或其他第二生物分子与颗粒上的此类一抗或其他生物分子特异性结合。
在一些实施方案中，珠的直径大于约0.001μm、大于约0.01μm、大于约0.1μm、大于约1.0μm、大于约10μm、大于约50μm、大于约100μm或大于约1000μm且不超过约1500μm。在一些实施方案中，珠的直径为约1.0μm至约500μm、约1.0μm至约150μm、约1.0μm至约30μm、约1.0μm至约10μm、约1.0μm至约5.0μm、约2.0μm至约5.0μm、或约3.0μm至约5.0μm。在一些实施方案中，珠的直径为约3μm至约5μm。在一些实施方案中，珠的直径为至少或至少约或约0.001μm、0.01μm、0.1μm、0.5μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm或20μm。在某些实施方案中，珠的直径为或约4.5μm。在某些实施方案中，珠的直径为或约2.8μm。
在一些实施方案中，珠的密度大于0.001g/cm3、大于0.01g/cm3、大于0.05g/cm3、大于0.1g/cm3、大于0.5g/cm3、大于0.6g/cm3、大于0.7g/cm3、大于0.8g/cm3、大于0.9g/cm3、大于1g/cm3、大于1.1g/cm3、大于1.2g/cm3、大于1.3g/cm3、大于1.4g/cm3、大于1.5g/cm3、大于2g/cm3、大于3g/cm3、大于4g/cm3、或大于5g/cm3。在一些实施方案中，珠的密度在约0.001g/cm3与约100g/cm3之间、约0.01g/cm3与约50g/cm3之间、约0.1g/cm3与约10g/cm3之间、约0.1g/cm3与约.5g/cm3之间、约0.5g/cm3与约1g/cm3之间、约0.5g/cm3与约1.5g/cm3之间、约1g/cm3与约1.5g/cm3之间、约1g/cm3与约2g/cm3之间、或约1g/cm3与约5g/cm3之间。在一些实施方案中，珠的密度为约0.5g/cm3、约0.5g/cm3、约0.6g/cm3、约0.7g/cm3、约0.8g/cm3、约0.9g/cm3、约1.0g/cm3、约1.1g/cm3、约1.2g/cm3、约1.3g/cm3、约1.4g/cm3、约1.5g/cm3、约1.6g/cm3、约1.7g/cm3、约1.8g/cm3、约1.9g/cm3、或约2.0g/cm3。在某些实施方案中，珠的密度为约1.6g/cm3。在特定实施方案中，珠或颗粒的密度为约1.5g/cm3。在某些实施方案中，颗粒的密度为约1.3g/cm3。
在某些实施方案中，多个珠具有均匀的密度。在某些实施方案中，均匀的密度包含平均珠密度的小于10％、小于5％或小于1％的密度标准差。
在一些实施方案中，珠在珠的表面处或附近含有可以与药剂偶联、连接或缀合的至少一种材料。在一些实施方案中，珠是表面官能化的，即包含能够与结合分子(例如，多核苷酸或多肽)形成共价键的官能团。在特定实施方案中，珠包含表面暴露的羧基、氨基、羟基、甲苯磺酰基、环氧基和/或氯甲基。在特定实施方案中，珠包含表面暴露的琼脂糖和/或琼脂糖凝胶。在某些实施方案中，珠表面包含附着的刺激试剂，所述刺激试剂可以结合或附着结合分子。在特定实施方案中，生物分子是多肽。在一些实施方案中，珠包含表面暴露的蛋白质A、蛋白质G或生物素。
在一些实施方案中，珠在磁场中反应。在一些实施方案中，珠是磁珠。在一些实施方案中，磁珠是顺磁性的。在特定实施方案中，磁珠是超顺磁性的。在某些实施方案中，珠不展示任何磁性特性，除非使它们暴露于磁场。
在特定实施方案中，珠包含磁核、顺磁核或超顺磁核。在一些实施方案中，磁核含有金属。在一些实施方案中，所述金属可以是但不限于铁、镍、铜、钴、钆、锰、钽、锌、锆或其任何组合。在某些实施方案中，磁核包含金属氧化物(例如，氧化铁)、铁氧体(例如，锰铁氧体、钴铁氧体、镍铁氧体等)、赤铁矿和金属合金(例如，CoTaZn)。在一些实施方案中，磁核包含铁氧体、金属、金属合金、氧化铁或二氧化铬中的一种或多种。在一些实施方案中，磁核包含元素铁或其化合物。在一些实施方案中，磁核包含磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γFe2O3)或硫复铁矿(Fe3S4)中的一种或多种。在一些实施方案中，内核包含氧化铁(例如，Fe3O4)。
在某些实施方案中，珠含有被表面官能化涂层(coat或coating)覆盖的磁核、顺磁核和/或超顺磁核。在一些实施方案中，涂层可以含有如下材料：其可以包括但不限于聚合物、多糖、二氧化硅、脂肪酸、蛋白质、碳、琼脂糖、琼脂糖凝胶或其组合。在一些实施方案中，聚合物可以是聚乙二醇、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚戊二醛、聚氨酯、聚苯乙烯或聚乙烯醇。在某些实施方案中，外涂层(coat或coating)包含聚苯乙烯。在特定实施方案中，外涂层是表面官能化的。
在一些实施方案中，刺激试剂包含珠，其含有金属氧化物核(例如，氧化铁核)和涂层，其中所述金属氧化物核包含至少一种多糖(例如，葡聚糖)，并且其中所述涂层包含至少一种多糖(例如，氨基葡聚糖)、至少一种聚合物(例如，聚氨酯)和二氧化硅。在一些实施方案中，金属氧化物核是胶体氧化铁核。在某些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。在一些实施方案中，刺激试剂包含抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗生物素抗体。在一些实施方案中，刺激试剂包含抗生物素抗体。在一些实施方案中，珠的直径为约3μm至约10μm。在一些实施方案中，珠的直径为约3μm至约5μm。在某些实施方案中，珠的直径为约3.5μm。
在一些实施方案中，刺激试剂包含附着至珠的一种或多种药剂，所述珠包含金属氧化物核(例如，氧化铁内核)和涂层(例如，保护涂层)，其中所述涂层包含聚苯乙烯。在某些实施方案中，珠是单分散的顺磁(例如超顺磁)珠，其包含顺磁(例如超顺磁)铁核(例如，包含磁铁矿(Fe3O4)和/或磁赤铁矿(γFe2O3)的核)和聚苯乙烯涂层(coat或coating)。在一些实施方案中，珠是无孔的。在一些实施方案中，珠含有所述一种或多种药剂附着的官能化表面。在某些实施方案中，所述一种或多种药剂与珠在表面上共价结合。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和/或抗CD28抗体、以及能够结合标记的抗体(例如生物素化的抗体)(如标记的抗CD3或抗CD28抗体)的抗体或其抗原片段。在某些实施方案中，珠具有约1.5g/cm3的密度和约1m2/g至约4m2/g的表面积。在特定实施方案中；珠是单分散的超顺磁珠，其具有约4.5μm的直径和约1.5g/cm3的密度。在一些实施方案中，珠是具有约2.8μm的平均直径和约1.3g/cm3的密度的单分散的超顺磁珠。
在一些实施方案中，将富集的T细胞的群体与刺激试剂以如下珠与细胞的比率一起孵育：为或为约3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1、或0.2:1。在特定实施方案中，珠与细胞的比率在2.5:1与0.2:1之间、在2:1与0.5:1之间、在1.5:1与0.75:1之间、在1.25:1与0.8:1之间、在1.1:1与0.9:1之间。在特定实施方案中，珠与细胞的比率为约1:1或为1:1。
b.寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂
在特定实施方案中，刺激试剂含有寡聚试剂(例如链霉亲和素突变蛋白试剂)，所述寡聚试剂被缀合、连接或附着至一种或多种能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的药剂(例如配体)。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂具有能够在特定的结合位点(例如结合位点Z)上结合寡聚试剂的附着的结合结构域或结合配偶体(例如，结合配偶体C)。在一些实施方案中，多种药剂可逆地结合寡聚试剂。在各种实施方案中，寡聚试剂具有多个特定结合位点，所述多个特定结合位点在某些实施方案中在结合结构域(例如，结合配偶体C)处可逆地结合多种药剂。在一些实施方案中，在竞争试剂(例如还能够结合特定结合位点(例如结合位点Z)的试剂)的存在下结合药剂的量被降低或减少。
在一些实施方案中，刺激试剂是或包括可逆系统，其中至少一种药剂(例如，能够在细胞(如T细胞)中产生信号的药剂)与寡聚试剂缔合(例如可逆地缔合)。在一些实施方案中，所述试剂含有能够与试剂结合(例如可逆地结合)的多个结合位点。在一些情况下，所述试剂是寡聚颗粒试剂，其具有能够在细胞(如T细胞)中产生信号的至少一种附着的药剂。
在一些实施方案中，所述药剂含有可以特异性结合分子的表位或区域的至少一个结合位点(例如结合位点B)并且还含有与试剂的至少一个结合位点(例如，试剂的结合位点Z)结合的结合配偶体(在本文中也称为结合配偶体C)。在一些实施方案中，结合配偶体C与所述至少一个结合位点Z之间的结合相互作用是非共价相互作用。在一些情况下，结合配偶体C与所述至少一个结合位点Z之间的结合相互作用是共价相互作用。在一些实施方案中，结合配偶体C与所述至少一个结合位点Z之间的结合相互作用(例如非共价相互作用)是可逆的。
可以在此类可逆系统中用作寡聚试剂的物质是已知的，参见例如美国专利号5,168,049；5,506,121；6,103,493；7,776,562；7,981,632；8,298,782；8,735,540；9,023,604；和国际公开PCT申请号WO 2013/124474和WO2014/076277。下文描述了能够形成可逆相互作用的试剂和结合配偶体以及能够逆转这种结合的物质(例如竞争试剂)的非限制性例子。
在一些实施方案中，寡聚试剂是链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突变蛋白或类似物(如中性抗生物素蛋白)或其混合物的寡聚物，其中这种寡聚试剂含有用于与药剂的结合结构域(例如，结合配偶体C)可逆地缔合的一个或多个结合位点。在一些实施方案中，所述药剂的结合结构域可以是生物素、生物素衍生物或类似物、或链霉亲和素结合肽或能够特异性结合链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白或类似物的其他分子。
在某些实施方案中，一种或多种药剂(例如，能够在细胞如T细胞中产生信号的药剂)例如经由寡聚试剂上存在的多个特定结合位点(例如，结合位点Z)与寡聚试剂缔合(如可逆地结合)。在一些情况下，这导致所述药剂彼此紧密地排列，使得如果使具有由所述药剂结合或识别的(至少两个拷贝的)细胞表面分子的靶细胞与所述药剂接触，则可以发生亲合力效应。
在一些实施方案中，寡聚试剂是链霉亲和素寡聚物、链霉亲和素突变蛋白寡聚物、链霉亲和素类似物寡聚物、抗生物素蛋白寡聚物、由抗生物素蛋白突变蛋白或抗生物素蛋白类似物(如中性抗生物素蛋白)构成的寡聚物或其混合物。在特定实施方案中，寡聚试剂含有能够与药剂的结合结构域(例如，结合配偶体C)结合的特定结合位点。在一些实施方案中，结合结构域可以是生物素、生物素衍生物或类似物、或链霉亲和素结合肽或能够特异性结合链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白或类似物的其他分子。在一些实施方案中，链霉亲和素可以是野生型链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物(如链霉亲和素样多肽)。同样，在一些方面，抗生物素蛋白包括野生型抗生物素蛋白、或者抗生物素蛋白的突变蛋白或类似物(如中性抗生物素蛋白，所述中性抗生物素蛋白是具有修饰的精氨酸的去糖基化抗生物素蛋白，其通常展现更中性的pi并且可用作天然抗生物素蛋白的替代物)。通常，抗生物素蛋白的去糖基化的中性形式包括例如那些可商购获得的形式，如可通过Sigma Aldrich公司获得的“Extravidin”、或可从ThermoScientific或Invitrogen公司获得的“NeutrAvidin”。
在一些实施方案中，所述试剂是链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白或类似物。在一些实施方案中，野生型链霉亲和素(wt-链霉亲和素)具有由Argarana等人,NucleicAcids Res.14(1986)1871-1882所披露的氨基酸序列(SEQ ID NO:61)。通常，链霉亲和素在自然界中作为四个相同亚基的四聚体存在，即它是同源四聚体，其中每个亚基含有针对生物素、生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的单一结合位点。链霉亲和素亚基的示例性序列是SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列，但是这个序列还可以包括在来自其他链霉菌属(Streptomyces)物种的同源物中存在的序列。特定地，链霉亲和素的每个亚基可以展现对生物素的强结合亲和力，其解离常数(Kd)大致为约10-14M。在一些情况下，链霉亲和素可以以单价四聚体存在，其中四个结合位点中仅一个有功能(Howarth等人(2006)Nat.Methods,3:267-73；Zhang等人(2015)Biochem.Biophys.Res.Commun.,463:1059-63)；以二价四聚体存在，其中四个结合位点中的两个有功能(Fairhead等人(2013)J.Mol.Biol.,426:199-214)；或者可以以单体或二聚形式存在(Wu等人(2005)J.Biol.Chem.,280:23225-31；Lim等人(2010)Biochemistry,50:8682-91)。
在一些实施方案中，链霉亲和素可以是任何形式，如野生型或未经修饰的链霉亲和素，如来自链霉菌属物种的链霉亲和素或其功能活性片段，所述功能活性片段包括含有针对生物素、生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的结合位点的至少一个功能性亚基，如通常含有SEQ ID NO:61所示的来自阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)的野生型链霉亲和素的至少一个功能性亚基或其功能活性片段。例如，在一些实施方案中，链霉亲和素可以包括野生型链霉亲和素的片段，所述片段在N末端和/或C末端被缩短。这种最小链霉亲和素包括任何如下链霉亲和素：在SEQ ID NO:61的氨基酸位置10至16的区域中的N末端开始，并且在SEQ ID NO:61的氨基酸位置133至142的区域中的C末端终止。在一些实施方案中，链霉亲和素的功能活性片段含有SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，如SEQ ID NO:62所示的链霉亲和素可以在对应于Ala13(其编号示于SEQ ID NO:61中)的位置进一步含有N末端甲硫氨酸。提及链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白中残基的位置是参考在SEQ ID NO:61中残基的编号。
链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的例子在例如WO86/02077、DE 19641876 Al、US 6,022,951、WO 98/40396或WO 96/24606中有提及。链霉亲和素突变蛋白的例子是本领域中已知的，参见例如，美国专利号5,168,049；5,506,121；6,022,951；6,156,493；6,165,750；6,103,493；或6,368,813；或者国际公开的PCT申请号WO2014/076277。
在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白可以含有不是未经修饰的或野生型链霉亲和素的一部分的氨基酸，或者可以仅包括野生型或未经修饰的链霉亲和素的一部分。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有至少一个亚基，所述至少一个亚基与未经修饰的或野生型链霉亲和素的亚基相比(例如与在SEQ ID NO:61所示的野生型链霉亲和素亚基或例如在SEQ ID NO:62所示的其功能活性片段相比)可以具有一个或多个氨基酸取代(置换)。
在一些实施方案中，链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白对结合结构域的结合亲和力如解离常数(Kd)小于1x10-4M、5x10-4M、1x10-5M、5x10-5M、1x10-6M、5x10-6M或1x10-7M，但是通常大于1x10-13M、1x10-12M或1x10-11M。例如，如美国专利号5,506,121中披露的肽序列(例如，Strep-tag)可以用作生物素模拟物并显示对链霉亲和素的结合亲和力，例如，其Kd大约在10-4与10-5M之间。在一些情况下，所述结合亲和力可以通过在链霉亲和素分子内进行突变来进一步改进，参见例如美国专利号6,103,493或WO2014/076277。在一些实施方案中，结合亲和力可以通过本领域已知的方法(例如本文所述的任何方法)来确定。
在一些实施方案中，所述试剂(如链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白)展现出对肽配体结合配偶体的结合亲和力，所述肽配体结合配偶体可以是药剂(例如受体结合剂或选择剂)中存在的结合配偶体C。在一些实施方案中，肽序列含有具有通式His-Pro-Xaa的序列，其中Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，如含有SEQ ID NO:78所示的序列。在一些实施方案中，肽序列含有SEQ ID NO:93所示的序列。在一些实施方案中，肽序列具有SEQ IDNO:79所示的通式，如SEQ ID NO:69所示。在一个例子中，肽序列是Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(也称为
Figure BDA0003008592730001131
示于SEQ ID NO:70中)。在一个例子中，肽序列是Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(也称为
Figure BDA0003008592730001132
II，示于SEQ ID NO:64中)。在一些实施方案中，肽配体含有至少两个链霉亲和素结合模块的顺序排列，其中在所述两个模块之间的距离为至少0个且不大于50个氨基酸，其中一个结合模块具有3个至8个氨基酸并且含有至少序列His-Pro-Xaa，其中Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，并且其中另一个结合模块具有相同或不同的链霉亲和素肽配体，如SEQ ID NO:79所示(参见例如国际公开的PCT申请号WO 02/077018；美国专利号7,981,632)。在一些实施方案中，肽配体含有具有SEQ IDNO:71或72中任一个所示的式的序列。在一些实施方案中，肽配体具有SEQ ID NO:65-67、73-74中任一个所示的氨基酸序列。在大多数情况下，所有这些链霉亲和素结合肽结合相同的结合位点，即链霉亲和素的生物素结合位点。如果将一种或多种此类链霉亲和素结合肽用作结合配偶体C(例如C1和C2)，经由结合配偶体C与所述一种或多种药剂结合的多聚化试剂和/或低聚颗粒试剂通常由一种或多种链霉亲和素突变蛋白构成。
在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白是如美国专利号6,103,493中所述的突变体。在一些实施方案中，基于野生型链霉亲和素的氨基酸序列(如SEQ ID NO:61所示)，链霉亲和素突变蛋白在氨基酸位置44至53的区域内含有至少一个突变。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白在一个或多个残基44、45、46和/或47处含有突变。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有疏水性脂肪族氨基酸(例如Val、Ala、Ile或Leu)对野生型链霉亲和素的位置44处的Glu的置换，位置45处的任何氨基酸，位置46处的脂肪族氨基酸(如疏水性脂肪族氨基酸)，和/或碱性氨基酸(例如Arg或Lys，如通常Arg)对位置47处的Val的置换。在一些实施方案中，Ala处于位置46和/或Arg处于位置47和/或Val或Ile处于位置44。在一些实施方案中，链霉亲和素突变体含有残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47，如含有SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76或77所示氨基酸序列的示例性链霉亲和素突变蛋白中所示(也称为链霉亲和素突变体1，SAM1)。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有残基Ile44-Gly45-Ala46-Arg47，如含有SEQ ID NO:80、63或68所示氨基酸序列的示例性链霉亲和素突变蛋白中所示(也称为SAM2)。在一些情况下，这种链霉亲和素突变蛋白描述于例如美国专利6,103,493中，并且可以在商标
Figure BDA0003008592730001143
下商业购得。在一些实施方案中，突变蛋白链霉亲和素含有SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述分子是链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的四聚体，其包含SEQ ID NO:62、76、63、81、83、77或68中任一个所示的序列，作为四聚体，其是含有20个伯胺(每个单体包括1个N末端胺和4个赖氨酸)的分子。
在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白展现特征为如下解离常数(Kd)的结合亲和力：对于肽配体(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly；也称为
Figure BDA0003008592730001141
示于SEQ IDNO:70中)，为或小于3.7x10-5M；和/或对于肽配体(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys；也称为
Figure BDA0003008592730001142
II，示于SEQ ID NO:64中)，为或小于7.1x10-5M；和/或对于SEQ ID NO:64、71-74、65-67、69、70、78、79中任一个所示的任何肽配体，为或小于7.0x10-5M、5.0x10-5M、1.0x10-5M、5.0x10-6M、1.0x10-6M、5.0x10-7M或1.0x10-7M，但通常大于1x10-13M、1x10-12M或1x10-11M。
在一些实施方案中，所得链霉亲和素突变蛋白展现特征为如下缔合常数(Ka)的结合亲和力：对于肽配体(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly；也称为
Figure BDA0003008592730001151
示于SEQID NO:70中)，为或大于2.7x104M-1；和/或对于肽配体(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys；也称为
Figure BDA0003008592730001152
II，示于SEQ ID NO:64中)，为或大于1.4x104M-1；和/或对于SEQ IDNO:64、71-74、65-67、69、70、78、79中任一个所示的任何肽配体，为或大于1.43x104M-1、1.67x104M-1、2x104M-1、3.33x104M-1、5x104M-1、1x105M-1、1.11x105M-1、1.25x105M-1、1.43x105M-1、1.67x105M-1、2x105M-1、3.33x105M-1、5x105M-1、1x106M-1、1.11x106M-1、1.25x106M-1、1.43x106M-1、1.67x106M-1、2x106M-1、3.33x106M-1、5x106M-1、1x107M-1，但通常小于1x1013M-1、1x1012M-1或1x1011M-1。
在特定实施方案中，本文提供了由多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体构成和/或含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体的寡聚颗粒试剂。在某些实施方案中，本文提供的寡聚颗粒试剂含有可逆地结合或能够可逆地结合一种或多种药剂(例如刺激剂和/或选择剂)的多个结合位点。在一些实施方案中，寡聚颗粒具有在70nm与125nm之间包含端值的半径(例如，平均半径)；在1x107g/mol与1x109g/mol之间包含端值的分子量；和/或在1,000与5,000之间的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体，包含端值。在一些实施方案中，寡聚颗粒试剂与一种或多种药剂结合(例如可逆地结合)，所述一种或多种药剂例如为与细胞表面上的分子(例如受体)结合的药剂。在某些实施方案中，一种或多种药剂是本文例如章节I-B-1-a中所述的药剂。在一些实施方案中，所述药剂是抗CD3和/或抗CD28抗体或其抗原结合片段，如抗体或其抗原片段，其含有结合配偶体，例如，链霉亲和素结合肽，例如
Figure BDA0003008592730001153
II。在特定实施方案中，一种或多种药剂是含有结合配偶体(例如链霉亲和素结合肽，例如
Figure BDA0003008592730001154
II)的抗CD3和/或抗CD28 Fab。在特定实施方案中，一种或多种药剂包含基于链霉亲和素的寡聚物，如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep-tag标签的抗CD3和带Strep-tag标签的抗CD28 Fab缀合。在一些实施方案中，寡聚颗粒试剂是如WO 2015/158868或WO 2018/197949中所述的任一种。
在一些实施方案中，本文提供了由多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体构成和/或含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体的寡聚颗粒试剂。在某些实施方案中，本文提供的寡聚颗粒试剂含有可逆地结合或能够可逆地结合一种或多种药剂(例如刺激剂和/或选择剂)的多个结合位点。在一些实施方案中，寡聚颗粒具有在80nm与120nm之间包含端值的半径(例如，平均半径)；在7.5x106g/mol与2x108g/mol之间包含端值的分子量(例如，平均分子量)；和/或在500与10,000之间的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体包含端值的量(例如，平均量)。在一些实施方案中，寡聚颗粒试剂与一种或多种药剂结合(例如可逆地结合)，所述一种或多种药剂例如为与细胞表面上的分子(例如受体)结合的药剂。在某些实施方案中，一种或多种药剂是本文例如在章节I-B-1-a中所述的药剂。在一些实施方案中，所述药剂是抗CD3和/或抗CD28 Fab，如含有结合配偶体(例如，链霉亲和素结合肽，例如
Figure BDA0003008592730001161
II)的Fab。在特定实施方案中，一种或多种药剂是含有结合配偶体(例如链霉亲和素结合肽，例如
Figure BDA0003008592730001162
II)的抗CD3和/或抗CD28 Fab。
在一些实施方案中，在以下的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激：每106个细胞为、为约或为至少0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、或10μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚物，如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep-tag标签的抗CD3和带Strep-tag标签的抗CD28Fab缀合)。在一些实施方案中，在以下的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激：每106个细胞为或为约4μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚物，如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep-tag标签的抗CD3和带Strep-tag标签的抗CD28 Fab缀合)。在特定实施方案中，在以下的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激：每106个细胞为或为约1.2μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚物，如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep-tag标签的抗CD3和带Strep-tag标签的抗CD28 Fab缀合)。在特定实施方案中，在以下的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激：每106个细胞为或为约0.8μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚物，如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep-tag标签的抗CD3和带Strep-tag标签的抗CD28 Fab缀合)。在特定实施方案中，在以下的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激：每106个细胞为或为约1.8μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚物，如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep-tag标签的抗CD3和带Strep-tag标签的抗CD28 Fab缀合)。在某些方面，在寡聚刺激试剂内，寡聚颗粒与附着药剂的质量比为约3:1。在某些方面，在寡聚刺激试剂内，寡聚颗粒、附着的抗CD3 Fab与附着的抗CD28 Fab之间的质量比为约3:0.5:0.5。在某些方面，4μg寡聚刺激试剂是或包括3μg寡聚颗粒和1μg附着药剂，例如，0.5μg抗CD3 Fab和0.5μg抗CD28 Fab。在其他例子中，每106个细胞的1.2μg寡聚刺激试剂是或包括每106个细胞的0.9μg寡聚颗粒和0.3μg附着药剂，例如，0.15μg抗CD3 Fab和0.15μg抗CD28 Fab。在一些实施方案中，将寡聚刺激试剂添加至无血清培养基，并且刺激在无血清培养基中进行，例如，如本文在章节II中或在PCT/US2018/064627中所述。
在特定实施方案中，使为或为约900x106个T细胞(例如，900x106个CD3+T细胞、或450x106个CD4+T细胞和450x06个CD8+T细胞)的量的输入群体在寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚物，如链霉亲和素突变蛋白寡聚物，其与带Strep-tag标签的抗CD3和带Strep-tag标签的抗CD28 Fab缀合)的存在下经受刺激，例如，在刺激条件下培养。在某些实施方案中，以以下密度对所述细胞(例如，输入群体的细胞)进行刺激或使其经受刺激(例如，在刺激条件下如在刺激试剂的存在下培养)：为、为约或至少0.01x106个细胞/mL、0.1x106个细胞/mL、0.5x106个细胞/mL、1.0x106个细胞/mL、1.5x106个细胞/mL、2.0x106个细胞/mL、2.5x106个细胞/mL、3.0x106个细胞/mL、4.0x106个细胞/mL、5.0x106个细胞/mL、10x106个细胞/mL、或50x106个细胞/mL。在某些实施方案中，以为、为约或至少3.0x106个细胞/mL的密度对所述细胞(例如，输入群体的细胞)进行刺激或使其经受刺激(例如，在刺激条件下如在刺激试剂的存在下培养)。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有一种或多种补充剂的基础培养基(例如OpTmizerTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher))。在一些实施方案中，所述一种或多种补充剂不含血清。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有一种或多种另外的组分的基础培养基，所述另外的组分用于细胞(例如，T细胞)的维持、扩增和/或激活，如由另外的补充剂(例如OpTmizerTMT细胞扩增补充剂(ThermoFisher))来提供。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含血清替代物补充剂，例如，免疫细胞血清替代物，例如，ThermoFisher(#A2596101)、CTSTM免疫细胞血清替代物、或Smith等人Clin TranslImmunology.2015年1月；4(1):e31中所述的免疫细胞血清替代物。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含游离形式的氨基酸，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，如GlutamaxTM(ThermoFisher)中的二肽。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含一种或多种重组细胞因子，如重组人IL-2(例如，100IU/mL)、重组人IL-7(例如，600IU/mL)和/或重组人IL-15(例如，100IU/mL)。
C.基因工程化
在一些实施方案中，所提供的方法包括将细胞基因工程化，例如，引入编码重组蛋白的异源或重组多核苷酸。此类重组蛋白可以包括重组受体，如章节III中所述的任一种。可以使用将导致编码重组受体的多核苷酸整合至细胞如T细胞的基因组中的引入异源或重组多核苷酸的任何方法，包括病毒和非病毒基因工程化过程。将编码重组蛋白的多核苷酸(例如，异源或重组多核苷酸)引入细胞中可以使用多种已知载体中的任一种来进行。此类载体包括病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统。示例性方法包括用于转移编码受体的异源多核苷酸的那些方法，包括经由病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)转导。在一些实施方案中，将刺激细胞群基因工程化，如以引入编码重组受体的异源或重组多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体(本文中也称为转化的细胞群)。
在一些实施方案中，所提供的方法包括使用非病毒方法将细胞基因工程化，例如，引入编码重组蛋白的异源或重组多核苷酸，所述非病毒方法如电穿孔、磷酸钙转染、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染、纳米颗粒如脂质纳米颗粒、钨颗粒促进的微粒轰击、磷酸锶DNA共沉淀以及在例如WO 2014055668和美国专利号7,446,190中所述的其他方法。还考虑基于转座子的系统。
在特定实施方案中，在已经如通过本文例如在章节I-B中提供的任何方法将细胞刺激、激活和/或在刺激条件下孵育之后，将细胞基因工程化、转化或转导。在特定实施方案中，在基因工程化、转化、转染或转导细胞之前，一个或多个受刺激的群体先前已经进行冷冻保护和储存，并且被解冻且任选地洗涤。
在特定实施方案中，在对细胞进行刺激或使其经受刺激或在刺激条件下培养之后，将细胞基因工程化、转化或转导。在特定实施方案中，在从刺激开始起的以下时间、约以下时间或以下时间内，将细胞基因工程化、转化或转导：72小时、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时，包含端值。在特定实施方案中，在从刺激开始起的以下时间、约以下时间或以下时间内，将细胞基因工程化、转化或转导：3天、两天或一天，包含端值。在某些实施方案中，在开始刺激之后在或在约12小时与48小时之间、16小时与36小时之间或18小时与30小时之间，将细胞基因工程化、转化或转导。在特定实施方案中，在开始刺激之后在或在约18小时与30小时之间，将细胞基因工程化、转化或转导。在特定实施方案中，在开始刺激之后在或在约16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，将细胞基因工程化、转化或转导。
在某些实施方案中，用于基因工程化的方法是通过以下方式来进行：使群体的一个或多个细胞与编码重组蛋白例如重组受体的核酸分子或多核苷酸接触，或向所述细胞中引入所述核酸分子或多核苷酸。在某些实施方案中，核酸分子或多核苷酸对于所述细胞是异源的。在特定实施方案中，异源核酸分子或异源多核苷酸对于所述细胞并非天然的。在某些实施方案中，异源核酸分子或异源多核苷酸编码并非所述细胞天然表达的蛋白质，例如，重组蛋白。在特定实施方案中，异源核酸分子或多核苷酸是或含有在所述接触或引入之前未在所述细胞中发现的核酸序列。
在一些实施方案中，所述细胞(例如，刺激的细胞)被工程化(例如，转导)，或在转导佐剂的存在下。示例性转导佐剂包括但不限于聚阳离子、纤连蛋白或源自纤连蛋白的片段或变体、以及RetroNectin。在某些实施方案中，在聚阳离子、纤连蛋白或源自纤连蛋白的片段或变体和/或RetroNectin的存在下将所述细胞工程化。在特定实施方案中，在聚阳离子的存在下将所述细胞工程化，所述聚阳离子是聚凝胺、DEAE-葡聚糖、硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸或阳离子脂质体。在特定实施方案中，在硫酸鱼精蛋白的存在下将所述细胞工程化。在一些实施方案中，寡聚刺激试剂的存在(例如，如章节I-B-1中所述)可以用作转导佐剂，参见例如，WO/2017/068419，所述申请通过引用并入本文。
在一些实施方案中，基因工程化(例如，转导)是在无血清培养基中进行，例如如本文在章节II中或在PCT/US2018/064627中所述。在一些实施方案中，无血清培养基是定义的或明确定义的细胞培养基。在某些实施方案中，无血清培养基是受控培养基，其已经过处理，例如被过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些实施方案中，无血清培养基含有蛋白质。在某些实施方案中，无血清培养基可含有血清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、载体蛋白和/或附着因子。
在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子的存在下将所述细胞工程化。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括重组IL-2。
在特定实施方案中，在刺激条件下在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下将细胞(例如，刺激的细胞)工程化。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在某些实施方案中，所述细胞被工程化(例如，转导)，或在刺激条件下，在重组IL-2、IL-7和IL-15(如重组人IL-2(例如，100IU/mL)、重组人IL-7(例如，600IU/mL)和/或重组人IL-15(例如，100IU/mL))的存在下。
在一些实施方案中，在与刺激期间存在的培养基相同或相似的培养基的存在下将细胞基因工程化、转化或转导。在一些实施方案中，在具有与刺激期间存在的培养基相同的细胞因子的培养基中将细胞基因工程化、转化或转导。在某些实施方案中，在以相同浓度具有与刺激期间存在的培养基相同的细胞因子的培养基中将细胞基因工程化、转化或转导。
1.转导
在一些实施方案中，将细胞基因工程化是或包括将多核苷酸(例如，异源或重组多核苷酸)通过转导引入细胞中。在一些实施方案中，所述细胞用病毒载体进行转导或经受转导。在特定实施方案中，所述细胞用病毒载体进行转导或经受转导。在一些实施方案中，所述病毒是逆转录病毒载体，如γ逆转录病毒载体或慢病毒载体。慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，所述转导通过使群体的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，所述接触可以通过离心如旋转接种(例如离心接种)来实现。所述方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的任何方法。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于
Figure BDA0003008592730001212
和
Figure BDA0003008592730001211
2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统和处理仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其全文并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在特定实施方案中，使已经经受刺激(例如，在刺激条件下培养)的组合物中为、为约或为至少50x106、100x106、150x106、200x106、250x106、300x106、350x106、400x106、450x106、500x106、550x106、600x106、700x106、800x106、900x106、或1,000x106的量的细胞经受基因工程化，例如，转导。在特定实施方案中，已经经受刺激并且随后经受转导的细胞(例如，活T细胞，包括CD4+T细胞和CD8+T细胞两者)的总数量是为或约50x106个细胞、为或约100x106个细胞、为或约150x106个细胞、为或约200x106个细胞、为或约250x106个细胞、为或约300x106个细胞、为或约350x106个细胞、为或约400x106个细胞、为或约450x106个细胞、为或约500x106个细胞、为或约550x106个细胞、为或约600x106个细胞、为或约700x106个细胞、为或约800x106个细胞、为或约900x106个细胞、或者为或约1,000x106个细胞，或者任何前述值之间的任何值。在特定实施方案中，使输入群体中多达900x106个细胞经受刺激，并且使为、为约或多达600x106个细胞的量的已经经受刺激的细胞经受基因工程化，例如，转导。在特定实施方案中，经受基因工程化(例如，转导)的细胞组合物以如下比率包含活CD4+T细胞和活CD8+T细胞：在1:10与10:1之间、在1:5与5:1之间、在4:1与1:4之间、在1:3与3:1之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25之间、在1.2:1与1:1.2之间、在1.1:1与1:1.1之间、或约1:1、或1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞。
在一些实施方案中，所提供的方法与将含有编码重组受体的多核苷酸的病毒载体转导至、至约或至少于300x106个细胞(例如，受刺激细胞群的活T细胞)中结合使用。在某些实施方案中，为或约100x106个细胞(例如，受刺激细胞群的活T细胞)进行转导或经受转导。
在一些实施方案中，所提供的方法与将含有编码重组受体的多核苷酸的病毒载体转导至、至约或至少于600x106个细胞(例如，受刺激细胞群的活T细胞)中结合使用。在某些实施方案中，为或约600x106个细胞(例如，受刺激细胞群的活T细胞)进行转导或经受转导。在一些实施方案中，使多达900x106个细胞(例如，活CD3+细胞或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合))经受刺激，并且使为、为约或多达600x106个细胞的量的已经经受刺激的细胞经受转导。
在一些实施方案中，转导在无血清培养基中进行。在一些实施方案中，转导在IL-2、IL-7和IL-15的存在下进行。在一些实施方案中，将用于转导的病毒载体在使用前冷冻并解冻，并用无血清培养基稀释解冻的病毒载体。在一些实施方案中，用于稀释病毒载体和用于转导的无血清培养基如本文在章节II中或PCT/US2018/064627中所述。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有一种或多种补充剂的基础培养基(例如OpTmizerTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher))。在一些实施方案中，所述一种或多种补充剂不含血清。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有一种或多种另外的组分的基础培养基，所述另外的组分用于细胞(例如，T细胞)的维持、扩增和/或激活，如由另外的补充剂(例如OpTmizerTMT细胞扩增补充剂(ThermoFisher))来提供。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含血清替代物补充剂，例如，免疫细胞血清替代物，例如，ThermoFisher(#A2596101)、CTSTM免疫细胞血清替代物、或Smith等人Clin TranslImmunology.2015年1月；4(1):e31中所述的免疫细胞血清替代物。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含游离形式的氨基酸，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，如GlutamaxTM(ThermoFisher)中的二肽。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含一种或多种重组细胞因子，如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15。
在特定实施方案中，所述细胞(例如，受刺激细胞群的细胞)含有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的作为CD4+T细胞或CD8+T细胞的细胞。在一些实施方案中，转导(包括转导后孵育)进行24小时与48小时之间、36小时与12小时之间、18小时与30小时之间，或者进行或进行约24小时。在一些实施方案中，转导(包括转导后孵育)分别进行或进行约24小时、48小时或72小时，或者进行或进行约1天、2天或3天。在特定实施方案中，转导(包括转导后孵育)进行或进行约24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时。在特定实施方案中，转导(包括转导后孵育)进行或进行约72小时、72±4小时，或者进行或进行约3天。
在某些实施方案中，在起始或开始孵育(例如，在刺激条件下孵育)的两天内、36小时内、30小时内、24小时内、18小时内、16小时内、14小时内、或12小时内，开始转导步骤。在某些实施方案中，在起始或开始孵育(例如，在刺激条件下孵育)约20小时，开始转导步骤。在某些实施方案中，在起始或开始孵育(例如，在刺激条件下孵育)20±4小时，开始转导步骤。
在一些实施方案中，将系统与其他仪器一起包括和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在系统中执行的一个或多个各种其他处理步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO 2016/073602中描述的离心室系统进行的一个或多个处理步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。
在一些实施方案中，所述系统包含一系列容器，例如袋、管路、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，容器(例如袋子)包括一个或多个容器(例如袋子)，其在同一容器或单独容器(例如同一袋子或单独袋子)中含有要转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，系统还包括一个或多个容器(例如袋子)，所述容器含有介质，如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他组件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或群体。所述容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。
在一些实施方案中，室与离心机相关联，离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴旋转。结合细胞的转导和/或在一个或多个其他处理步骤中，旋转可以发生在孵育之前、期间和/或之后。因此，在一些实施方案中，各个处理步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。所述室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。
在一些实施方案中，在将群体提供至空腔之前，可以将含有细胞的群体和含有病毒载体颗粒的群体和任选地空气组合或混合。在一些实施方案中，含有细胞的群体和含有病毒载体颗粒的群体和任选地空气是单独提供并且在空腔中组合并混合。在一些实施方案中，可以按任何顺序将含有细胞的群体、含有病毒载体颗粒的群体和任选地空气提供至内部空腔中。在此类一些实施方案中的任一个中，含有细胞和病毒载体颗粒的群体在组合或混合在一起后就是输入群体，不论是在离心室内部还是外部组合或混合的，和/或不论细胞和病毒载体颗粒是一起还是单独(如同时或依序)提供至离心室中。
在一些实施方案中，在转导方法中，在孵育细胞和病毒载体颗粒(如旋转)之前，进行一定体积的气体(如空气)的摄入。在一些实施方案中，在转导方法中，在细胞和病毒载体颗粒的孵育(如旋转)期间，进行一定体积的气体(如空气)的摄入。
在一些实施方案中，构成转导群体的细胞或病毒载体颗粒的液体体积、以及任选地空气的体积可以是预定体积。所述体积可以是被编程到与系统相关的电路中和/或由与所述系统相关的电路控制的体积。
在一些实施方案中，手动、半自动和/或自动地控制转导群体和任选地气体(如空气)的摄入，直到已经将所需或预定的体积摄入室的内部空腔中为止。在一些实施方案中，与系统相关的传感器可以例如经由液体和/或气体的颜色、流速和/或密度来检测流入和流出离心室的液体和/或气体，并且可以与相关电路通信，以按照需要停止或继续摄入，直到已经实现这种所需或预定体积的摄入为止。在一些方面，可以使被编程或仅能够检测系统中的液体而非气体(例如空气)的传感器能够在不停止摄入的情况下允许气体(如空气)通过进入系统中。在一些此类实施方案中，当需要气体(如空气)摄入时，可以将一条不透明的管道放置在传感器附近的线中。在一些实施方案中，可以手动地控制气体(如空气)的摄入。
在所提供的方法的方面中，使离心室的内部空腔经受高速旋转。在一些实施方案中，在摄入液体输入群体和任选地空气之前、同时、之后或间歇地实现旋转。在一些实施方案中，在摄入液体输入群体和任选地空气之后实现旋转。在一些实施方案中，旋转通过离心室的离心来进行，其在内部空腔的侧壁内表面处和/或在细胞的表面层处的相对离心力为或约或者至少为或至少约200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、1000g、1100g、1500、1600g、1800g、2000g、2200g、2500g、3000g、3200g、3500g或4000g。在一些实施方案中，旋转通过离心进行，其力大于或大于约1100g，如大于或大于约1200g、大于或大于约1400g、大于或大于约1600g、大于或大于约1800g、大于或大于约2000g、大于或大于约2400g、大于或大于约2800g、大于或大于约3000g或者大于或大于约3200g。在特定实施方案中，通过离心进行的旋转的力在600g与800g之间。在特定实施方案中，通过离心进行的旋转的力为或为约693g。在一些实施方案中，旋转通过离心进行，其力为或为约1600g。
在一些实施方案中，将室的空腔中的气体(如空气)从室中排出。在一些实施方案中，将气体(如空气)排出到容器，所述容器作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接。在一些实施方案中，容器是自由或空的容器。在一些实施方案中，室的空腔中的空气(如气体)通过过滤器排出，所述过滤器经由无菌管组线与室的内部空腔可操作地连接。在一些实施方案中，使用手动、半自动或自动过程排出空气。在一些实施方案中，在从室的空腔中输送(express)含有孵育的细胞和病毒载体颗粒(如已经开始转导的细胞或已经用病毒载体转导的细胞)的输出群体之前、同时、间歇地或随后将空气从室中排出。
在一些实施方案中，转导和/或其他孵育作为连续或半连续过程或作为所述连续或半连续过程的一部分进行。在一些实施方案中，连续过程涉及连续摄入细胞和病毒载体颗粒，例如转导组合物(作为单一预先存在的组合物，或者通过连续抽入同一容器(例如空腔)中，从而混合其部分)，和/或在孵育的至少一部分期间(例如，在离心的同时)，从容器中连续输送或排出液体，以及任选地排出气体(例如空气)。在一些实施方案中，至少部分同时进行连续摄入和连续输送。在一些实施方案中，连续摄入发生在部分孵育期间，例如在部分离心期间，并且连续输送发生在孵育的单独部分期间。两者可以交替进行。因此，在进行孵育的同时，连续摄入和输送可以允许处理(例如转导)总体积更大的样品。
在一些实施方案中，孵育是连续过程的一部分，所述方法包括在孵育的至少一部分期间，实现在室旋转期间以及在孵育的一部分期间将所述转导组合物连续摄入空腔中，实现在室的旋转期间通过至少一个开口从空腔中连续输送液体并任选地排出气体(例如空气)。
在一些实施方案中，通过在以下步骤之间交替来进行半连续孵育：实现将组合物摄入空腔中，孵育，从空腔中输送液体和任选地从空腔中排出气体(例如空气)，如到输出容器，然后摄入含有更多细胞和用于处理的其他试剂(例如，病毒载体颗粒)的后续(例如第二、第三等)组合物，并重复所述过程。例如，在一些实施方案中，孵育是半连续过程的一部分，所述方法包括在孵育之前，实现通过所述至少一个开口将转导组合物摄入空腔中，并在孵育之后，实现从空腔中输送流体；实现将包含细胞和病毒载体颗粒的另一种转导组合物摄入所述内部空腔中；并且在所述内部空腔中在一定条件下孵育另一种转导组合物，借此将所述另一种转导组合物中的所述细胞用所述载体转导或经受转导。所述过程可以以迭代的方式再继续进行多轮。在此方面，半连续或连续方法可以允许产生甚至更大体积和/或数量的细胞。
在一些实施方案中，转导孵育的一部分在离心室中进行，在包括旋转或离心的条件下进行。
在特定实施方案中，用病毒载体转导细胞是或包括旋转接种，例如，含有细胞和病毒颗粒的混合物的离心。在一些实施方案中，可以使含有细胞和病毒颗粒的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从或从约600rpm至1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm、或1500rpm、或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转以如下力(例如，相对离心力)进行：从或从约100g至4000g(例如为或约或者至少为或至少约100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3500g)，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。
在一些实施方案中，将所述细胞用病毒载体以如下力(例如，相对离心力)旋转接种：在或在约100g与4000g之间、200g与1,000g之间、500g与1200g之间、1000g与2000g之间、600g与800g之间、1200g与1800g之间、或1500g与1800g之间。在某些实施方案中，将所述细胞用病毒载体颗粒以如下力旋转接种：为、为至少或为约100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1200g、1500g、1600g、2000g、2500g、3000g、3200g、或3500g。在一些实施方案中，将所述细胞用病毒载体以为或为约692g或693g的力进行转导或经受转导。在特定实施方案中，将所述细胞用病毒载体以为或为约1600g的力进行转导或经受转导。在一些实施方案中，所述力是在内部空腔的侧壁的内表面处和/或在细胞的表面层处的力。
在某些实施方案中，将所述细胞旋转接种，例如，使含有细胞和病毒载体的细胞组合物旋转，进行大于或大于约5分钟，如大于或大于约10分钟、大于或大于约15分钟、大于或大于约20分钟、大于或大于约30分钟、大于或大于约45分钟、大于或大于约60分钟、大于或大于约90分钟或者大于或大于约120分钟；或者在或在约5分钟与120分钟之间、30分钟与90分钟之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、30分钟与60分钟之间或45分钟与60分钟之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，将所述细胞用病毒载体旋转接种，进行为或为约30分钟。在某些实施方案中，将所述细胞用病毒载体旋转接种，进行为或为约60分钟。
在一些实施方案中，转导方法包括转导组合物和任选地空气在离心室中的旋转接种(例如，旋转或离心)，持续大于或大于约5分钟，如大于或大于约10分钟、大于或大于约15分钟、大于或大于约20分钟、大于或大于约30分钟、大于或大于约45分钟、大于或大于约60分钟、大于或大于约90分钟或者大于或大于约120分钟。在一些实施方案中，将转导组合物和任选地空气在离心室中旋转或离心大于5分钟，但不超过60分钟、不超过45分钟、不超过30分钟或不超过15分钟。在特定实施方案中，转导包括旋转或离心进行为或为约60分钟。
在一些实施方案中，转导方法包括转导组合物和任选地空气在离心室中旋转或离心，进行在或在约10分钟与60分钟之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、30分钟与60分钟之间或45分钟与60分钟之间，每个都包含端值，并且其在内部空腔的侧壁的内表面处和/或在细胞的表面层处的力为、为约或在1000g、1100g、1200g、1400g、1500g、1600g、1800g、2000g、2200g、2400g、2800g、3200g或3600g。在特定实施方案中，转导方法包括转导组合物(例如，细胞和病毒载体颗粒)以为或为约1600g旋转或离心，进行为或为约60分钟。
2.病毒载体颗粒
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(如例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移至细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550-557。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，要表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了多种说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human GeneTherapy1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109)。
病毒载体基因组通常以质粒形式构建，其可以转染到包装细胞系或生产细胞系中。在任何此类例子中，将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸插入或定位在病毒载体的区域中，例如通常在病毒基因组的非必需区域中。在一些实施方案中，将核酸插入病毒基因组的某些病毒序列的位置中以产生具有复制缺陷的病毒。
可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因传递系统：第一，包装质粒，包括结构蛋白以及产生病毒载体颗粒所必需的酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分之一或两者时引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺少另外的病毒基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef和/或Tat(HIV的主要反式激活因子))。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含三种亲本病毒的基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。
在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代地，除了一种或多种目标序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并且在包装细胞系中单独提供。
在一些实施方案中，用含有产生颗粒所必需的组分的一种或多种质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目标序列，即编码抗原受体(例如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(例如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多种载体分离产生逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了重组事件的可能性，否则可能产生有复制能力的病毒。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单一质粒载体。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性、多嗜性或双嗜性包膜，如辛德比斯病毒包膜、GALV或VSV-G。
在一些实施方案中，包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装到慢病毒载体颗粒中反式作用所需的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达所述一种或多种病毒蛋白。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。
在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒经由转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是熟知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，所述包装序列可以允许待包装至病毒颗粒中的重组质粒的RNA转录，然后所述病毒颗粒可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，随后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。
在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒颗粒，而在包装细胞系(例如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，所述包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如HEK293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有可以回收并滴定的重组慢病毒载体。
所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，如CAR)的表达。
3.孵育细胞
在特定实施方案中，如通过用病毒载体转化(例如转导)细胞进行基因工程化还包括在向细胞引入病毒载体或使细胞与病毒载体接触之后孵育细胞的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在用于基因工程化、转化、转导或转染细胞以将病毒载体引入细胞中的过程之后，孵育细胞(例如，转化的细胞群的细胞(也称为“转化的细胞”)。在特定实施方案中，所述孵育得到孵育细胞的群体(本文中也称为孵育的细胞群)。
在一些实施方案中，在不进一步处理细胞的情况下进行异源或重组多核苷酸(例如，病毒载体颗粒)的引入之后，孵育所述细胞(例如转化的细胞)。在特定实施方案中，在孵育之前，洗涤细胞，如以去除或基本上去除编码异源或重组多核苷酸的外源或剩余多核苷酸(例如病毒载体颗粒)，如在旋转接种后在基因工程化过程之后培养基中剩余的那些。
在一些此类实施方案中，进一步孵育是在一定条件下实现，以使病毒载体整合到一个或多个细胞的宿主基因组中。例如，进一步孵育在例如经由旋转接种进行转导之后为可能结合至T细胞的病毒载体整合在细胞的基因组内以递送目标基因提供时间。在一些方面，进一步孵育在一定条件下进行，以允许细胞(例如转化的细胞)休眠或恢复，其中在孵育期间对细胞的培养支持或维持细胞的健康。在特定实施方案中，在静态条件(如不涉及培养基的离心、振荡、旋转、摇摆或灌注(例如，连续或半连续灌注)的条件)下孵育细胞。
熟练技术人员可以熟练地评估或确定孵育是否可导致病毒载体颗粒整合至宿主基因组中，并且因此凭经验确定用于进一步孵育的条件。在一些实施方案中，可以通过测量在孵育后由病毒载体颗粒基因组中含有的核酸编码的重组蛋白(如异源蛋白)的表达水平来评估病毒载体在宿主基因组中的整合。可以使用多种熟知方法来评价重组分子的表达水平，例如在细胞表面蛋白的情况下，例如通过基于亲和力的方法(例如基于免疫亲和力的方法)来检测，例如通过流式细胞术进行。在一些例子中，通过检测转导标记和/或报告物构建体来测量表达。在一些实施方案中，编码截短的表面蛋白的核酸包括在载体内并用作其表达和/或增强的标记。
在某些实施方案中，孵育是在静态条件(如不涉及培养基的离心、振荡、旋转、摇摆或灌注(例如，连续或半连续灌注)的条件)下进行。在一些实施方案中，在开始孵育之前或之后不久，例如，在5、15或30分钟内，将细胞转移(例如，在无菌条件下转移)至容器如袋子或小瓶中，并置于孵育器中。
在一些实施方案中，孵育的至少一部分在离心室的内部空腔中进行，如国际公开号WO 2016/073602中所述。
在一些实施方案中，将已经引入编码异源或重组多肽的多核苷酸(例如，病毒载体)的细胞转移至用于孵育的容器中。在一些实施方案中，容器是小瓶。在特定实施方案中，容器是袋子。在一些实施方案中，即所述细胞和任选地异源或重组多肽在封闭或无菌条件下转移至容器中。在一些实施方案中，然后将容器(例如小瓶或袋子)置入孵育器中进行孵育的全部或一部分。在特定实施方案中，将孵育器设定为、为约或至少16℃、24℃或35℃。在一些实施方案中，将孵育器设定为37℃、为约37℃或37℃±2℃、±1℃、±0.5℃或±0.1℃。
在一些方面，用于孵育的条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
在一些实施方案中，在无血清培养基中进行孵育。在一些实施方案中，无血清培养基是定义的和/或明确定义的细胞培养基。在某些实施方案中，无血清培养基是受控培养基，其已经过处理，例如被过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些实施方案中，无血清培养基含有蛋白质。在某些实施方案中，无血清培养基可含有血清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、载体蛋白和/或附着因子。
在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下孵育所述细胞。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括重组IL-2。
在特定实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下孵育细胞。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在某些实施方案中，在重组IL-2、IL-7和IL-15的存在下孵育细胞。
在一些实施方案中，将所述细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的细胞因子(例如，重组人细胞因子)一起孵育：在1IU/mL与1,000IU/mL之间、在10IU/mL与50IU/mL之间、在50IU/mL与100IU/mL之间、在100IU/mL与200IU/mL之间、在100IU/mL与500IU/mL之间、在250IU/mL与500IU/mL之间、或在500IU/mL与1,000IU/mL之间。
在一些实施方案中，将所述细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的IL-2(例如，人重组IL-2)一起孵育：在1IU/mL与500IU/mL之间、在10IU/mL与250IU/mL之间、在50IU/mL与200IU/mL之间、在50IU/mL与150IU/mL之间、在75IU/mL与125IU/mL之间、在100IU/mL与200IU/mL之间、或在10IU/mL与100IU/mL之间。在特定实施方案中，将细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的重组IL-2一起孵育：为或为约50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mL、或100IU/mL。在一些实施方案中，在为或为约100IU/mL重组IL-2(例如，人重组IL-2)的存在下孵育所述细胞(例如，转化的细胞)。
在一些实施方案中，将所述细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的重组IL-7(例如，人重组IL-7)一起孵育：在100IU/mL与2,000IU/mL之间、在500IU/mL与1,000IU/mL之间、在100IU/mL与500IU/mL之间、在500IU/mL与750IU/mL之间、在750IU/mL与1,000IU/mL之间、或在550IU/mL与650IU/mL之间。在特定实施方案中，将所述细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的IL-7一起孵育：为或为约50IU/mL、100IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、250IU/mL、300IU/mL、350IU/mL、400IU/mL、450IU/mL、500IU/mL、550IU/mL、600IU/mL、650IU/mL、700IU/mL、750IU/mL、800IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、或1,000IU/mL。在特定实施方案中，在为或为约600IU/mL IL-7的存在下孵育所述细胞(例如，转化的细胞)。
在一些实施方案中，将所述细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的重组IL-15(例如，人重组IL-15)一起孵育：在1IU/mL与500IU/mL之间、在10IU/mL与250IU/mL之间、在50IU/mL与200IU/mL之间、在50IU/mL与150IU/mL之间、在75IU/mL与125IU/mL之间、在100IU/mL与200IU/mL之间、或在10IU/mL与100IU/mL之间。在特定实施方案中，将细胞(例如，转化的细胞)与如下浓度的重组IL-15一起孵育：为或为约50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mL、或200IU/mL。在一些实施方案中，在为或为约100IU/mL重组IL-15(例如，人重组IL-2)的存在下孵育所述细胞(例如，转化的细胞)。
在特定实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下孵育所述细胞(例如，转化的细胞)。在一些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在某些实施方案中，在重组IL-2、IL-7和IL-15的存在下孵育细胞。
在一些实施方案中，例如，非扩增过程的孵育的全部或一部分在包含以下的培养基中进行：基础培养基(例如，CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher))、谷氨酰胺和一种或多种重组细胞因子，如重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在一些实施方案中，培养基可以含有一种或多种另外的组分，如章节II.B中所示。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分可以包括二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分由另外的补充剂(例如
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补充剂(Thermofisher))提供。在一些实施方案中，培养基是无血清培养基并且不含任何血清组分。在一些方面，培养基可以含有一种或多种血清取代蛋白，如白蛋白、胰岛素或转铁蛋白(例如CTSTM免疫细胞血清替代物)中的一种或多种。示例性无血清培养基或其组分描述于章节II中。
在一些实施方案中，在与细胞刺激期间存在的培养基相同或相似的培养基的存在下孵育细胞，如与上述刺激方法或过程结合进行。在一些实施方案中，在具有与细胞刺激期间存在的培养基相同的细胞因子的培养基中孵育细胞，如与上述刺激方法或过程结合进行。在某些实施方案中，在以相同浓度具有与细胞刺激期间存在的培养基相同的细胞因子的培养基中孵育细胞，如与上述刺激方法或过程结合进行。在一些实施方案中，在不存在重组细胞因子的情况下孵育细胞。在一些实施方案中，在不存在如本文所述的一种或多种细胞因子的情况下孵育细胞。在一些实施方案中，在不存在本文所述的所有细胞因子的情况下孵育细胞。
在一些方面，进一步孵育在一定条件下进行以允许细胞休眠或恢复，所述进一步孵育不包括刺激条件(例如，呈重组细胞因子或其他刺激剂的形式)的存在。例如，孵育在足以支持或维持孵育期间细胞的健康的培养的无脂培养基的存在下进行。
在一些实施方案中，孵育的全部或一部分在基础培养基(如不含一种或多种重组细胞因子或不含任何重组细胞因子的基础培养基)中进行。在一些实施方案中，培养基不包含一种或多种重组细胞因子，如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15。在一些方面，孵育在没有任何重组细胞因子的情况下进行。在某些实施方案中，基础培养基补充有另外的添加剂。在一些实施方案中，基础培养基未补充任何另外的添加剂。细胞培养基的添加剂可以包括但不限于营养素、糖(例如，葡萄糖)、氨基酸、维生素或添加剂(如ATP和NADH)。还可以添加其他添加剂，但通常特定添加剂和量使得含有细胞的培养基的孵育有利于维持细胞，但在孵育期间最小化、限制和/或不诱导细胞的代谢活性。
在特定实施方案中，培养基是基础培养基，其不含一种或多种重组细胞因子并且不含血清组分，即是无血清培养基，但是可以含有一种或多种另外的组分，如章节II.B中所述。在特定实施方案中，在例如非扩增过程的孵育的全部或一部分中使用这种无血清培养基提供无脂培养基，所述无脂培养基提供细胞的维持，但不包括可以激活细胞或使细胞具有代谢活性的某些因子，从而培养所处状态是或可能是休眠或静息状态的细胞。在一些方面，在这种无血清培养基的存在下孵育允许细胞在刺激和基因工程化(例如转导)之后恢复或休眠。在一些方面，在这种无血清培养基的存在下孵育得到输出组合物，所述输出组合物含有对损伤或活力的损失不太敏感的细胞，例如在制造过程期间或之后，以及在将收获/配制的细胞冷冻保存，然后在即将使用前解冻时。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞在解冻时具有的半胱天冬酶或其他细胞凋亡标记的水平低于在类似培养基中孵育的细胞，但所述类似培养基含有一种或多种重组细胞因子、血清或可能使细胞的代谢活性在输出组合物的冷冻保存时更强的其他因子。
在一些实施方案中，基础培养基含有无机盐、糖、氨基酸和任选地维生素、有机酸和/或缓冲液或其他熟知的细胞培养营养素的混合物。除了营养素外，所述培养基还有助于维持pH和渗透压。在一些方面，基础培养基的试剂支持细胞生长、增殖和/或扩增。多种可商业购得的基础培养基对本领域技术人员而言是熟知的，并且包括达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、罗斯威尔公园纪念学院培养基(Roswell Park Memorial Institute Medium，RPMI)、伊斯科夫改良的达尔伯克培养基和哈氏(Hams)培养基。在一些实施方案中，基础培养基是伊斯科夫改良的达尔伯克培养基、RPMI-1640或α-MEM。
在一些实施方案中，基础培养基是平衡盐溶液(例如，PBS、DPBS、HBSS、EBSS)。在一些实施方案中，基础培养基选自达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良的达尔伯克培养基和M199。在一些实施方案中，基础培养基是复合培养基(例如，RPMI-1640、IMDM)。在一些实施方案中，基础培养基是OpTmizerTMCTSTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)。
在一些实施方案中，基础培养基不含蛋白质。在一些实施方案中，基础培养基不含人蛋白(例如，人血清蛋白)。在一些实施方案中，基础培养基不含血清。在一些实施方案中，基础培养基不含源自人的血清。在一些实施方案中，基础培养基不含重组蛋白。在一些实施方案中，基础培养基不含人蛋白和重组蛋白。在一些实施方案中，基础培养基不含如本文所述的一种或多种或所有细胞因子。在一些实施方案中，例如非扩增过程的孵育的全部或一部分在不含任何另外的添加剂或重组细胞因子的基础培养基中进行。在一些实施方案中，基础培养基是不含任何另外的添加剂或重组细胞因子的CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher)。
在一些实施方案中，例如非扩增过程的孵育的全部或一部分在包含以下的培养基中进行：基础培养基和谷氨酰胺，例如，含有谷氨酰胺的CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher)。
在一些实施方案中，例如非扩增过程的孵育的全部或一部分在包含以下的培养基中进行：不含一种或多种重组细胞因子如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15的基础培养基(例如，CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher))。在一些实施方案中，所述培养基补充有一种或多种另外的非血清组分，如章节II.B中所示。在一些实施方案中，所述一种或多种补充剂不含血清。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含游离形式的氨基酸，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述无血清培养基不包含血清替代物补充剂。在一些实施方案中，所述无血清培养基不包含二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述无血清培养基不包含任何重组细胞因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有T细胞补充剂和游离形式的L-谷氨酰胺的基础培养基，并且不含任何免疫细胞血清替代物、任何二肽形式的L-谷氨酰胺或任何重组细胞因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含基础培养基(例如OpTmizerTMT细胞扩增基础培养基)、L-谷氨酰胺和如由补充剂(例如OpTmizerTMT细胞扩增补充剂)提供的一种或多种另外的组分。
在特定实施方案中，在如下浓度的无血清培养基中孵育细胞：为或为约0.25×106个细胞/mL、0.5×106个细胞/mL、0.75×106个细胞/mL、1.0×106个细胞/mL、1.25×106个细胞/mL、1.5×106个细胞/mL、1.75×106个细胞/mL、或2.0×106个细胞/mL。在特定实施方案中，在浓度为或为约0.75×106个细胞/mL的无血清培养基中孵育细胞。在一些实施方案中，所述孵育进行或进行约18小时与30小时之间。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约24小时或者进行或进行约一天。在一些实施方案中，所述孵育分别进行或进行约48小时或72小时，或者进行或进行约2天或3天。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约72小时、72±4小时，或者进行或进行约3天，例如，在该时间期间在浓度为或为约0.75×106个细胞/mL的无血清培养基中孵育细胞。在一些实施方案中，孵育的全部或一部分在包含以下的无血清培养基中进行：不含一种或多种重组细胞因子如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15的基础培养基(例如，CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher))。在一些实施方案中，所述无血清培养基补充有L-谷氨酰胺和/或一种或多种细胞补充剂，例如OpTmizerTMT细胞扩增补充剂，但是不含任何免疫细胞血清替代物、任何二肽形式的L-谷氨酰胺或任何重组细胞因子。
在特定实施方案中，在不存在细胞因子的情况下孵育细胞。在特定实施方案中，在不存在任何重组细胞因子的情况下孵育细胞。在特定实施方案中，在不存在一种或多种重组细胞因子如重组IL-2、IL-7和/或IL-15的情况下孵育细胞。
在一些实施方案中，基础培养基还包含谷氨酰胺，如L-谷氨酰胺。在一些方面，谷氨酰胺是游离形式的谷氨酰胺，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，谷氨酰胺如L-谷氨酰胺在基础培养基中的浓度为约或小于约0.5mM-1mM、0.5mM-1.5mM、0.5mM-2mM、0.5mM-2.5mM、0.5mM-3mM、0.5mM-3.5mM、0.5mM-4mM、0.5mM-4.5mM、0.5mM-5mM、1mM-1.5mM、1mM-2mM、1mM-2.5mM、1mM-3mM、1mM-3.5mM、1mM-4mM、1mM-4.5mM、1mM-5mM、1.5mM-2mM、1.5mM-2.5mM、1.5mM-3mM、1.5mM-3.5mM、1.5mM-4mM、1.5mM-4.5mM、1.5mM-5mM、2mM-2.5mM、2mM-3mM、2mM-3.5mM、2mM-4mM、2mM-4.5mM、2mM-5mM、2.5mM-3mM、2.5mM-3.5mM、2.5mM-4mM、2.5mM-4.5mM、2.5mM-5mM、3mM-3.5mM、3mM-4mM、3mM-4.5mM、3mM-5mM、3.5mM-4mM、3.5mM-4.5mM、3.5mM-5mM、4mM-4.5mM、4mM-5mM、或4.5mM-5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，谷氨酰胺如L-谷氨酰胺在基础培养基中的浓度为至少约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM。在一些实施方案中，谷氨酰胺如L-谷氨酰胺在基础培养基中的浓度为至多约2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM。在一些实施方案中，谷氨酰胺如L-谷氨酰胺在基础培养基中的浓度为约2mM。在一些实施方案中，基础培养基还可以包含蛋白质或肽。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人蛋白质或源自人。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、纤连蛋白、抑肽酶或胎球蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质包含白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述蛋白质是白蛋白或白蛋白取代物。在一些实施方案中，所述白蛋白是人源白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是天然人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是来自非人来源的重组白蛋白。白蛋白取代物可以是任何蛋白质或多肽来源。此类蛋白质或多肽样品的例子包括但不限于牛垂体提取物、植物水解物(例如，大米水解物)、胎牛白蛋白(胎球蛋白)、卵白蛋白、人血清白蛋白(HSA)或另一种动物来源的白蛋白、鸡提取物、牛胚胎提取物、
Figure BDA0003008592730001391
I和
Figure BDA0003008592730001392
II。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽包括转铁蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽包括纤连蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽包括抑肽酶。在一些实施方案中，所述蛋白质包括胎球蛋白。
在一些实施方案中，一种或多种另外的蛋白质是被添加至基础培养基中的血清替代物补充剂的一部分。血清替代物补充剂的例子包括例如免疫细胞血清替代物(ThermoFisher，#A2598101)或Smith等人Clin Transl Immunology.2015年1月；4(1):e31中所述的那些。
在某些实施方案中，在引入编码异源或重组蛋白的多核苷酸(例如，病毒载体)之后将细胞孵育为、为约或为至少18小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、或超过96小时。在某些实施方案中，在引入编码异源或重组蛋白的多核苷酸(例如，病毒载体)之后将细胞孵育为、为约或为至少一天、2天、3天、4天、或超过4天。在一些实施方案中，在基因工程化之前，所述孵育进行如下时间量：在30分钟与2小时之间、在1小时与8小时之间、在6小时与12小时之间、在12小时与18小时之间、在16小时与24小时之间、在18小时与30小时之间、在24小时与48小时之间、在24小时与72小时之间、在42小时与54小时之间、在60小时与120小时之间、在96小时与120小时之间、在90小时与在1天与7天之间之间、在3天与8天之间、在1天与3天之间、在4天与6天之间、或在4天与5天之间。在一些实施方案中，所述孵育进行或进行约18小时与30小时之间。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约24小时或者进行或进行约一天。
在某些实施方案中，所述孵育的总持续时间为、为约或为至少12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、或120小时。在某些实施方案中，所述孵育的总持续时间为、为约或为至少一天、2天、3天、4天、或5天。在特定实施方案中，所述孵育在以下时间、在约以下时间或在以下时间内完成：120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、54小时、48小时、42小时、36小时、30小时、24小时、18小时、或12小时。在特定实施方案中，所述孵育在以下时间、在约以下时间或在以下时间内完成：一天、2天、3天、4天、或5天。在一些实施方案中，所述孵育的总持续时间在或在约12小时与120小时之间、18小时与96小时之间、24小时与72小时之间、或24小时与48小时之间，包含端值。在一些实施方案中，所述孵育的总持续时间在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，包含端值。在特定实施方案中，所述孵育分别进行或进行约24小时、48小时或72小时，或者进行或进行约1天、2天或3天。在特定实施方案中，所述孵育进行24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约72小时或者进行或进行约3天。
在特定实施方案中，所述孵育在开始刺激之后在、在约或至少12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时开始。在特定实施方案中，所述孵育在开始刺激之后在、在约或至少0.5天、一天、1.5天或2天开始。在特定实施方案中，所述孵育在以下时间、在约以下时间或在以下时间内开始：刺激开始的120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、54小时、48小时、42小时、36小时、30小时、24小时、18小时、或12小时。在特定实施方案中，所述孵育在以下时间、在约以下时间或在以下时间内开始：刺激开始的5天、4天、3天、2天、一天、或0.5天。
在一些实施方案中，所述孵育在以下时间完成：在开始刺激之后在或在约24小时与120小时之间、36小时与108小时之间、48小时与96小时之间、或48小时与72小时之间，包含端值。在一些实施方案中，所述孵育在以下时间、约以下时间或以下时间内完成：从刺激开始120小时、108小时、96小时、72小时、48小时、或36小时。在一些实施方案中，所述孵育在以下时间、约以下时间或以下时间内完成：从刺激开始5天、4.5天、4天、3天、2天、或1.5天。在特定实施方案中，所述孵育在开始刺激之后在以下小时后完成：24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时。在一些实施方案中，所述孵育在或在约72小时后或者在或在约3天后完成。
在一些实施方案中，所述孵育进行足以使异源或重组多核苷酸被整合至基因组中的时间量。在特定实施方案中，所述孵育进行足以使至少整合病毒拷贝数(iVCN)是每个二倍体基因组为、为约或为至少0.1、0.5、1、2、3、4、5或大于5的时间量。在特定实施方案中，所述孵育进行足以使至少iVCN为、为约或为至少0.5或1的时间量。在特定实施方案中，所述孵育进行足以使异源或重组多核苷酸被稳定整合至基因组中的时间量。在特定实施方案中，当每个二倍体基因组的iVCN在例如至少12、24或48小时的时间段内变化不超过20％、15％、10％、5％、1％或0.1％时，认为所述异源或重组多核苷酸被稳定整合。在特定实施方案中，所述孵育在稳定整合之前完成。
在某些实施方案中，至少直至在基因组中检测到整合载体为止，执行或进行所述孵育。在一些实施方案中，所述孵育在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前完成。在特定实施方案中，至少直至在基因组中检测到整合载体为止，但在达到每个二倍体基因组的稳定iVCN之前，执行或进行所述孵育。在某些实施方案中，当所述iVCN达到峰值和/或保持不变或者在容许误差内不变持续一段时间时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。在一些实施方案中，容许误差为以下值，在以下值内或为约以下值：±40％、±35％、±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％、±2％、±1％或小于±1％。在某些实施方案中，所述时间段为、为约或为至少2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时。在某些实施方案中，所述时间段为、为约或为至少一天、2天或3天。在某些实施方案中，当所述iVCN达到峰值并保持不变或者在容许误差(例如，±25％)内不变持续为、为约或为至少24小时或一天的一段时间时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。在一些实施方案中，当所述转化的细胞的群体的二倍体基因组中iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为、为至少或为约0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5或者在其容许误差(例如，±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±1％)内时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。在某些实施方案中，当所述转化的细胞的群体的二倍体基因组中iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为或为约0.8或在其容许误差内时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。在一些实施方案中，当所述转化的细胞的群体的二倍体基因组中iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为或为约1.0或者在其容许误差内时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。
在一些实施方案中，所述孵育在iVCN达到、达到约或达到至少5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或0.25个拷贝/二倍体基因组之前完成。在某些实施方案中，所述孵育在iVCN达到或达到约1.0个拷贝/二倍体基因组之前完成。在特定实施方案中，所述孵育在iVCN达到或达到约0.5个拷贝/二倍体基因组之前完成。
在某些实施方案中，在细胞群的为、为约或至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、八次、十次、二十次或更多次细胞倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前，收获细胞。在特定实施方案中，细胞倍增的量可以通过在不同时间点，如在工程化过程的不同时间或阶段测量群体中活细胞的数量来计算。在特定实施方案中，可以通过将在一个时间点的活细胞的总量与在较早时间点存在的活细胞的总数量进行比较来计算细胞倍增。在某些实施方案中，所述孵育在细胞群的为、为约或至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、八次、十次、二十次或更多次细胞倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前完成。在某些方面，细胞倍增是通过以下方式来计算：在开始孵育时和在完成孵育时确定总有核细胞数(TNC)，然后确定完成时的TNC除以开始时的TNC的乘积的自然对数，然后将乘积的所述自然对数除以2的自然对数。
在一些方面，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：
Figure BDA0003008592730001431
在一些方面，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：
Figure BDA0003008592730001432
在某些实施方案中，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：
Figure BDA0003008592730001433
在各种实施方案中，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：
Figure BDA0003008592730001434
在特定实施方案中，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：
Figure BDA0003008592730001441
在某些实施方案中，所述孵育在细胞的总数量(例如，孵育细胞或经历孵育的细胞的总数量)是输入群体的细胞数量(例如，与刺激试剂接触的细胞的总数量)的大于或大于约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍或超过二十倍之前完成。在各种实施方案中，所述孵育在孵育细胞的总数量是转化、转导或旋转接种的细胞的总数量(例如，与病毒载体接触的细胞的总数量)的大于或大于约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍或超过二十倍之前完成。在某些实施方案中，所述细胞是T细胞、活T细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、表达CAR的T细胞、或任何前述的组合。在一些实施方案中，所述孵育在细胞总数大于输入群体中细胞的总数量之前完成。在一些实施方案中，所述孵育在活CD3+T细胞的总数量大于输入群体中活CD3+细胞的总数量之前完成。在某些实施方案中，所述孵育在细胞总数大于转化、转导或旋转接种的细胞中细胞的总数量之前完成。在一些实施方案中，所述孵育在活CD3+T细胞的总数量大于转化、转导或旋转接种的细胞中活CD3+的总数量之前完成。
在一些实施方案中，细胞群的总细胞数或总活细胞数在孵育期间保持相似、相同或基本上相同。在特定实施方案中，细胞群的总细胞数或总活细胞数在孵育期间不变。在一些方面，总细胞数或总活细胞数在孵育期间降低。在特定方面，在刺激开始之前(例如即将开始之前)或开始时，总活细胞数是输入群体的总细胞数或总活细胞数的为、为约或小于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％。
D.过程中的小分子
在一些实施方案中，本文提供如下方法，其包括在调节剂的存在下制造或产生工程化细胞(例如，CAR-T细胞)，从而改进通过所述方法制造或产生的工程化细胞的持久性、消耗的缺乏和/或功效。在一些方面，所提供的方法产生包括工程化以表达重组受体的原代T细胞的细胞组合物，如用于细胞疗法中，如与通过替代性方法(如并非在调节剂的存在下进行的替代性方法)产生的工程化细胞的组合物相比，所述组合物(i)含有更少的消耗的细胞和/或更少的展示与消耗相关的标记或表型的细胞；(ii)含有增加的记忆样T细胞(如长寿记忆T细胞)的百分比；(iii)分化程度更低；(iv)展现改进的或增强的存活、扩增、持久性和/或抗肿瘤活性；(v)展现改进的治疗功效；和/或(vi)展现改进的反应临床耐久性。在一些实施方案中，对相同过程进行与替代性过程的比较，其差异仅在于替代性过程并非在调节剂的存在下进行。
在一些实施方案中，在收集、收获或配制细胞之前，使调节剂与细胞或细胞群解除(例如，调节剂位于细胞中或者与一种或多种细胞表面分子相互作用)。在一些实施方案中，调节剂在使细胞经受刺激(例如，T细胞激活)之前、期间或之后存在。在一些实施方案中，在刺激(例如，本文如在章节I-B中所述的刺激)之前或期间，使调节剂与细胞或细胞群接触(例如，调节剂位于细胞中或者与一种或多种细胞表面分子相互作用)。在一些实施方案中，调节剂在使细胞经受工程化(例如，转导)之前、期间或之后存在。在一些实施方案中，在工程化(例如，本文如在章节I-C中所述的工程化)之前或期间，使调节剂与细胞或细胞群接触(例如，调节剂位于细胞中或者与一种或多种细胞表面分子相互作用)。在一些实施方案中，在孵育(例如，本文如在章节I-C-3中所述的孵育)期间或之后，使调节剂与细胞或细胞群接触(例如，调节剂位于细胞中或者与一种或多种细胞表面分子相互作用)。在一些实施方案中，在刺激(例如，本文如在章节I-B中所述的刺激)期间，在工程化(本文如在章节I-C中所述的工程化)期间，和/或在孵育(例如，本文如在章节I-C-3中所述的孵育)期间，使调节剂与细胞或细胞群接触(例如，调节剂位于细胞中或者与一种或多种细胞表面分子相互作用)。在某些实施方案中，在孵育之后但在用于收集、收获或配制细胞的步骤之前，在调节剂的存在下，所述细胞或细胞群经历过程、程序、步骤或技术。在特定实施方案中，在孵育之后，在调节剂的存在下，所述细胞或细胞群经历过程、程序、步骤或技术。
在一些实施方案中，在工程化之前使要工程化(例如转导)的细胞例如在培养基中与调节剂接触(例如，孵育)。在一些实施方案中，在调节剂的存在下将细胞工程化。在一些实施方案中，使一种或多种工程化细胞例如在培养基(如不含一种或多种重组细胞因子或不含任何重组细胞因子的基础培养基)中与调节剂接触(例如，孵育)。在一些实施方案中，还在工程化细胞的制造或产生期间提供组合物，例如，用于基于细胞的疗法，所述组合物包含(i)调节剂，和(ii)要工程化的细胞和/或已经经受工程化的细胞(包括工程化细胞)，如原代免疫细胞(例如，T细胞)。
在一些实施方案中，调节剂选自PI3K抑制剂、Akt途径、mTOR抑制剂、Ras/ERK抑制剂、NF-κΒ抑制剂、BET抑制剂、CDK抑制剂、CRAC通道抑制剂、Cox抑制剂、多巴胺拮抗剂、ERK5抑制剂、糖皮质激素、IGF-1R抑制剂、IKK抑制剂、JAK抑制剂、Lck抑制剂、PDKl抑制剂、Raf抑制剂和Syk抑制剂。在一些实施方案中，Src抑制剂包括但不限于达沙替尼、塞卡替尼、博舒替尼、KX01和瑞巴替尼(DCC-2036)。在一些实施方案中，Src抑制剂包含瑞巴替尼(DCC-2036)。可用作本公开文本的调节剂的某些药剂披露于WO 2019018603、WO 2018106595和PCT/US2018/058812中，所述申请都通过引用以整体并入本文。
在一些实施方案中，调节剂是或包含化合物、小分子(例如，小有机分子)、多核苷酸、寡核苷酸、siRNA或多肽，或其片段、亚型、变体、类似物或衍生物，所述调节剂抑制、降低、防止和/或能够抑制、降低、防止靶标如mTOR的一种或多种活性。在特定实施方案中，所述药剂是小分子，其分子量小于10kD、小于9kD、小于8kD、小于7kD、小于6kD、小于5kD、小于4kD、小于3kD、小于2kD、小于1kD、小于0.5kD或小于0.1kD。
在一些实施方案中，调节剂是或包含抑制mTOR活性的药剂。在一些实施方案中，在工程化之前，使要工程化(例如转导)的细胞与mTOR抑制剂接触(例如，孵育)。在一些实施方案中，在mTOR抑制剂的存在下将细胞工程化。在一些实施方案中，使一种或多种工程化细胞例如在培养基(如不含一种或多种重组细胞因子或不含任何重组细胞因子的基础培养基)中与mTOR抑制剂接触(例如，孵育)。在一些实施方案中，还在工程化细胞的制造或产生期间提供组合物，所述组合物包含(i)mTOR抑制剂，和(ii)要工程化的细胞和/或已经经受工程化的细胞(包括工程化细胞)。
在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂抑制、减少和/或降低，和/或能够抑制、减少和/或降低mTOR的至少一种活性。在特定实施方案中，抑制mTOR活性的药剂抑制、减少和/或降低，和/或能够抑制、减少和/或降低mTOR激酶活性。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂抑制、减少和/或降低，和/或能够抑制、减少和/或降低mTORC1活性(例如mTORC1激酶活性)和/或mTORC2活性。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂防止mTORC1复合物的形成和/或使mTORC1复合物不稳定。在特定实施方案中，抑制活性的药剂防止mTORC2复合物的形成和/或使mTORC2复合物不稳定。
在特定实施方案中，抑制mTOR活性的药剂抑制至少一种另外的激酶的活性。在某些实施方案中，所述至少一种另外的激酶是PI3K。在特定实施方案中，抑制mTOR活性的药剂：(i)不抑制PI3K活性；(ii)在针对mTOR活性的IC50下，不会可检测地抑制PI3K活性；和/或(iii)在可检测地抑制mTOR活性的所有浓度下，不会可检测地抑制PI3K。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂相对于PI3K活性抑制(例如选择性抑制)mTORC1和mTORC2激酶活性。在某些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1和mTORC2激酶活性。在特定实施方案中，抑制mTOR活性的药剂选择性抑制mTORC1活性，如mTORC1激酶活性。
在某些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂：(i)不抑制mTORC2活性；(ii)在针对mTORC1活性的IC50下，不会可检测地抑制mTORC2活性；和/或(iii)在可检测地抑制mTORC1活性的所有浓度下，不会可检测地抑制mTORC2。
在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂包括但不限于CC214-1(Celgene)、CC214-2(Celgene)、CC0470324、GDC0980、SAR245409、VS5584、PI-103、SF1126、BGT226、XL765、PF-04691502、达托里昔布(代号NVP-BEZ235和BEZ-235)、吡唑并嘧啶、Torin l、托基尼(PP242)、PP30、Ku-0063794、WAY-600(Wyeth)、WAY-687(Wyeth)、WAY-354(Wyeth)、DS3078a、雷帕霉素(西罗莫司)、替西罗莫司(CC1779)、依维莫司(RAD001)、地弗莫司(AP23573)、AZD8055(AstraZeneca)和OSI-027(OSI)。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂具有或包括式(I)、式(II)或式(III)中提供的式。在一些实施方案中，所述药剂是化合物155、化合物246或化合物63。
在特定实施方案中，所述药剂包含式(I)所示的式
Figure BDA0003008592730001481
其中R1是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或者取代或未取代的杂环烷基，R2是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或者取代或未取代的杂环烷基，并且R3和R4独立地是H或C1-8烷基。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂是或包含式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂是或包含式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂是或包含2-(3-羟苯基)-9-(2-异丙基苯基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-甲酰胺、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂是或包含
Figure BDA0003008592730001482
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述药剂包含式(II)所示的式
Figure BDA0003008592730001483
其中L是直接键、NH或O，Y是N或CR3，其中R1是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的C2-8烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或者取代或未取代的杂环烷基，R2是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或者取代或未取代的杂环烷基，R3是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、-NHR4或-N(R4)2，并且R4在每次出现时独立地为取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或者取代或未取代的杂环烷基。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂是或包含式(II)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂是或包含6-(4-(2H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-1-(2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-2(3H)-酮、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂是或包含
Figure BDA0003008592730001491
或其药学上可接受的盐。
在特定实施方案中，所述药剂包含式(III)所示的式
Figure BDA0003008592730001492
其中R1是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基或者取代或未取代的杂环基烷基，R2是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的芳烷基或者取代或未取代的环烷基烷基，并且R3是H或者取代或未取代的C1-8烷基。在某些实施方案中，R1是取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。在一些实施方案中，R1是被取代的吡啶基。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂是或包含式(III)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂是或包含式(III)的化合物、或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂是或包含7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((1r,4r)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂是或包含
Figure BDA0003008592730001501
或其药学上可接受的盐。
如本领域技术人员所理解，本发明的范围还包括基于其靶标按功能分类在其相应类别下的所有其他药剂的类似物或衍生物，所述类似物或衍生物包括但不限于盐、酯、醚、溶剂化物、水合物、立体异构体或前药。
E.刺激试剂的去除
在一些实施方案中，在收集、收获或配制细胞之前，将刺激试剂从细胞或细胞群中去除或分离。在一些实施方案中，在孵育(例如，本文如在章节I-C中所述的孵育)之后或期间，将刺激试剂从细胞或细胞群去除或分离。在某些实施方案中，所述细胞或细胞群经历过程、程序、步骤或技术以在孵育之后但在用于收集、收获或配制细胞的步骤之前去除刺激试剂。在特定实施方案中，细胞或细胞群在孵育之后经历去除刺激试剂的过程、程序、步骤或技术。在一些方面，当在孵育期间从细胞分离或去除刺激试剂时，对于孵育的剩余持续时间，将细胞返回到与分离或去除之前相同的孵育条件。
在某些实施方案中，从细胞去除和/或分离刺激试剂。在不希望受理论束缚的情况下，特定的实施方案考虑，在一些情况下，在孵育期间，刺激试剂与细胞之间的结合和/或缔合可能随着时间而减少。在某些实施方案中，可以添加一种或多种药剂以减少刺激试剂与细胞之间的结合和/或缔合。在特定实施方案中，细胞培养条件的变化(例如，添加药剂)可以降低刺激试剂与细胞之间的结合和/或缔合。因此，在一些实施方案中，可以将刺激试剂与细胞分开地从孵育、细胞培养系统和/或溶液去除，例如，不会也将细胞从孵育、细胞培养系统和/或溶液去除。
在某些实施方案中，在一定时间量后将刺激试剂从细胞分离和/或去除。在特定实施方案中，时间量是从刺激开始起的时间量。在特定实施方案中，孵育的开始被认为是在或约在细胞与刺激试剂和/或含有刺激试剂的培养基或溶液接触的时候。在特定实施方案中，在刺激开始的为或约120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时(包含端值)内，将刺激试剂从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在刺激开始的为或约5天、4天、3天、2天、一天、或0.5天(包含端值)内，将刺激试剂从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在刺激开始后为或为约48小时或者为或为约2天，将刺激试剂从细胞去除或分离。在某些实施方案中，在刺激开始后为或为约72小时或者为或为约3天，将刺激试剂从细胞去除或分离。在一些实施方案中，在刺激开始后为或为约96小时或者为或为约4天，将刺激试剂从细胞去除或分离。
1.珠试剂的去除
在某些实施方案中，将珠刺激试剂(例如，抗CD3/抗CD28抗体缀合的顺磁珠)从细胞或细胞群分离或去除。从细胞去除刺激试剂(例如是或含有颗粒如珠颗粒或可磁化颗粒的刺激试剂)的方法是已知的。在一些实施方案中，可以使用竞争性抗体(如未标记的抗体)的使用，其例如与刺激试剂的一抗结合，并改变所述一抗对细胞上其抗原的亲和力，从而允许温和脱离。在一些情况下，在脱离之后，竞争性抗体可以保持与颗粒(例如珠颗粒)缔合，而未反应的抗体被洗掉或可以被洗掉，并且细胞不含分离、选择、富集和/或激活抗体。这种试剂的例子是DETACaBEAD(Friedl等人1995；Entschladen等人1997)。在一些实施方案中，可以在可切割接头(例如DNA接头)存在下去除颗粒(例如珠颗粒)，借此使颗粒结合的抗体与接头(例如，CELLection，Dynal)缀合。在一些情况下，接头区提供了可切割位点，以在分离之后例如通过添加DNA酶或其他释放缓冲液从细胞去除颗粒(例如珠颗粒)。在一些实施方案中，还可以采用其他酶促方法从细胞释放颗粒(例如珠颗粒)。在一些实施方案中，颗粒(例如珠颗粒或可磁化颗粒)是可生物降解的。
在一些实施方案中，刺激试剂是磁性、顺磁性和/或超顺磁性的，和/或含有磁性、顺磁性或超顺磁性的珠，并且可以通过将细胞暴露于磁场从细胞去除刺激试剂。含有用于产生磁场的磁体的合适设备的例子包括DynaMag CTS(Thermo Fisher)、磁分离器(Takara)和EasySep磁体(Stem Cell Technologies)。
在特定实施方案中，在所提供的方法完成之前，例如，在收获、收集和/或配制通过本文所提供的方法产生的工程化细胞之前，将刺激试剂从细胞去除或分离。在一些实施方案中，在工程化(例如转导或转染)细胞之后，从细胞去除和/或分离刺激试剂。
在一些实施方案中，在收集、收获或配制细胞之前，将刺激性珠试剂(例如刺激性磁珠试剂)从细胞或细胞群中去除或分离。在一些实施方案中，在孵育(例如，本文如在章节I-C中所述的孵育)期间或之后，通过暴露于磁场将刺激性珠试剂(例如，刺激性磁珠试剂)从细胞或细胞群去除或分离。在某些实施方案中，在孵育之后但在用于收集、收获或配制细胞的步骤之前，将细胞或细胞群暴露于磁场以去除刺激性珠试剂(例如，刺激性磁珠试剂)。在特定实施方案中，在孵育之后，使细胞或细胞群经历暴露于磁场以去除刺激性珠试剂，例如刺激性磁珠试剂。在一些方面，当在孵育期间将刺激性珠试剂从细胞或细胞群分离或去除时，使细胞或细胞群返回到与暴露于磁场之前相同的孵育条件，持续孵育的剩余持续时间。
在特定实施方案中，在刺激开始的为或约120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时内(包含端值)，例如通过暴露于磁场，将刺激性珠试剂(例如刺激性磁珠试剂)从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在刺激开始的为或为约5天、4天、3天、2天、一天、或0.5天(包含端值)内，例如通过暴露于磁场将刺激性珠试剂(例如，刺激性磁珠试剂)从细胞去除或分离。在某些实施方案中，在刺激开始后为或为约72小时或者为或为约3天，例如通过暴露于磁场将刺激性珠试剂(例如，刺激性磁珠试剂)从细胞去除或分离。在某些实施方案中，在刺激开始后为或为约48小时或者为或为约2天，例如通过暴露于磁场将刺激性珠试剂(例如，刺激性磁珠试剂)从细胞去除或分离。在一些实施方案中，在刺激开始后为或为约96小时或者为或为约4天，例如通过暴露于磁场将刺激性珠试剂(例如，刺激性磁珠试剂)从细胞去除或分离。
2.寡聚试剂的去除
在一些实施方案中，根据本文所提供的任何方法产生或生成孵育的T细胞的群体，其中将物质如竞争剂添加至T细胞以破坏(如减少和/或终止)一种或多种刺激剂的信号传导。在一些实施方案中，所孵育的T细胞群体含有物质如竞争剂(例如生物素或生物素类似物，例如D-生物素)的存在。在一些实施方案中，所述物质如竞争剂(例如生物素或生物素类似物，例如D-生物素)以如下量存在：是其中在孵育期间没有外源性添加所述物质的培养T细胞的参考群体或制剂中所述物质的量的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍。在一些实施方案中，所述物质如竞争剂(例如生物素或生物素类似物，例如D-生物素)在培养T细胞的群体中的量是从或从约10μΜ至100μΜ、100μΜ至1mM、100μΜ至500μΜ或10μΜ至100μΜ。在一些实施方案中，将10μm或约10μm的生物素或生物素类似物(例如D-生物素)添加至细胞或细胞群，以从所述细胞或细胞群分离或去除寡聚刺激试剂。
在某些实施方案中，一种或多种药剂(例如刺激或激活TCR和/或共受体的药剂)如经由寡聚试剂上存在的多个特定结合位点(例如，结合位点Z)与寡聚试剂缔合(如可逆地结合)。在一些情况下，这导致所述药剂彼此紧密地排列，使得如果使具有由所述药剂结合或识别的(至少两个拷贝的)细胞表面分子的靶细胞与所述药剂接触，则可以发生亲合力效应。在一些方面，受体结合试剂在结合位点B处对细胞的受体分子具有低亲和力，使得受体结合试剂在竞争试剂的存在下从细胞解离。因此，在一些实施方案中，在竞争试剂的存在下从细胞去除所述药剂。
在一些实施方案中，寡聚刺激试剂是具有可逆地附着的抗CD3和抗CD28 Fab的链霉亲和素突变蛋白寡聚物。在一些实施方案中，所附着的Fab含有链霉亲和素结合结构域，例如，其允许可逆地附着至链霉亲和素突变蛋白寡聚物。在一些情况下，抗CD3和抗CD28Fab彼此紧密地排列，使得如果使表达CD3和/或CD28的T细胞与具有可逆地附着的Fab的寡聚刺激试剂接触，则可以发生亲合力效应。在一些方面，所述Fab对CD3和CD28具有低亲和力，使得所述Fab在竞争试剂(例如，生物素或生物素变体或类似物)的存在下从细胞解离。因此，在一些实施方案中，在竞争试剂(例如D-生物素)的存在下将Fab从细胞去除或解离。
在一些实施方案中，在收集、收获或配制细胞之前，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞或细胞群去除或分离。在一些实施方案中，在孵育(例如，本文如在章节I-C-3中所述的孵育)之后或期间，通过接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞或细胞群去除或分离。在某些实施方案中，在孵育之后但在用于收集、收获或配制细胞的步骤之前，使细胞或细胞群接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)，以去除寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)。在特定实施方案中，在孵育之后，使细胞或细胞群接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)，以去除寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)。在一些方面，当在孵育期间例如通过接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞分离或去除时，使细胞返回到与分离或去除之前相同的孵育条件，持续孵育的剩余持续时间。
在一些实施方案中，使细胞与为、为约或为至少0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mM或10mM的竞争试剂接触，以从细胞去除或分离寡聚刺激试剂。在各种实施方案中，使细胞与为、为约或为至少0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mM或10mM的生物素或生物素类似物如D-生物素接触，以将具有可逆地附着的抗CD3和抗CD28 Fab的刺激性链霉亲和素突变蛋白寡聚物从细胞去除或分离。在各种实施方案中，使细胞与在或在约100μM与10mM之间(例如，1mM)的生物素或生物素类似物如D-生物素接触，以将具有可逆地附着的抗CD3和抗CD28 Fab的寡聚刺激试剂(如链霉亲和素突变蛋白寡聚物)从细胞去除或分离。在各种实施方案中，在接触或暴露于D-生物素之后，使细胞与在或在约100μM与10mM之间(例如，1mM)的生物素或生物素类似物如D-生物素接触为或为约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时或48小时。
在特定实施方案中，在刺激开始的为或为约120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时(包含端值)内，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在刺激开始的为或为约5天、4天、3天、2天、一天或0.5天(包含端值)内，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在刺激开始后为或为约48小时或者为或为约2天，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞去除或分离。在某些实施方案中，在刺激开始后为或为约72小时或者为或为约3天，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞去除或分离。在一些实施方案中，在刺激开始后为或为约96小时或者为或为约4天，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞去除或分离。
在某些实施方案中，在刺激开始后为或为约48小时或者为或为约2天，例如，在本文如在章节I-C-3中所述的孵育期间或之后，使细胞或细胞群接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)，以去除寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)。在一些方面，当在孵育期间例如通过接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞分离或去除时，使细胞返回到与分离或去除之前相同的孵育条件，持续孵育的剩余持续时间。在其他方面，当在孵育之后例如通过接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞分离或去除时，在接触或暴露于竞争试剂之后将细胞进一步孵育持续或持续约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时或48小时。在一些实施方案中，在D-生物素添加之后，将用D-生物素处理转导的细胞进一步孵育持续或持续约48小时。
F.收获、收集或配制细胞
在一些实施方案中，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在孵育完成后收集或收获细胞。在某些实施方案中，收集或收获的细胞是输出群体的细胞。在一些实施方案中，输出群体包括如下细胞：是活的、CD3+、CD4+、CD8+和/或对重组受体呈阳性(例如，CAR+)。在特定实施方案中，收获的CD4+T细胞和配制的CD8+T细胞是输出CD4+和CD8+T细胞。在特定实施方案中，配制的细胞群(例如，富集的CD4+和CD8+细胞的配制群体)是输出细胞群，例如，富集的CD4+和CD8+细胞的输出群体。
在一些实施方案中，收获、收集或配制的细胞或细胞群尚未经历任何扩增，例如，如下任何条件：其中在一定条件下孵育或培育细胞，并在所述孵育或培育期间增加活细胞的量。例如，在一些方面，收获的细胞尚未经历任何孵育或培育，其中如与所述孵育或培育开始时总活细胞的数量相比，在所述孵育或培育结束时总活细胞的量增加。在一些实施方案中，收获的细胞尚未经历任何孵育或培育步骤，所述步骤明确用于与所述孵育或培育过程开始时相比，在所述孵育或培育过程结束时增加(例如，扩增)活细胞总数量的目的。在一些实施方案中，在可以导致扩增的条件下孵育或培育细胞，但是执行所述孵育或培育条件的目的并非扩增细胞群。在一些实施方案中，虽然是在不包括扩增步骤的过程中制造，但收获的细胞可能已经经历了扩增。在一些实施方案中，不包括扩增步骤的制造过程被称为非扩增或最小扩增的过程。“非扩增”过程也可以被称为“最小扩增”过程。在一些实施方案中，虽然过程不包括用于扩增的步骤，但非扩增或最小扩增过程可能得到已经经历扩增的细胞。在一些实施方案中，收获的细胞可能已经经历孵育或培育步骤，所述步骤包括设计用于降低、抑制、最小化或消除细胞群作为整体的扩增的培养基组合物。在一些实施方案中，收集、收获或配制的细胞先前尚未经历在如下生物反应器中或在如下条件下进行的孵育或培育：其中在孵育或培育的全部或一部分中摇摆、旋转、振荡或灌注细胞。
在一些实施方案中，细胞选择、分离、分开、富集和/或纯化步骤在收获、收集或配制细胞或细胞群之前进行。在一些实施方案中，细胞选择、分离、分开、富集和/或纯化步骤使用如本文所公开的色谱进行。在一些实施方案中，通过色谱进行的T细胞选择步骤在T细胞转导之后，但在收获之前、在收集之前和/或在配制细胞之前进行。在一些实施方案中，通过色谱进行的T细胞选择步骤在即将收获细胞之前进行。
在某些实施方案中，从刺激开始到收集、收获或配制细胞的时间量为、为约或小于36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或120小时。在某些实施方案中，从刺激开始到收集、收获或配制细胞的时间量为、为约或小于1.5天、2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，从刺激开始到收集、收获或配制细胞用于产生工程化细胞的时间量，从刺激开始到收集、收获或配制细胞为在或在约36小时与120小时之间、48小时与96小时之间或48小时与72小时之间，包含端值，或者在或在约1.5天与5天之间、2天与4天之间或2天与3天之间，包含端值。在特定实施方案中，从孵育开始到收获、收集或配制细胞的时间量为、为约或小于48小时、72小时或96小时。在特定实施方案中，从孵育开始到收获、收集或配制细胞的时间量为、为约或小于2天、3天或4天。在特定实施方案中，从孵育开始到收获、收集或配制细胞的时间量为48小时±6小时、72小时±6小时或96小时±6小时。在特定实施方案中，从孵育开始到收获、收集或配制细胞的时间量为或为约96小时或四天。
在特定实施方案中，将细胞收获、收集或配制在无血清培养基中，如本文在章节II中或在PCT/US 2018/064627中描述的无血清培养基，所述申请通过引用并入本文。在一些实施方案中，将细胞收获、收集或配制至与孵育(例如，如本文在章节I-C-3中所述)期间所用相同的无血清培养基中。
在特定实施方案中，将细胞收获、收集或配制在基础培养基中，所述基础培养基不含一种或多种重组细胞因子并且不含血清组分，即，是无血清培养基，但可能含有一种或多种另外的组分，如章节II.B中所述。在特定实施方案中，这种无血清培养基的使用提供无脂培养基，其提供细胞的维持，但不包括可以激活细胞或使细胞具有代谢活性的某些因子，从而培养所处状态是或可能是休眠或静息状态的细胞。在一些方面，在这种无血清培养基的存在下孵育允许细胞在刺激和基因工程化(例如转导)之后恢复或休眠。在一些方面，在这种无血清培养基的存在下收获、收集或配制细胞得到输出组合物的配制品，所述组合物含有对损伤或活力的损失不太敏感的细胞，例如，在将收获/配制的细胞冷冻保存，然后在即将使用前解冻时。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞在解冻时具有的半胱天冬酶或其他细胞凋亡标记的水平低于在类似培养基中孵育的细胞，但所述类似培养基含有一种或多种重组细胞因子、血清或可能使细胞的代谢活性在输出组合物的冷冻保存时更强的其他因子。
在某些实施方案中，配制富集的T细胞的一个或多个群体。在特定实施方案中，在已经工程化和/或培育一个或多个群体之后，配制富集的T细胞的一个或多个群体。在特定实施方案中，所述一个或多个群体是输入群体。在一些实施方案中，一个或多个输入群体先前已经进行冷冻保护和储存，并且在孵育之前解冻。
在某些实施方案中，至少在基因组中检测到整合载体时，收获或收集细胞。在一些实施方案中，在每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在基因组中检测到整合载体之后但在达到每个二倍体基因组的稳定iVCN时之前，收获或收集细胞。
在一些实施方案中，在iVCN达到、达到约或达到至少5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或0.25个拷贝/二倍体基因组之前，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在iVCN达到或达到约1.0个拷贝/二倍体基因组之前，收获或收集细胞。在一些实施方案中，在iVCN达到或达到约0.5个拷贝/二倍体基因组之前，收集或收获细胞。
在某些实施方案中，在细胞群的为、为约或至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、八次、十次、二十次或更多次细胞倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前，收获细胞。
在特定实施方案中，在细胞的总数量(例如，孵育细胞或经历孵育的细胞的总数量)是输入群体的细胞数量(例如，与刺激试剂接触的细胞的总数量)的大于或大于约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍或超过二十倍之前的时间，收获或收集细胞。在一些实施方案中，在孵育细胞的总数量是转化、转导或旋转接种的细胞的总数量(例如，与病毒载体接触的细胞的总数量)的大于或大于约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍或超过二十倍之前的时间，收获或收集细胞。在某些实施方案中，所述细胞是T细胞、活T细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、表达CAR的T细胞、或任何前述的组合。在特定实施方案中，在细胞总数大于输入群体中细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在活CD3+T细胞的总数量大于输入群体中活CD3+细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在细胞总数大于转化、转导或旋转接种的细胞中细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在活CD3+T细胞的总数量大于转化、转导或旋转接种的细胞中活CD3+细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在活CD4+细胞和CD8+细胞的总数量大于输入群体中活CD4+细胞和CD8+细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在细胞总数大于转化、转导或旋转接种的细胞中细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在活CD4+细胞和CD8+细胞的总数量大于转化、转导或旋转接种的细胞中活CD4+细胞和CD8+细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。
在某些实施方案中，所述过程包括如下步骤：在收获或收集期间或之后例如使用过滤器(例如，40μm过滤器)过滤细胞组合物，例如，以去除大颗粒。在某些实施方案中，所述过滤步骤在正在收获或收集细胞的同时进行。例如，可以将过滤器串联在转导后被孵育的细胞与收获/收集装置(如
Figure BDA0003008592730001591
或Sepax
Figure BDA0003008592730001592
细胞处理系统)之间。在某些实施方案中，收获或收集细胞，然后过滤，之后任选地洗涤过滤的组合物。在某些实施方案中，收获或收集细胞，洗涤，并且过滤洗涤的细胞组合物。
在某些实施方案中，配制细胞是输出细胞。在一些实施方案中，富集的T细胞的配制群体是富集的T细胞的输出群体。在特定实施方案中，配制的CD4+T细胞和配制的CD8+T细胞是输出CD4+和CD8+T细胞。在特定实施方案中，配制的细胞群(例如，富集的CD4+和CD8+细胞的配制群体)是输出细胞群，例如，富集的CD4+和CD8+细胞的输出群体。
在一些实施方案中，可以将细胞配制到容器如袋子或小瓶中。
在一些实施方案中，将细胞配制在药学上可接受的缓冲液中，所述药学上可接受的缓冲液在一些方面可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，处理包括将介质交换成药学上可接受的或施用至受试者所需的介质或配制缓冲液。在一些实施方案中，处理步骤可以涉及洗涤转导的和/或扩增的细胞以替代药学上可接受的缓冲液中的细胞，所述药学上可接受的缓冲液可以包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。包括药学上可接受的载体或赋形剂的此类药物形式的例子可以是下文与将细胞和组合物施用至受试者可接受的形式结合描述的任何形式。在一些实施方案中，药物组合物以有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)含有细胞。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或施用方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如以下文献中：Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)。
配制品可以包括水溶液。配制品或组合物还可含有可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，优选地活性与细胞互补的那些成分，其中相应活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量合适地组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包括其他药物活性药剂或药物，例如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，在一些方面可以将其缓冲至所选pH)提供。液体组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料，这取决于施用途径和所需的制剂。在一些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保防止微生物的作用。可以通过使用延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
在一些实施方案中，配制缓冲液含有冷冻保存剂。在一些实施方案中，用含有1.0％至30％DMSO溶液，如5％至20％DMSO溶液或5％至10％DMSO溶液的冷冻保存溶液来配制细胞。在一些实施方案中，冷冻保存溶液是或含有例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻介质。在一些实施方案中，冷冻保存溶液是或含有例如至少或约7.5％DMSO。在一些实施方案中，处理步骤可以涉及洗涤转导的和/或扩增的细胞以替代在冷冻保存剂溶液中的细胞。在一些实施方案中，将细胞在具有以下终浓度的介质和/或溶液中冷冻(例如，冷冻保护或冷冻保存)：为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％DMSO，或者在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将细胞在具有以下终浓度的介质和/或溶液中冷冻(例如，冷冻保护或冷冻保存)：为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％HSA，或者在0.1％与-5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间或在1％与2％之间的HSA。
在特定实施方案中，将富集的T细胞(例如已经进行刺激、工程化和/或培育的T细胞)的组合物配制，冷冻保护，然后储存一定时间量。在某些实施方案中，将配制的冷冻保护的细胞储存直至释放细胞用于输注。在特定实施方案中，将配制的冷冻保护的细胞储存1天与6个月之间、1个月与3个月之间、1天与14天之间、1天与7天之间、3天与6天之间、6个月与12个月之间、或长于12个月。在一些实施方案中，将细胞冷冻保护并储存为、为约或小于1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在某些实施方案中，在储存后，将细胞解冻并施用至受试者。在某些实施方案中，将细胞储存持续或持续约5天。在一些实施方案中，配制的细胞并未冷冻保存。
在一些实施方案中，使用一个或多个处理步骤进行配制，所述步骤包括洗涤、稀释或浓缩细胞，如培养或扩增的细胞。在一些实施方案中，处理可以包括将细胞稀释或浓缩至所需浓度或数量，如包括用于以给定剂量或其部分用的细胞数量的单位剂型组合物。在一些实施方案中，处理步骤可以包括减小体积，从而根据需要增加细胞的浓度。在一些实施方案中，处理步骤可以包括增加体积，从而根据需要减小细胞的浓度。在一些实施方案中，处理包括向转导的和/或扩增的细胞添加一定体积的配制缓冲液。在一些实施方案中，配制缓冲液的体积是从或从约10mL至1000mL，如至少或约至少或为约或为50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。
在一些实施方案中，用于配制细胞组合物的此类处理步骤在封闭系统中进行。此类处理步骤的例子可以使用与一种或多种系统或试剂盒结合的离心室进行，所述系统或试剂盒与细胞处理系统相关，如由Biosafe SA生产和出售的离心室，包括与
Figure BDA0003008592730001621
或Sepax
Figure BDA0003008592730001622
细胞处理系统一起使用的那些。示例性的系统和过程描述于国际公开号WO 2016/073602中。在一些实施方案中，所述方法包括从离心室的内部空腔中输送配制的组合物，所述配制的组合物是在如所述的任何上述实施方案中在配制缓冲液(如药学上可接受的缓冲液)中配制的细胞的所得组合物。在一些实施方案中，将所配制的组合物输送到容器，如作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接的袋子。在一些实施方案中，容器(如袋子)在输出线或输出位置处与系统连接。
在一些实施方案中，如与离心室或细胞处理系统相关联的封闭系统包括多端口输出试剂盒，所述试剂盒含有在管线的每个末端与端口相关联的多路歧管，所述端口可以连接至一个或多个容器以供输送配制的组合物。在一些方面，可以将所需数量或多个输出容器(例如，袋子)无菌地连接至多端口输出的一个或多个(通常两个或更多个，如至少3、4、5、6、7、8个或更多个)端口。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个容器(例如，袋子)附着到端口，或者附着到少于所有端口。因此，在一些实施方案中，所述系统可以实现将输出组合物输送到多个输出袋中。
在一些方面，可以将细胞以用于剂量施用(如用于单一单位剂量施用或多剂量施用)的量输送到多个输出袋中的一个或多个中。例如，在一些实施方案中，输出袋可以各自含有用于以给定剂量或其部分施用的细胞数量。因此，在一些方面，每个袋子可以含有用于施用的单一单位剂量或可以含有所需剂量的一部分，使得多个输出袋中的超过一个(例如两个输出袋、或3个输出袋)一起构成用于施用的剂量。
因此，容器(例如输出袋)通常含有要施用的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。单位剂量可以是要施用至受试者的细胞的量或数量，或者是要施用的细胞的数量的两倍(或更多数量)。它可以是要施用至受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
在一些实施方案中，每个容器(例如，袋子)单独地包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或大致或基本相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或约至少1x106、2x106、5x106、1x107、5x107个或1x108个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个袋中的经配制的细胞组合物的体积是10mL至100mL，如至少或约至少20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。
在一些实施方案中，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物施用至受试者以治疗疾病或病症。
G.顺序选择、平行选择和精细纯化(Polishing)
本文所提供的方法允许例如通过柱色谱进行多个选择步骤，以分离和/或富集靶细胞群(例如，T细胞、CD3+、CD4+、CD8+T细胞)。在一些实施方案中，在用于产生输出治疗性细胞组合物的过程(例如如上文章节IA-F所述的过程)中一个或多个时间点或在某些步骤之后进行一个或多个选择步骤。在一些实施方案中，在初始细胞选择(例如，如章节I-A中所述)之后进行的选择步骤被称为精细纯化步骤。精细纯化步骤的进行可以用于多种目的，包括但不限于进一步纯化细胞组合物，选择特定细胞亚型(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)，去除死细胞(例如，选择活细胞)，选择成功工程化的细胞(例如，表达转基因(例如，嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)等)的细胞)，或用于调整特定细胞类型的比率、总数量或浓度(例如，CD4+与CD8+细胞、CAR+或TCR+细胞与CAR-或TCR-细胞、或者CD4+、CD8+、CAR+、TCR+和/或活细胞的总数量或浓度)。在一些实施方案中，选择步骤(例如，精细纯化步骤)可用于增强产品控制和/或减小患者间差异。
在一些实施方案中，选择步骤(例如，初始选择步骤和/或精细纯化步骤)包括多个选择步骤，其用于例如进一步纯化细胞组合物，选择特定细胞亚型，选择活细胞，选择工程化细胞，和/或调整细胞的比率、总数量或浓度。在一些实施方案中，在孵育(例如，如章节I-C-3中所述的孵育)之前，进行选择步骤(例如，精细纯化步骤)。在一些实施方案中，在收获和收集(例如，如章节I-H中所述的收获和收集)之前，进行选择步骤(例如，精细纯化步骤)。
在一些方面，此类方法(例如，选择步骤(例如，初始选择和/或精细纯化步骤))通过单一过程物流如在封闭系统中通过采用顺序选择来实现，在所述顺序选择中富集和/或分离来自如本文所提供的样品(例如，刺激和/或工程化细胞的输出组合物)的多个不同的细胞群。在一些方面，在同一容器或容器组(例如，管道组)中进行分开或分离是通过进行顺序阳性和阴性选择步骤来实现，后一步骤使来自前一步骤的阴性和/或阳性级分经受进一步选择，其中整个过程在同一管或管道组中进行。在一个实施方案中，使含有靶细胞的样品(例如，刺激和/或工程化的细胞的输出组合物)经受顺序选择，其中实现第一选择以富集CD4+或CD8+群体中的一种，并且使用第一选择中的未选择细胞作为第二选择的细胞来源，以富集CD4+或CD8+群体中的另一种。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD4+或CD8+群体中的一种或两种的亚群，例如，中枢记忆T(TCM)细胞或幼稚T细胞。在一些实施方案中，在选择步骤(例如，初始选择步骤和/或精细纯化步骤)期间，通过阳性或阴性选择技术选择T细胞的特定亚群(例如，CD3+、CD4+、CD8+细胞)，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞，例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的细胞群(例如，刺激和/或工程化的细胞的输出组合物)经受顺序选择，其中精细纯化步骤选择活细胞。在一些实施方案中，精细纯化步骤允许控制或调整细胞组合物中细胞的比率或总数量。
在一个实施方案中，使含有靶细胞的样品(例如，刺激和/或工程化的细胞的输出组合物)经受顺序选择，其中实现第一选择以富集CD3+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+群体的亚群，例如，CD4+细胞。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+群体的亚群，例如，CD8+细胞。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集活细胞。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+细胞的亚群，例如活的CD3+CD4+和/或CD3+CD8+细胞。在一些实施方案中，选择活细胞包括从细胞群(例如，刺激和/或工程化的细胞的输出组合物或其亚群)去除死细胞或由其组成。
在一些实施方案中，本章节中公开的所述方法(例如，选择步骤(例如，初始选择步骤和/或精细纯化步骤))无需使用顺序选择技术进行。在一些实施方案中，本章节中公开的所述方法(例如，选择步骤(例如，初始选择和/或精细纯化步骤))可以使用与平行选择技术组合的顺序选择技术来进行。在一些实施方案中，选择步骤(例如，初始选择和/或精细纯化步骤)不采用顺序选择或者可以采用不在封闭系统中或在使用同一管道的容器组中进行的顺序选择。在一些实施方案中，选择步骤(例如，初始选择和/或精细纯化步骤)在单一步骤中例如使用单一色谱柱来完成。在一些实施方案中，选择步骤(例如，初始选择和/或精细纯化步骤)使用平行选择技术来完成。例如，选择步骤(例如，初始选择和/或精细纯化步骤)通过例如在封闭系统中同时进行阳性和/或阴性选择步骤来实现，其中整个过程在同一管或管道组中进行。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品(例如，刺激和/或工程化的细胞的输出组合物)经受平行选择，其中将样品(例如，刺激和/或工程化的细胞的输出组合物)加载至两个或更多个色谱柱上，其中每个柱实现细胞群的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱单独实现CD3+、CD4+或CD8+群体的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱实现相同细胞群的选择。例如，两个或更多个色谱柱可以实现CD3+细胞的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱(包括亲和色谱或凝胶渗透色谱)独立实现相同细胞群的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱(包括亲和色谱或凝胶渗透色谱)独立实现不同细胞群的选择。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集经由平行选择而选择的一个或所有细胞群的亚群。例如，所选细胞可以针对中枢记忆T(TCM)细胞或幼稚T细胞进行进一步选择。在一些实施方案中，使含有靶细胞(例如，CD3+细胞)的样品(例如，刺激和/或工程化的细胞的输出组合物)经受平行选择，其中实现平行选择以富集CD4+群体和CD8+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD4+和CD8+群体的亚群，例如，中枢记忆T(TCM)细胞或幼稚T细胞。考虑到在一些方面，通过阳性或阴性选择技术来选择T细胞的特定亚群(例如，CD3+、CD4+、CD8+T细胞)，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞，例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞(例如，CD3+细胞)的样品(例如，刺激和/或工程化的细胞的输出组合物)经受平行选择，其中实现平行选择以富集中枢记忆T(TCM)细胞或幼稚T细胞。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集中枢记忆T(TCM)细胞或幼稚T细胞的亚群，例如，CD4+、CD3+或CD8+细胞。在一些实施方案中，在经由顺序选择技术完成平行选择之后，进行进一步选择。
在一些实施方案中，选择步骤(例如，初始选择和/或精细纯化步骤)可以使用以如本文所述的选择剂标记的珠来进行，并且可以保留第一选择步骤的阳性和阴性级分，之后如通过使用以第二选择剂标记的珠或通过使阳性级分经受如上所述的柱色谱来对阳性级分进行进一步阳性选择以富集第二选择标记。在一些实施方案中，一个或多个精细纯化步骤使用如本文所述的柱色谱(例如，如章节I-A中所述的色谱和/或包括如上所述的药剂和试剂系统的色谱)来进行。在一些实施方案中，选择步骤(例如，初始选择和/或精细纯化步骤)使用包括珠分离和柱色谱的一种或多种方法来完成。在一些实施方案中，选择步骤(例如，初始选择和/或精细纯化步骤)使用柱色谱来完成。
在一些方面，在单一或同一分离或分开容器或容器组(如单一柱或柱组和/或同一管或管道组)中或使用相同分开基质或介质或试剂(如相同磁性基质、亲和力标记的固体支持物或者抗体或其他结合配偶体)分离多个群体包括精简所述分离的特征，例如，导致降低的成本、时间、复杂性、对样品操作的需要、对资源、试剂或设备的利用。在一些方面，此类特征的有利之处在于，它们使与所述方法相关的成本、效率、时间和/或复杂性降至最低，和/或避免对细胞产物的潜在损伤，如感染、污染和/或温度变化引起的损伤。本文所提供的方法允许在与柱上刺激组合的细胞选择之前或之后进行多个选择步骤来富集靶群体。
本文所提供的方法还允许选择并富集成功刺激和工程化的细胞。例如，在一些实施方案中，可以使用上述顺序选择、平行选择或单一选择程序来鉴定表达重组受体(例如，CAR、TCR)的刺激的细胞。在一些实施方案中，表达重组受体(例如，CAR)的细胞可以针对亚群细胞(例如，CD4+CAR+T细胞、CD8+CAR+T细胞、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD45RA+、CD45RO+T细胞和/或活细胞)进行进一步富集(例如，精细纯化)。在一些实施方案中，选择步骤(例如，初始选择和/或精细纯化步骤)允许控制或调整表达重组受体(例如，CAR、TCR)和/或其亚群的细胞的比率、浓度或总数量。在一些实施方案中，可以配制富集的(例如，精细纯化的)群体以供在细胞疗法中使用(例如，施用)。
H.过程和/或输出群体的示例性特征
在特定实施方案中，所提供的方法与从一种或多种输入群体(如从单一生物样品获得、选择或富集的输入群体)产生或生成工程化T细胞的输出群体的过程结合使用。在某些实施方案中，输出群体含有表达重组受体(例如，TCR或CAR)的细胞。在特定实施方案中，输出群体的细胞适合于作为疗法(例如，自体细胞疗法)施用至受试者。
在特定实施方案中，所提供的方法与用于生成或产生工程化T细胞的输出细胞和/或输出群体的完整过程结合使用，所述完整过程如包括以下步骤中的一些或所有的过程：刺激来自输入群体的细胞；工程化、转化、转导或转染刺激的细胞以表达或含有异源或重组多核苷酸，例如，编码重组受体的多核苷酸，如CAR；孵育所述细胞，从所述细胞去除或分离刺激试剂，并且收获和收集所述细胞，在一些方面由此产生工程化T细胞的输出群体。
在一些实施方案中，所提供的方法与用于生成或产生富集的T细胞的输出细胞和/或输出组合物的完整过程结合使用，所述完整过程如包括以下步骤中的一些或所有的过程：收集或获得生物样品；从生物样品分离、选择或富集输入细胞；低温冷冻并储存输入细胞，然后解冻；刺激所述细胞；基因工程化刺激的细胞以表达或含有重组多核苷酸，例如，编码重组受体的多核苷酸，如CAR；配制输出组合物中培育的细胞；以及低温冷冻并储存配制的输出细胞，直至释放所述细胞用于输注和/或施用至受试者。在一些实施方案中，所提供的方法不包括在所述过程期间扩增细胞或增加细胞数量的步骤，所述步骤如通过在生物反应器中在一定条件下培育细胞来进行，其中细胞例如扩增至如与输入群体相比的细胞的量、水平或浓度的至少3倍、4倍、5倍或更多倍的阈值量。在一些实施方案中，将细胞基因工程化是或包括用病毒载体转导细胞的步骤，所述步骤如通过以下方式来进行：在病毒颗粒的存在下旋转接种细胞，然后在静态条件下在病毒颗粒的存在下孵育所述细胞。
在某些实施方案中，用于产生工程化细胞的所提供过程从刺激开始到收集、收获或配制细胞的总持续时间为、为约或小于36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或120小时。在某些实施方案中，用于产生工程化细胞的所提供过程从刺激开始到收集、收获或配制细胞的总持续时间为、为约或小于1.5天、2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，用于产生工程化细胞的所提供过程从刺激开始到收集、收获或配制细胞的总持续时间在或在约36小时与120小时之间、48小时与96小时之间或48小时与72小时之间，包含端值，或者在或在约1.5天与5天之间、2天与4天之间或2天与3天之间，包含端值。在特定实施方案中，如从孵育开始到收获、收集或配制细胞所测量的完成所提供过程的时间量为、为约或小于48小时、72小时或96小时，或者为、为约或小于2天、3天或4天。在特定实施方案中，如从孵育开始到收获、收集或配制细胞所测量的完成所提供过程的时间量为48小时±6小时、72小时±6小时或96小时±6小时。
在一些实施方案中，例如如章节I-C-3中所公开的孵育在以下时间完成：在开始刺激之后，在或在约24小时与120小时之间、36小时与108小时之间、48小时与96小时之间、或48小时与72小时之间，包含端值。在一些实施方案中，所述孵育在以下时间、约以下时间或以下时间内完成：从刺激开始120小时、108小时、96小时、72小时、48小时、或36小时。在特定实施方案中，所述孵育在24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时之后完成。在一些实施方案中，所述孵育在以下时间完成：在开始刺激之后，在或在约一天与5天之间、1.5天与4.5天之间、2天与4天之间或2天与3天之间，包含端值。在一些实施方案中，所述孵育在以下时间、约以下时间或以下时间内完成：从刺激开始5天、4天、3天、2天或1.5天。
在一些实施方案中，整个过程用富集的T细胞(例如，CD4+和CD8+T细胞)的单一群体来进行。在某些实施方案中，所述过程用富集的T细胞(例如，CD4和CD8细胞)的两种或更多种输入群体进行，所述两种或更多种输入群体在生成或产生富集的T细胞的单一输出群体的过程之前和/或期间进行组合。在一些实施方案中，富集的T细胞是或包含工程化的T细胞，例如，转导以表达重组受体的T细胞。
在一些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过以下方式产生：(i)将T细胞的输入群体或含有T细胞的输入群体在刺激条件下孵育在或在约18小时与30小时之间，包含端值，(ii)将编码重组受体的异源或重组多核苷酸引入受刺激的群体的T细胞中，(iii)孵育所述细胞，然后(iv)收集或收获孵育的细胞。
在一些实施方案中，在开始于刺激条件下孵育之后36小时与108小时之间或1.5天与4.5天之间内，收集或收获细胞。在特定实施方案中，在转化的(例如，基因工程化、转导或转染的)T细胞达到稳定的每个基因组的整合载体拷贝数(iVCN)(其在24-48小时或一天至两天的跨度内增加或减少不超过20％)之后48小时或两天内，收集或收获细胞。在一些实施方案中，当所测量的细胞群的iVCN在所述群体中测量的总载体拷贝数(VCN)的为或为约20％、15％、10％或5％内时，认为整合是稳定的。特定实施方案考虑，为了实现稳定整合，在将病毒载体接触或引入细胞之后，必须将细胞孵育为、为约或为至少48小时、60小时或72小时或者一天、2天或3天。在一些实施方案中，稳定整合发生在孵育的为或为约72小时内。在一些实施方案中，在转化的T细胞的总数量为或小于输入群体中细胞的总数量时的时间，收集或收获细胞。在各种实施方案中，在输入群体的细胞已经倍增超过三次、两次或一次之前的时间，收集或收获细胞。
在某些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过以下方式产生：(i)将包含T细胞的输入群体在刺激试剂(例如，本文如在章节I-B-1中所述的刺激试剂)的存在下在刺激条件下孵育18小时与30小时之间，包含端值，(ii)用编码重组受体的病毒载体转导刺激的T细胞，如通过在所述病毒载体的存在下旋转接种刺激的T细胞来进行，(iii)将转导的T细胞在静态条件下孵育在或在18小时与96小时之间，包含端值，以及(iv)在开始于刺激条件下孵育之后在或在约36小时与108小时内，收获转化的群体的T细胞。
在一些实施方案中，将与所提供方法相关的过程与替代性过程进行比较。例如，在一些实施方案中，将本文所提供的方法与含有用于扩增细胞的步骤的替代性过程相比较。在特定实施方案中，替代性过程可以在一个或多个特定方面不同，但在其他方面含有与所提供方法相关的过程相似或相同的特征、方面、步骤、阶段、试剂和/或条件。在一些实施方案中，替代性过程类似于与所提供的方法相关的过程，例如，缺少或不包括扩增，但是不同之处包括但不限于以下中的一种或多种：不同的试剂和/或培养基配制品；在孵育、转导、转染和/或培育期间血清的存在；输入群体的不同的细胞组成，例如，CD4+与CD8+T细胞的比率；不同的刺激条件和/或不同的刺激试剂；不同的刺激试剂与细胞的比率；不同的转导载体和/或方法；不同的孵育、转导和/或转染细胞的时间安排或顺序；在孵育或转导期间存在的一种或多种重组细胞因子的不存在或差异(例如，不同的细胞因子或不同浓度)；或者不同的收获或收集细胞的时间安排。
在一些实施方案中，如从分离、富集和/或选择来自生物样品的输入细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)至收集、配制和/或冷冻保护输出细胞的时间所测量，完成所提供过程所需的持续时间或时间量是为、为约或小于48小时、72小时、96小时、120小时、2天、3天、4天、5天、7天或10天。在一些实施方案中，分离、选择或富集的细胞在刺激之前未进行冷冻保护，并且如从分离、富集和/或选择输入细胞(至收集、配制和/或冷冻保护输出细胞的时间)所测量，完成所提供过程所需的持续时间或时间量是为、为约或小于48小时、72小时、96小时、或120小时、或2天、3天、4天、或5天。
在某些实施方案中，对从生物样品分离、富集或选择的细胞(例如，CD4+和CD8+T细胞)的群体进行所提供的过程。在一些方面，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时起，在如与其他方法或过程相比缩短的时间量内，产生或生成工程化T细胞的组合物。在一些实施方案中，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时至收集、收获或配制工程化T细胞(例如，用于冷冻保存或施用)时，在或在约10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天内，或者在或在约120小时、96小时、72小时或48小时内，产生或生成工程化T细胞，包括在用于刺激或转导的步骤之前对生物样品或者富集、分离或选择的细胞进行冷冻保存和储存的任何或所有时间。在特定实施方案中，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时至收集、收获或配制工程化T细胞时，在或在约6天与8天之间(包含端值)内，产生或生成工程化T细胞，包括在用于刺激或转导的步骤之前对生物样品或者富集、分离或选择的细胞进行冷冻保存和储存的任何或所有时间。
在某些实施方案中，所提供的方法与生成或产生富集的T细胞的输出细胞和/或输出群体的过程结合使用。在特定实施方案中，富集的T细胞的输出细胞和/或输出群体是或包括如下细胞：从生物样品(如血液样品或白细胞单采术样品)收集、获得、分离、选择和/或富集；在刺激条件下孵育；工程化(例如，转导)以表达或含有重组多核苷酸，例如，编码重组受体的多核苷酸，如CAR；培育至阈值量、密度或扩增；和/或进行配制。在一些实施方案中，例如，在所述过程的一个或多个步骤期间、之前和/或之后，输出群体的先前已经进行冷冻保护并解冻。在一些实施方案中，输出群体含有表达重组受体(例如，CAR)的T细胞，例如，CD4+T细胞和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，输出群体中至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％、至少95％的细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少50％的细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的CD3+T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，输出组合物中至少50％的CD3+T细胞表达重组受体。在特定实施方案中，输出组合物中至少至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或超过99％的CD4+T细胞表达重组受体。在特定实施方案中，输出组合物中至少50％的CD4+T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，输出组合物中至少至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或超过99％的CD8+T细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少50％的CD8+T细胞表达重组受体。
在特定实施方案中，如与通过替代性过程(例如，包括扩增细胞的一个或多个步骤的过程)产生的输出细胞相比，所述输出组合物的细胞具有改进的针对表达由重组受体结合和/或识别的抗原的细胞(例如，靶细胞)的细胞溶解活性。在一些实施方案中，当使输出组合物的细胞暴露于表达抗原的细胞(例如，靶细胞)时，所述输出组合物的细胞杀伤、杀伤约或杀伤至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的表达抗原的细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞比相似或相同条件下通过替代性过程产生的输出细胞多杀伤至少25％、50％、75％、100％、150％或者1倍、2倍、3倍、4倍或5倍的量的表达抗原的细胞(例如，靶细胞)。
在特定实施方案中，如与通过替代性过程(例如，包括扩增细胞的一个或多个步骤的过程)产生的输出细胞相比，输出群体的细胞具有改进的体内抗肿瘤活性。在一些实施方案中，在将输出组合物的细胞施用至受试者(例如，患有肿瘤或癌症的受试者)时，输出群体的细胞杀伤、杀伤约或杀伤至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的受试者体内的肿瘤细胞(例如，表达抗原的癌细胞或肿瘤细胞)。在某些实施方案中，输出组合物的细胞比相似或相同条件下通过替代性过程产生的输出细胞多杀伤至少25％、50％、75％、100％、150％或者1倍、2倍、3倍、4倍或5倍的量的体内肿瘤细胞。
在特定实施方案中，输出群体的大多数细胞是幼稚样、中枢记忆和/或效应记忆细胞。在特定实施方案中，输出群体的大多数细胞是幼稚样或中枢记忆细胞。在一些实施方案中，输出群体的大多数细胞对CCR7或CD27表达中的一种或多种呈阳性。在某些实施方案中，输出群体的细胞具有比从替代性过程(如涉及扩增的过程)产生的输出群体更大份额的幼稚样或中枢记忆细胞。
在某些实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的被消耗的和/或衰老的细胞。在特定实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的被消耗的和/或衰老的细胞。在一些实施方案中，输出群体中小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的细胞是被消耗的和/或衰老的。在某些实施方案中，输出群体中小于25％的细胞是被消耗的和/或衰老的。在某些实施方案中，输出群体中小于小于10％的细胞是被消耗的和/或衰老的。在特定实施方案中，所述细胞具有低份额。
在一些实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的对CD27和CCR7表达(例如，表面表达)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的CD27-CCR7-细胞。在一些实施方案中，输出群体中小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的细胞是CD27-CCR7-细胞。在某些实施方案中，输出群体中小于25％的细胞是CD27-CCR7-细胞。在某些实施方案中，输出群体中小于小于10％的细胞是CD27-CCR7-细胞。在实施方案中，输出群体中小于5％的细胞是CD27-CCR7-细胞。
在一些实施方案中，输出群体的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CCR7表达(例如，表面表达)中的一种或两种呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出群体的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性。在各种实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD4+CAR+细胞对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性。在一些实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD8+CAR+细胞对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性。
在某些实施方案中，输出群体的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CCR7表达(例如，表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出群体的细胞具有高份额和/或频率的CD27+CCR7+细胞。在一些实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞是CD27+CCR7+细胞。在各种实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD4+CAR+细胞是CD27+CCR7+细胞。在一些实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD8+CAR+细胞是CD27+CCR7+细胞。
在某些实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的对CCR7表达(例如，表面表达)呈阴性并且对CD45RA表达(例如，表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出群体中小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在一些实施方案中，输出群体中小于25％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出群体中小于小于10％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在某些实施方案中，输出群体中小于5％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。
在特定实施方案中，在细胞群的为、为约或至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、八次、十次、二十次或更多次细胞倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前，收获细胞。在某些实施方案中，在群体的任何倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前，收获细胞。在一些方面，减少在工程化过程期间可能发生的倍增将在一些实施方案中增加幼稚样的工程化T细胞的份额。在一些实施方案中，增加工程化过程期间的倍增增加在工程化过程期间可能发生的T细胞分化。
在一些方面，考虑到，对于生成或产生工程化细胞组合物的过程，减少在过程期间(例如，在孵育期间)发生的扩增或细胞倍增增加所得工程化细胞组合物中幼稚样T细胞的量或份额。在特定方面，增加在过程期间发生的扩增或细胞倍增增加所得工程化细胞组合物中分化的T细胞的量或份额。在一些方面，考虑到，增加或增大所得工程化细胞组合物中幼稚样细胞的份额的过程(如本文所提供的过程)可以增加在施用后工程化细胞组合物例如在体内的效力、功效和持久性。
1.使用刺激性珠试剂的过程
在一些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过包括以下的步骤产生：(i)将T细胞的输入群体或含有T细胞的输入群体与含有珠的刺激试剂(例如，本文如在章节I-B-1-a中所述的基于珠的刺激试剂)一起孵育在或在约18小时与30小时之间，包含端值，(ii)将编码重组受体的异源或重组多核苷酸引入受刺激的群体的T细胞中，(iii)在静态条件下孵育细胞，(iv)从细胞去除或分离顺磁珠试剂，以及(v)收集或收获孵育的细胞。
在某些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过以下方式产生：(i)将包含T细胞的输入群体在抗CD3/抗CD28抗体缀合的顺磁珠的存在下在刺激条件下孵育18小时与30小时之间，包含端值，(ii)用编码重组受体的病毒载体转导刺激的T细胞，如通过在所述病毒载体的存在下旋转接种刺激的T细胞来进行，(iii)将转导的T细胞在静态条件下孵育在或在约42小时与84小时之间，包含端值，以及(iv)收获或收集T细胞。
在一些实施方案中，所提供的用于产生工程化细胞群的方法包括以下中的一项或多项：在含有重组IL-2、Il-7和IL-15的培养基中，在抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠以1:1的珠:细胞的比率的存在下，将T细胞的输入群体刺激18小时与30小时之间，包含端值；通过以下方式用编码重组受体的病毒载体转导细胞：首先将细胞在病毒载体的存在下以693g的力旋转接种30分钟，然后将旋转接种的细胞与病毒载体一起孵育48小时与96小时之间，包含端值；将细胞暴露于磁体以从细胞去除或分离抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠；以及收集或收获细胞。
在一些实施方案中，从刺激开始在或在约54小时与120小时之间(包含端值)，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在开始刺激之后60小时与108小时之间或72小时与96小时之间(包含端值)，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在开始刺激之后60小时与108小时之间或72小时与96小时之间(包含端值)，从细胞去除或分离抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠。
在一些实施方案中，在从刺激开始为或为约48小时(例如，48小时±6小时)之后，从细胞去除或分离抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠。在一些实施方案中，在从刺激开始为或为约72小时(例如，72小时±6小时)之后，从细胞去除或分离抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠。在特定实施方案中，在从刺激开始为或为约96小时(例如，96小时±6小时)之后，从细胞去除或分离抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠。在一些实施方案中，在孵育期间从细胞去除或分离抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠，并且在暴露于磁场之后将细胞返回到孵育。在特定实施方案中，在孵育之后从细胞去除或分离抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠，并且在暴露于磁场之后收集或收获细胞。
2.基于寡聚刺激试剂的方案
在一些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过包括以下的步骤产生：将T细胞的输入群体或含有T细胞的输入群体与寡聚刺激性颗粒试剂(例如，本文如在章节I-B-1-b中所述的基于寡聚物的刺激试剂)一起孵育在或在约18小时与30小时之间，包含端值；将编码重组受体的异源或重组多核苷酸引入受刺激的群体的T细胞中，(iii)在静态条件下孵育细胞，(iv)通过添加竞争试剂从细胞去除或分离刺激试剂，以及(v)收集或收获孵育的细胞。
在某些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过包括以下的步骤产生：将包含T细胞的输入群体在具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的链霉亲和素突变蛋白寡聚物的存在下在刺激条件下孵育18小时与30小时之间，包含端值；用编码重组受体的病毒载体转导刺激的T细胞，如通过在所述病毒载体的存在下旋转接种刺激的T细胞来进行，然后将转导的T细胞在静态条件下孵育在或在约42小时与84小时之间，包含端值；以及收获或收集T细胞。
在一些实施方案中，所提供的用于产生工程化细胞群的方法包括以下中的一项或多项：在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，在具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白(其量为对于每106个细胞在或在约0.4μg与8μg之间，包含端值，例如，对于每106个细胞1.2μg)的存在下，将T细胞的输入群体刺激18小时与30小时之间，包含端值；通过以下方式用编码重组受体的病毒载体转导细胞：首先将细胞在病毒载体的存在下以693g的力旋转接种30分钟，然后将旋转接种的细胞与病毒载体一起孵育24小时与96小时之间，包含端值；将生物素(例如，D-生物素)添加至细胞以从细胞去除或分离具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白；以及收集或收获细胞。
在一些实施方案中，从刺激开始在或在约36小时与96小时之间(包含端值)，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在开始刺激之后36小时与108小时之间或48小时与96小时之间(包含端值)，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在开始刺激之后36小时与96小时之间或48小时与72小时之间(包含端值)，将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞去除或分离。
在一些实施方案中，在从刺激开始为或为约48小时(例如，48小时±6小时)之后，将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在从刺激开始为或为约72小时(例如，72小时±6小时)之后，将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在从刺激开始为或为约96小时(例如，96小时±6小时)之后，将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在孵育之后将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞去除或分离，并且在添加生物素或生物素类似物之后收集或收获细胞。在某些实施方案中，在孵育期间将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞去除或分离，使得在添加生物素或生物素类似物之后将细胞返回到孵育。
在一些实施方案中，孵育在重组细胞因子(例如IL-2、IL-7和IL-15)的存在下在无血清培养基中进行。在某些实施方案中，孵育在不存在重组细胞因子的情况下进行。在特定实施方案中，孵育在基础培养基的存在下进行。在某些实施方案中，如与其中将用寡聚刺激试剂刺激的细胞在含有重组细胞因子的无血清培养基的存在下孵育的过程相比，在基础培养基中的孵育促进整合(例如，异源或重组核苷酸的稳定整合)，增加表达重组受体的细胞的百分比，改进效力，或者降低细胞的分化。
在特定实施方案中，如通过添加生物素或生物素类似物去除寡聚刺激试剂(例如，具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白)减少在从细胞分离或去除刺激试剂时可能发生的细胞损失的量。在一些实施方案中，在从细胞分离或去除寡聚刺激试剂时，从细胞群损失、杀伤或分离小于或小于约30％、25％、20％、15％、10％或5％的细胞。在某些实施方案中，从使用寡聚刺激试剂进行刺激的过程产生的输出群体具有的总细胞比从利用替代性刺激试剂(如抗体缀合的顺磁珠)的过程产生的输出群体多为、为约或至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。
3.载体拷贝数
在一些实施方案中，转基因序列(如编码重组受体例如CAR的转基因序列)的基因组整合可以在与用于工程化细胞的任何所提供过程结合产生的细胞中进行评估。在一些实施方案中，评估整合拷贝数，其是整合至细胞的染色体DNA或基因组DNA中的转基因序列的拷贝数。
在一些实施方案中，用于评估转基因序列的基因组整合的方法涉及从自一种或多种细胞分离的DNA分开脱氧核糖核酸(DNA)的高分子量级分，如大于或大于约10千碱基(kb)的DNA种类。在一些方面，这种分离可以通过诸如脉冲场凝胶电泳(PFGE)的方法进行。在一些方面，所述一个或多个细胞含有或被怀疑含有至少一个工程化细胞，所述至少一个工程化细胞包含编码重组蛋白的转基因序列。在一些方面，所述方法涉及确定整合到所述一个或多个细胞的基因组中的转基因序列的存在、不存在或量，例如通过定量方法(如定量聚合酶链式反应(qPCR)、数字PCR(dPCR)或微滴式数字PCR(ddPCR))来确定。
在一些实施方案中，所述高分子量级分主要含有大DNA分子如染色体或基因组DNA，并且含有低的或几乎不含大小小于阈值的分子，如质粒、非整合的DNA片段、线性互补DNA(cDNA)、自体整合体(autointegrant)、长末端重复序列(LTR)环或者尚非整合至基因组中的其他残余种类或分子。在一些实施方案中，通过确定所述高分子量级分中转基因序列的存在、不存在或量，所检测到的转基因序列表示已整合到工程化细胞的基因组中的那些，并且最小限度地检测到非整合转基因序列。
在一些实施方案中，所述高分子量级分包含大小大于或大于约10千碱基(kb)的DNA分子。在一些实施方案中，所述高分子量级分包含大小大于或大于约10、11、12、12.5、13、14、15、16、17、17.5、18、19、20、25或30千碱基(kb)或更大的DNA分子。在一些实施方案中，所述高分子量级分包含大小大于或大于约10、12.5、15、17.5或20千碱基(kb)或更大的DNA分子。在一些方面，所述高分子量级分含有基因组DNA或基因组DNA片段，并且排除或分离可能存在于DNA样品中的非整合或残留的核酸种类。在一些方面，所述高分子量级分例如高于阈值(如约10、11、12、12.5、13、14、15、16、17、17.5、18、19、20、25或30千碱基(kb)或更大)的DNA样品。在一些实施方案中，所述阈值大于或大于约10、12.5、15、17.5或20千碱基(kb)或更大。
在一些实施方案中，使用基于电泳的方法分开或分离所述高分子量级分。在一些方面，电泳依据电荷和/或大小经由在存在电场的情况下通过分离基质的迁移率分离生物分子。在一些实施方案中，电泳系统可以用于基于大小或分子量来分级分离、分析和收集特定分析物，包括核酸分子。在一些方面，级分是或包括所述多个分子的子集。在一些方面，可以通过大小或分子量来定义或确定级分，或者在一些方面通过任何如下物理特性来定义或确定级分，当由电场力驱动其迁移通过本发明的缓冲液组合物时，所述物理特性使其以比多个分子或级分中的其他分子或级分更快或更慢的速率(即，电泳迁移率)迁移。
在一些实施方案中，使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分开或分离所述高分子量级分。在一些方面，PFGE涉及在电泳系统中引入交流电压梯度以提高较大核酸分子(如染色体或基因组DNA)的分辨率。在一些方面，所述电泳系统的电压在三个方向之间周期性地切换：一个沿着凝胶的中心轴，并且两个沿着两侧60度的角度。在一些方面，用于通过PFGE分开或分离核酸分子的示例性系统和方法包括在例如US 9599590、US 2017/0240882或US 2017/0254774中描述的那些。
在一些方面，所述电泳(如PFGE)可以使用设备或系统来进行。在一些方面，所述设备或系统是自动化系统或高通量系统。用于进行PFGE的示例性系统包括例如US 9599590、US 2017/0240882或US 2017/0254774中所述的那些，或可商购的设备或系统，如PippinPrep、Blue Pippin或Pippin HT(Sage Science)；CHEF
Figure BDA0003008592730001791
XA系统、
Figure BDA0003008592730001792
III变角度系统、CHEF-DR II系统(Bio-Rad)；和Biometra Rotaphor 8系统(Analytik JenaAG)。
在一些方面，用于评估的示例性样品包括核酸、寡核苷酸、DNA分子、RNA分子或其任何组合。在一些方面，所述样品可以包括氨基酸、肽、蛋白质或其任何组合。在一些方面，所述样品可以是全细胞裂解物或细胞裂解物(如工程化用于过继细胞疗法的细胞的裂解物)的DNA或蛋白质级分。
在一些实施方案中，来自样品的核酸可以包括基因组DNA、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、编码DNA(或cDNA)、信使RNA(mRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、单链RNA、双链RNA(dsRNA)、吗啉代、RNA干扰(RNAi)分子、线粒体核酸、叶绿体核酸、病毒DNA、病毒RNA和具有单独遗传物质的其他细胞器。在一些方面，来自样品的核酸还可以包括含有经修饰的、合成的或非天然存在的核苷酸或结构元件的核酸类似物或者其他替代/经修饰的核酸化学物质(如碱基类似物(如肌苷)、嵌入剂(美国专利号4,835,263)和小沟结合剂(美国专利号5,801,115)。
在一些实施方案中，在分离或分开高分子量或低分子量级分之前，可以将样品与如下试剂组合，所述试剂在电泳系统中评估之前赋予净负电荷、使肽或蛋白质变性或消化DNA或RNA分子。在一些方面，出于检测的目的，可以将样品与赋予样品或其级分荧光、磁性或放射性特性的药剂组合。在一些例子中，将dsDNA样品与溴化乙锭混合，施加至电泳盒，并且使用超亮绿色LED检测样品的级分。
在一些方面，用于分开或分离核酸样品的系统(如电泳系统)可以是自动化的和/或高通量的。在一些方面，所述电泳系统可以利用一次性消耗品或试剂，如电泳盒。
在一些方面，确定转基因序列的存在、不存在或量可以使用用于确定核酸序列的存在、不存在或量的方法来进行。特别地，用于定量核酸序列的方法(如定量聚合酶链式反应(qPCR)或相关方法)可以用于确定含有DNA的样品中或从含有DNA的样品分开或分离的特定级分(如高分子量级分)中的转基因序列的拷贝数。在一些实施方案中，确定转基因序列的存在、不存在或量包括例如使用下文用于对核酸分子进行定量的任一种示例性测定来确定拷贝数。
在一些方面，可以使用探针或引物检测特定序列的存在、不存在和/或量，所述探针或引物可以特异性结合或识别所述转基因序列的全部或一部分。在一些实施方案中，可以使用探针或引物序列来确定拷贝数，所述探针可以特异性检测所述转基因序列的一部分，所述引物序列可以特异性扩增所述转基因序列的一部分。在一些方面，所述探针或引物序列可以特异性检测、结合或识别所述转基因序列的一部分，如所述转基因序列中对细胞而言为异源的、外源的或转基因的部分。在一些实施方案中，用于qPCR或其他基于核酸的方法的引物或探针对结合、识别和/或扩增编码重组蛋白的核酸和/或所述质粒和/或载体的其他组分或元件具有特异性，所述其他组分或元件包括调节元件(例如启动子、转录和/或转录后调节元件或反应元件)或标记(例如替代标记)。在一些方面，所述探针或引物可以用于确定转基因序列的存在、不存在和/或量的示例性方法，如定量PCR(qPCR)、数字PCR(dPCR)或微滴式数字PCR(ddPCR)。
在一些方面，确定所述存在、不存在或量包括确定所述转基因序列的量，如确定在一个或多个细胞中或在含有一个或多个细胞的生物样品中所述转基因序列的质量、重量、浓度或拷贝数。在一些方面，确定核酸序列的存在、不存在或量或评估所述转基因序列的质量、重量、浓度或拷贝数可以在细胞群体的一部分或生物样品的一部分中进行，并且可以进行归一化、平均、和/或外推以确定整个样品或整个细胞群体中的存在、不存在或量。
在一些实施方案中，确定所述转基因序列的存在、不存在或量包括确定所述一个或多个细胞中的每个二倍体基因组或每个细胞中所述转基因序列的质量、重量、浓度或拷贝数。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞构成细胞群体，其中所述群体的多个细胞包含编码所述重组蛋白的转基因序列。在一些实施方案中，所述拷贝数是所述细胞群体中的每个二倍体基因组或每个细胞中的平均或均值拷贝数。
在一些方面，确定所述拷贝数包括确定存在于一个或多个细胞或生物样品中的转基因序列的拷贝数。在一些方面，所述拷贝数可以表示为平均或均值拷贝数。在一些方面，特定整合转基因的拷贝数包括每个细胞中的整合体(含有转基因序列)的数量。在一些方面，特定整合转基因的拷贝数包括每个二倍体基因组中的整合体(含有转基因序列)的数量。在一些方面，转基因序列的拷贝数表示为每个细胞中的整合转基因序列的数量。在一些方面，转基因序列的拷贝数表示为每个二倍体基因组中的整合转基因序列的数量。在一些方面，所述一个或多个细胞构成细胞群体，其中所述群体的多个细胞包含编码所述重组蛋白的转基因序列。在一些实施方案中，所述拷贝数是所述细胞群体中的每个二倍体基因组或每个细胞中的平均或均值拷贝数。
在一些实施方案中，确定所述转基因序列的量包括评估所述一个或多个细胞的每个细胞中、任选每个CD3+、CD4+和/或CD8+细胞中和/或每个表达所述重组蛋白的细胞中所述转基因序列的质量、重量、浓度或拷贝数。在一些方面，可以使用基于细胞的方法(如通过流式细胞术或免疫染色)来确定在细胞上表达的表面标记或表型。在一些方面，表达重组蛋白的细胞可以使用基于细胞的方法来确定，如通过流式细胞术或免疫染色(例如使用抗独特型抗体或针对替代标记染色)来进行。在一些方面，转基因序列的量可以针对特定细胞(如CD3+、CD4+和/或CD8+细胞)的数量来归一化，和/或按照表达重组蛋白的细胞或按照细胞总数(如按照样品中的细胞总数或按照正在经历工程化过程的细胞总数)来归一化。
在一些实施方案中，所确定的拷贝数表示为归一化值。在一些实施方案中，将所确定的拷贝数定量为每个基因组或每个细胞中的转基因序列的拷贝数。在一些方面，每个基因组的值表示为每个二倍体基因组中的转基因序列的拷贝，因为典型的体细胞(如T细胞)含有二倍体基因组。在一些方面，所确定的拷贝数可以针对细胞的基因组中已知参考基因的拷贝数归一化。在一些方面，参考基因是RRP30(编码核糖核酸酶P蛋白亚基p30)、或18SrRNA(编码18S核糖体RNA)、28S rRNA(编码28S核糖体RNA)、TUBA(编码α-微管蛋白)、ACTB(编码β-肌动蛋白)、β2M(编码β2-微球蛋白)、ALB(编码白蛋白)、RPL32(编码核糖体蛋白L32)、TBP(编码TATA序列结合蛋白)、CYCC(编码亲环蛋白C)、EF1A(编码延伸因子1α)、GAPDH(编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、HPRT(编码次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)或RPII(编码RNA聚合酶II)。在一些实施方案中，将所确定的拷贝数定量为每微克DNA中的转基因序列的拷贝。
在一些方面，所述拷贝数是来自多个细胞或细胞群体(如多个工程化细胞或工程化细胞群体)的平均、均值或中值拷贝数。在一些方面，拷贝数是来自多个细胞或细胞群(如多个工程化细胞或工程化细胞群)的平均或均值拷贝数。在一些方面，所述平均或均值拷贝数是从多个细胞或细胞群(如经受工程化或制造过程的一个或多个步骤的多个细胞或细胞群)或在细胞组合物(如用于施用至受试者的细胞组合物)中确定。在一些方面，归一化的平均拷贝数被确定为例如针对参考基因(如在二倍体基因组中以两个拷贝存在的已知基因)归一化的转基因序列的平均或均值拷贝数。在一些方面，针对通常在每个二倍体基因组中以两个拷贝存在的参考基因的归一化可以对应于细胞(如二倍体细胞)中的拷贝数。因此，在一些方面，归一化的平均或均值拷贝数可以对应于多个细胞(例如，通常具有二倍体基因组的T细胞)或细胞群体中检测到的转基因序列的平均或均值拷贝数。
在一些实施方案中，确定所述转基因序列的存在、不存在或量是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的。在一些实施方案中，所述PCR是定量聚合酶链式反应(qPCR)、数字PCR或微滴式数字PCR，如下文中描述的任一种。在一些实施方案中，所述转基因序列的存在、不存在或量通过微滴式数字PCR来确定。在一些实施方案中，所述PCR是使用与所述转基因序列的至少一部分互补或能够将其特异性扩增的一种或多种引物进行的，并且在一些情况下是使用与参考基因的至少一部分互补或能够将其特异性扩增的一种或多种引物进行的。
在一些方面，qPCR可以用于实时检测随着反应进展而测量的扩增产物的积累，并在每个循环后进行产物定量。因此，在一些方面，qPCR可以用于确定样品中特定核酸序列(如转基因序列)的拷贝数。在一些方面，qPCR在每个反应孔中使用荧光报告分子，所述荧光报告分子随着产物DNA的量增加而产生增加的荧光。在一些方面，使用的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异性引物或探针。在一些方面，qPCR使用专门的热循环仪，所述热循环仪具有以指定波长照射每个样品并检测由激发的荧光团发射的荧光的能力。在一些方面，所测量的荧光与扩增子的总量成比例；荧光随时间的变化用于计算每个循环中产生的扩增子的量。
在一些实施方案中，dPCR是用于检测和定量核酸的方法，并且允许对靶核酸分子进行准确的定量分析和高度灵敏的检测。在一些方面，dPCR涉及将DNA有限稀释成一系列单独PCR反应物(或分区)。在一些方面，有限稀释可以基于待评估的模板核酸(例如，转基因序列)的随机分布和泊松统计，使用以纳米流体学和乳液化学物质划分的原理来测量对于给定比例的正分区存在的DNA的量。在一些方面，dPCR通常是线性的并且是灵敏的，能够检测或定量非常少量的DNA。在一些方面，dPCR允许使用无需标准曲线的单分子计数方法对DNA样品进行绝对定量，并且可以从每个孔的单个分区的PCR获得绝对定量(参见Pohl等人,(2004)Expert Rev.Mol.Diagn.4(1),41-47)。
用于dPCR的示例性可商购设备或系统包括RaindropTM数字PCR系统(RaindanceTMTechnologies)；QX200TMDroplet DigitalTMPCR系统(Bio-Rad)；BioMarkTMHD系统和qdPCR 37KTMIFC(Fluidigm Corporation)和QuantStudioTM3D数字PCR系统(LifeTechnologiesTM)(参见例如，Huggett等人(2013)Clinical Chemistry 59:1691–1693；Shuga等人(2013)Nucleic Acids Research 41(16):e159；Whale等人(2013)PLoS One 3:e58177)。
在一些实施方案中，使用微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)确定用于整合到工程化细胞的基因组中的转基因序列(如编码重组蛋白的转基因序列)的存在、不存在或量。ddPCR是一种类型的数字PCR，其中将所述PCR溶液通过水油乳液化学物质分成或划分为较小的反应物，以产生大量微滴。在一些方面，可以使用特定的表面活性剂产生油包水微滴。(参见例如，Hindson等人,(2011)Anal Chem 83(22):8604–8610；Pinheiro等人,(2012)Anal Chem 84,1003–1011)。在一些方面，每个单独微滴随后作为单独反应运行。在一些方面，将PCR样品划分为纳升大小的样品并封装进油性微滴中。在一些方面，所述油性微滴是使用微滴生成器制备的，所述微滴生成器向每个孔施加真空。在示例性的情况下，可以由20μL样品体积制备用于单独反应的大约20,000个油性微滴。
在一些方面，评估整合拷贝数的方法可以在不同时间点进行，以确定并比较基因工程化(如将引入的转基因序列整合至将所述转基因序列引入其中的细胞的基因组中)的时间安排、程度或进展。在一些方面，所述方法可以在用于工程化细胞组合物的工程化或制造过程(如所述的任何过程)的不同阶段进行。例如，所提供的方法可以在扩增工程化过程或非扩增工程化过程的各个阶段进行。
在一些方面，使用上述用于载体拷贝数的测定，针对如编码重组受体(例如CAR)的转基因序列的基因组整合来评估通过所提供的方法工程化的细胞。在一些实施方案中，所述方法涉及从自细胞分离的脱氧核糖核酸(DNA)分开大于或大于约10千碱基(kb)的高分子量级分，其中在所述分开之前，已经在用于将转基因序列整合至细胞基因组中的条件下，如通过病毒转导向细胞中引入包含转基因序列的多核苷酸；以及确定所述转基因序列在所述高分子量级分中的存在、不存在或量。
4.输出组合物的示例性特征。
在某些实施方案中，所提供的方法与用于生成或产生富集的T细胞的输出细胞和/或输出组合物(例如，治疗性T细胞组合物)的过程结合使用。在特定实施方案中，输出组合物是富含CD3+T细胞的细胞组合物。在一些实施方案中，输出组合物中至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％或约100％的总细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或约86％、至少或约86.5％、至少或约87％、至少或约87.5％、至少或约88％、至少或约88.5％、至少或约89％、至少或约89.5％、至少或约90％、至少或约90.5％、至少或约91％、至少或约91.5％、至少或约92％、至少或约92.5％、至少或约93％、至少或约93.5％、至少或约94％、至少或约94.5％、至少或约95％、至少或约95.5％、至少或约96％、至少或约96.5％、至少或约97％、至少或约97.5％、至少或约98％、或至少或约98.5％的总细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中在约80％与约100％之间、在约85％与约98％之间、在约88％与约96％之间或在约90％与约94％之间的总细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物基本上由CD3+T细胞组成。在一些实施方案中，输出组合物中至少或约90％的总细胞是CD3+T细胞，并且输出组合物中至少或约40％的总细胞表达重组受体(例如，CAR)。
在某些实施方案中，输出组合物是富含CD4+T细胞和CD8+T细胞的细胞组合物。在特定实施方案中，CD4+T细胞和CD8+T细胞占输出组合物中总细胞的至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％或约100％。在一些实施方案中，CD4+T细胞和CD8+T细胞占输出组合物中总细胞的至少或约86％、至少或约86.5％、至少或约87％、至少或约87.5％、至少或约88％、至少或约88.5％、至少或约89％、至少或约89.5％、至少或约90％、至少或约90.5％、至少或约91％、至少或约91.5％、至少或约92％、至少或约92.5％、至少或约93％、至少或约93.5％、至少或约94％、至少或约94.5％、至少或约95％、至少或约95.5％、至少或约96％、至少或约96.5％、至少或约97％、至少或约97.5％、至少或约98％、或至少或约98.5％。在一些实施方案中，CD4+T细胞和CD8+T细胞占输出组合物中总细胞的在约80％与约100％之间、在约85％与约98％之间、在约88％与约96％之间或在约90％与约94％之间。在一些实施方案中，输出组合物基本上由CD4+T细胞和CD8+T细胞组成。
在特定实施方案中，输出组合物含有在为或约10％与为或约90％之间、在为或约20％与为或约80％之间、在为或约25％与为或约75％之间、在为或约30％与为或约70％之间、在为或约35％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约60％之间、在为或约55％与为或约45％之间、或约50％或50％的CD4+T细胞，以及为或约在为或约10％与为或约90％之间、在为或约20％与为或约80％之间、在为或约25％与为或约75％之间、在为或约30％与为或约70％之间、在为或约35％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约60％之间、在为或约55％与为或约45％之间、或约50％或50％的CD8+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物含有在为或约35％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约60％之间、在为或约55％与为或约45％之间、或约50％或50％的CD4+T细胞，以及为或约在为或约35％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约60％之间、在为或约55％与为或约45％之间、或约50％或50％的CD8+T细胞。在特定实施方案中，输出含有在为或约35％与为或约65％之间的CD4+T细胞以及为或约在为或约35％与为或约65％之间的CD8+T细胞。在特定实施方案中，输出组合物含有比率在3:1与1:3之间、在2.5:1与1:2.5之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.4:1与1:1.4之间、在1.3:1与1:1.3之间、在1.2:1与1:1.2之间、或在1.1:1与1:1.1之间的CD4+T细胞与CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞组合物具有比率为或为约3:1、为或为约2.8:1、为或为约2.5:1、为或为约2.25:1、为或为约2:1、为或为约1.8:1、为或为约1.7:1、为或为约1.6:1、为或为约1.5:1、为或为约1.4:1、为或为约1.3:1、为或为约1.2:1、为或为约1.1:1、为或为约1:1、为或为约1:1.1、为或为约1:1.2、为或为约1:1.3、为或为约1:1.4、为或为约1:1.5、为或为约1:1.6、为或为约1:1.7、为或为约1:1.8、为或为约1:2、为或为约1:2.25、为或为约1:2.5、为或为约1:2.8或者为或为约1:3的CD4+T细胞与CD8+T细胞。
在一些实施方案中，至少为或约75％、至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约95％、至少为或约97％、至少为或约98％、或至少为或约99％的通过本文所提供的方法产生的输出组合物具有在10:90与90:10之间、在20:80与80:20之间、在75:25与25:75之间、在70:30与30:70之间、在35:65与65:35之间、在40:60与60:40之间、在45:55与55:45之间、或约50:50或50:50的CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率。在特定实施方案中，至少80％、至少85％、或至少90％的通过本文所提供的方法产生的输出组合物具有比率在3:1与1:3之间、在2.5:1与1:2.5之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.4:1与1:1.4之间、在1.3:1与1:1.3之间、在1.2:1与1:1.2之间或在1.1:1与1:1.1之间的CD4+T细胞与CD8+T细胞。在某些实施方案中，至少90％的通过本文所提供的方法产生的输出组合物具有在1:2与2:1之间的CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率。在特定实施方案中，至少90％的通过本文所提供的方法产生的输出组合物具有在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25之间或在1.1:1与1:1.1之间的CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率。
在一些实施方案中，输出组合物含有比率在3:1与1:3之间、在2.5:1与1:2.5之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.4:1与1:1.4之间、在1.3:1与1:1.3之间、在1.2:1与1:1.2之间、或在1.1:1与1:1.1之间的表达重组受体(例如CAR)的CD4+T细胞与表达重组受体(例如CAR)的CD8+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中表达重组受体(例如，CAR)的CD4+T细胞与表达重组受体(例如，CAR)的CD8+T细胞的比率为或为约3:1、为或为约2.8:1、为或为约2.5:1、为或为约2.25:1、为或为约2:1、为或为约1.8:1、为或为约1.7:1、为或为约1.6:1、为或为约1.5:1、为或为约1.4:1、为或为约1.3:1、为或为约1.2:1、为或为约1.1:1、为或为约1:1、为或为约1:1.1、为或为约1:1.2、为或为约1:1.3、为或为约1:1.4、为或为约1:1.5、为或为约1:1.6、为或为约1:1.7、为或为约1:1.8、为或为约1:2、为或为约1:2.25、为或为约1:2.5、为或为约1:2.8或者为或为约1:3。
在特定实施方案中，至少80％、至少85％、或至少90％的通过本文所提供的方法产生的输出组合物具有比率在3:1与1:3之间、在2.5:1与1:2.5之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.4:1与1:1.4之间、在1.3:1与1:1.3之间、在1.2:1与1:1.2之间或在1.1:1与1:1.1之间的表达重组受体(例如，CAR)的CD4+T细胞与表达重组受体(例如，CAR)的CD8+T细胞。在某些实施方案中，至少90％的通过本文所提供的方法产生的输出组合物具有在1:2与2:1之间的CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率。在特定实施方案中，至少90％的通过本文所提供的方法产生的输出组合物具有在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25之间、在1.1:1与1:1.1之间的CD4+T细胞与CD8+T细胞的比率。
在一些实施方案中，与所提供的方法结合生成或产生的输出组合物含有表达重组受体(例如，TCR或CAR)的细胞。在一些实施方案中，表达重组受体可以包括但不限于具有定位于细胞膜和/或细胞表面的一种或多种重组受体蛋白，具有可检测量的重组受体蛋白，具有可检测量的编码重组受体的mRNA，具有或含有编码重组受体的重组多核苷酸，和/或具有或含有作为重组受体表达的替代标记的mRNA或蛋白质。
在一些实施方案中，输出组合物中至少或约5％、至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或超过99％的细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少或约50％的细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少或约5％、至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或超过99％的CD3+T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，输出组合物中至少或约50％的CD3+T细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少或约5％、至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或超过99％的细胞是表达重组受体的CD3+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或约50％的细胞是表达重组受体的CD3+T细胞。
在特定实施方案中，输出组合物中至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或超过99％的CD4+T细胞表达重组受体。在特定实施方案中，输出组合物中至少或约50％的CD4+T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，输出组合物中至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或超过99％的CD8+T细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少或约50％的CD8+T细胞表达重组受体。
在特定实施方案中，输出组合物含有至少为或约50％、至少为或约60％、至少为或约70％、至少为或约75％、至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约95％、至少为或约99％、或至少为或约99.9％的活细胞。在一些实施方案中，输出组合物含有至少为或约75％的活细胞。在某些实施方案中，输出组合物含有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％的活细胞。在一些实施方案中，输出组合物含有至少为或约50％、至少为或约60％、至少为或约70％、至少为或约75％、至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约95％、至少为或约99％、或至少为或约99.9％的活CD3+T细胞。在特定实施方案中，输出组合物含有至少为或约75％的活CD3+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物含有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％的活CD3+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物含有至少为或约50％、至少为或约60％、至少为或约70％、至少为或约75％、至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约95％、至少为或约99％、或至少为或约99.9％的活CD4+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物含有至少为或约75％的活CD4+T细胞。在特定实施方案中，输出组合物含有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％的活CD4+T细胞。在特定实施方案中，输出组合物含有至少为或约50％、至少为或约60％、至少为或约70％、至少为或约75％、至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约95％、至少为或约99％、或至少为或约99.9％的活CD8+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物含有至少为或约75％的活CD8+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物含有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％的活CD8+T细胞。
在特定实施方案中，输出细胞具有低份额和/或频率的细胞正在经历和/或被准备、引发和/或进入凋亡。在特定实施方案中，输出细胞具有低份额和/或频率的对凋亡标记呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于为或约40％、小于为或约35％、小于为或约30％、小于为或约25％、小于为或约20％、小于为或约15％、小于为或约10％、小于为或约5％或小于为或约1％的细胞表达、含有细胞凋亡标记和/或对细胞凋亡标记呈阳性。在某些实施方案中，输出组合物中小于为或约25％的细胞表达、含有细胞凋亡标记和/或对细胞凋亡标记呈阳性。在某些实施方案中，输出组合物中小于为或约小于为或约10％的细胞表达、含有细胞凋亡标记和/或对细胞凋亡标记呈阳性。
在特定实施方案中，输出组合物中至少为或约50％、至少为或约60％、至少为或约70％、至少为或约75％、至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约95％、至少为或约99％、或至少为或约99.9％的重组受体表达(例如，CAR+)细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％的重组受体表达(例如，CAR+)细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少为或约90％的重组受体表达(例如，CAR+)细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少为或约50％、至少为或约60％、至少为或约70％、至少为或约75％、至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约95％、至少为或约99％、或至少为或约99.9％的CD3+T细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％的CD3+T细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，输出组合物中至少为或约90％的CD3+T细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少为或约50％、至少为或约60％、至少为或约70％、至少为或约75％、至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约95％、至少为或约99％、或至少为或约99.9％的重组受体表达(例如，CAR+)CD3+T细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，输出组合物中至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％的重组受体表达(例如，CAR+)CD3+T细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少为或约90％的重组受体表达(例如，CAR+)CD3+T细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。
在特定实施方案中，通过本文所公开方法产生的多种输出组合物中平均至少为或约50％、至少为或约60％、至少为或约70％、至少为或约75％、至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约95％、至少为或约99％、或至少为或约99.9％的重组受体表达(例如，CAR+)细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在某些实施方案中，通过本文所公开方法产生的多种输出组合物中平均至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％的重组受体表达(例如，CAR+)细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在一些实施方案中，通过本文所公开方法产生的多种输出组合物中平均至少为或约90％的重组受体表达(例如，CAR+)细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在一些实施方案中，通过本文所公开方法产生的多种输出组合物中平均至少为或约50％、至少为或约60％、至少为或约70％、至少为或约75％、至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约95％、至少为或约99％、或至少为或约99.9％的CD3+T细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在某些实施方案中，通过本文所公开方法产生的多种输出组合物中平均至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％的CD3+T细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，通过本文所公开方法产生的多种输出组合物中平均至少为或约90％的CD3+T细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在一些实施方案中，通过本文所公开方法产生的多种输出组合物中平均至少为或约50％、至少为或约60％、至少为或约70％、至少为或约75％、至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约95％、至少为或约99％、或至少为或约99.9％的重组受体表达(例如，CAR+)CD3+T细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，通过本文所公开方法产生的多种输出组合物中平均至少85％、至少90％、或至少95％的重组受体表达(例如，CAR+)CD3+T细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。在某些实施方案中，通过本文所公开方法产生的多种输出组合物中平均至少90％的重组受体表达(例如，CAR+)CD3+T细胞是活细胞，例如，对细胞凋亡标记如半胱天冬酶(例如，激活的半胱天冬酶-3)呈阴性的细胞。
在任何进行的实施方案中，通过本文公开的方法生产的多种输出组合物可以源自相同或不同的供体。在一些方面，所述多种输出组合物中的至少两种源自不同的供体。在一些方面，所述多种输出组合物中的每一种都源自许多不同供体之一，所述供体例如约2、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、或超过约60名不同的供体，例如需要细胞疗法(如CAR-T细胞疗法)的患者。
在任何进行的实施方案中，输出组合物可以在一个或多个容器如小瓶中包含约或至少约10x106、约或至少约20x106、约或至少约25x106、约或至少约50x106、约或至少约100x106、约或至少约200x106、约或至少约400x106、约或至少约600x106、约或至少约800x106、约或至少约1000x106、约或至少约1200x106、约或至少约1400x106、约或至少约1600x106、约或至少约1800x106、约或至少约2000x106、约或至少约2500x106、约或至少约3000x106、或者约或至少约4000x106个总细胞，例如，总活细胞。在任何进行的实施方案中，输出组合物的体积可以是在1.0mL与10mL之间，包含端值，任选地为或约2mL、为或约3mL、为或约4mL、为或约5mL、为或约6mL、为或约7mL、为或约8mL、为或约9mL、或者为或约10mL，或者任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，输出组合物含于多个容器中，如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个小瓶中。在任何进行的实施方案中，输出组合物可以包含每个单元容器如每个小瓶约或至少约5x106、约或至少约10x106、约或至少约20x106、约或至少约25x106、约或至少约50x106、约或至少约100x106、约或至少约150x106、约或至少约200x106、约或至少约250x106、约或至少约300x106、约或至少约350x106、约或至少约400x106、约或至少约450x106、约或至少约500x106、约或至少约550x106、或者约或至少约600x106个总细胞，例如，总活细胞。在一些实施方案中，一个或多个容器中输出组合物的细胞在溶液或缓冲液中(例如，在冷冻保存溶液或缓冲液中)的密度为、为约或至少5x106个细胞/mL、10x106个细胞/mL、20x106个细胞/mL、30x106个细胞/mL、40x106个细胞/mL、50x106个细胞/mL、60x106个细胞/mL、70x106个细胞/mL、80x106个细胞/mL、90x106个细胞/mL、100x106个细胞/mL、110x106个细胞/mL、120x106个细胞/mL、130x106个细胞/mL、140x106个细胞/mL、或150x106细胞/mL。在一些实施方案中，使约或多达约900x106个细胞(例如，活CD4+T细胞和活CD8+T细胞或活CD3+T细胞)经受刺激，其中使刺激的组合物中约或多达约600x106个细胞(例如，活CD4+T细胞和活CD8+T细胞或活CD3+T细胞)经受如使用病毒载体(例如，通过转导)或非病毒基因工程化方法的基因工程化，之后在不含任何重组细胞因子的无血清基础培养基(例如，补充有一种或多种补充剂)中孵育约72小时或约三天。在一些实施方案中，所产生的输出组合物在一个或多个容器如小瓶中包含约100x106与约1400x106之间的总细胞，例如，总活细胞。
在特定实施方案中，输出组合物的大多数细胞是幼稚或幼稚样细胞、中枢记忆细胞和/或效应记忆细胞。在特定实施方案中，输出组合物的大多数细胞是幼稚样或中枢记忆细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的大多数细胞是中枢记忆细胞。在一些方面，分化较低的细胞(例如中枢记忆细胞)寿命更长，并且消耗较慢，从而增加了持久性和耐久性。在一些方面，细胞疗法(如CAR-T细胞疗法)的反应者具有增加的中枢记忆基因的表达。参见例如，Fraietta等人(2018)Nat Med.24(5):563-571。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中幼稚样细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，幼稚样T细胞可以包括处于不同分化状态的细胞，并且特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CCR7、CD45RA、CD28和/或CD27的阳性或高表达。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CD25、CD45RO、CD56、CD62L和/或KLRG1的阴性表达。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CD95的低表达。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD45RA+，其中所述细胞是CD27+或CD27-。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CD27+CCR7+，其中所述细胞是CD45RA+或CD45RA-。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CD62L-CCR7+。
在特定实施方案中，输出组合物的细胞富含CCR7+细胞。CCR7是在T细胞进入淋巴结中涉及的趋化因子受体。在特定方面，CCR7由幼稚或幼稚样T细胞(例如CCR7+CD45RA+或CCR7+CD27+)和中枢记忆T细胞(CCR7+CD45RA-)表达。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的所提供的工程化T细胞的组合物包括T细胞群，其中所述群体中大于为或约50％、大于为或约55％、大于或大于为或约60％、大于或大于为或约65％、大于或大于为或约70％、大于或大于为或约75％、大于或大于为或约80％、大于或大于为或约85％、或大于或大于为或约90％的T细胞是中枢记忆和幼稚样T细胞。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的所提供的工程化T细胞的组合物包括T细胞群，其中所述群体中大于为或约50％、大于为或约55％、大于或大于为或约60％、大于或大于为或约65％、大于或大于为或约70％、大于或大于为或约75％、大于或大于为或约80％、大于或大于为或约85％、或大于或大于为或约90％的T细胞是CCR7+T细胞。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的所提供的工程化T细胞的组合物包括T细胞群，其中所述群体中大于为或约50％、大于为或约55％、大于或大于为或约60％、大于或大于为或约65％、大于或大于为或约70％、大于或大于为或约75％、大于或大于为或约80％、大于或大于为或约85％、或大于或大于为或约90％的T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的所提供的工程化T细胞的组合物包括T细胞群，其中所述群体中大于为或约50％、大于为或约55％、大于或大于为或约60％、大于或大于为或约65％、大于或大于为或约70％、大于或大于为或约75％、大于或大于为或约80％、大于或大于为或约85％、或大于或大于为或约90％的T细胞是CCR7+CD45RA-。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的中枢记忆T细胞或对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中中枢记忆细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，中枢记忆T细胞可以包括处于不同分化状态的细胞，并且特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达)。在一些方面，中枢记忆T细胞的特征为CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表达。在一些方面，中枢记忆T细胞的特征为CD45RA和/或颗粒酶B的阴性或低表达。在某些实施方案中，中枢记忆T细胞或对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD45RA-。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞中幼稚样细胞和中枢记忆细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的效应记忆和/或效应记忆RA T细胞或对效应记忆和/或效应记忆RAT细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中效应记忆和/或效应记忆RAT细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，效应记忆和/或效应记忆RA T细胞可以包括处于不同分化状态的细胞，并且特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在某些实施方案中，效应记忆T细胞或对效应记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7-CD45RA-。在某些实施方案中，效应记忆RA T细胞或对效应记忆RA T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7-CD45RA+。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞中效应记忆T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中效应记忆RAT细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中幼稚样细胞和中枢记忆细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物，并且效应记忆和效应记忆RAT细胞的份额和/或频率低于所述从替代性过程产生的输出组合物。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的幼稚样和/或中枢记忆细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的中枢记忆细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的细胞具有记忆表型，具有幼稚样或中枢记忆表型，或者是幼稚样或中枢记忆T细胞，或者是中枢记忆T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+T细胞和CD8+T细胞是幼稚样或中枢记忆T细胞，或是中枢记忆T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD4+T细胞，或是中枢记忆CD4+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD4+T细胞，或是中枢记忆CD4+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD4+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+CAR+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD4+CAR+T细胞，或是中枢记忆CD4+CAR+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+CAR+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD4+CAR+T细胞，或是中枢记忆CD4+CAR+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+CAR+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD4+CAR+T细胞，或是中枢记忆CD4+CAR+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD8+T细胞，或是中枢记忆CD8+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD8+T细胞，或是中枢记忆CD8+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD8+T细胞，或是中枢记忆CD8+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+CAR+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD8+CAR+T细胞，或是中枢记忆CD8+CAR+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+CAR+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD8+CAR+T细胞，或是中枢记忆CD8+CAR+T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+CAR+T细胞是幼稚样或中枢记忆CD8+CAR+T细胞，或是中枢记忆CD8+CAR+T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+T细胞(例如，CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞)是幼稚样或中枢记忆T细胞，或是中枢记忆T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+T细胞(例如，CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞)是幼稚样或中枢记忆T细胞，或是中枢记忆T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+。
在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约85％的细胞具有幼稚样或中枢记忆表型，或是幼稚样或中枢记忆T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或为或约15％的细胞具有效应或效应RA表型，或是效应或效应RA T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的被消耗的和/或衰老的细胞。在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的被消耗的和/或衰老的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于为或约40％、小于为或约35％、小于为或约30％、小于为或约25％、小于为或约20％、小于为或约15％、小于为或约10％、小于为或约5％或小于为或约1％的细胞是被消耗的和/或衰老的。在某些实施方案中，输出组合物中小于为或约25％的细胞是被消耗的和/或衰老的。在某些实施方案中，输出组合物中小于为或约10％的细胞是被消耗的和/或衰老的。
在一些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的对CD27和CD28表达(例如表面表达)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的CD27-CD28-细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于为或约40％、小于为或约35％、小于为或约30％、小于为或约25％、小于为或约20％、小于为或约15％、小于为或约10％、小于为或约5％或小于为或约1％的细胞是CD27-CD28-细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于为或约25％的细胞是CD27-CD28-细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于为或约10％的细胞是CD27-CD28-细胞。在实施方案中，输出组合物中小于为或约5％的细胞是CD27-CD28-细胞。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CD28表达(例如表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞具有高份额和/或频率的CD27+CD28+细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少为或约50％、至少为或约60％、至少为或约70％、至少为或约75％、至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约95％、或大于为或约95％的细胞是CD27+CD28+细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于为或约25％的细胞是CD27-CD28-细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少为或约50％的细胞是CD27+CD28+细胞。在实施方案中，输出组合物中至少为或约75％的细胞是CD27+CD28+细胞。
在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的作为TEMRA细胞的细胞。在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的TEMRA细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于为或约40％、小于为或约35％、小于为或约30％、小于为或约25％、小于为或约20％、小于为或约15％、小于为或约10％、小于为或约5％或小于为或约1％的细胞是TEMRA细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于为或约25％的细胞是TEMRA细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于为或约10％的细胞是TEMRA细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于为或约5％的细胞是TEMRA细胞。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的对CCR7表达(例如表面表达)呈阴性并且对CD45RA表达(例如表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出组合物中小于为或约40％、小于为或约35％、小于为或约30％、小于为或约25％、小于为或约20％、小于为或约15％、小于为或约10％、小于为或约5％或小于为或约1％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于为或约25％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出组合物中小于为或约10％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于为或约5％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的处于早期分化阶段中的T细胞，或对处于早期分化阶段中的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中处于早期分化阶段中的T细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，处于早期分化阶段中的T细胞的特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在一些方面，处于早期分化阶段中的T细胞的特征为CCR7和/或CD27的阳性或高表达。在某些实施方案中，处于早期分化阶段中的T细胞或对处于早期分化阶段中的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD27+。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的处于中期分化阶段中的T细胞，或对处于中期分化阶段中的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中处于中期分化阶段中的T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(如涉及扩增的过程)产生的输出组合物。在某些实施方案中，处于中期分化阶段中的T细胞的特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在某些实施方案中，处于中期分化阶段中的T细胞或对处于中期分化阶段中的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD27-。在某些实施方案中，处于中期分化阶段中的T细胞或对处于中期分化阶段中的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7-CD27+。在某些实施方案中，处于中期分化阶段中的T细胞或对处于中期分化阶段中的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞包括呈CCR7+CD27-的细胞和呈CCR7-CD27+的细胞。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的高分化的T细胞，或对高分化的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中高分化的T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(如涉及扩增的过程)产生的输出组合物。在某些实施方案中，高分化的T细胞的特征可以是某些细胞标记的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在一些方面，高分化的T细胞的特征为CCR7和/或CD27的阴性或低表达。在某些实施方案中，高分化的T细胞或对高分化的T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞是CCR7-CD27-。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞中处于早期分化阶段中的T细胞(例如，呈CCR7+CD27+的细胞)的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程)产生的输出组合物，处于中期分化阶段中的T细胞(例如，呈CCR7+CD27-的细胞和/或呈CCR7-CD27+的细胞)的份额和/或频率低于所述从替代性过程产生的输出组合物，并且高分化的T细胞(例如，呈CCR7-CD27-的细胞)的份额和/或频率低于所述从替代性过程产生的输出组合物。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞中幼稚样细胞和中枢记忆细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程)产生的输出组合物。在某些实施方案中，幼稚样细胞和中枢记忆细胞包括处于不同分化状态的细胞，包括处于早期分化阶段中的T细胞，例如，呈CCR7+CD27+的细胞。
在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的对CCR7和CD27表达(例如表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞具有高份额和/或频率的CCR7+CD27+细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约5％、小于或小于约10％、小于或小于约15％、小于或小于约20％、小于或小于约25％或小于或小于约30％的细胞是CCR7-或CD27-细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、至少或为或约98％、或大于98％的细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+T细胞和CD8+T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+CAR+T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+CAR+T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+CAR+T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+CAR+T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+CAR+T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+CAR+T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+T细胞(例如，CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞)是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+T细胞(例如，CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞)是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+。
在一些实施方案中，本文提供治疗性T细胞组合物，其包含和/或富含表达重组受体的CD3+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD3+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD3+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD3+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD3+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少50％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少90％的细胞是CD3+T细胞，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
在一些实施方案中，本文提供治疗性T细胞组合物，其包含和/或富含表达重组受体的CD3+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD3+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD3+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD3+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD3+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD3+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的细胞是CD3+T细胞，所述组合物中至少50％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少90％的细胞是CD3+T细胞，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。
在一些实施方案中，本文提供治疗性T细胞组合物，其包含和/或富含表达重组受体的CD4+T细胞和CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，本文提供治疗性T细胞组合物，其包含和/或富含表达重组受体的CD4+T细胞和CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少50％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。
在某些实施方案中，本文公开治疗性T细胞组合物，其包含表达重组受体的CD4+T细胞和表达重组受体的CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+，其中所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD3+T细胞。在某些实施方案中，本文公开治疗性T细胞组合物，其包含表达重组受体的CD4+T细胞和表达重组受体的CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+，其中所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些方面，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约60％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且治疗性T细胞组合物中至少或至少约40％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约65％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且治疗性T细胞组合物中至少或至少约45％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、或者至少或至少约85％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且治疗性T细胞组合物中至少或至少约50％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、或者至少或至少约65％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约75％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且治疗性T细胞组合物中至少或至少约55％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约80％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约60％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约85％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约65％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约70％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少60％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少40％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少60％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少70％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少80％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少80％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
在任何前述实施方案中，细胞群或组合物内对一种或多种标记(例如，CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CCR7或CD45RA等)呈阳性/阴性的细胞的百分比可以是来自通过本文所公开方法产生的多种输出组合物的平均、均值或中值百分比。在一些实施方案中，细胞群或组合物内对标记呈阳性的细胞的百分比是来自通过本文所公开方法产生的多种输出组合物的此类百分比的平均值。在一些实施方案中，多种输出组合物是通过本文所公开方法从多种输入组合物产生，所述输入组合物可以源自例如来自同一供体或不同供体的相同生物样品或不同生物样品(例如，PBMC或单采术或白细胞单采术样品)。在一些方面，所述平均值是基于约或至少约5、约或至少约10、约或至少约15、约或至少约20、约或至少约25、约或至少约30、约或至少约35、约或至少约40、约或至少约45、约或至少约50、约或至少约55、约或至少约60、约或至少约100、或者超过约100种通过本文所公开方法产生的输出组合物的多个值。
在一些实施方案中，其中平均而言，在通过所述方法产生的多种输出组合物(例如，约或至少约5种)中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些实施方案中，平均而言，在通过所述方法产生的多种输出组合物(例如，约或至少约5种)中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性(例如，CD27+CCR7+细胞)。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的CD27+CCR7+细胞。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物平均包含至少或至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的CD3+T细胞。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体+/CD3+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞(例如，CD27+CCR7+细胞)上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体+/CD3+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体+/CD3+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的CD27+CCR7+细胞。
II.无血清培养基配制品和相关组分
所提供的方法的一个或多个步骤可以在无血清培养基的存在下进行，所述无血清培养基在基础培养基中含有游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。可以添加一种或多种其他补充剂，包括含有以下的一种或多种补充剂：至少一种蛋白质如血清取代蛋白，或者支持细胞的维持、生长和/或扩增的一种或多种其他组分。在一些实施方案中，无血清培养基含有合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM至为或约5mM(如2mM)。在一些实施方案中，L-谷氨酰胺的浓度是为或约0.5mM至为或约5mM(如2mM)。在一些实施方案中，至少一种蛋白质是人蛋白质或重组蛋白质，如血清取代蛋白，例如白蛋白。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含一种或多种重组细胞因子(如IL-2、IL-7或IL-15)。在一些实施方案中，所述无血清培养基不进一步包含一种或多种重组细胞因子(如IL-2、IL-7或IL-15)。在一些实施方案中，所述无血清培养基不包含酚红。
在一些实施方案中，所提供的无血清培养基是从液体基础培养基和一种或多种补充剂产生或制备。
在一些实施方案中，无血清培养基可以含有能够在细胞培养物中被转化为L-谷氨酰胺的合成氨基酸，如作为二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的合成氨基酸。在一些情况下，合成氨基酸是在基础培养基中提供，在所述基础培养基中含有游离的L-谷氨酰胺和蛋白质。在一些实施方案中，合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM至为或约5mM(如2mM)。在一些实施方案中，至少一种蛋白质是人源蛋白、重组蛋白或两者。在一些实施方案中，基础培养基不包含酚红。
在一些实施方案中，用于制备无血清培养基的补充剂包括包含至少一种蛋白质和游离形式的谷氨酰胺(例如L-谷氨酰胺)的补充剂，其中所述补充剂在L-谷氨酰胺变为其组分之后被冷冻或已经被冷冻。在一些实施方案中，补充剂中L-谷氨酰胺的浓度小于200mM，如小于150mM、100mM或更小，如20mM至120mM或40mM至100mM，如或约80mM。在一些实施方案中，在补充剂已经与基础培养基组合之后，L-谷氨酰胺的浓度为约0.5mM至约5mM(如2mM)。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人蛋白质或人源蛋白或是重组的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包括白蛋白，例如人或重组人白蛋白。
A.基础培养基
在一些实施方案中，基础培养基包含碳源如葡萄糖、水、一种或多种盐以及氨基酸和氮的来源。
在一些实施方案中，基础培养基包含氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸和/或脯氨酸。
在一些实施方案中，基础培养基包含至少一种合成氨基酸。在一些实施方案中，所述合成氨基酸能够在包含细胞的细胞培养物中转化为游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述细胞包含人细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化T细胞。在一些实施方案中，将所述细胞基因工程化以表达重组受体(例如嵌合抗原受体)。在一些实施方案中，所述细胞是嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞。
在一些实施方案中，合成氨基酸是稳定化形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，合成氨基酸在水性溶液(例如基础培养基)中比谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)更稳定。在一些实施方案中，合成氨基酸在基础培养基中不产生大量谷氨酰胺。在一些实施方案中，合成氨基酸在基础培养基中不产生大量吡咯烷酮羧酸或氨。在一些实施方案中，合成氨基酸在基础培养基中至少约1、3、5、7、9、11、13或14天不产生大量谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，合成氨基酸在基础培养基中至少约1、2、3、4、5、6、7或8周不产生大量谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，合成氨基酸在基础培养基中至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月不产生大量谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，合成氨基酸在基础培养基中至少1、2、3、4或5年不产生大量谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，合成氨基酸在基础培养基中至少约1、3、5、7、9、11、13或14天不产生大量吡咯烷酮羧酸或氨。在一些实施方案中，合成氨基酸在基础培养基中至少约1、2、3、4、5、6、7或8周不产生大量吡咯烷酮羧酸或氨。在一些实施方案中，合成氨基酸在基础培养基中至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月不产生大量吡咯烷酮羧酸或氨。在一些实施方案中，合成氨基酸在基础培养基中至少1、2、3、4或5年不产生大量吡咯烷酮羧酸或氨。
在一些实施方案中，合成氨基酸可溶于水溶液(例如，基础培养基)中。在一些实施方案中，合成氨基酸在水溶液中的溶解度高于游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，合成氨基酸能够被转运至细胞中，其中它可以被转化为游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述细胞包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化T细胞。在一些实施方案中，将所述细胞基因工程化以表达重组受体(例如嵌合抗原受体)。在一些实施方案中，所述细胞是嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞。
在一些实施方案中，合成氨基酸是二肽。在一些实施方案中，合成氨基酸是三肽。在一些实施方案中，合成氨基酸是二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，如GlutamaxTM中的二肽，其在基础培养基中不会自发降解。
在一些实施方案中，基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度为约0.5mM-5mM。在一些实施方案中，基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约2mM。在一些实施方案中，二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM-1mM、0.5mM-1.5mM、0.5mM-2mM、0.5mM-2.5mM、0.5mM-3mM、0.5mM-3.5mM、0.5mM-4mM、0.5mM-4.5mM、0.5mM-5mM、1mM-1.5mM、1mM-2mM、1mM-2.5mM、1mM-3mM、1mM-3.5mM、1mM-4mM、1mM-4.5mM、1mM-5mM、1.5mM-2mM、1.5mM-2.5mM、1.5mM-3mM、1.5mM-3.5mM、1.5mM-4mM、1.5mM-4.5mM、1.5mM-5mM、2mM-2.5mM、2mM-3mM、2mM-3.5mM、2mM-4mM、2mM-4.5mM、2mM-5mM、2.5mM-3mM、2.5mM-3.5mM、2.5mM-4mM、2.5mM-4.5mM、2.5mM-5mM、3mM-3.5mM、3mM-4mM、3mM-4.5mM、3mM-5mM、3.5mM-4mM、3.5mM-4.5mM、3.5mM-5mM、4mM-4.5mM、4mM-5mM、或4.5mM-5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约5mM-7.5mM、5mM-10mM、5mM-12.5mM、5mM-15mM、5mM-17.5mM、5mM-20mM、7.5mM-10mM、7.5mM-12.5mM、7.5mM-15mM、7.5mM-17.5mM、7.5mM-20mM、10mM-12.5mM、10mM-15mM、10mM-17.5mM、10mM-20mM、12.5mM-15mM、12.5mM-17.5mM、12.5mM-20mM、15mM-17.5mM、15mM-20mM、或17.5mM-20mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度是至少约为或0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM。在一些实施方案中，基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度为或为约2mM。在一些实施方案中，基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度是至多为或约2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM、或20mM。
在一些实施方案中，基础培养基不包含L-谷氨酰胺或不包含大量L-谷氨酰胺。
在一些实施方案中，基础培养基包含L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，基础培养基中的L-谷氨酰胺的浓度是为或约或小于为或约0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、或0.5mM。在一些实施方案中，基础培养基中的L-谷氨酰胺的浓度是为或约或小于为或约1mM、2mM、3mM、4mM、或5mM。在一些实施方案中，基础培养基中的L-谷氨酰胺的浓度是为或约2mM。
在一些实施方案中，在基础培养基中提供一种或多种氨基酸，包括能够被转化为游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)至少一种合成氨基酸，例如二肽形式的L-谷氨酰胺，如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，基础培养基是人工或合成培养基。在一些实施方案中，基础培养基是或包含平衡盐溶液(例如，PBS、DPBS、HBSS、EBSS)。在一些实施方案中，基础培养基选自达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良的达尔伯克培养基和M199。在一些实施方案中，基础培养基是复合培养基(例如，RPMI-1640、IMDM)。在一些实施方案中，基础培养基是OpTmizerTMCTSTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)。
在一些实施方案中，基础培养基包含无机盐、糖、氨基酸的营养混合物，所述营养混合物任选地还含有维生素、有机酸、抗氧化剂和/或缓冲液。
在一些实施方案中，基础培养基包含CO3 2-和HCO3 -。在一些实施方案中，基础培养基的CO3 2-/HCO3 -含量与气态CO2(例如，5-10％)平衡，从而维持培养基中的最佳pH。在一些实施方案中，基础培养基包含两性离子，例如HEPES。在一些实施方案中，基础培养基包含酚红。在一些实施方案中，基础培养基不包含酚红。
在一些实施方案中，基础培养基包含无机盐。在一些实施方案中，所述无机盐促进渗透平衡。在一些实施方案中，所述无机盐通过提供钠、钾和钙离子来调节膜电位。
在一些实施方案中，基础培养基包含一种或多种碳水化合物。在一些实施方案中，所述碳水化合物包括蔗糖。在一些实施方案中，所述碳水化合物包括半乳糖。在一些实施方案中，所述碳水化合物包括麦芽糖。在一些实施方案中，所述碳水化合物包括果糖。
在一些实施方案中，基础培养基包含脂肪酸。在一些实施方案中，基础培养基包含脂质。在一些实施方案中，基础培养基包含维生素(例如，维生素A、维生素B7、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素E)。在一些实施方案中，基础培养基包含微量元素。在一些实施方案中，所述微量元素包括铜。在一些实施方案中，所述微量元素包括锌。在一些实施方案中，所述微量元素包括硒。在一些实施方案中，所述微量元素包括三羧酸中间体。
在一些实施方案中，基础培养基含有无机盐、糖、氨基酸和任选地维生素、有机酸和/或缓冲液或其他熟知的细胞培养营养素的混合物。除了营养素外，所述培养基还有助于维持pH和渗透压。在一些方面，基础培养基的试剂支持细胞生长、增殖和/或扩增。可获得众多种基础培养基，并且包括达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、罗斯威尔公园纪念学院培养基(RPMI)、伊斯科夫改良的达尔伯克培养基和哈氏培养基。在一些实施方案中，基础培养基是伊斯科夫改良的达尔伯克培养基、RPMI-1640或α-MEM。
在一些实施方案中，基础培养基不含蛋白质。在一些实施方案中，基础培养基不含人蛋白(例如，人血清蛋白)。在一些实施方案中，基础培养基不含血清。在一些实施方案中，基础培养基不含源自人的血清。在一些实施方案中，基础培养基不含重组蛋白。在一些实施方案中，基础培养基不含人蛋白和重组蛋白。
在一些实施方案中，基础培养基包含蛋白质或肽。在一些实施方案中，所述蛋白质是白蛋白或白蛋白取代物。在一些实施方案中，所述白蛋白是人源白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是天然人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是来自非人来源的重组白蛋白。白蛋白取代物可以是任何蛋白质或多肽来源。此类蛋白质或多肽样品的例子包括但不限于牛垂体提取物、植物水解物(例如，大米水解物)、胎牛白蛋白(胎球蛋白)、卵白蛋白、人血清白蛋白(HSA)或另一种动物来源的白蛋白、鸡提取物、牛胚胎提取物、
Figure BDA0003008592730002142
I和
Figure BDA0003008592730002141
II。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽包括转铁蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽包括纤连蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽包括抑肽酶。在一些实施方案中，所述蛋白质包括胎球蛋白。
在一些实施方案中，基础培养基(例如OpTmizerTMCTSTMT细胞扩增基础培养基)是液体配制品。在一些实施方案中，在既定用途之前，基础培养基未被冷冻或被指示不进行冷冻(例如，根据其方案)。在一些实施方案中，将基础培养基储存在为或约2℃至8℃下。在一些实施方案中，将基础培养基储存在室温下。在一些实施方案中，在储存于2℃至8℃下时，基础培养基稳定至少为或约1、2、3、4、5或6周。在一些实施方案中，在储存于2℃至8℃下时，基础培养基稳定至少为或约1、2、3、4、5或6个月。
B.另外的组分和补充剂
在一些实施方案中，无血清培养基包括基础培养基和可以由一种或多种补充剂提供的一种或多种另外的组分。在一些实施方案中，所述一种或多种补充剂包括至少第一补充剂，其包含游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，这种补充剂在使用和/或掺入基础培养基中之前进行冷冻。在一些实施方案中，补充剂(如本文所述的这些)意图用作培养基补充剂(例如，用于基础培养基的培养基补充剂)。在一些实施方案中，第一补充剂和/或其他补充剂提供细胞的维持。在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD4 T细胞或CD8T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是来自人的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是来自人的免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是来自人的T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是来自人的原代免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞是源自人的基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞是来自人的基因工程化T细胞(例如，嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞)。
在一些实施方案中，第一补充剂在其既定用途之前储存在或被建议储存在为或约-20℃至为或约0℃下。在一些实施方案中，所述补充剂储存在或被建议储存在低于约0℃下。在一些实施方案中，所述补充剂在游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)变为其组分之后立即或快速冷冻，直至所述补充剂用于其既定用途时。在一些实施方案中，所述补充剂在游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)变为其组分之后的大部分时间被冷冻，直至所述补充剂用于其既定用途时。在一些实施方案中，所述补充剂在游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)变为其组分之后超过1、2、3、4、5、6或7天不保持为液体，直至所述补充剂用于其既定用途时。在一些实施方案中，所述补充剂在游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)变为其组分之后大于或大于约4、8、12、16、20或24小时不保持为液体，直至所述补充剂用于其既定用途时。在一些实施方案中，所述补充剂在游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)变为其组分之前和之后的大部分时间被冷冻，直至所述补充剂用于其既定用途时。在一些实施方案中，当游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)变为所述补充剂的组分时，所述补充剂在等于或在低于室温下(例如，补充剂的温度低于或低于约20℃、15℃、10℃、5℃或0℃)。在一个方面，L-谷氨酰胺在冷冻补充剂中的存在确保其在添加至基础培养基之前的稳定性，以使无血清培养基配制品中可能由于L-谷氨酰胺不稳定而发生的可变的谷氨酰胺浓度和/或渐增的氨浓度降至最低。
在一些实施方案中，补充剂中的游离形式的L-谷氨酰胺在将补充剂解冻时不沉淀。在一些实施方案中，补充剂中的游离形式的L-谷氨酰胺在所述补充剂是液体时不沉淀。在一些实施方案中，补充剂中的游离形式的L-谷氨酰胺在将补充剂于室温下解冻时不沉淀。在一些实施方案中，补充剂中的游离形式的L-谷氨酰胺的浓度是为或约或小于或小于约400mM、300mM、200mM、180mM、160mM、140mM、120mM、100mM或80mM。在一些实施方案中，补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度为约200mM。
在一些实施方案中，补充剂中的游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)的浓度使得在将补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，所述培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM-5mM。在一些实施方案中，基础培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是为或约2mM。在一些实施方案中，游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM-1mM、0.5mM-1.5mM、0.5mM-2mM、0.5mM-2.5mM、0.5mM-3mM、0.5mM-3.5mM、0.5mM-4mM、0.5mM-4.5mM、0.5mM-5mM、1mM-1.5mM、1mM-2mM、1mM-2.5mM、1mM-3mM、1mM-3.5mM、1mM-4mM、1mM-4.5mM、1mM-5mM、1.5mM-2mM、1.5mM-2.5mM、1.5mM-3mM、1.5mM-3.5mM、1.5mM-4mM、1.5mM-4.5mM、1.5mM-5mM、2mM-2.5mM、2mM-3mM、2mM-3.5mM、2mM-4mM、2mM-4.5mM、2mM-5mM、2.5mM-3mM、2.5mM-3.5mM、2.5mM-4mM、2.5mM-4.5mM、2.5mM-5mM、3mM-3.5mM、3mM-4mM、3mM-4.5mM、3mM-5mM、3.5mM-4mM、3.5mM-4.5mM、3.5mM-5mM、4mM-4.5mM、4mM-5mM或4.5mM-5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，基础培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)的浓度是为或约5mM-7.5mM、5mM-10mM、5mM-12.5mM、5mM-15mM、5mM-17.5mM、5mM-20mM、7.5mM-10mM、7.5mM-12.5mM、7.5mM-15mM、7.5mM-17.5mM、7.5mM-20mM、10mM-12.5mM、10mM-15mM、10mM-17.5mM、10mM-20mM、12.5mM-15mM、12.5mM-17.5mM、12.5mM-20mM、15mM-17.5mM、15mM-20mM或17.5mM-20mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，基础培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是至少为或约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mM。在一些实施方案中，基础培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)的浓度是至多为或约2mM。
在一些实施方案中，第一补充剂含有一种或多种另外的组分。在一些实施方案中，提供其他补充剂，如第二补充剂，以提供一种或多种另外的组分。在一些实施方案中，补充剂即第一补充剂和任选地一种或多种其他补充剂(例如第二补充剂)与基础培养基组合，以向所述基础培养基提供一种或多种另外的组分。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括至少一种蛋白质。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人蛋白质或源自人。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、纤连蛋白、抑肽酶或胎球蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质包含白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述蛋白质是白蛋白或白蛋白取代物。在一些实施方案中，所述白蛋白是人源白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是天然人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是来自非人来源的重组白蛋白。白蛋白取代物可以是任何蛋白质或多肽来源。此类蛋白质或多肽样品的例子包括但不限于牛垂体提取物、植物水解物(例如，大米水解物)、胎牛白蛋白(胎球蛋白)、卵白蛋白、人血清白蛋白(HSA)或另一种动物来源的白蛋白、鸡提取物、牛胚胎提取物、
Figure BDA0003008592730002171
I和
Figure BDA0003008592730002172
II。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是人白蛋白或源自人白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白源自人血清或人血浆。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组白蛋白。在一些实施方案中，所述重组白蛋白源自人。在一些实施方案中，所述重组白蛋白并非源自人。在一些实施方案中，所述补充剂包含天然白蛋白。在一些实施方案中，所述天然白蛋白源自人。在一些实施方案中，所述天然白蛋白并非源自人。在一些实施方案中，补充剂中白蛋白的浓度使得在将补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，为或约培养基中白蛋白的浓度是为或约0mg/mL至为或约2mg/mL、为或约0mg/mL至为或约4mg/mL、为或约0mg/mL至为或约6mg/mL、为或约0mg/mL至为或约8mg/mL、为或约0mg/mL至为或约10mg/mL、为或约0mg/mL至为或约12mg/mL、为或约2mg/mL至为或约4mg/mL、为或约2mg/mL至为或约6mg/mL、为或约2mg/mL至为或约8mg/mL、为或约2mg/mL至为或约10mg/mL、为或约2mg/mL至为或约12mg/mL、为或约4mg/mL至为或约6mg/mL、为或约4mg/mL至为或约8mg/mL、为或约4mg/mL至为或约10mg/mL、为或约4mg/mL至为或约12mg/mL、为或约6mg/mL至为或约8mg/mL、为或约6mg/mL至为或约10mg/mL、为或约6mg/mL至为或约12mg/mL、为或约8mg/mL至为或约10mg/mL、为或约8mg/mL至为或约12mg/mL、为或约10mg/mL至为或约12mg/mL、或者为或约10mg/mL至为或约15mg/mL，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述培养基中的白蛋白是为或约5mg/mL。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括转铁蛋白或转铁蛋白取代物。在一些实施方案中，所述转铁蛋白取代物是可以替代补充剂中的转铁蛋白以得到与转铁蛋白基本上相似的结果的化合物。转铁蛋白取代物的例子包括但不限于任何铁螯合化合物。可以使用的铁螯合化合物包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、去铁胺甲磺酸盐、二巯基丙醇、二亚乙基三胺五乙酸(DPTA)和反式-l,2-二氨基环己烷-N,N,N',N'-四乙酸(CDTA)的铁螯合物，以及柠檬酸铁螯合物和硫酸亚铁螯合物。在一些实施方案中，所述转铁蛋白是铁饱和的转铁蛋白。在一些实施方案中，所述转铁蛋白是铁饱和的人转铁蛋白。
在一些实施方案中，所述转铁蛋白或转铁蛋白取代物是人转铁蛋白或源自人转铁蛋白。在一些实施方案中，所述转铁蛋白或转铁蛋白取代物源自人血清或血浆。在一些实施方案中，所述转铁蛋白或转铁蛋白取代物是重组转铁蛋白。在一些实施方案中，所述转铁蛋白的浓度使得在将补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合后,培养基中转铁蛋白的浓度是为或约10mg/L至为或约50mg/L、为或约10mg/L至为或约100mg/L、为或约10mg/L至为或约150mg/L、为或约10mg/L至为或约200mg/L、为或约10mg/L至为或约250mg/L、为或约10mg/L至为或约300mg/L、为或约10mg/L至为或约350mg/L、为或约10mg/L至为或约400mg/L、为或约10mg/L至为或约450mg/L、为或约10mg/L至为或约500mg/L、为或约10mg/L至为或约550mg/L、为或约10mg/L至为或约600mg/L、为或约10mg/L至为或约650mg/L、为或约10mg/L至为或约750mg/L。在一些实施方案中，所述转铁蛋白的浓度使得在将补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合后，培养基中转铁蛋白的浓度是为或约100mg/L。在一些实施方案中，所述转铁蛋白的浓度使得在将补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合后，培养基中转铁蛋白的浓度是为或约50mg/L至为或约150mg/L。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括胰岛素或胰岛素取代物。在一些实施方案中，所述胰岛素取代物是含锌化合物，其可以用于代替胰岛素以得到与胰岛素基本上相似的结果。胰岛素取代物的例子包括但不限于氯化锌、硝酸锌、溴化锌和硫酸锌。许多胰岛素是本领域普通技术人员已知的。参见Gilman,A.G.等人编辑,ThePharmacological Basis of Therapeutics,Pergamon Press,纽约,1990,第1463-1495页。在一些实施方案中，在补充剂和培养基中使用胰岛素而非胰岛素取代物。在一些实施方案中，所述胰岛素是胰岛素锌。在一些实施方案中，所述胰岛素是人胰岛素锌。
在一些实施方案中，所述胰岛素是人胰岛素或源自人胰岛素。在一些实施方案中，所述胰岛素是重组胰岛素。在一些实施方案中，所述胰岛素是重组人胰岛素。在一些实施方案中，所述胰岛素(或胰岛素取代物)的浓度使得在将补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合后，为或约培养基中胰岛素(或胰岛素取代物)的浓度是约1mg/L至为或约2.5mg/L、为或约1mg/L至为或约5mg/L、为或约1mg/L至为或约7.5mg/L、为或约1mg/L至为或约10mg/L、为或约1mg/L至为或约12.5mg/L、为或约1mg/L至为或约15mg/L、为或约1mg/L至为或约17.5mg/L、为或约1mg/L至为或约20mg/L、为或约1mg/L至为或约22.5mg/L、为或约1mg/L至为或约25mg/L、为或约1mg/L至为或约27.5mg/L、为或约1mg/L至为或约30mg/L。在一些实施方案中，培养基中胰岛素或胰岛素取代物的浓度是为或约10mg/L。在一些实施方案中，培养基中胰岛素或胰岛素取代物的浓度是为或约7.5mg/L至为或约12.5mg/L。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括生长因子。在一些实施方案中，所述生长因子包括表皮生长因子(EGF)。在一些实施方案中，所述生长因子包括成纤维细胞生长因子(FGF)。在一些实施方案中，所述生长因子包含胰岛素样生长因子(IGF)。在一些实施方案中，所述生长因子包括神经生长因子(NGF)。在一些实施方案中，所述生长因子包括血小板源性生长因子(PDGF)。在一些实施方案中，所述生长因子包括转化生长因子(TGF)。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括激素(例如，生长激素、胰岛素、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸、雌激素、雄激素、孕酮、催乳素、促卵泡激素、胃泌素释放肽)。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括α-球蛋白或β-球蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括肽或肽级分(例如，源自动物、微生物或植物的蛋白质水解物)。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括脂质。在一些实施方案中，所述脂质包括胆固醇。在一些实施方案中，所述脂质包括类固醇。在一些实施方案中，所述脂质包括脂肪酸(例如，棕榈酸酯、硬脂酸酯、油酸酯、亚油酸酯)。在一些实施方案中，所述脂质包括乙醇胺。在一些实施方案中，所述脂质包括胆碱。在一些实施方案中，所述脂质包括肌醇。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括过渡金属。在一些实施方案中，所述过渡金属包括铁。在一些实施方案中，所述过渡金属包括锌。在一些实施方案中，所述过渡金属包括铜。在一些实施方案中，所述过渡金属包括铬。在一些实施方案中，所述过渡金属包括碘。在一些实施方案中，所述过渡金属包括钴。在一些实施方案中，所述过渡金属包括硒。在一些实施方案中，所述过渡金属包括镁。在一些实施方案中，所述过渡金属包括钼。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括维生素。在一些实施方案中，所述维生素包括脂溶性维生素(例如，维生素A、维生素D、维生素E、维生素K)。在一些实施方案中，所述维生素包括水溶性维生素(例如，B1、B2、B6、B12、C、叶酸)。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括多胺。在一些实施方案中，所述多胺包括腐胺。在一些实施方案中，所述多胺包括亚精胺。在一些实施方案中，所述多胺包括精胺。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括还原剂。在一些实施方案中，所述还原剂包括2-巯基乙醇。在一些实施方案中，所述还原剂包括α-硫代甘油。在一些实施方案中，所述还原剂包含还原型谷胱甘肽。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括保护性添加剂。在一些实施方案中，所述保护性添加剂包括羧甲基纤维素。在一些实施方案中，所述保护性添加剂包括聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方案中，所述保护性添加剂包括普朗尼克(pluronic)F-68。在一些实施方案中，保所述护性添加剂包括Tween 80。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括粘附因子。在一些实施方案中，所述粘附因子包括纤连蛋白。在一些实施方案中，所述粘附因子包含层粘连蛋白。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分是以下中的一种或多种：一种或多种抗氧化剂、一种或多种白蛋白或白蛋白取代物、一种或多种脂质药剂、一种或多种胰岛素或胰岛素取代物、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白取代物、一种或多种痕量元素、以及一种或多种糖皮质激素。在一些实施方案中，所述抗氧化剂包括N-乙酰基-L-半胱氨酸、2-巯基乙醇、或D,L-生育酚乙酸酯、或其衍生物或混合物。在一些实施方案中，所述白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述脂质药剂包括人
Figure BDA0003008592730002211
或乙醇胺或其衍生物和混合物。在一些实施方案中，所述胰岛素是人胰岛素锌。在一些实施方案中，转铁蛋白是人铁饱和转铁蛋白。在一些实施方案中，所述微量元素是Se4+。在一些实施方案中，糖皮质激素是氢化可的松。在一些实施方案中，所述补充剂是浓缩的。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包含一种或多种抗氧化剂，以及选自以下的一种或多种成分：一种或多种白蛋白或白蛋白取代物、一种或多种脂质药剂、一种或多种胰岛素或胰岛素取代物、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白取代物、一种或多种痕量元素和一种或多种糖皮质激素。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包含以下中的一种或多种：N-乙酰基-L半胱氨酸、人血清白蛋白、人
Figure BDA0003008592730002221
乙醇胺、人胰岛素锌、人铁饱和的转铁蛋白、Se4+、氢化可的松、D,L-乙酸生育酚和/或2-巯基乙醇。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)。在一些实施方案中，NAC的浓度使得在将补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合后，基础培养基中NAC的浓度是为或约10mg/L至为或约50mg/L、为或约10mg/L至为或约100mg/L、为或约10mg/L至为或约150mg/L、为或约10mg/L至为或约200mg/L、为或约10mg/L至为或约250mg/L、为或约10mg/L至为或约300mg/L、为或约10mg/L至为或约350mg/L、为或约10mg/L至为或约400mg/L、为或约10mg/L至为或约450mg/L、为或约10mg/L至为或约500mg/L、为或约10mg/L至为或约550mg/L、为或约10mg/L至为或约600mg/L、为或约10mg/L至为或约650mg/L、为或约10mg/L至为或约700mg/L。
在一些实施方案中，基础培养基中NAC的浓度是为或约0mM至为或约1mM、为或约0mM至为或约2mM、为或约0mM至为或约3mM、为或约0mM至为或约4mM、为或约0mM至为或约5mM、为或约0mM至为或约6mM、为或约0mM至为或约7mM、为或约0mM至为或约8mM、为或约0mM至为或约9mM、为或约0mM至为或约10mM、为或约0mM至为或约12mM、为或约0mM至为或约14mM、为或约0mM至为或约16mM、为或约0mM至为或约18mM、为或约0mM至为或约20mM。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括乙醇胺。在一些实施方案中，乙醇胺的浓度使得在将补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合后，基础培养基中乙醇胺的浓度是为或约0mg/L至为或约2mg/L、为或约0mg/L至为或约4mg/L、为或约0mg/L至为或约6mg/L、为或约0mg/L至为或约8mg/L、为或约0mg/L至为或约10mg/L、为或约0mg/L至为或约12mg/L、为或约0mg/L至为或约14mg/L、为或约0mg/L至为或约16mg/L、为或约0mg/L至为或约18mg/L、为或约0mg/L至为或约20mg/L、为或约0mg/L至为或约22mg/L、为或约0mg/L至为或约24mg/L、为或约0mg/L至为或约26mg/L、为或约0mg/L至为或约28mg/L、为或约0mg/L至为或约30mg/L。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分可以通过将一种或多种补充剂(如第一补充剂和一种或多种其他或另外的补充剂)添加至基础培养基来提供。
在一些实施方案中，所述第一补充剂是通过添加或混合L-谷氨酰胺与含有一种或多种所需组分的现有补充剂来制备。在一些实施方案中，将L-谷氨酰胺添加或与血清替代物补充剂(例如，免疫细胞血清替代物，例如，ThermoFisher，#A2598101，或CTSTM免疫细胞血清替代物)混合。在一些实施方案中，将L-谷氨酰胺添加至补充剂或与所述补充剂混合，所述补充剂包括Smith等人Clin Transl Immunology.2015年1月；4(1):e31中所述的免疫细胞血清替代物。
在一些实施方案中，无血清培养基配制品包含为或约90％至98.75％(v/v)的基础培养基和为或约1.25％至10％(v/v)的第一补充剂。在一些实施方案中，无血清培养基配制品包含为或约90％至97.5％(v/v)的基础培养基和为或约1.25％至5％(v/v)的第一补充剂。在一些实施方案中，无血清培养基配制品包含为或约95％(v/v)的基础培养基和为或约2.5％±0.2％(v/v)(如为或约2.5％(v/v))的第一补充剂。在一些实施方案中，一升基础培养基补充有为或约25毫升第一补充剂。
在一些实施方案中，将另一补充剂(例如第二补充剂)与基础培养基组合以提供一种或多种另外的组分。在一些实施方案中，第二补充剂包含一种或多种另外的组分(如上文所述的任一种)，其包括一种或多种抗氧化剂、一种或多种白蛋白或白蛋白取代物、一种或多种脂质药剂、一种或多种胰岛素或胰岛素取代物、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白取代物、一种或多种痕量元素、以及一种或多种糖皮质激素。上文描述了第二补充剂的示例性组分。在一些实施方案中，第二补充剂包含白蛋白、N-乙酰基半胱氨酸(NAC)和乙醇胺。在一些实施方案中，第二补充剂包含白蛋白、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和乙醇胺，其中白蛋白、NAC和/或乙醇胺的浓度使得在将第二补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，白蛋白、NAC和/或乙醇胺的浓度与本文所述基本上相同。在一些实施方案中，所述白蛋白是人源白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是来自人血浆或血清的人源白蛋白。在一些实施方案中，第二补充剂是液体，并且不包括或不大量包括游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，第二补充剂包含
Figure BDA0003008592730002231
补充剂(Thermofisher，A1048503的一部分)。
在一些实施方案中，第二补充剂是液体。在一些实施方案中，第二冷冻剂不被冷冻，或不建议被冷冻用于储存。在一些实施方案中，无血清培养基配制品包含约1.25％至5％(v/v)的第二补充剂，如或约2.5％±0.2％，如或约2.5％或2.6％。在一些实施方案中，一升基础培养基补充有约26毫升第二补充剂。在一些实施方案中，无血清培养基配制品包含为或约90％至97.5％(v/v)的基础培养基和为或约1.25％至5％(v/v)的第二补充剂。在一些实施方案中，无血清培养基配制品包含为或约95％(v/v)的基础培养基和为或约2.5％±0.2％(v/v)的第二补充剂，如为或约2.5％(v/v)或2.6％(v/v)。在一些实施方案中，一升基础培养基补充有为或约25毫升或26毫升第二补充剂。
在一些实施方案中，将第一补充剂(例如血清替代物补充剂，例如CTSTM免疫细胞血清替代物)和另一补充剂(例如
Figure BDA0003008592730002241
细胞补充剂)两者添加至基础培养基。在一些实施方案中，无血清培养基配制品包含约90％至97.5％(v/v)的基础培养基、约1.25％至5％(v/v)的第一补充剂和约1.25％至5％(v/v)的第二补充剂。在一些实施方案中，无血清培养基配制品包含约95％(v/v)的基础培养基、约2.5％±0.2％(v/v)的第一补充剂和约2.5％±0.2％(v/v)的第二补充剂。
在一些实施方案中，将一种或多种补充剂浓缩为或约2倍至为或约100倍。在一些实施方案中，补充剂是为或约40X配制品。在一些实施方案中，一升基础培养基补充有为或约20至30毫升(如25±2毫升)的至少一种补充剂(包括第一补充剂)和在一些情况下一种或多种其他补充剂。
C.无血清培养基
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含基础培养基和合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)、游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含基础培养基和合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)、游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含至少一种蛋白质或另外的组分，所述另外的组分如用于在用于产生工程化T细胞的所证实过程期间支持T细胞的维持。
在一些实施方案中，所述无血清培养基是含有合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的形式，所述合成氨基酸能够在包含细胞的细胞培养物中被转化为游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)，其中所述培养基不含血清。在一些实施方案中，合成氨基酸可溶于水溶液(例如，无血清培养基)中。在一些实施方案中，合成氨基酸在水溶液中的溶解度高于游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，无血清培养基中二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM-5mM。在一些实施方案中，无血清培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约2mM。在一些实施方案中，二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM-1mM、0.5mM-1.5mM、0.5mM-2mM、0.5mM-2.5mM、0.5mM-3mM、0.5mM-3.5mM、0.5mM-4mM、0.5mM-4.5mM或0.5mM-5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，无血清培养基中二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度是至少为或约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM。在一些实施方案中，无血清培养基中二肽形式的L-谷氨酰胺(如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约2mM，并且无血清培养基中游离形式的L-谷氨酰胺的浓度是为或约2mM。
在一些实施方案中，无血清培养基中游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)的浓度为约0.5mM-5mM。在一些实施方案中，无血清培养基中游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是为或约2mM。在一些实施方案中，无血清培养基中游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM-1mM、0.5mM-1.5mM、0.5mM-2mM、0.5mM-2.5mM、0.5mM-3mM、0.5mM-3.5mM、0.5mM-4mM、0.5mM-4.5mM或0.5mM-5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述培养基中游离形式的谷氨酰胺(即，L-谷氨酰胺)的浓度是至少为或约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM。
在一些实施方案中，无血清培养基包含至少一种蛋白质。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人蛋白质或源自人。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括至少一种蛋白质。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人蛋白质或源自人。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、纤连蛋白、抑肽酶或胎球蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质包含白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。
在一些实施方案中，无血清培养基包含白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白源自人。在一些实施方案中，所述白蛋白源自人血清或人血浆。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组白蛋白。在一些实施方案中，所述重组白蛋白源自人。在一些实施方案中，所述重组白蛋白并非源自人。在一些实施方案中，所述补充剂包含天然白蛋白。在一些实施方案中，所述天然白蛋白源自人。在一些实施方案中，所述天然白蛋白并非源自人。在一些实施方案中，无血清培养基中白蛋白的浓度是为或约0mg/mL至为或约2mg/mL、为或约0mg/mL至为或约4mg/mL、为或约0mg/mL至为或约6mg/mL、为或约0mg/mL至为或约8mg/mL、为或约0mg/mL至为或约10mg/mL、为或约0mg/mL至为或约12mg/mL、为或约2mg/mL至为或约4mg/mL、为或约2mg/mL至为或约6mg/mL、为或约2mg/mL至为或约8mg/mL、为或约2mg/mL至为或约10mg/mL、为或约2mg/mL至为或约12mg/mL、为或约4mg/mL至为或约6mg/mL、为或约4mg/mL至为或约8mg/mL、为或约4mg/mL至为或约10mg/mL、为或约4mg/mL至为或约12mg/mL、为或约6mg/mL至为或约8mg/mL、为或约6mg/mL至为或约10mg/mL、为或约6mg/mL至为或约12mg/mL、为或约8mg/mL至为或约10mg/mL、为或约8mg/mL至为或约12mg/mL、为或约10mg/mL至为或约12mg/mL、或者为或约10mg/mL至为或约15mg/mL，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述培养基中的白蛋白是为或约5mg/mL。
在一些实施方案中，无血清培养基包含转铁蛋白或转铁蛋白取代物(如本文所述的这些)。在一些实施方案中，所述转铁蛋白或转铁蛋白取代物源自人。在一些实施方案中，所述转铁蛋白或转铁蛋白取代物源自人血清或血浆。在一些实施方案中，无血清培养基中转铁蛋白的浓度是为或约10mg/L至为或约50mg/L、为或约10mg/L至为或约100mg/L、为或约10mg/L至为或约150mg/L、为或约10mg/L至为或约200mg/L、为或约10mg/L至为或约250mg/L、为或约10mg/L至为或约300mg/L、为或约10mg/L至为或约350mg/L、为或约10mg/L至为或约400mg/L、为或约10mg/L至为或约450mg/L、为或约10mg/L至为或约500mg/L、为或约10mg/L至为或约550mg/L、为或约10mg/L至为或约600mg/L、为或约10mg/L至为或约650mg/L或者为或约10mg/L至为或约750mg/L。在一些实施方案中，无血清培养基中转铁蛋白的浓度是为或约100mg/L。在一些实施方案中，无血清培养基中转铁蛋白的浓度是为或约50mg/L至150mg/L。
在一些实施方案中，所述补充剂包含胰岛素或胰岛素取代物(如本文所述的这些)。在一些实施方案中，所述胰岛素源自人。在一些实施方案中，所述胰岛素是重组胰岛素。在一些实施方案中，所述胰岛素是重组人胰岛素。在一些实施方案中，无血清培养基中胰岛素(或胰岛素取代物)的浓度是为或约1mg/L至为或约2.5mg/L、为或约1mg/L至为或约5mg/L、为或约1mg/L至为或约7.5mg/L、为或约1mg/L至为或约10mg/L、为或约1mg/L至为或约12.5mg/L、为或约1mg/L至为或约15mg/L、为或约1mg/L至为或约17.5mg/L、为或约1mg/L至为或约20mg/L、为或约1mg/L至为或约22.5mg/L、为或约1mg/L至为或约25mg/L、为或约1mg/L至为或约27.5mg/L或者为或约1mg/L至为或约30mg/L。在一些实施方案中，无血清培养基中胰岛素或胰岛素取代物的浓度是为或约10mg/L。在一些实施方案中，无血清培养基中胰岛素或胰岛素取代物的浓度是为或约7.5mg/L至为或约12.5mg/L。
在一些实施方案中，所述无血清培养基不包含酚红。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含酚红。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含无机盐、糖、氨基酸的营养混合物，所述营养混合物任选地还含有维生素、有机酸、抗氧化剂、脂质、生长因子、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺和/或缓冲液。例子包括本文如在上文章节中所述的那些，包括无机盐、糖、氨基酸、维生素、有机酸、抗氧化剂、脂质、生长因子、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺和/或缓冲液。
在一些实施方案中，无血清培养基包含选自以下中的一种或多种的一种或多种成分：一种或多种抗氧化剂、一种或多种白蛋白或白蛋白取代物、一种或多种脂质药剂、一种或多种胰岛素或胰岛素取代物、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白取代物、一种或多种痕量元素、一种或多种糖皮质激素、一种或多种无机盐、一种或多种能量来源、一种或多种缓冲剂、一种或多种丙酮酸盐、一种或多种pH指示剂、一种或多种氨基酸和一种或多种维生素。在一些实施方案中，所述抗氧化剂选自N-乙酰基-L-半胱氨酸、2-巯基乙醇和D,L-乙酸生育酚或其衍生物或混合物。在一些实施方案中，所述白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述脂质药剂是人
Figure BDA0003008592730002281
和乙醇胺。在一些实施方案中，所述胰岛素是人胰岛素锌。在一些实施方案中，所述转铁蛋白是人铁饱和转铁蛋白。在一些实施方案中，所述糖皮质激素是氢化可的松。在一些实施方案中，无机盐成分包含选自以下的一种或多种无机盐：一种或多种钙盐、一种或多种钾盐、一种或多种镁盐、一种或多种钠盐、一种或多种碳酸盐及一种或多种磷酸盐。在一些实施方案中，所述能量来源是D-葡萄糖。在一些实施方案中，所述缓冲剂是HEPES。在一些实施方案中，所述丙酮酸盐是丙酮酸钠。在一些实施方案中，所述pH指示剂是酚红。在一些实施方案中，氨基酸成分包含选自以下的一种或多种氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸HCL、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸及其盐和衍生物。在一些实施方案中，所述维生素成分包含选自以下的一种或多种维生素：生物素、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素和维生素B12及其衍生物。在一些实施方案中，成分包含N-乙酰基-L-半胱氨酸、2-巯基乙醇、人血清白蛋白、D,L-生育酚乙酸酯、人
Figure BDA0003008592730002282
乙醇胺、人胰岛素锌、铁饱和的转铁蛋白、Se4+、氢化可的松、Ca2+、K+、Mg2+、Na+、CO3 2-、PO4 3-、D-葡萄糖、HEPES、丙酮酸钠、酚红、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、盐酸L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、和L-缬氨酸、生物素、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、异肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素和维生素B12。
在一些实施方案中，提供包含基础培养基和至少一种补充剂的无血清培养基。基础培养基和补充剂的各种例子描述于本文中，如上文章节中。
在一些实施方案中，无血清培养基配制品包含为或约90％至为或约97.5％(v/v)的基础培养基、为或约2.5％至为或约10％(v/v)的补充剂，例如第一补充剂和/或第二补充剂。在一些实施方案中，无血清培养基配制品包含为或约90％至为或约97.5％(v/v)的基础培养基、为或约1.25％至为或约5％(v/v)的第一补充剂和为或约1.25％至为或约5％(v/v)的第二补充剂。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含基础培养基，如OpTmizerTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)，其补充有一种或多种补充剂。在一些实施方案中，所述一种或多种补充剂不含血清。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有补充剂的基础培养基，所述补充剂用于维持细胞(例如，T细胞)，如OpTmizerTMT细胞扩增补充剂(ThermoFisher)。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含游离形式的氨基酸，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述无血清培养基不含重组细胞因子，如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15中的一种或多种。在特定实施方案中，所述无血清培养基可以用于本文所述过程的任何一个或多个步骤中，如章节I中所述的一个或多个步骤中。在一些实施方案中，如无血清培养基在细胞的孵育和/或收获、收集或配制期间使用。
在一些实施方案中，无血清培养基包含补充有T细胞补充剂和游离形式的L-谷氨酰胺的基础培养基。在一些实施方案中，无血清培养基包含补充有OpTmizerTMT细胞扩增补充剂和L-谷氨酰胺的OpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。在一些实施方案中，无血清培养基包含补充有约2.6％OpTmizerTMT细胞扩增补充剂和约1.0％L-谷氨酰胺(约2mM终浓度)的OpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。在一些实施方案中，这种无血清培养基不含重组细胞因子，如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15中的一种或多种。在特定实施方案中，所述无血清培养基可以用于本文所述过程的任何一个或多个步骤中，如章节I中所述的一个或多个步骤中。在一些实施方案中，如无血清培养基在细胞的孵育和/或收获、收集或配制期间使用。
在一些实施方案中，无血清培养基包含补充有补充剂的基础培养基，所述补充剂用于维持细胞(例如，T细胞)，如OpTmizerTMT细胞扩增补充剂(ThermoFisher)，并且所述基础培养基还包含血清替代物补充剂，例如，免疫细胞血清替代物，例如，ThermoFisher(#A2596101)、CTSTM免疫细胞血清替代物或Smith等人Clin Transl Immunology.2015年1月；4(1):e31中所述的免疫细胞血清替代物。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含游离形式的氨基酸，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，如GlutamaxTM(ThermoFisher)中的二肽。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含一种或多种细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15中的一种或多种。在特定实施方案中，所述无血清培养基可以用于本文所述过程的任何一个或多个步骤中，如章节I中所述的一个或多个步骤中。在特定实施方案中，所述无血清培养基可以用于涉及样品制备、选择、刺激和/或工程化的任何一个或多个步骤中。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有以下的基础培养基：T细胞补充剂、免疫细胞血清替代物、游离形式的L-谷氨酰胺、二肽形式的L-谷氨酰胺、重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有以下的OpTmizerTMT细胞扩增基础培养基：OpTmizerTMT细胞扩增补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、重组人IL-2、重组人IL-7和重组人IL-15。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有以下的OpTmizerTMT细胞扩增基础培养基：约2.6％OpTmizerTMT细胞扩增补充剂、约2.5％CTSTM免疫细胞血清替代物、约1.0％L-谷氨酰胺(约2mM终浓度)、约1.0％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(约2mM终浓度)、约100IU/mL重组人IL-2、约600IU/mL重组人IL-7和约100IU/mL重组人IL-15。在特定实施方案中，所述无血清培养基可以用于本文所述过程的任何一个或多个步骤中，如章节I中所述的一个或多个步骤中。在特定实施方案中，所述无血清培养基可以用于涉及样品制备、选择、刺激和/或工程化的任何一个或多个步骤中。
在一些实施方案中，所述无血清培养基是浓缩的培养基配制品。在一些实施方案中，所述无血清培养基不是浓缩的培养基配制品。在一些实施方案中，所述无血清培养基浓缩为或约2X至为或约100X。在一些实施方案中，所述无血清培养基是为或约10X配制品。在一些实施方案中，可以将无血清培养基储存在为或约2℃至8℃下。
III.重组蛋白
在各种实施方案中，提供工程化、转化、转导或转染的细胞，如免疫细胞，如T细胞，所述细胞表达一种或多种重组蛋白。在特定实施方案中，一种或多种重组蛋白中的至少一种是重组受体，例如，抗原受体和含有其一种或多种组分的受体。
A.重组受体
在一些实施方案中，提供工程化细胞，如免疫细胞，如T细胞，所述细胞表达一种或多种重组受体。所述受体包括抗原受体以及含有其一种或多种组分的受体。重组受体可以包括嵌合受体(如含有配体结合结构域或其结合片段以及细胞内信号传导结构域或区域的那些)、功能性非TCR抗原受体、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)(如重组或转基因TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)及前述任一种的组分。重组受体(如CAR)通常包括在一些方面经由接头和/或一个或多个跨膜结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域。在一些实施方案中，工程化细胞表达含有不同组分、结构域或区域的两种或更多种受体。在一些方面，两种或更多种受体允许对重组受体的特异性、活性、抗原(或配体)结合、功能和/或表达进行空间或时间调节或控制。
1.嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施方案中，工程化细胞(如T细胞)表达对特定抗原(或标记或配体)(如在特定细胞类型的表面上表达的抗原)具有特异性的重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))。在一些实施方案中，所述抗原是多肽。在一些实施方案中，抗原是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织(例如在健康细胞或组织中)相比，抗原在疾病或病症的细胞例如肿瘤细胞或致病细胞上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。在一些方面，重组受体(例如，CAR)包括选自以下的一个或多个区域或结构域：细胞外配体(例如，抗原)结合区域或结构域(例如，本文所述的任何抗体或片段)和细胞内信号传导区。在一些实施方案中，配体(例如，抗原)结合区域或结构域是或包括scFv或单一结构域VH抗体，并且细胞内信号传导区或结构域是或含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导区或结构域包括CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域或其部分。在一些方面，一个或多个细胞外配体(例如，抗原)结合区域或结构域与一个或多个细胞内信号传导区或结构域经由一个或多个接头和/或一个或多个跨膜结构域连接(link或connect)。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括设置在细胞外结构域与细胞内信号传导区之间的跨膜结构域。
示例性抗原受体(包括CAR)以及用于工程化细胞和将此类受体引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 2000/14257、WO 2013/126726、WO 2012/129514、WO 2014/031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061；美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337；美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118；以及欧洲专利申请号EP2537416；和/或以下文献所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；以及Wu等人,Cancer,2012年3月18日(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR，以及国际专利申请公开号WO 2014/055668中所述的那些。CAR的例子包括如任何前述参考文献中披露的CAR，所述参考文献如WO 2014/031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、US 7,446,190、US 8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)。
在一些实施方案中，重组受体(例如，抗原受体)含有结合(例如，特异性结合)抗原、配体和/或标记的细胞外抗原结合结构域或配体结合结构域。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，抗原受体是含有特异性结合抗原的细胞外抗原识别结构域的CAR。在一些实施方案中，CAR被构建为具有对特定抗原、标记或配体的特异性，所述特定抗原、标记或配体是例如在由过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原(例如，癌症标记)和/或旨在诱导衰减应答的抗原(如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原)。因此，CAR通常在其细胞外部分中包括一种或多种配体(例如，抗原)结合分子，如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或者一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)、或单结构域抗体(sdAb)(如sdFv、纳米抗体、VHH和VNAR)。在一些实施方案中，抗原结合片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
在一些实施方案中，CAR含有特异性识别在细胞表面上表达的抗原或配体(如完整抗原)的抗体或抗原结合片段(例如scFv)。在一些实施方案中，抗原或配体是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，抗原或配体是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，如与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原或配体在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，嵌合受体靶向的抗原包括在通过过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的情况下表达的抗原。所述疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液癌、免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B型、T型和骨髓性的白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，所述抗原或配体是肿瘤抗原或癌症标记。在一些实施方案中，所述抗原或配体所述抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，所述受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任一种。在一些实施方案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特有的或病原体表达的抗原，如病毒抗原(例如，来自HIV、HCV、HBV的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，所述抗体是包括一个或多个接头的抗原结合片段(如scFv)，所述一个或多个接头连接两个抗体结构域或区域(如重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区)。接头通常是肽接头，例如，柔性和/或可溶性肽接头。接头包括富含甘氨酸和丝氨酸的那些和/或在一些情况下富含苏氨酸的那些。在一些实施方案中，接头还包括带电荷的残基(如赖氨酸和/或谷氨酸)，其可以改善溶解性。在一些实施方案中，接头还包括一个或多个脯氨酸。在一些方面，富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的接头包括至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的此类一种或多种氨基酸。在一些实施方案中，它们包括至少或至少约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方案中，接头基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸构成。接头的长度通常在约5个与约50个氨基酸之间，通常在为或约10个与为或约30个之间，例如10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个，并且在一些例子中长度在10个与25个氨基酸之间。示例性接头包括具有不同数量的序列GGGGS(4GS；SEQ ID NO:115)或GGGS(3GS；SEQ ID NO:116)的重复(如在2、3、4与5个之间的这种序列的重复)的接头。示例性接头包括具有SEQ ID NO:52(GGGGSGGGGSGGGGS)、SEQ ID NO:58(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)或SEQ ID NO:117(SRGGGGSGGGGSG GGGSLEMA)所示序列或由所述序列组成的那些。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如scFv或VH结构域)特异性识别抗原，如CD19。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段源自特异性结合CD19的抗体或抗原结合片段，或者是所述抗体或抗原结合片段的变体。
在一些实施方案中，所述scFv和/或VH结构域源自FMC63。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987)Leucocyte typing III.302)。FMC63抗体包含SEQ ID NO:38所示的CDR H1；SEQ ID NO:39所示的CDR H2；SEQ ID NO:40或54所示的CDR H3；以及SEQ ID NO:35所示的CDR L1；SEQ IDNO:36或55所示的CDR L2；和SEQ ID NO:37或56所示的CDR L3。FMC63抗体包含含有SEQ IDNO:41的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:35的CDR L1序列、SEQ ID NO:36的CDRL2序列和SEQ ID NO:37的CDR L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:38的CDR H1序列、SEQ ID NO:39的CDR H2序列和SEQ ID NO:40的CDR H3序列的可变重链，或者与任何前述序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述序列的变体。在一些实施方案中，scFv包含SEQ IDNO:41所示的FMC63的可变重链区和SEQ ID NO:42所示的FMC63的可变轻链区，或者与任何前述序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述序列的变体。在一些实施方案中，所述可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，所述接头如SEQ ID NO:58所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:57展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:43展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，scFv和/或VH结构域源自SJ25C1。SJ25C1是针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typing III.302)。SJ25C1抗体包含分别在SEQ ID NO:47-49所示的CDR H1、H2和H3，以及分别在SEQ ID NO:44-46所示的CDR L1、L2和L3序列。SJ25C1抗体包含含有SEQID NO:50的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，svFv包含含有SEQ ID NO:44所示的CDR L1；SEQ ID NO:45所示的CDR L2；和SEQ ID NO:46所示的CDR L3的可变轻链；和/或含有SEQ ID NO:47所示的CDRH1、SEQ ID NO:48所示的CDR H2和SEQ ID NO:49所示的CDR H3的可变重链，或者与任何前述序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述序列的变体。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:50所示的SJ25C1的可变重链区和SEQ ID NO:51所示的SJ25C1的可变轻链区，或者与任何前述序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述序列的变体。在一些实施方案中，所述可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，所述接头如SEQ ID NO:52所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段(例如scFv或VH结构域)特异性识别抗原如BCMA。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段源自特异性结合至BCMA的抗体或抗原结合片段，或者是所述抗体或抗原结合片段的变体。
在一些实施方案中，CAR是对BCMA(例如人BCMA)具有特异性的抗BCMA CAR。先前已经描述了含有抗BCMA抗体(包括小鼠抗人B CMA抗体和人抗人抗体)的嵌合抗原受体，以及表达此类嵌合受体的细胞。参见Carpenter等人,Clin Cancer Res.,2013,19(8):2048-2060，WO 2016/090320、WO 2016090327、WO 2010104949A2和WO 2017173256。在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是BCMA。在一些实施方案中，scFv含有源自对BCMA具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合BCMA的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090327和WO 2016/090320中所述的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，所述抗BCMA CAR含有抗原结合结构域如scFv，所述抗原结合结构域含有源自WO 2016/090320或WO 2016090327中所述抗体的可变重链(VH)区和/或可变轻链(VL)区。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域如scFv含有SEQ ID NO:109所示的VH和SEQ ID NO:110所示的VL。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域如scFv含有SEQ IDNO:111所示的VH和SEQ ID NO:112所示的VL。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域如scFv含有SEQ ID NO:113所示的VH和SEQ ID NO:114所示的VL。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域如scFv含有SEQ ID NO:106所示的VH和SEQ ID NO:107所示的VL。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域如scFv含有SEQ ID NO:118所示的VH和SEQ ID NO:119所示的VL。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域如scFv含有SEQ ID NO:120所示的VH和SEQ IDNO:121所示的VL。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域如scFv含有SEQ ID NO:122所示的VH和SEQ ID NO:123所示的VL。在一些实施方案中，所述VH或VL具有如下氨基酸序列：其与任何前述VH或VL序列展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，并且保留与BCMA的结合。在一些实施方案中，VH区位于VL区的氨基末端。在一些实施方案中，VH区位于VL区的羧基末端。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是GPRC5D。在一些实施方案中，scFv含有源自对GPRC5D具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合GPRC5D的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090329和WO 2016/090312中所述的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些方面，CAR含有结合或识别(例如，特异性结合)通用标签或通用表位的配体(例如，抗原)结合结构域。在一些方面，结合结构域可以结合分子、标签、多肽和/或表位，所述分子、标签、多肽和/或表位可以连接至识别与疾病或障碍相关的抗原的不同结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)。示例性标签或表位包括染料(例如，异硫氰酸荧光素)或生物素。在一些方面，结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)与标签连接，所述标签识别与疾病或障碍相关的抗原(例如，肿瘤抗原)，且工程化细胞表达对所述标签具有特异性的CAR，以实现所述工程化细胞的细胞毒性或其他效应子功能。在一些方面，CAR对与疾病或障碍相关的抗原的特异性由带标签的结合分子(例如，抗体)提供，并且不同的带标签的结合分子可以用于靶向不同抗原。对通用标签或通用表位具有特异性的示例性CAR包括例如以下文献中所述的那些：U.S.9,233,125、WO 2016/030414；Urbanska等人,(2012)Cancer Res 72:1844-1852；和Tamada等人,(2012).Clin Cancer Res18:6436-6445。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特有的抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，例如抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性识别作为主要组织相容性复合物(MHC)-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原，如肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体(如抗原受体)的部分在细胞上表达。所述抗原受体包括功能性非T细胞受体(TCR)抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，含有展现针对肽-MHC复合物的TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是被处理的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，所述抗原像TCR一样，在MHC分子的背景下在细胞表面上被识别。在一些实施方案中，TCR样CAR中对MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结合结构域在一些方面经由接头和/或一个或多个跨膜结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以模拟或接近通过天然抗原受体(如TCR)的信号，以及任选地通过这种受体与共刺激受体组合的信号。
提及“主要组织相容性复合物”(MHC)是指含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞机构处理的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复合物，即MHC-肽复合物，用于呈递具有T细胞上的抗原受体(如TCR或TCR样抗体)可识别的构象的抗原。通常，MHC I类分子是具有跨膜α链(在一些情况下具有三个α结构域)和非共价缔合的β2微球蛋白的异二聚体。通常，MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β构成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包括MHC的有效部分，其含有抗原结合位点或用于结合肽的位点以及由适当抗原受体识别所必需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶的肽递送至细胞表面，在此处MHC-肽复合物被T细胞(如通常是CD8+T细胞，但是在一些情况下是CD4+T细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送至细胞表面，其中所述肽通常被CD4+T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，它们在小鼠中统称为H-2，并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也可以称为人白细胞抗原(HLA)。
术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相互作用来形成。在一些实施方案中，MHC-肽复合物存在或展示于细胞表面上。在一些实施方案中，MHC-肽复合物可以由抗原受体(如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部分)特异性识别。
在一些实施方案中，多肽的肽(如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，例如用于由抗原受体识别。通常，所述肽源自或基于更长生物分子(如多肽或蛋白质)的片段。在一些实施方案中，所述肽的长度通常为约8至约24个氨基酸。在一些实施方案中，对于MHC II类复合物中的识别，肽的长度为从或从约9至22个氨基酸。在一些实施方案中，对于MHC I类复合物中的识别，肽的长度为从或从约8至13个氨基酸。在一些实施方案中，在识别MHC分子(如MHC-肽复合物)的背景中的肽后，抗原受体(如TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T细胞，从而诱导T细胞应答，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞应答或其他应答。
在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合部分是已知的或者可以通过已知方法来产生(参见例如，美国公开申请号US 2002/0150914；US 2003/0223994；US 2004/0191260；US 2006/0034850；US 2007/00992530；US 20090226474；US 20090304679；和国际申请公开号WO 03/068201)。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性结合的抗体或其抗原结合部分可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些情况下，MHC-肽复合物的肽是能够与MHC结合的抗原的表位，所述抗原是例如肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主施用有效量的免疫原以用于引发免疫应答，其中免疫原保持其三维形式，持续足以引发针对所述肽在MHC分子的结合沟中的三维呈递的免疫应答的时间段。然后测定从宿主中收集的血清以确定是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈递的所需抗体。在一些实施方案中，可以评估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目的肽以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所需抗体。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性结合的抗体或其抗原结合部分可以通过采用抗体文库展示方法(如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可以产生突变体Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如，其中所述文库的成员在一个或多个CDR的一个或多个残基处发生突变。参见例如，美国专利申请公开号US 20020150914、US20140294841；以及Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:324-332。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体、VHH或VNAR)或片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。在一些方面，CAR是双特异性CAR，例如含有两个具有不同特异性的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，所述抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，所述抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单结构域VH单一抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
单结构域抗体(sdAb)是包含抗体的重链可变结构域的全部或一部分或轻链可变结构域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，所述CAR包含特异性结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记或待靶向的细胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文所述或已知的任何靶抗原。示例性的单结构域抗体包括sdFv、纳米抗体、VHH或VNAR。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区域或链的那些)，和/或可能并非通过天然存在的完整抗体的酶消化产生的片段。在一些实施方案中，所述抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基源自非人CDR，并且所有或基本上所有FR氨基酸残基源自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
因此，在一些实施方案中，嵌合抗原受体(包括TCR样CAR)包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv。在一些方面，抗体或抗原结合片段可以通过筛选多个抗原结合片段或分子(例如其文库)来获得，例如通过针对与特定抗原或配体的结合筛选scFv文库来获得。
在一些方面，所述重组受体(例如嵌合抗原受体)包括细胞外部分，其含有一个或多个配体(例如抗原)结合结构域(如抗体或其片段)；和一个或多个细胞内信号传导区或结构域(也可互换地称为胞质信号传导结构域或区域)。在一些方面，所述重组受体(例如CAR)还包括间隔子和/或跨膜结构域或部分。在一些方面，间隔子和/或跨膜结构域可以连接含有配体(例如，抗原)结合结构域的细胞外部分和一个或多个细胞内信号传导区或结构域。
在一些实施方案中，所述重组受体(如CAR)还包括间隔子，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰形式，如铰链区(例如，IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，所述重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，所述恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况相比，间隔子的长度可以提供细胞在抗原结合后增加的反应性。在一些例子中，所述间隔子具有为或约12个氨基酸的长度或者具有不超过12个氨基酸的长度。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸，约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。在一些实施方案中，间隔子具有小于250个氨基酸的长度、小于200个氨基酸的长度、小于150个氨基酸的长度、小于100个氨基酸的长度、小于75个氨基酸的长度、小于50个氨基酸的长度、小于25个氨基酸的长度、小于20个氨基酸的长度、小于15个氨基酸的长度、小于12个氨基酸的长度或小于10个氨基酸的长度。在一些实施方案中，间隔子具有从或从约10至250个氨基酸的长度、10至150个氨基酸的长度、10至100个氨基酸的长度、10至50个氨基酸的长度、10至25个氨基酸的长度、10至15个氨基酸的长度、15至250个氨基酸的长度、15至150个氨基酸的长度、15至100个氨基酸的长度、15至50个氨基酸的长度、15至25个氨基酸的长度、25至250个氨基酸的长度、25至100个氨基酸的长度、25至50个氨基酸的长度、50至250个氨基酸的长度、50至150个氨基酸的长度、50至100个氨基酸的长度、100至250个氨基酸的长度、100至150个氨基酸的长度或150至250个氨基酸的长度。示例性间隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；Hudecek等人(2015)CancerImmunol Res.3(2):125-135；或国际专利申请公开号WO2014031687。
在一些方面，所述间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ IDNO:1所示且由SEQ ID NO:2所示的序列编码的仅铰链间隔子。在其他实施方案中，间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如，IgG4铰链，如SEQ ID NO:3所示。在一些实施方案中，间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如，IgG4铰链，如SEQ ID NO:4所示。
在一些实施方案中，所编码的间隔子是或含有SEQ ID NO:108所示的序列。
在一些实施方案中，所述间隔子是或包含富含甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:5所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有与SEQ ID NO:1、3、4和5中的任何一个展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述间隔子可以全部或部分地源自IgG4和/或IgG2。在一些实施方案中，所述间隔子可以是含有源自IgG4、IgG2和/或IgG2和IgG4的铰链、CH2和/或CH3序列中的一个或多个的嵌合多肽。在一些实施方案中，所述间隔子可以含有突变，如一个或多个结构域中的一个或多个单氨基酸突变。在一些例子中，氨基酸修饰是在IgG4的铰链区中脯氨酸(P)对丝氨酸(S)的取代。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰是天冬酰胺(N)被谷氨酰胺(Q)取代以降低糖基化异质性，如在对应于SEQ ID NO:60所示的IgG4重链恒定区序列的CH2区中的位置177的位置(Uniprot登录号P01861；对应于依据EU编号的位置297和SEQID NO:4所示的铰链-CH2-CH3间隔子序列的位置79的位置)处的N至Q取代，或在对应于SEQID NO:59所示的IgG2重链恒定区序列的CH2区中的位置176的位置(Uniprot登录号P01859；对应于依据EU编号的位置297的位置)处的N至Q取代。
在一些方面，间隔子是多肽间隔子，如选自以下的一种或多种：(a)包含全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式或由其组成，或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区，(b)包含全部或部分免疫球蛋白铰链、任选地IgG4铰链或其修饰形式或由其组成，和/或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区，或(c)长度为或约12个氨基酸和/或包含全部或部分免疫球蛋白铰链、任选地IgG4铰链或其修饰形式或由其组成；或(d)由以下组成或包含以下：SEQ ID NO:1、3-5或27-34所示的氨基酸序列或前述任一项的变体，所述变体与前述任一项具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，或(e)包含式X1PPX2P(SEQ ID NO:31)或由其组成，其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸。
在一些实施方案中，CAR的配体(例如，抗原)结合或识别结构域连接至一种或多种细胞内信号传导组分，如细胞内信号传导区或结构域，和/或模拟经由抗原受体复合物(如TCR复合物)激活和/或经由另一细胞表面受体传导信号的信号传导组分。因此，在一些实施方案中，所述抗原结合组分(例如，抗体)连接至一个或多个跨膜和细胞内信号传导区或结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一些实施方案中，使用与受体(例如，CAR)中的一个结构域天然缔合的跨膜结构域。在一些情形下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或源自合成来源。在来源是天然的情况下，所述结构域在一些方面源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下(即，至少包含其一个或多个跨膜区)的那些：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(4-1BB)或CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来进行连接。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分或其变体。所述细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。
在一些实施方案中，所述受体(例如，CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域或其变体，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域，或者是包含SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，含有重组受体的部分的跨膜结构域包含SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，重组受体(例如，CAR)包括细胞内信号传导区或结构域(也可互换地称为胞质信号传导结构域或区域)。在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区或结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中刺激和/或诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域(例如CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或区域或其功能变体或信号传导部分)和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导区或结构域。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)包括至少一种或多种细胞内信号传导组分，如细胞内信号传导区或结构域。细胞内信号传导区包括模拟或接近以下的那些：经由天然抗原受体的信号、经由这种受体与共刺激受体的组合的信号和/或仅经由共刺激受体的信号。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头(如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并且在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
在一些实施方案中，在连接CAR后，CAR的胞质结构域或细胞内信号传导区刺激和/或激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些背景下，CAR诱导T细胞的功能，如细胞溶解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导区或结构域的截短部分(例如，如果其转导效应子功能信号)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区(例如包含一个或多个细胞内信号传导结构域)包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体并行起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。在一些实施方案中，例如包含一个或多个细胞内结构域的细胞内信号传导区包括参与提供共刺激信号的区域或结构域的胞质序列。
在一些实施方案中，所述受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合或抗原识别结构域连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，所述受体(例如，CAR)还包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ(FcRγ)、CD8α、CD8β、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR包括CD3 zeta(CD3ζ)或FcRγ与CD8α、CD8β、CD4、CD25或CD16中的一种或多种之间的嵌合分子。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要经由TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。在一些方面，T细胞激活被描述为由两类胞质信号传导序列介导：启动经由TCR的抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导区或结构域)，以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导区或结构域)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级刺激和/或激活的初级胞质信号传导区。以刺激性方式作用的一个或多个初级胞质信号传导区可以含有被称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。一个或多个含有ITAM的初级胞质信号传导区的例子包括源自以下的那些：TCR或CD3 zeta(CD3ζ)、Fc受体(FcR)γ或FcRβ。在一些实施方案中，CAR中的胞质信号传导区或结构域含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。在一些实施方案中，所述细胞内(或胞质)信号传导区包含人CD3链、任选地CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的亚型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含SEQ ID NO:13、14或15所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13、14或15展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
因此，在一些实施方案中，为了促进完全刺激和/或激活，CAR中还包括用于产生次级或共刺激信号的一种或多种组分。在其他实施方案中，所述CAR不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在相同细胞中表达，并且提供用于产生次级或共刺激信号的组分。
在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、ICOS和/或其他共刺激受体)的信号传导区和/或跨膜部分。在一些方面，同一CAR包括初级胞质信号传导区和共刺激信号传导组分两者。
在一些实施方案中，一种或多种不同的重组受体可以含有一个或多个不同的细胞内信号传导区或结构域。在一些实施方案中，初级细胞质信号传导区被包括于一个CAR内，而共刺激组分由另一受体(例如，识别另一抗原的另一CAR)提供。在一些实施方案中，CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。
在某些实施方案中，细胞内信号传导区包含与CD3(例如，CD3ζ)细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区包含与CD3ζ细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR在细胞质部分中包含一个或多个(例如两个或更多个)共刺激结构域和初级细胞质信号传导区。示例性CAR包括CD3ζ、CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D和/或ICOS的细胞内组分，如一个或多个细胞内信号传导区或结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内信号传导区或结构域，例如来自CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D和/或ICOS，在一些情况下，在跨膜结构域与细胞内信号传导区或结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D和/或ICOS中的一种或多种。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区或结构域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10或11展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内区域包含CD137(4-1BB)的细胞内共刺激信号传导区或结构域或其功能变体或部分，如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42个氨基酸的胞质结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与SEQID NO:12展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代、第三代或第四代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后例如经由CD3链诱导的信号仅提供初级刺激或激活信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自一种或多种共刺激受体如CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOS和/或其他共刺激受体的一个或多个细胞内信号传导区或结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体(例如选自CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOS和/或其他共刺激受体)的多个共刺激结构域的CAR；在一些方面，第四代CAR是包括不同共刺激受体(例如选自CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOS和/或其他共刺激受体)的三个或更多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，所述细胞被工程化以表达一种或多种另外的分子和/或多肽，和/或使用组合和/或多重靶向方法来调控、控制或调节CAR的功能和/或活性。用于CAR的示例性方法和组合方法描述于例如下文所述的组合方法和多重靶向章节中。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及细胞内信号传导区(含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体)。在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及细胞内信号传导结构域(含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体)。在一些此类实施方案中，受体还包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。
2.修改的方法
在一些实施方案中，工程化细胞包括采用修改的方法(例如，多重靶向策略或可调节受体)的细胞。在一些实施方案中，所述修改的策略或方法包括采用多种多肽，如两种或更多种多肽。在一些实施方案中，示例性修改的方法或策略包括在细胞上表达两种或更多种基因工程化受体，每种所述受体识别相同或不同的抗原，并且通常每种所述受体包括不同的区域或结构域，如不同的细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，示例性修改的方法或策略包括表达编码CAR的一个或多个结构域或区域的一条或多条多肽链。在一些方面，组合中的各种多肽链可以执行CAR的功能或活性，和/或调控、控制或调节CAR的功能和/或活性。在一些方面，多重靶向策略包括作为双特异性CAR的CAR，例如，其如通过含有具有不同特异性的两个抗原结合结构域来靶向两种抗原。
在一些实施方案中，修改的策略或方法包括激活和共刺激CAR的组合，例如，所述CAR靶向单独存在于脱靶(例如，正常细胞)上，但是仅一起存在于要治疗的疾病或病症的细胞上的两种不同抗原。在一些实施方案中，多重靶向策略包括表达激活和抑制性CAR的细胞，例如如下的那些细胞：其中激活CAR结合至在正常或未患病细胞和要治疗的疾病或病症的细胞两者上表达的一种抗原，并且抑制性CAR结合至仅在正常细胞或不期望治疗的细胞上表达的另一种抗原。在一些方面，修改的策略或方法包括能够被调控、调节或控制的重组受体，例如，CAR。
在一些实施方案中，修改的方法或策略包括将细胞工程化以表达编码CAR的一个或多个结构域或区域的一条或多条多肽链。在一些方面，组合中的各种多肽链可以包含CAR。在一些实施方案中，在CAR中存在一个或多个另外的结构域或区域。在一些实施方案中，使用存在于一条或多条多肽链中的各个结构域或区域以组合和/或多重靶向方法来调控、控制或调节CAR的功能和/或活性。在一些实施方案中，工程化细胞表达含有不同组分、结构域或区域的两种或更多种受体。在一些方面，两种或更多种受体允许对重组受体的特异性、活性、抗原(或配体)结合、功能和/或表达进行空间或时间调节或控制。
在一些方面，编码CAR的结构域或区域的一条或多条多肽链可以靶向一种或多种抗原或分子。示例性多重靶向策略描述于例如以下文献中：国际专利申请公开号WO2014055668；或Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,Sci Transl Med.(2013)5(215):215ra172；Sadelain,Curr Opin Immunol.(2016)41:68-76；Wang等人(2017)Front.Immunol.8:1934；Mirzaei等人(2017)Front.Immunol.8:1850；Marin-Acevedo等人(2018)Journal of Hematology&Oncology 11:8；Fesnak等人(2016)Nat Rev Cancer.16(9):566-581；以及Abate-Daga和Davila,(2016)Molecular Therapy-Oncolytics 3,16014。
例如，在一些实施方案中，工程化细胞可以表达第一重组受体(例如，CAR或TCR)，其通常在与第一受体识别的抗原(例如，第一抗原)特异性结合后，能够将激活或刺激信号诱导至细胞。在一些实施方案中，所述细胞还可以表达第二重组受体(例如，CAR或TCR)，例如，嵌合共刺激受体，其通常在与第二受体识别的第二抗原特异性结合后，能够将共刺激信号诱导至免疫细胞。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是相同的。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是不同的。
在一些实施方案中，第一和/或第二重组受体(例如CAR或TCR)能够将激活或刺激信号诱导至细胞。在一些实施方案中，受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，由第一受体诱导的激活涉及信号转导或细胞中蛋白质表达的变化，从而导致免疫应答(如ITAM磷酸化)的起始和/或ITAM介导的信号转导级联的起始、免疫突触的形成和/或所结合受体(例如，CD4或CD8等)附近的分子的聚簇、一种或多种转录因子(如NF-κB和/或AP-1)的激活和/或对诸如细胞因子的因子的基因表达的诱导、增殖和/或存活。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括共刺激受体(如CD28、CD137(4-1BB)、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、NKG2D、ICOS和/或其他共刺激受体)的细胞内信号传导区或结构域。在一些实施方案中，第一和第二受体可以含有不同共刺激受体的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，第一受体含有CD28共刺激信号传导区，并且第二受体含有4-1BB共刺激信号传导区，或反之亦然。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域和共刺激受体的细胞内信号传导结构域两者。
在一些实施方案中，第一受体包含含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域，并且第二受体包含共刺激受体的细胞内信号传导结构域。与在相同细胞中诱导的激活或刺激信号组合的共刺激信号是导致免疫应答的共刺激信号，所述免疫应答例如为稳健且持续的免疫应答，例如增加的基因表达，细胞因子和其他因子的分泌，以及T细胞介导的效应子功能(如细胞杀伤)。
在一些实施方案中，单独的第一受体的连接和单独的第二受体的连接都不会诱导稳健的免疫应答。在一些方面，如果仅连接一种受体，则细胞变得耐受抗原或对抗原无反应，或被抑制，和/或不被诱导增殖或分泌因子或实现效应子功能。然而，在一些此类实施方案中，在连接多个受体时，如在遇到表达第一和第二抗原的细胞时，实现所需应答，如完全免疫激活或刺激，例如如通过一种或多种细胞因子的分泌、增殖、持久性和/或执行免疫效应子功能(如靶细胞的细胞毒性杀伤)所指示。
在一些实施方案中，激活结构域被包括在一个CAR内，而共刺激组分由识别另一抗原的另一CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括均在同一细胞上表达的激活或刺激CAR、共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，所述细胞包括一种或多种刺激或激活CAR和/或共刺激CAR。
在一些实施方案中，表达重组受体的细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013))，如识别除了与疾病或病症相关和/或为疾病或病症所特有的抗原以外的抗原的CAR，由此通过抑制性CAR与其配体的结合而减小或抑制经由疾病靶向CAR递送的激活信号，例如以减小脱靶效应。
在一些实施方案中，这两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的连接激活细胞或诱导应答，但是第二抑制性受体与其抗原的连接诱导抑制或减弱该应答的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR(iCAR)的组合。例如，这种策略可以用于例如降低在如下背景下的脱靶效应的可能性，在所述背景中激活CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合在正常细胞上表达但不在所述疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
在一些方面，嵌合受体是或包括抑制性CAR(例如iCAR)，并且包括减弱或抑制免疫应答(如细胞中ITAM和/或共刺激促进的应答)的细胞内组分。此类细胞内信号传导组分的示例是在免疫检查点分子(包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体(包括A2AR))上发现的那些组分。在一些方面，工程化细胞包括抑制性CAR，所述抑制性CAR包括这种抑制性分子的或源自这种抑制性分子的信号传导结构域，使得其起到减弱细胞应答(例如，由激活和/或共刺激CAR诱导的应答)的作用。
在一些实施方案中，多重靶向策略用于如下情况：其中与特定疾病或病症相关的抗原在未患病细胞上表达和/或在工程化细胞本身上表达，所述表达为瞬时表达(例如，在与基因工程化相关的刺激后)或永久表达。在此类情况下，由于需要连接两个分开的和单独特异性抗原受体，可以改善特异性、选择性和/或功效。
在一些实施方案中，多种抗原(例如，第一和第二抗原)在所靶向的细胞、组织或者疾病或病症上(如在癌细胞上)表达。在一些方面，细胞、组织、疾病或病症是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，多种抗原中的一种或多种通常也在不需要用细胞疗法靶向的细胞(例如正常或未患病细胞或组织，和/或工程化细胞本身)上表达。在此类实施方案中，因为需要连接多种受体以实现细胞的应答，实现特异性和/或功效。
在一些实施方案中，第一和/或第二重组受体中的一种是可以调节另一种重组受体的表达、抗原结合和/或活性的重组受体。
在一些方面，可以使用两个受体系统来调节重组受体的表达。在一些实施方案中，第一重组受体含有与调节分子(如转录因子)连接的第一配体(例如，抗原)结合结构域，其经由可调节切割元件来连接。在一些方面，可调节切割元件源自修饰的Notch受体(例如，synNotch)，它能够在接合第一配体(例如，抗原)结合结构域后切割并释放细胞内结构域。在一些方面，第二重组受体含有与细胞内信号传导组分连接的第二配体(例如，抗原)结合结构域，所述细胞内信号传导组分能够将激活或刺激信号诱导至细胞，如含有ITAM的细胞内信号传导结构域。在一些方面，编码第二重组受体的核酸序列与能够由特定转录因子(例如，第一重组受体编码的转录因子)调节的转录调节元件(例如，启动子)可操作地连接。在一些方面，配体或抗原与第一配体(例如，抗原)结合结构域的接合导致转录因子的蛋白水解释放，这又可以诱导第二重组受体的表达(参见Roybal等人(2016)Cell164:770-779；Morsut等人(2016)Cell 164:780-791)。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是不同的。
在一些情况下，将所述细胞工程化以表达一种或多种另外的分子，例如，另外的效应分子和/或辅助分子。在一些情况下，所述工程化细胞被称为“装甲CAR”或针对通用细胞因子杀伤重定向的T细胞(TRUCK)。在一些实施方案中，所述另外的效应分子是可溶分子。在一些实施方案中，所述另外的效应分子是膜结合分子。在一些方面，另外的效应分子可以用于克服或抵消免疫抑制性环境如肿瘤微环境(TME)的影响。在一些方面，示例性另外的分子包括细胞因子、细胞因子受体、嵌合共刺激受体、共刺激配体和T细胞功能或活性的其他调节剂。在一些实施方案中，工程化细胞表达的另外的分子包括IL-7、IL-12、IL-15、CD40配体(CD40L)和4-1BB配体(4-1BBL)。在一些方面，另外的分子是结合不同分子的另外的受体，例如，膜结合受体。例如，在一些实施方案中，另外的分子是细胞因子受体或趋化因子受体，例如，IL-4受体或CCL2受体。
在一些实施方案中，CAR是多特异性CAR，例如，含有可以结合和/或识别(例如，特异性结合)多种不同抗原的多个配体(例如，抗原)结合结构域。在一些方面，CAR是双特异性CAR。在一些实施方案中，CAR含有双特异性结合结构域，例如，双特异性抗体或其片段，其含有结合至靶细胞上的不同表面抗原(例如，选自如本文所述任何列示抗原，例如，CD19和CD22或CD19和CD20)的至少一个抗原结合结构域。在一些实施方案中，双特异性结合结构域与其每一表位或抗原的结合可以导致刺激T细胞的功能、活性和/或应答，例如，细胞毒性活性和随后对靶细胞的裂解。这种示例性双特异性结合结构域可以包括：在一些情况下经由例如柔性接头彼此融合的串联scFv分子；双抗体及其衍生物，包括串联双抗体(Holliger等人,Prot Eng9,299-305(1996)；Kipriyanov等人,J Mol Biol 293,41-66(1999))；双重亲和力重靶向(DART)分子，其可以包括具有C末端二硫桥的双抗体形式；双特异性T细胞接合器(BiTE)分子，其含有通过柔性接头融合的串联scFv分子(参见例如，Nagorsen和Bauerle,Exp Cell Res 317,1255-1260(2011)；或者三功能抗体(triomab)，其包括完整杂合小鼠/大鼠IgG分子(Seimetz等人,Cancer Treat Rev 36,458-467(2010))。本文所述的任何重组受体中可以含有此类结合结构域中的任一种。
在一些情况下，重组受体(例如，CAR)能够被调节，可期望优化使用所述重组受体的疗法的安全性和功效。在一些方面，本文提供工程化细胞，其包含能够被调节的重组受体。能够被调节的重组受体(本文中也称为“可调节重组受体”)是指一组多肽，如一组至少两种多肽，其在工程化细胞(例如，工程化T细胞)中表达时为所述工程化细胞提供在诱导物的控制下产生细胞内信号的能力。
在一些实施方案中，本文提供的可调节重组受体的多肽含有多聚化结构域，所述多聚化结构域能够与另一多聚化结构域发生多聚化。在一些实施方案中，多聚化结构域能够在与诱导物结合后发生多聚化。例如，多聚化结构域可以结合诱导物，如化学诱导物，从而导致可调节重组受体的多肽借助所述多聚化结构域的多聚化而发生多聚化，从而产生可调节重组受体。在一些实施方案中，可调节重组受体的一种多肽包含配体(例如，抗原)结合结构域，并且可调节重组受体中不同的多肽包含细胞内信号传导区，其中两种多肽借助所述多聚化结构域的多聚化而发生的多聚化产生包含配体结合结构域和细胞内信号传导区的可调节重组受体。在一些实施方案中，多聚化可以诱导、调节、激活、介导和/或促进含有可调节重组受体的工程化细胞中的信号。在一些实施方案中，诱导物结合至可调节重组受体中至少一种多肽的多聚化结构域并诱导可调节重组受体的构象变化，其中所述构象变化激活信号传导。在一些实施方案中，配体与此类重组受体的结合诱导重组受体中的构象变化，在一些情况下，所述构象变化包括重组受体寡聚化，从而可以使所述受体胜任细胞内信号传导。
在一些实施方案中，诱导物发挥功能以偶联或多聚化(例如，二聚化)工程化细胞中表达的可调节重组受体的一组至少两种多肽，以使所述可调节重组受体产生所需细胞内信号，如在可调节重组受体与靶抗原的相互作用期间。可调节重组受体的至少两种多肽通过诱导物进行的偶联或多聚化在诱导物与多聚化结构域结合后实现。例如，在一些实施方案中，工程化细胞中的第一多肽和第二多肽可以各自包含能够结合诱导物的多聚化结构域。在多聚化结构域与诱导物结合后，第一多肽和第二多肽偶联在一起以产生所需的细胞内信号。在一些实施方案中，多聚化结构域位于多肽的细胞内部分上。在一些实施方案中，多聚化结构域位于多肽的细胞外部分上。
在一些实施方案中，可调节重组受体的一组至少两种多肽包含两种、三种、四种或五种或更多种多肽。在一些实施方案中，所述组中的至少两种多肽是相同多肽，例如，包含细胞内信号传导区和多聚化结构域的两种、三种或更多种相同多肽。在一些实施方案中，所述组中的至少两种多肽是不同多肽，例如，包含配体(例如，抗原)结合结构域和多聚化结构域的第一多肽以及包含细胞内信号传导区和多聚化结构域的第二多肽。在一些实施方案中，细胞内信号在诱导物的存在下产生。在一些实施方案中，细胞内信号在不存在诱导物的情况下产生，例如，诱导物干扰可调节重组受体中至少两种多肽的多聚化，从而阻止通过可调节重组受体进行细胞内信号传导。
在一些实施方案中，所提供的多聚化结构域可以在结合诱导物后发生多聚化(例如，二聚化)。本文考虑的诱导物包括但不限于化学诱导物或蛋白质(例如，半胱天冬酶)。在一些实施方案中，诱导物选自雌激素、糖皮质激素、维生素D、类固醇、四环素、环孢菌素、雷帕霉素、香豆霉素、赤霉素、FK1012、FK506、FKCsA、rimiducid或HaXS或其类似物或衍生物。在一些实施方案中，诱导物是AP20187或AP20187类似物，如AP1510。
在一些实施方案中，所提供的多聚化结构域可以在结合诱导物(如本文提供的诱导物)后发生多聚化(例如，二聚化)。在一些实施方案中，多聚化结构域可以来自FKBP、亲环蛋白受体、类固醇受体、四环素受体、雌激素受体、糖皮质激素受体、维生素D受体、钙神经素A、CyP-Fas、mTOR的FRB结构域、GyrB、GAI、GID1、Snap-tag和/或HaloTag或其部分或衍生物。在一些实施方案中，多聚化结构域是FK506结合蛋白(FKBP)或其衍生物、或其片段和/或多聚体，如FKBP12v36。在一些实施方案中，FKBP包含氨基酸序列GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDS SRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(SEQ ID NO:85)。在一些实施方案中，FKB P12v36包含氨基酸序列GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGK KVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYG ATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(SEQ ID NO:85)。
示例性诱导物和相应的多聚化结构域是已知的，例如，如以下文献中所述：美国专利申请公开号2016/0046700；Clackson等人(1998)Proc Natl Acad Sci U S A.95(18):10437-42；Spencer等人(1993)Science 262(5136):1019-24；Farrar等人(1996)Nature383(6596):178-81；Miyamoto等人(2012)Nature Chemical Biology 8(5):465-70；Erhart等人(2013)Chemi stry and Biology 20(4):549-57。在一些实施方案中，诱导物是rimiducid(也称为AP1903；CAS索引名：2-哌啶甲酸1-[(2S)-1-氧代-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁基]-,1,2-乙二基双[亚氨基(2-氧代-2,1-乙二基)氧基-3,1-亚苯基[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)亚丙基]]酯，[2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R]]]]]-(9Cl)；CAS登记号：195514-63-7；分子式：C78H98N4O20；分子量：1411.65)，并且多聚化结构域是FK506结合蛋白(FKBP)。
在一些实施方案中，工程化细胞的细胞膜对于诱导物是不可渗透的。在一些实施方案中，工程化细胞的细胞膜对于诱导物是可渗透的。
在一些实施方案中，在不存在诱导物的情况下，所提供的可调节重组受体的多肽并非多聚体或二聚体的一部分。在结合诱导物后，多聚化结构域可以发生多聚化，例如，二聚化。在一些方面，多聚化结构域的多聚化导致可调节重组受体的多肽与可调节重组受体的另一多肽的多聚化，例如可调节重组受体的至少两种多肽的多聚复合物。在一些实施方案中，多聚化结构域的多聚化可以借助诱导信号传导组分的物理靠近或者多聚体或二聚体的形成来诱导、调节、激活、介导和/或促进信号转导。在一些实施方案中，在结合诱导物后，多聚化结构域的多聚化还诱导与多聚化结构域直接或间接连接的信号传导结构域的多聚化。在一些实施方案中，多聚化诱导、调节、激活、介导和/或促进经由信号传导结构域或区域的信号传导。在一些实施方案中，与多聚化结构域连接的信号传导结构域或区域是细胞内信号传导区。
在一些实施方案中，多聚化结构域在细胞内或者与工程化细胞(例如，工程化T细胞)的细胞内或胞质侧上的细胞膜缔合。在一些方面，细胞内多聚化结构域与膜缔合结构域(例如，脂质连接结构域，如豆蔻酰化结构域、棕榈酰化结构域、异戊烯化结构域或跨膜结构域)直接或间接连接。在一些实施方案中，多聚化结构域在细胞内，并且经由跨膜结构域与细胞外配体(例如，抗原)结合结构域连接。在一些实施方案中，细胞内多聚化结构域与细胞内信号传导区直接或间接连接。在一些方面，诱导的多聚化结构域的多聚化也使细胞内信号传导区彼此靠近，从而允许多聚化(例如，二聚化)，并刺激细胞内信号传导。在一些实施方案中，可调节重组受体的多肽包含跨膜结构域、一个或多个细胞内信号传导区以及一个或多个多聚化结构域，它们各自直接或间接连接。
在一些实施方案中，多聚化结构域在细胞外或者与工程化细胞(例如，工程化T细胞)的细胞外侧上的细胞膜缔合。在一些方面，细胞外多聚化结构域与膜缔合结构域(例如，脂质连接结构域，如豆蔻酰化结构域、棕榈酰化结构域、异戊烯化结构域或跨膜结构域)直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外多聚化结构域与配体结合结构域(例如，抗原结合结构域)直接或间接连接，如用于结合至与疾病相关的抗原。在一些实施方案中，多聚化结构域在细胞外，并且经由跨膜结构域与细胞内信号传导区连接。
在一些方面，膜缔合结构域是现有跨膜蛋白的跨膜结构域。在一些例子中，膜缔合结构域是上述任何跨膜结构域。在一些方面，膜缔合结构域含有蛋白质-蛋白质相互作用基序或跨膜序列。
在一些方面，膜缔合结构域是酰化结构域，如豆蔻酰化结构域、棕榈酰化结构域、异戊烯化结构域(即，法尼基化、牻牛儿基-牻牛儿基化、CAAX盒)。例如，膜缔合结构域可以是存在于蛋白质的N末端或C末端的酰化序列基序。此类结构域含有可以由酰基转移酶识别的特定序列基序，所述酰基转移酶将酰基部分转移至含有所述结构域的多肽。例如，酰化基序可以被单一酰基部分修饰(在一些情况下，所述酰基部分之后有几个带正电的残基(例如人c-Src：MGSNKSKPKDASQRRR(SEQ ID NO:86)，以改进与阴离子脂质头基的缔合)。在其他方面，乙酰化基序能够被多个酰基部分修饰。例如，双酰化区位于某些蛋白激酶的N末端区域内，所述蛋白激酶如Src家族成员的子集(例如，Yes、Fyn、Lck)和G蛋白α亚基。示例性双酰化区含有序列基序Met-Gly-Cys-Xaa-Cys(SEQ ID NO:87)，其中Met被切割，Gly发生N-酰化，并且一个Cys残基发生S-酰化。Gly通常发生豆蔻酰化，并且Cys可以发生棕榈酰化。
其他示例性酰化区包括序列基序Cys-Ala-Ala-Xaa(所谓的“CAAX盒”；SEQ ID NO:88)，其可以被C15或O10异戊烯基部分修饰，并且是本领域已知的(参见例如，Gauthier-Campbell等人(2004)Molecular Biology of the Cell 15:2205-2217；Glabati等人(1994)Biochem.J.303:697-700；以及Zlakine等人(1997)J.Cell Science 110:673-679；ten Klooster等人(2007)Biology of the Cell 99:1-12；Vincent等人(2003)NatureBiotechnology 21:936-40)。在一些实施方案中，酰基部分是C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C3-C6环烷基、C1-C4卤代烷基、C4-C12环烷基烷基、芳基、取代的芳基或芳基(C1-C4)烷基。在一些实施方案中，含有酰基的部分是脂肪酸，并且脂肪酸部分的例子是丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)、庚基(C7)、辛基(C8)、壬基(C9)、癸基(C10)、十一烷基(C11)、月桂基(C12)、肉豆蔻基(C14)、棕榈基(C16)、硬脂酰基(C18)、二十烷基(C20)、山嵛基(C22)和木蜡基部分(C24)，并且每部分可以含有0、1、2、3、4、5、6、7或8个不饱和键(即，双键)。在一些例子中，酰基部分是脂质分子，如磷脂酰基脂质(例如，磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱)、鞘酯(例如，鞘磷脂、鞘氨醇、神经酰胺、神经节苷脂、脑苷脂)或其修饰的形式。在某些实施方案中，一个、两个、三个、四个或五个或更多个酰基部分与膜缔合结构域连接。
在一些方面，膜缔合结构域是促进糖脂(也称为糖基磷脂酰肌醇或GPI)的添加的结构域。在一些方面，GPI分子通过转酰胺反应翻译后附着至蛋白质靶标，从而导致羧基末端GPI信号序列的切割(参见例如，Whit e等人(2000)J.Cell Sci.113:721)且同时将已合成的GPI锚分子转移至新形成的羧基末端氨基酸(参见例如，Varki A等人编辑.Essentialsof Glycobiol ogy.Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press；1999.第10章,Glycophospholipid Anchors.可从以下网址获得：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20711/，参见www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20711)。在某些实施方案中，所述膜缔合结构域是GPI信号序列。
在一些实施方案中，如本文提供的多聚化结构域连接至细胞内信号传导区，例如，初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，多聚化结构域在细胞外，并且经由跨膜结构域与细胞内信号传导区连接。在一些实施方案中，多聚化结构域在细胞内，并且经由跨膜结构域与配体(例如，抗原)结合结构域连接。配体结合结构域和跨膜结构域可以直接或间接连接。在一些实施方案中，配体结合结构域与跨膜通过间隔子(如本文所述的任一种)连接。在一些实施方案中，多聚化结构域是FK506结合蛋白(FKBP)或其衍生物或片段，如FKBP12v36。在一些例子中，在引入诱导物如rimiducid之后，可调节重组受体的多肽发生多聚化，例如，二聚化，从而刺激与多聚化结构域缔合的信号传导结构域并形成多聚复合物。多聚复合物的形成导致诱导、调节、刺激、激活、介导和/或促进经由细胞内信号传导区的信号。
在一些实施方案中，经由可调节重组受体的信号传导可以以条件方式经由条件多聚化来调节。例如，可调节重组受体的多肽的多聚化结构域可以结合诱导物以进行多聚化，并且诱导物可以从外源提供。在一些方面，在结合诱导物后，多聚化结构域发生多聚化并诱导、调节、激活、介导和/或促进经由信号传导结构域的信号传导。例如，可以从外源施用诱导物，从而控制提供至含有所述可调节重组受体的工程化细胞的信号的位置和持续时间。在一些实施方案中，可调节重组受体的多肽的多聚化结构域可以结合诱导物以进行多聚化，并且诱导物可以内源提供。例如，诱导物可以由工程化细胞(例如，工程化T细胞)在可诱导或条件启动子的控制下从重组表达载体或从所述工程化细胞的基因组内源产生，从而控制提供至含有可调节重组受体的工程化细胞的信号的位置和持续时间。
在一些实施方案中，使用自杀开关控制可调节重组受体。示例性重组受体利用可诱导半胱天冬酶-9(iCasp9)系统，包含人半胱天冬酶-9与修饰的FKBP二聚化结构域的融合物，从而允许与诱导物(例如，AP1903)结合后的条件二聚化。在通过结合诱导物进行二聚化之后，半胱天冬酶-9被激活并导致表达嵌合受体的细胞的细胞凋亡和细胞死亡(参见例如，Di Stasi等人(2011)N.Engl.J.Med.365:1673-1683)。
在一些实施方案中，示例性可调节重组受体包括：(1)可调节重组受体的第一多肽，其包含：(i)细胞内信号传导区；以及(ii)能够结合诱导物的至少一个多聚化结构域；以及(2)可调节重组受体的第二多肽，其包含：(i)配体(例如，抗原)结合结构域；(ii)跨膜结构域；以及(iii)能结合诱导物的至少一个多聚化结构域。在一些实施方案中，示例性可调节重组受体包括：(1)可调节重组受体的第一多肽，其包含：(i)跨膜结构域或酰化结构域；(ii)细胞内信号传导区；以及(iii)能结合诱导物的至少一个多聚化结构域；以及(2)可调节重组受体的第二多肽，其包含：(i)配体(例如，抗原)结合结构域；(ii)跨膜结构域；以及(iii)能结合诱导物的至少一个多聚化结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区还包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，第二多肽还包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，两个多肽上的至少一个多聚化结构域在细胞内。在一些实施方案中，两个多肽上的至少一个多聚化结构域在细胞外。
在一些实施方案中，示例性可调节重组受体包括：(1)可调节重组受体的第一多肽，其包含：(i)能结合诱导物的至少一个细胞外多聚化结构域；(ii)跨膜结构域；以及(iii)细胞内信号传导区；以及(2)可调节重组受体的第二多肽，其包含：(i)配体(例如，抗原)结合结构域；(ii)能结合诱导物的至少一个细胞外多聚化结构域，以及(iii)跨膜结构域、酰化结构域或GPI信号序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导区还包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，第二多肽还包含共刺激信号传导结构域。
在一些实施方案中，示例性可调节重组受体包括：(1)可调节重组受体的第一多肽，其包含：(i)跨膜结构域或酰化结构域；(ii)至少一个共刺激结构域；(iii)能够结合诱导物的多聚化结构域，以及(iv)细胞内信号传导区；以及(iii)至少一个共刺激结构域；以及(2)可调节重组受体的第二多肽，其包含：(i)配体(例如，抗原)结合结构域；(ii)跨膜结构域；(iii)至少一个共刺激结构域；以及(iv)能结合诱导物的至少一个细胞外多聚化结构域。
在一些方面，示例性可调节重组受体中所述的任何区域和/或结构域可以按多种不同顺序排序。在一些方面，一种或多种可调节重组受体的各种多肽含有在细胞膜同一侧上的多聚化结构域，例如，两种或更多种多肽中的多聚化结构域都在细胞内或都在细胞外。
可调节重组受体的变异是已知的，例如描述于以下文献中：美国专利申请公开号2014/0286987、美国专利申请公开号2015/0266973、国际专利申请公开号WO 2014/127261和国际专利申请公开号WO 2015/142675。
3.嵌合自身抗体受体(CAAR)
在一些实施方案中，重组受体是嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，CAAR结合(例如特异性结合)或识别自身抗体。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞(如工程化以表达CAAR的T细胞)可以用于结合至并杀伤表达自身抗体的细胞，而不是表达正常抗体的细胞。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以用于治疗与自身抗原的表达相关的自身免疫性疾病，例如自身免疫性疾病。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以靶向最终产生自身抗体并在其细胞表面上展示自身抗体的B细胞，将这些B细胞标记为用于治疗干预的疾病特异性靶标。在一些实施方案中，CAAR表达细胞可以用于通过使用抗原特异性嵌合自身抗体受体靶向引起疾病的B细胞，有效靶向并杀伤自身免疫性疾病中的致病性B细胞。在一些实施方案中，所述重组受体是CAAR，如美国专利申请公开号US 2017/0051035中所述的任何一种，所述申请通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，CAAR包含自身抗体结合结构域、跨膜结构域以及一个或多个细胞内信号传导区或结构域(也可互换地称为胞质信号传导结构域或区域)。在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中刺激和/或诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域(例如CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或区域或其功能变体或信号传导部分)和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
在一些实施方案中，自身抗体结合结构域包含自身抗原或其片段。自身抗原的选择可以取决于所靶向的自身抗体的类型。例如，可以因为自身抗原识别与特定疾病状态(例如自身免疫性疾病，如自身抗体介导的自身免疫性疾病)相关的靶细胞(如B细胞)上的自身抗体而选择所述自身抗原。在一些实施方案中，自身免疫性疾病包括寻常型天疱疮(PV)。示例性自身抗原包括桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)和Dsg3。
4.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，工程化细胞如T细胞表达识别靶多肽(如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的细胞内和/或肽表位或T细胞表位的T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分。在一些方面，重组受体是或包括重组TCR。
在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是如下分子，该分子含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)或其抗原结合部分，并且能够特异性结合与MHC分子结合的肽。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR的结构大体上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学位置或功能。TCR可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现TCR，在此处它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。
除非另有说明，否则术语“TCR”应当理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是小于全长TCR但结合至MHC分子中所结合的特定肽(如结合至MHC-肽复合物)的抗原结合部分。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR或其抗原结合片段的可变结构域(如TCR的可变α(Vα)链和可变β(Vβ)链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区(CDR)，它们通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，如与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见例如，Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者在给定TCR可变区上在三个CDR中对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合物的经处理肽部分的相互作用最重要。在一些情况下，α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情况下，β链的CDR1可以与肽的C末端部分相互作用。在一些情况下，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，β链的可变区可以含有另一高变区(CDR4或HVR4)，所述高变区通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)ClinicalMicrobiology Reviews,8:411-426)。
在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4:33页,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链(例如，α链或β链)的细胞外部分可以含有与细胞膜相邻的两个免疫球蛋白样结构域，如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常为基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences ofProteins of Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常为基于Kabat编号的链的位置117至259；或β链恒定结构域或Cβ，通常为基于Kabat的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可以在α链和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
在一些实施方案中，所述TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链含有胞质尾。在一些情况下，所述结构允许TCR与其他分子(像CD3)及其亚基缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并与CD3信号传导设备或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM。
在一些实施方案中，所述TCR含有各种结构域或区域。在一些情况下，确切的结构域或区域可以根据特定结构或同源性建模或者用于描述特定结构域的其他特征而变化。应理解，提及氨基酸(包括提及用于描述重组受体(例如，TCR)的结构域组织的作为SEQ ID NO所示的特定序列)是出于说明性目的，并且不意图限制所提供的实施方案的范围。在一些情况下，特定结构域(例如可变或恒定)可以长或短几个氨基酸(如一个、两个、三个或四个)。在一些方面，TCR的残基是已知的或者可以根据国际免疫遗传学信息系统(IMGT)编号系统来鉴定(参见例如，www.imgt.org；还参见Lefranc等人(2003)Developmental andComparative Immunology,2&；55-77；和The T Cell Factsbook第2版,Lefranc andLeFranc Academic Press 2001)。使用此系统，TCR Vα链和/或Vβ链内的CDR1序列对应于残基编号27-38之间(包含端值)存在的氨基酸，TCR Vα链和/或Vβ链内的CDR2序列对应于残基编号56-65之间(包含端值)存在的氨基酸，并且TCR Vα链和/或Vβ链内的CDR3序列对应于残基编号105-117之间(包含端值)存在的氨基酸。
在一些实施方案中，TCR的α链和β链各自还含有恒定结构域。在一些实施方案中，α链恒定结构域(Cα)和β链恒定结构域(Cβ)单独地是哺乳动物(如人或鼠)恒定结构域。在一些实施方案中，恒定结构域与细胞膜相邻。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自含有CDR。
在一些实施方案中，Cα和Cβ结构域中的每一个是人的。在一些实施方案中，Cα是由TRAC基因编码(IMGT命名法)，或者是其变体。在一些实施方案中，Cβ是由TRBC1或TRBC2基因编码(IMGT命名法)，或者是其变体。在一些实施方案中，任何所提供的TCR或其抗原结合片段可以是人/小鼠嵌合TCR。在一些情况下，TCR或其抗原结合片段具有包含小鼠恒定区的α链和/或β链。在一些方面，Cα和/或Cβ区是小鼠恒定区。在一些任何此类实施方案中，TCR或其抗原结合片段是由已经进行密码子优化的核苷酸序列编码。
在一些任何此类实施方案中，结合分子或TCR或其抗原结合片段是分离的或纯化的或者是重组的。在一些任何此类实施方案中，结合分子或TCR或其抗原结合片段是人的。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β的异二聚体，它是如通过一个或多个二硫键连接的。在一些实施方案中，TCR的恒定结构域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可以在α和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。在一些实施方案中，恒定和可变结构域中的每一个包含由半胱氨酸残基形成的二硫键。
在一些实施方案中，所述TCR可以是两条链α和β(或者任选γ和δ)的异二聚体，或者TCR可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有如通过一个或多个二硫键连接的两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体。
在一些实施方案中，所述TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα、Vβ链的序列)产生，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是可容易获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCRDNA序列的合成获得。
在一些实施方案中，重组受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。在一些实施方案中，从患者鉴定、分离靶抗原(例如，癌抗原)的高亲和力T细胞克隆，并将其引入细胞中。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生针对靶抗原的TCR克隆。参见例如，肿瘤抗原(参见例如，Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169-180和Cohen等人(2005)J Im munol.175:5799-5808)。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶标抗原的TCR(参见例如，Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390-1395和Li(2005)Nat Biotechnol.23:349-354)。
在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是经培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分或其抗原结合片段可以根据对所述TCR序列的知识以合成方式产生。
在一些实施方案中，所述TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR产生的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ库来生成，所述T细胞是从受试者中分离的，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，TCR文库可以从CD4+或CD8+细胞产生。在一些实施方案中，TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常TCR文库。在一些实施方案中，TCR可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即，患病TCR文库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如在从人获得的样品(如T细胞)中通过RT-PCR扩增。在一些实施方案中，文库如单链TCR(scTv)文库可以从幼稚Vα和Vβ文库组装，其中扩增产物被克隆或组装以由接头隔开。根据受试者和细胞的来源，所述文库可以是HLA等位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱变或多样化产生。
在一些方面，使TCR经受例如α或β链的定向进化，如通过诱变来进行。在一些方面，TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰经选择的TCR。在一些实施方案中，可以如通过筛选以评估针对肽的CTL活性来选择抗原特异性T细胞。在一些方面，可以选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR，如通过对抗原的结合活性(例如特定亲和力或亲合力)来选择。
在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合部分是已经被修饰或工程化的。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性(如对特定MHC-肽复合物具有较高亲和力)的TCR。在一些实施方案中，通过展示方法实现定向进化，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl AcadSci USA,97,5387-92)；噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示方法涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生经诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原，其可以是神经胶质瘤相关抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、B细胞成熟抗原(BCM A、BCM)、B细胞激活因子受体(BAFFR、BR3)、和/或跨膜激活剂和CAML相互作用子(TACI)、Fc受体样5(FCRL5、FcRH5)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、黑色素-A/MART-1、WT-1、S-100、MBP、CD63、MUC1(例如MUC1-8)、p53、Ras、细胞周期蛋白B1、HER-2/neu、癌胚抗原(CEA)、gp100、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A11、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-C1、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)、β-连环蛋白、NY-ESO-1、LAGE-1a、PP1、MDM2、MDM4、EGVFvIII、Tax、SSX2、端粒酶、TARP、pp65、CDK4、波形蛋白、S100、eIF-4A1、IFN诱导型p78、和黑素转铁蛋白(p97)、尿路斑块蛋白II、前列腺特异性抗原(PSA)、人激肽释放酶(huK2)、前列腺特异性膜抗原(PSM)、和前列腺酸性磷酸酶(PAP)、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、BA-46、β-连环蛋白、Bcr-abl、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、半胱天冬酶8或B-Raf抗原。其他肿瘤抗原可以包括源自以下的任何抗原：FRa、CD24、CD44、CD133、CD 166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、雌激素受体、孕酮受体、uPA、PAI-1、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、GD-2、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II和IGF-I受体。特定肿瘤相关抗原或T细胞表位是已知的(参见例如，van derBruggen等人(2013)Cancer Immun,可在www.cancerimmunity.org/peptide/获得；Cheever等人(2009)Clin Cancer Res,15,5323-37)。
在一些实施方案中，抗原是病毒抗原。多种病毒抗原靶标已经被鉴定并且是已知的，包括源自HIV、HTLV和其他病毒的病毒基因组的肽(参见例如，Addo等人(2007)PLoSONE,2,e321；Tsomides等人(1994)JExp Med,180,1283-93；Utz等人(1996)J Virol,70,843-51)。示例性病毒抗原包括但不限于来自以下的抗原：甲型肝炎、乙型肝炎(例如，HBV核心和表面抗原(HBVc、HBV))、丙型肝炎(HCV)、EB病毒(例如EBVA)、人乳头瘤病毒(HPV；例如，E6和E7)、人免疫缺陷1型病毒(HIV1)、卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感病毒、拉沙病毒、HTLN-1、HIN-1、HIN-II、CMN、EBN或HPN。在一些实施方案中，靶蛋白是细菌抗原或其他致病性抗原，如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MT)抗原、锥虫(例如，克氏锥虫(Tiypansoma cruzi，T.cruzi))抗原如表面抗原(TSA)、或疟疾抗原。特定病毒抗原或表位或其他致病性抗原或T细胞表位是已知的(参见例如，Addo等人(2007)PLoSONE,2:e321；Anikeeva等人(2009)Clin Immunol,130:98-109)。
在一些实施方案中，抗原是源自与癌症相关的病毒(如致癌病毒)的抗原。例如，致癌病毒是如下病毒，其中已知某些病毒的感染会导致发生不同类型的癌症，例如甲型肝炎、乙型肝炎(例如，HBV核心和表面抗原(HBVc、HBV))、丙型肝炎(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒感染、EB病毒(EBV)、人疱疹病毒8(HHV-8)、人T细胞白血病病毒-1(HTLV-1)、人T细胞白血病病毒-2(HTLV-2)或巨细胞病毒(CMV)抗原。
在一些实施方案中，病毒抗原是HPV抗原，其在一些情况下可以导致发生宫颈癌的风险更大。在一些实施方案中，抗原可以是HPV-16抗原、和HPV-18抗原、和HPV-31抗原、HPV-33抗原或HPV-35抗原。在一些实施方案中，病毒抗原是HPV-16抗原(例如，HPV-16的E1、E2、E6和/或E7蛋白的血清反应区，参见例如，美国专利号6,531,127)或HPV-18抗原(例如，HPV-18的L1和/或L2蛋白的血清反应区，如美国专利号5,840,306中所述)。在一些实施方案中，病毒抗原是来自HPV-16的E6和/或E7蛋白的HPV-16抗原。在一些实施方案中，TCR是针对HPV-16E6或HPV-16E7的TCR。在一些实施方案中，TCR是例如WO 2015/184228、WO 2015/009604和WO 2015/009606中所述的TCR。
在一些实施方案中，病毒抗原是HBV或HCV抗原，其在一些情况下可以导致比HBV或HCV阴性受试者更高的患上肝癌的风险。例如，在一些实施方案中，异源抗原是HBV抗原，如乙型肝炎核心抗原或乙型肝炎包膜抗原(US2012/0308580)。
在一些实施方案中，病毒抗原是EBV抗原，其在一些情况下可以导致比EBV阴性受试者更高的患上伯基特淋巴瘤、鼻咽癌和霍奇金氏病的风险。例如，EBV是在一些情况下发现与许多不同组织来源的人类肿瘤相关的人疱疹病毒。虽然主要发现为无症状感染，但是EBV阳性肿瘤的特征在于病毒基因产物(如EBNA-1、LMP-1和LMP-2A)的活跃表达。在一些实施方案中，异源抗原是EBV抗原，其可以包括爱泼斯坦-巴尔核抗原(Epstein-Barr nuclearantigen，EBNA)-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-前导蛋白(EBNA-LP)，潜伏膜蛋白LMP-1、LMP-2A和LMP-2B，EBV-EA、EBV-MA或EBV-VCA。
在一些实施方案中，病毒抗原是HTLV-1或HTLV-2抗原，其在一些情况下可以导致比HTLV-1或HTLV-2阴性受试者更高的患上T细胞白血病的风险。例如，在一些实施方案中，异源抗原是HTLV抗原，如TAX。
在一些实施方案中，病毒抗原是HHV-8抗原，其在一些情况下可以导致比HHV-8阴性受试者更高的患上卡波西肉瘤的风险。在一些实施方案中，异源抗原是CMV抗原，如pp65或pp64(参见美国专利号8361473)。
在一些实施方案中，抗原是自身抗原，如与自身免疫性疾病或障碍相关的多肽的抗原。在一些实施方案中，自身免疫性疾病或障碍可以是多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎(RA)、舍格伦综合征、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、系统性红斑狼疮、幼年型类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、重症肌无力(MG)、大疱性类天疱疮(针对真皮-表皮接合部的基膜的抗体)、天疱疮(针对粘多糖蛋白复合物或细胞内粘合质的抗体)、肾小球肾炎(针对肾小球基膜的抗体)、肺出血肾炎综合征、自身免疫溶血性贫血(针对红细胞的抗体)、桥本病(针对甲状腺的抗体)、恶性贫血(针对内因子的抗体)、特发性血小板减少性紫癜(针对血小板的抗体)、格雷夫斯病或艾迪生病(针对甲状腺球蛋白的抗体)。在一些实施方案中，自身抗原(如与前述自身免疫性疾病中的一种相关的自身抗原)可以是胶原蛋白(如II型胶原蛋白)、分枝杆菌热激蛋白、甲状腺球蛋白、乙酰胆碱受体(AcHR)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)或蛋白脂质蛋白(PLP)。特定自身免疫相关表位或抗原是已知的(参见例如，Bulek等人(2012)NatImmunol,13:283-9；Harkiolaki等人(2009)Immunity,30:348-57；Skowera等人(2008)JClin Invest,1(18):3390-402)。
在一些实施方案中，用于产生或生成目的TCR的靶多肽的肽是已知的或者可以容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于产生TCR或抗原结合部分的肽可以基于目的靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使用可用的计算机预测模型来鉴定肽。在一些例子中，使用电脑预测模型的蛋白酶体和免疫蛋白酶体的HLA-A0201结合基序和切割位点是已知的。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinfor matics 17(12):1236-1237)；和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immuno informatics Methods inMolecular Biology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其在所有高加索人的大约39％-46％中表达，并且因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结合分子的MHC抗原的合适选择。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白或其突变形式，其中一种或多种特性(如结合特征)已发生改变。在一些实施方案中，TCR可以源自多个动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，TCR呈在细胞表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，重组TCR是全长TCR。在一些实施方案中，重组TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，所述TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR是单链TCR(scTCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如例如以下文献中所述的结构：国际专利申请公开号WO 03/020763、WO 04/033685和WO 2011/044186。
在一些实施方案中，重组TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，TCR能够与CD3形成TCR复合物。在一些实施方案中，任何重组TCR(包括dTCR或scTCR)可以与信号传导结构域连接，从而在T细胞表面上产生活性TCR。在一些实施方案中，重组TCR在细胞表面上表达。在含有引入的或工程化的链间二硫键的dTCR或scTCR的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸被取代为另一种残基，如丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，引入的或工程化的二硫键可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成。TCR的示例性非天然二硫键描述于已公开的国际PCT号WO 2006/000830中。
在某些实施方案中，TCR含有一个或多个修饰，以引入能够在TCRα链与TCRβ链之间形成一个或多个非天然二硫桥的一个或多个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，TCR含有TCRα链或其部分，所述TCRα链或其部分含有具有一个或多个半胱氨酸残基的TCRα恒定结构域，所述半胱氨酸残基能够与TCRβ链形成非天然二硫键。在一些实施方案中，转基因编码TCRβ链或其部分，所述TCRβ链或其部分含有具有一个或多个半胱氨酸残基的TCRβ恒定结构域，所述半胱氨酸残基能够与TCRα链形成非天然二硫键。在一些实施方案中，TCR包含TCRα和/或TCRβ链和/或TCRα和/或TCRβ链恒定结构域，其含有一个或多个修饰以引入一个或多个二硫键。在一些实施方案中，转基因编码TCRα和/或TCRβ链和/或TCRα和/或TCRβ，其具有一个或多个修饰以例如在转基因的TCRα与内源TCRβ链之间或在转基因的TCRβ与内源TCRα链之间，去除或防止天然二硫键。在一些实施方案中，形成和/或能够形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸被取代为另一残基，例如丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，参考TCRα恒定结构域的编号，在残基Thr48、Thr45、Tyr10、Thr45和Ser15中的一个或多个处引入半胱氨酸。在某些实施方案中，可以在TCRβ链恒定结构域的残基Ser57、Ser77、Ser17、Asp59或Glu15处引入半胱氨酸。TCR的示例性非天然二硫键描述于以下文献中：公开的国际PCT号WO 2006/000830、WO 2006/037960和Kuball等人(2007)Blood,109:2331-2338。
在一些实施方案中，重组TCR是二聚TCR(dTCR)。在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽，其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合；以及第二多肽，其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合，所述第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚体αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，链间二硫键在天然TCR中不存在。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。在一些实施方案中，所述TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链，所述TCRα链含有可变α结构域、恒定α结构域和附着至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序；以及TCRβ链，所述TCRβ链包含可变β结构域、恒定β结构域和附着至恒定β结构域C末端的第一二聚化基序，其中所述第一和第二二聚化基序相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与TCRβ链连接在一起。
在一些实施方案中，重组TCR是单链TCR(scTCR或scTv)。通常，scTCR可以使用已知方法来产生，参见例如，Soo Hoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C.和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)90 3830(1993)；国际专利申请公开号WO 96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO2011/044186；以及Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，所述scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见例如，国际专利申请公开号WO 03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C末端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如，国际专利申请公开号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有经由肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际专利申请公开号WO 99/18129)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成)、第二区段(由与对应于TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成)和接头序列(将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR的连接第一和第二TCR区段的接头可以是能够形成单一多肽链同时保留TCR结合特异性的任何接头。在一些实施方案中，所述接头序列可以例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，所述第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因此，在一些情况下，所述接头具有足够的长度以跨越所述第一区段的C末端与所述第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长以阻断或减少所述scTCR与所述靶配体的结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有从或从约10至45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头具有式-PGGG-(SGGGG)5-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，并且S是丝氨酸(SEQ ID NO:22)。在一些实施方案中，所述接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:23)
在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，其将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段展现对靶抗原具有如下平衡解离常数(KD)的亲和力：在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
B.核酸、载体和用于基因工程化的方法
在一些实施方案中，将细胞(例如T细胞)基因工程化以表达重组受体。在一些实施方案中，工程化是通过引入编码重组受体或其部分或组分的一种或多种多核苷酸来进行。还提供编码重组受体的多核苷酸，以及含有此类核酸和/或多核苷酸的载体或构建体。
在一些实施方案中，编码重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组受体的表达。在一些例子中，多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组受体的表达。在一些实施方案中，多核苷酸可以含有对引入所述多核苷酸的宿主的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性的调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，酌情并考虑所述多核苷酸是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，多核苷酸可以含有调节/控制元件，如启动子、增强子、内含子、多腺苷酸化信号、Kozak共有序列、内部核糖体进入位点(IRES)、2A序列和剪接受体或供体。在一些实施方案中，多核苷酸可以含有与编码重组受体和/或一种或多种另外的多肽的核苷酸序列可操作地连接的非天然启动子。在一些实施方案中，启动子选自RNA pol I、polII或pol III启动子。在一些实施方案中，启动子由RNA聚合酶II识别(例如CMV、SV40早期区域或腺病毒主要晚期启动子)。在另一个实施方案中，启动子由RNA聚合酶III识别(例如U6或H1启动子)。在一些实施方案中，启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还设想其他已知的启动子。
在一些实施方案中，启动子是或包含组成型启动子。示例性组成型启动子包括例如猿病毒40早期启动子(SV40)、巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、人泛素C启动子(UBC)、人延伸因子1α启动子(EF1α)、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)、和与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在一些实施方案中，组成型启动子是合成的或修饰的启动子。在一些实施方案中，所述启动子是或包含MND启动子，它是一种合成启动子，含有修饰的MoMuLV LTR的U3区和骨髓增生性肉瘤病毒增强子(参见Challita等人(1995)J.Virol.69(2):748-755)。在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子。在另一个实施方案中，启动子是病毒启动子。在另一个实施方案中，启动子是非病毒启动子。在一些实施方案中，示例性启动子可以包括但不限于人延伸因子1α(EF1α)启动子或其修饰形式或MND启动子。
在另一个实施方案中，启动子是受调节的启动子(例如诱导型启动子)。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子或阻抑型启动子。在一些实施方案中，启动子包含Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列，或者是其类似物或能够由Lac阻遏因子或四环素阻遏因子或其类似物结合或识别。在一些实施方案中，多核苷酸不包括调节元件，例如，启动子。
在一些情况下，编码所述重组受体的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，所述信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，信号序列可以编码异源或非天然信号肽，例如SEQ ID NO:25所示并且由SEQ ID NO:24所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链的示例性信号肽。在一些情况下，编码重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。非限制性示例性的信号肽包括例如SEQ ID NO:25所示的并且由SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽，或SEQ ID NO:26所示的CD8α信号肽。
在一些实施方案中，多核苷酸含有编码一种或多种另外的多肽(例如一种或多种标记和/或一种或多种效应分子)的核酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种标记包括转导标记、替代标记和/或选择标记。所引入的例如编码一种或多种另外的多肽的另外的核酸序列包括：可以例如通过促进所转移细胞的活力和/或功能来改善疗法的功效的核酸序列；提供用于选择和/或评价细胞(如评估体内存活或定位)的遗传标记的核酸序列；例如通过使细胞对体内阴性选择敏感来提高安全性的核酸序列，如以下文献中所述：LuptonS.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)；还参见WO 1992008796和WO 1994028143(描述源自将显性阳性可选标记与阴性可选标记融合的双功能可选融合基因的用途)，以及美国专利号6,040,177。
在一些实施方案中，所述标记是转导标记或替代标记。转导标记或替代标记可用于检测已经引入多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，所述转导标记可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记是经制备在细胞表面上与重组受体(例如，CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标记是已经修饰以具有极少活性或无活性的表面蛋白。在一些实施方案中，替代标记是在编码重组受体的相同多核苷酸上编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地由内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自我切割肽或引起核糖体跳跃的肽如2A序列的核酸隔开。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞结合用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还用于促进细胞消除和/或细胞自杀。
示例性替代标记可以包括细胞表面多肽的截短的形式，如以下截短的形式，其是非功能性的，并且不转导或不能转导信号或通常由细胞表面多肽的全长形式转导的信号，和/或不内化或不能内化。示例性截短的细胞表面多肽包括生长因子或其他受体的截短形式，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，SEQ ID NO:7或16所示的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式(如截短的PSMA(tPSMA))。在一些方面，tEGFR可以含有抗体西妥昔单抗
Figure BDA0003008592730002761
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和编码的外源蛋白质工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，所述标记(例如替代标记)包括全部或部分(例如，截短形式)的CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如，截短的非人CD19)。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7或16展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述标记是或包含可检测蛋白，如荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体、密码子优化的、稳定的和/或增强的变体。在一些实施方案中，所述标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌(E.coli)的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或其变体。在一些方面，所述酶的表达可以通过添加底物来检测，所述底物可以根据所述酶的表达和功能活性来检测。
在一些实施方案中，所述标记是选择标记。在一些实施方案中，所述选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，所述选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，所述选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其经修饰形式。
本文所述的重组受体和/或一种或多种另外的多肽中的任一种可以由一种或多种多核苷酸编码，所述多核苷酸含有呈任何组合、定向或排列的编码重组受体的一个或多个核酸序列。例如，一种、两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同多肽(例如，重组受体或其部分或组分)和/或一种或多种另外的多肽(例如，标记和/或效应分子)。在一些实施方案中，一种多核苷酸含有编码重组受体(例如，CAR)或其部分或组分的核酸序列，以及编码一种或多种另外的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码重组受体(例如，CAR)或其部分或组分的核酸序列，并且单独载体或构建体含有编码一种或多种另外的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列和编码一种或多种另外的多肽的核酸序列可操作地连接至两种不同启动子。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码一种或多种另外的多肽的核酸的上游。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码一种或多种另外的多肽的核酸的下游。
在某些情况下，一种多核苷酸含有的核酸序列编码两种或更多种不同多肽链，例如，重组受体和一种或多种另外的多肽，例如，标记和/或效应分子。在一些实施方案中，编码两种或更多种不同多肽链(例如，重组受体和一种或多种另外的多肽)的核酸序列存在于两种单独多核苷酸中。例如，提供两种单独多核苷酸，并且每一种可以单独地转移至或引入细胞中以供在细胞中表达。在一些实施方案中，编码标记的核酸序列和编码重组受体的核酸序列存在于或插入于细胞基因组内的不同位置。在一些实施方案中，编码标记的核酸序列和编码重组受体的核酸序列可操作地连接至两种不同启动子。
在一些实施方案中，如多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码不同多肽链中的每一种的编码序列可以与相同或不同的启动子操作性地连接。在一些实施方案中，所述核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列和编码一种或多种另外的多肽的核酸序列可操作地连接至相同启动子，并且任选地由内部核糖体进入位点(IRES)或者编码自我切割肽或引起核糖体跳跃的肽如2A元件的核酸隔开。例如，示例性标记和任选的核糖体跳跃序列可以是PCT公开号WO2014031687中披露的任一种。
在一些实施方案中，可以将转录单元工程化为含有IRES的双顺反子单元，其允许基因产物(例如编码重组受体和另外的多肽)通过来自单一启动子的信息共表达。可替代地，在一些情况下，单一启动子可引导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码标记和编码重组受体)，所述基因由编码自切割肽(例如，2A序列)或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶)的序列彼此隔开。ORF由此编码单一多肽，所述多肽在翻译期间(在2A的情况下)或在翻译后被加工为单独蛋白质。在一些情况下，肽(如T2A)可以引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，从而导致2A序列末端与下游的下一个肽之间隔开(参见例如，de Felipe,Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)以及de Felipe等人Traffic 5:616-626(2004))。各种2A元件是已知的。可以用于本文所公开的方法和系统中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如，SEQ ID NO:21)、马鼻炎A病毒(E2A，例如，SEQ ID NO:20)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如，SEQ ID NO:6或17)和猪捷申病毒-1(P2A，例如，SEQ ID NO:18或19)，如美国专利公开号20070116690中所述。
在一些实施方案中，编码重组受体和/或另外的多肽的多核苷酸含于载体中或可以被克隆至一种或多种载体中。在一些实施方案中，所述一种或多种载体可以用于转化或转染宿主细胞，例如用于工程化的细胞。示例性载体包括设计用于引入、增殖和扩增或用于表达或用于两者的载体，如质粒和病毒载体。在一些方面，载体是表达载体，例如，重组表达载体。在一些实施方案中，可以使用标准重组DNA技术来制备所述重组表达载体。
在一些实施方案中，载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕罗奥图)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。
在一些实施方案中，载体是病毒载体，如逆转录病毒载体。在一些实施方案中，将编码重组受体和/或一种或多种另外的多肽的多核苷酸经由逆转录病毒或慢病毒载体或者经由转座子引入细胞中(参见例如，Baum等人(2006)Molecular Therapy:The Journal ofthe American Society of Gene Therapy.13:1050-1063；Frecha等人(2010)MolecularTherapy 18:1748–1757；以及Hackett等人(2010)Molecular Therapy 18:674–683)。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(如例如，源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将一种或多种多核苷酸引入细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将一种或多种多核苷酸引入T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550-557)。
在一些实施方案中，所述载体是逆转录病毒载体。在一些方面，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，要表达的基因替代逆转录病毒gag、p ol和/或env序列。已经描述了多种说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.US A 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Devel op.3:102-109)。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。在一些实施方案中，如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码重组受体和/或一种或多种另外的多肽的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。
在一些实施方案中，使用电穿孔将一种或多种多核苷酸引入T细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；以及Van Tedeloo等人(2000)GeneTherapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移至T细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec TherNucl Acids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在一些方面，可以使用基于转座子的系统来引入包括重组蛋白的多核苷酸，如基于PiggyBac或SleepingBeauty的基因转移系统。在免疫细胞中引入并表达遗传物质(例如，多核苷酸和/或载体)的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,纽约州纽约市中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))以及例如国际专利申请公开号WO 2014055668和美国专利号7,446,190中所述的其他方法。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后将编码重组受体和/或一种或多种另外的多肽的一种或多种多核苷酸或载体引入细胞(例如，T细胞)中。例如，一种或多种多核苷酸或载体的该引入可以用任何合适的逆转录病毒载体来进行。然后可以使所得基因工程化细胞摆脱初始刺激物(例如，抗CD3/抗CD28刺激物)，随后在第二种类型的刺激物(例如，经由从头引入的重组受体)的存在下进行刺激。该第二种类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然抗原和/或配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66；或Barrett等人,Chimeric Antigen ReceptorTherapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些这样的情况下，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在培养的至少一部分的同时或期间将细胞工程化。
IV.治疗方法
本文提供治疗方法，例如，包括施用任何本文所述的工程化细胞或含有工程化细胞的组合物。在一些方面，还提供将任何本文所述的工程化细胞或含有工程化细胞的组合物施用至受试者(如患有疾病或障碍的受试者)的方法。在一些方面，还提供任何本文所述的工程化细胞或含有工程化细胞的组合物用于治疗疾病或障碍的用途。在一些方面，还提供任何本文所述的工程化细胞或含有工程化细胞的组合物用于制造用以治疗疾病或障碍的药物的用途。在一些方面，还提供任何本文所述的工程化细胞或含有工程化细胞的组合物，用于治疗疾病或障碍，或者用于施用至患有疾病或障碍的受试者。
用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如以下文献中：Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat RevClin Oncol.8(10):577-85。参见例如，Kindt等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE8(4):e61338。
所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病、病症或障碍的病因相关和/或参与所述病因，例如引起、加重或以其他方式参与这种疾病、病症或障碍。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如癌症)、自身免疫性疾病或炎性疾病或例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病或病症。上文描述了示例性抗原，其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在特定实施方案中，所述嵌合抗原受体或转基因TCR特异性结合至与所述疾病或病症相关的抗原。
疾病、病症和障碍包括肿瘤，包括实体瘤、血液恶性肿瘤和黑色素瘤，并且包括局部和转移性肿瘤；感染性疾病，如病毒或其他病原体的感染，例如HIV、HCV、HBV、CMV、HPV和寄生虫病；以及自身免疫性和炎性疾病。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、肿疡或其他增殖性疾病或障碍。此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如，急性髓样(或髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或成淋巴细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，疾病或病症是选自以下的B细胞恶性肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是NHL，并且NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)(任选地3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B))。
在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症，如关节炎(例如类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
在一些实施方案中，与疾病或障碍相关的抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，所述受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任一种。在一些实施方案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特有的或病原体表达的抗原，如病毒抗原(例如，来自HIV、HCV、HBV的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如scFv或VH结构域)特异性识别抗原，如CD19。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段源自特异性结合CD19的抗体或抗原结合片段，或者是所述抗体或抗原结合片段的变体。在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中从接受细胞疗法的受试者或从源自这种受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，所述细胞来源于需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和处理后将所述细胞施用至同一受试者。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将细胞施用于相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超型。
可以将所述细胞通过任何合适的方式施用，例如通过推注输注，通过注射例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜(posteriorjuxtascleral)递送。在一些实施方案中，将它们通过肠胃外、肺内和鼻内以及(如果局部治疗需要)病灶内施用来施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量是通过所述细胞的单次推注施用来施用。在一些实施方案中，给定剂量通过例如在不超过3天的时间段内细胞的多次推注施用，或通过细胞的连续输注施用来施用。在一些实施方案中，细胞剂量或任何其他疗法(例如，淋巴细胞清除疗法、干预疗法和/或组合疗法)的施用是通过门诊递送进行的。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于要治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、是针对预防目的还是针对治疗目的而施用细胞、先前治疗、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，将所述组合物和细胞以合适的方式一次或经一系列治疗施用于所述受试者。
在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分施用，如与另一种治疗性干预(如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂))同时施用或以任何顺序依序施用。在一些实施方案中，所述细胞与一种或多种另外的治疗剂共施用或与另一种治疗性干预结合施用(同时或以任何顺序依序施用)。在一些情况下，将所述细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共施用，使得所述细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，在所述一种或多种另外的治疗剂之前施用细胞。在一些实施方案中，所述细胞在一种或多种另外的治疗剂之后施用。在一些实施方案中，一种或多种另外的药剂包括细胞因子如IL-2，以例如增强持久性。在一些实施方案中，所述方法包括施用化学治疗剂。
在一些实施方案中，所述方法包括在所述施用之前施用化学治疗剂(例如，调理性化学治疗剂)，例如以减小肿瘤负荷。
在一些方面，用免疫清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预调理受试者可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。
因此，在一些实施方案中，所述方法包括在开始所述细胞疗法之前将预调理剂施用至受试者，所述预调理剂如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在开始所述细胞疗法之前至少2天(如之前至少3、4、5、6或7天)，向所述受试者施用预调理剂。在一些实施方案中，在开始所述细胞疗法之前不超过7天(如之前不超过6、5、4、3或2天)，向所述受试者施用预调理剂。
在一些实施方案中，用环磷酰胺以在或在约20mg/kg与100mg/kg之间，如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量对所述受试者进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺对所述受试者进行预调理。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，每天一次施用环磷酰胺，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺的情况下，按以下剂量向受试者施用环磷酰胺：在或在约100mg/m2与500mg/m2之间，如在或在约200mg/m2与400mg/m2之间，或者250mg/m2与350mg/m2之间，包含端值。在一些情形中，向所述受试者施用约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，每天施用环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在开始所述细胞疗法之前，每天向所述受试者施用约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方案中，当淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨时，向所述受试者施用剂量在或在约1mg/m2与100mg/m2之间、如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与40mg/m2之间、或24mg/m2与35mg/m2之间的氟达拉滨(包含端值)。在一些情形中，向受试者施用约30mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，氟达拉滨可以按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每天给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，每天施用氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在开始所述细胞疗法之前，每天向所述受试者施用约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方案中，所述淋巴细胞清除剂包含药剂组合，如环磷酰胺与氟达拉滨的组合。因此，所述药剂组合可以包括任何剂量或施用时间表(如上文所述的那些)的环磷酰胺，以及任何剂量或施用时间表(如上文所述的那些)的氟达拉滨。例如，在一些方面，在第一剂量或后续剂量之前，向受试者施用60mg/kg(约2g/m2)的环磷酰胺和3至5次剂量的25mg/m2氟达拉滨。
在一些实施方案中，在施用细胞后，例如通过许多已知方法中的任一种测量工程化细胞群的生物学活性。要评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用任何合适的已知方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)；和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面，生物学活性是通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量。
在某些实施方案中，将工程化细胞以任何数量的方式进一步修饰，使得其治疗或预防功效增加。例如，可以将所述群体表达的工程化CAR或TCR直接或通过接头间接缀合至靶向部分。将化合物(例如，CAR或TCR)与靶向部分缀合的实践是已知的。参见例如，Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:1 1 1(1995)和美国专利5,087,616。
在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分施用，如与另一种治疗性干预(如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂))同时施用或以任何顺序依序施用。在一些实施方案中，所述细胞与一种或多种另外的治疗剂共施用或与另一种治疗性干预结合施用(同时或以任何顺序依序施用)。在一些情况下，将所述细胞与另一种疗法在时间上足够接近地共施用，使得所述细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施方案中，在所述一种或多种另外的治疗剂之前施用细胞。在一些实施方案中，所述细胞在一种或多种另外的治疗剂之后施用。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的药剂包括细胞因子(如IL-2)，例如以增强持久性。
A.给药
在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物将一定剂量的细胞施用至受试者。在一些实施方案中，所述剂量的大小或时间安排是根据所述受试者的特定疾病或病症来确定。在一些情况下，可以根据所提供的描述凭经验确定用于特定疾病的剂量的大小或时间安排。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞包含在为或约2x105个细胞/kg与为或约2x106个细胞/kg之间，如在为或约4x105个细胞/kg与为或约1x106个细胞/kg之间或在为或约6x105个细胞/kg与为或约8x105个细胞/kg之间。在一些实施方案中，所述剂量的细胞包含不超过2x105个细胞(例如抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如不超过或不超过约3x105个细胞/kg、不超过或不超过约4x105个细胞/kg、不超过或不超过约5x105个细胞/kg、不超过或不超过约6x105个细胞/kg、不超过或不超过约7x105个细胞/kg、不超过或不超过约8x105个细胞/kg、不超过或不超过约9x105个细胞/kg、不超过或不超过约1x106个细胞/kg、或不超过或不超过约2x106个细胞/kg。在一些实施方案中，所述剂量的细胞包含至少或至少约或为或约2x105个细胞(例如抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如至少或至少约或为或约3x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约4x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约5x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约6x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约7x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约8x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约9x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约1x106个细胞/kg、或至少或至少约或为或约2x106个细胞/kg。
在某些实施方案中，所述细胞或细胞的亚型的单独群体是以约100万至约1000亿个细胞和/或按每公斤体重该细胞量的范围施用至受试者，如例如100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值定义的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。
在一些实施方案中，细胞的剂量是细胞的平稳剂量或细胞的固定剂量，使得细胞的所述剂量与受试者的体表面积或体重无关或不基于受试者的体表面积或体重。
在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，剂量包括少于约5x108个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如在约1x106到5x108个此类细胞的范围内，如2x106、5x106、1x107、5x107、1x108或5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从或从约1x105至5x108个总CAR表达T细胞、1x105至2.5x108个总CAR表达T细胞、1x105至1x108个总CAR表达T细胞、1x105至5x107个总CAR表达T细胞、1x105至2.5x107个总CAR表达T细胞、1x105至1x107个总CAR表达T细胞、1x105至5x106个总CAR表达T细胞、1x105至2.5x106个总CAR表达T细胞、1x105至1x106个总CAR表达T细胞、1x106至5x108个总CAR表达T细胞、1x106至2.5x108个总CAR表达T细胞、1x106至1x108个总CAR表达T细胞、1x106至5x107个总CAR表达T细胞、1x106至2.5x107个总CAR表达T细胞、1x106至1x107个总CAR表达T细胞、1x106至5x106个总CAR表达T细胞、1x106至2.5x106个总CAR表达T细胞、2.5x106至5x108个总CAR表达T细胞、2.5x106至2.5x108个总CAR表达T细胞、2.5x106至1x108个总CAR表达T细胞、2.5x106至5x107个总CAR表达T细胞、2.5x106至2.5x107个总CAR表达T细胞、2.5x106至1x107个总CAR表达T细胞、2.5x106至5x106个总CAR表达T细胞、5x106至5x108个总CAR表达T细胞、5x106至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x106至1x108个总CAR表达T细胞、5x106至5x107个总CAR表达T细胞、5x106至2.5x107个总CAR表达T细胞、5x106至1x107个总CAR表达T细胞、1x107至5x108个总CAR表达T细胞、1x107至2.5x108个总CAR表达T细胞、1x107至1x108个总CAR表达T细胞、1x107至5x107个总CAR表达T细胞、1x107至2.5x107个总CAR表达T细胞、2.5x107至5x108个总CAR表达T细胞、2.5x107至2.5x108个总CAR表达T细胞、2.5x107至1x108个总CAR表达T细胞、2.5x107至5x107个总CAR表达T细胞、5x107至5x108个总CAR表达T细胞、5x107至2.5x108个总CAR表达T细胞、5x107至1x108个总CAR表达T细胞、1x108至5x108个总CAR表达T细胞、1x108至2.5x108个总CAR表达T细胞或2.5x108至5x108个总CAR表达T细胞。在一些实施方案中，基因工程化T细胞的剂量是或含有少于50x106个总CAR表达T细胞。在某些实施方案中，所述剂量是或含有少于25x106个总CD4+CAR表达T细胞。在各种实施方案中，所述剂量是或含有少于25x106个总CD8+CAR表达T细胞。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含至少或至少约1x105个表达CAR的细胞、至少或至少约2.5x105个表达CAR的细胞、至少或至少约5x105个表达CAR的细胞、至少或至少约1x106个表达CAR的细胞、至少或至少约2.5x106个表达CAR的细胞、至少或至少约5x106个表达CAR的细胞、至少或至少约1x107个表达CAR的细胞、至少或至少约2.5x107个表达CAR的细胞、至少或至少约5x107个表达CAR的细胞、至少或至少约1x108个表达CAR的细胞、至少或至少约2.5x108个表达CAR的细胞、或者至少或至少约5x108个表达CAR的细胞。
在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下细胞数量：从或从约1x105至5x108个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，从或从约5x105至1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)或者从或从约1x106至1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述细胞疗法包括施用一定剂量的细胞，所述剂量包含如下细胞数量：至少或至少约1x105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，如至少或至少1x106、至少或至少约1x107、至少或至少约1x108个此类细胞。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+、CD4+或CD8+的总数量，在一些情况下还关于重组受体表达(例如CAR+)细胞。在一些实施方案中，细胞疗法包括使用一定剂量，所述剂量包含如下细胞数量：从或从约1x105至5x108个CD3+或CD8+总T细胞或者CD3+或CD8+重组受体表达细胞、从或从约5x105至1x107个CD3+或CD8+总T细胞或者CD3+或CD8+重组受体表达细胞或者从或从约1x106至1x107个CD3+或CD8+总T细胞或者CD3+或CD8+重组受体表达细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用一定剂量，所述剂量包含如下细胞数量：从或从约1x105至5x108个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、从或从约5x105至1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、或从或从约1x106至1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如，如果受试者是人，那么所述剂量(包括在包括CD4+和CD8+T细胞的剂量中)的CD8+T细胞包括在约1x106与5x108个之间的总重组受体(例如CAR)表达CD8+细胞，例如，在约5x106至1x108个此类细胞的范围内，例如1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108或5x108个总此类细胞，或在任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞剂量包括施用从或从约1x107至0.75x108个总重组受体表达CD8+T细胞、1x107至2.5x107个总重组受体表达CD8+T细胞、从或从约1x107至0.75x108个总重组受体表达CD8+T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞剂量包括使用为或约1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108或5x108个总重组受体表达CD8+T细胞。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达T细胞)的所述剂量是作为单一剂量施用于受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅施用一次。
在过继细胞疗法的情况下，施用给定“剂量”涵盖施用作为单一组合物和/或单次不间断施用(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段中(如在不超过3天中)施用在多种单独组合物或输注中提供的作为分割剂量或作为多种组合物的给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，剂量是在单一时间点给予或开始的指定数量的细胞的单次或连续施用。然而，在一些情况下，所述剂量是在不超过三天的时间段内以多次注射或输注来施用，如每天一次持续三天或持续两天，或者在单日时间段内多次输注。
因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方案中，所述剂量的细胞以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物施用。
在一些实施方案中，术语“分割剂量”是指被分割从而可在超过一天中施用的剂量。这种类型的给药包括在本发明方法中并且被认为是单一剂量。
因此，细胞剂量可以作为分割剂量(例如在一定时间中施用的分割剂量)来施用。例如，在一些实施方案中，剂量可以在2天中或在3天中施用至受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天施用剂量的25％和在第二天施用剂量的剩余75％。在其他实施方案中，可以在第一天施用剂量的33％，并且在第二天施用剩余67％。在一些方面，在第一天施用10％的剂量，在第二天施用30％的剂量，并且在第三天施用60％的剂量。在一些实施方案中，所述分割剂量的分布不超过3天。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过施用多种组合物或溶液(如第一和第二，任选地更多)来施用，每种组合物或溶液含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地在某一时间段内，分开地或独立地施用各自含有不同细胞群和/或细胞亚型的多个组合物。例如，细胞群或细胞亚型可以分别包括CD8+和CD4+T细胞，和/或分别包括富集CD8+和CD4+的群体，例如CD4+和/或CD8+T细胞，其各自单独地包括基因工程化以表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，所述剂量的施用包括施用第一组合物，其包含CD8+T细胞的剂量或CD4+T细胞的剂量；以及施用第二组合物，其包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的剂量中的另一者。
在一些实施方案中，组合物或剂量的施用(例如，多种细胞组合物的施用)包括单独施用细胞组合物。在一些方面，所述分开施用是同时或按任何顺序依序进行的。在一些实施方案中，所述剂量包含第一组合物和第二组合物，并且所述第一组合物和第二组合物的施用相隔0至12小时，相隔0至6小时或相隔0至2小时。在一些实施方案中，第一组合物的施用的开始与第二组合物的施用的开始是相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。在一些实施方案中，第一组合物的施用的开始和/或完成与第二组合物的施用的完成和/或开始是相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。
在一些组合物中，第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD4+T细胞。在一些组合物中，第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD8+T细胞。在一些实施方案中，第一组合物是在第二组合物之前施用。
在一些实施方案中，细胞的剂量或组合物包括限定或目标比率的表达重组受体的CD4+细胞与表达重组受体的CD8+细胞和/或CD4+细胞与CD8+细胞，所述比率任选地为大约1:1，或者在大约1:3与大约3:1之间，如大约1:1。在一些方面，具有目标或所需比率的不同细胞群(例如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如1:1)的组合物或剂量的施用涉及施用含有一种群体的细胞组合物，和随后施用包含另一种群体的单独细胞组合物，其中所述施用为或大约为目标或所需比率。在一些方面，以限定比率施用细胞的剂量或组合物导致改进T细胞疗法的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如，两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，向受试者施用两个剂量。在一些实施方案中，受试者接受连续剂量，例如，第二剂量，其在第一剂量后大约4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天施用。在一些实施方案中，在第一剂量后施用多个连续剂量，使得在施用所述连续剂量后施用另外一个或多个剂量。在一些方面，以另外的剂量施用于所述受试者的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量大于先前剂量。
在一些方面，所述第一和/或连续剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如所述受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、所述受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的范围或类型、分期和/或所述受试者发生毒性结果(例如CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些方面，第一剂量的施用与连续剂量的施用之间的时间为约9至约35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，施用所述连续剂量是在施用所述第一剂量后大于约14天且在施用所述第一剂量后小于约28天的某个时间点进行。在一些方面，所述第一剂量与所述连续剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在施用连续剂量后施用另外一个或多个剂量(例如连续剂量)。在一些方面，在施用先前剂量后至少约14天且小于约28天，施用另外一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天(例如，在先前剂量后4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天)施用所述另外的剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天不施用剂量，和/或在先前剂量后超过约28天不施用剂量。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞(例如，重组受体表达细胞)包含两个剂量(例如，双剂量)，包含第一剂量的T细胞和连续剂量的T细胞，其中第一剂量和第二剂量中之一或两者包括施用分割剂量的T细胞。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞通常足够大以有效减轻疾病负荷。
在一些实施方案中，将所述细胞以所需剂量施用，所述所需剂量在一些方面包括细胞或一种或多种细胞类型的所需剂量或数量和/或细胞类型的所需比率。因此，在一些实施方案中，细胞的剂量是基于细胞总数(或每kg体重的数量)和单独群体或亚型的所需比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，细胞的所述剂量基于单独群体中的细胞或单独细胞类型的所需总数(或每kg体重的数量)。在一些实施方案中，所述剂量是基于此类特征的组合，如总细胞的所需数量、所需比率和单独群体中细胞的所需总数量。
在一些实施方案中，以总细胞的所需剂量(如T细胞的所需剂量)的容忍差异或在所述容忍差异内施用细胞的群体或亚型(如CD8+和CD4+T细胞)。在一些方面，所需剂量是所需细胞数量或被施用细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数量，例如细胞/kg。在一些方面，所需剂量等于或高于最小细胞数量或每单位体重的最小细胞数量。在一些方面，在以所需剂量施用的总细胞中，单独群体或亚型以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+的比率)存在，所述输出比率例如在这种比率的一定容忍差异或误差内。
在一些实施方案中，所述细胞以一种或多种单独细胞群或亚型的所需剂量(如CD4+细胞的所需剂量和/或CD8+细胞的所需剂量)的容忍差异或在所述容忍差异内施用。在一些方面，所需剂量是亚型或群体的细胞的所需数量，或被施用所述细胞的受试者的每单位体重的此类细胞的所需数量，例如细胞/kg。在一些方面，所述所需剂量等于或高于群体或亚型的最小细胞数量或每单位体重的所述群体或亚型的最小细胞数量。
因此，在一些实施方案中，所述剂量基于总细胞的所需固定剂量和所需比率，和/或基于一种或多种(例如，每种)单独亚型或亚群的所需固定剂量。因此，在一些实施方案中，所述剂量是基于T细胞的所需固定或最小剂量和CD4+与CD8+细胞的所需比率，和/或是基于CD4+和/或CD8+细胞的所需固定或最小剂量。
在一些实施方案中，所述细胞以多种细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比率的容忍范围或在所述容忍范围内施用。在一些方面，所需比率可以是特定比率或可以是一系列比率。例如，在一些实施方案中，所需比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)是在为或约1:5与为或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)、或在为或约1:3与为或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在为或约2:1与为或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1，如为或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，容忍差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括这些范围之间的任何值。
在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如，CAR)表达细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指施用的所有细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些方面，剂量的大小基于一个或多个标准来确定，所述标准如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的范围或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或宿主针对所施用的细胞和/或重组受体的免疫应答)的可能性或发生率。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用一个或多个另外的剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中，一个或多个另外的剂量不同于初始剂量，例如更高，如是初始剂量的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更高；或者更低，如是初始剂量的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、六分之一、七分之一、八分之一、九分之一或十分之一或更低。在一些实施方案中，基于以下确定一个或多个另外的剂量的施用：受试者对初始治疗或任何先前治疗的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的范围或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或宿主针对所施用的细胞和/或重组受体的免疫应答)的可能性或发生率。
V.组合物和配制品
在一些实施方案中，本文提供通过本文公开的任何制造过程产生的治疗组合物(例如，治疗性T细胞组合物)，例如，输出组合物，如章节I-H-4中公开的那些。在一些实施方案中，本文提供治疗组合物(例如，治疗性T细胞组合物)，其具有本文例如在章节I-H-4中公开的任何一种或多种特征。在一些实施方案中，包含用重组抗原受体(例如CAR或TCR)工程化的细胞的细胞的剂量是作为组合物或配制品(如药物组合物或配制品)来提供。此类组合物可以根据所提供的方法来使用，和/或与所提供的制品或组合物一起使用，如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法。
术语“药物配制品”是指如下制剂，其呈如下形式以允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且其不含对会被施用所述配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞或药剂和/或施用方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如以下文献中：Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)。
配制品或组合物还可以含有多于一种活性成分，所述活性成分可用于用细胞或药剂预防或治疗的特定适应症、疾病或病症，其中相应活性不会对彼此造成不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量合适地组合存在。因此，在一些实施方案中，所述药物组合物还包括其他药学活性剂或药物，如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，将所述药剂或细胞以盐(例如，药学上可接受的盐)的形式施用。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸，硝酸和硫酸)和有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的那些盐。
在一些实施方案中，药物组合物以有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)含有药剂或细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于在数天或更长时间内重复施用，根据病症，重复治疗直到出现对疾病症状的所需抑制为止。然而，其他剂量方案可能有用并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物或通过连续输注施用组合物来递送。
所述药剂或细胞可以通过任何合适的方式施用，例如，通过推注输注，通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜递送。在一些实施方案中，将它们通过肠胃外、肺内和鼻内以及(如果局部治疗需要)病灶内施用来施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞或药剂的单次推注施用来施用。在一些实施方案中，给定剂量是通过细胞或药剂例如在不超过3天的时间段内的多次推注施用来施用，或者通过细胞或药剂的连续输注施用来施用。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可以取决于要治疗的疾病类型、一种或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、施用所述药剂或细胞用于预防性目的还是治疗性目的、先前疗法、受试者的临床病史和对所述药剂或所述细胞的反应、以及主治医师的决断。在一些实施方案中，将组合物一次性或在一系列治疗中合适地施用至受试者。
细胞或药剂可以使用标准施用技术、配制品和/或装置来施用。提供了用于储存和施用组合物的配制品和装置(如注射器和小瓶)。关于细胞，施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答性细胞或祖细胞可以从一名受试者获得，并将其施用至同一受试者或不同但相容的受试者。源自外周血的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用治疗组合物(例如，含有基因修饰的免疫应答细胞或者治疗或改善神经毒性症状的药剂的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，药剂或细胞群是肠胃外施用。如本文所用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，将药剂或细胞群通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送施用至受试者。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，在一些方面可以将其缓冲至所选pH)提供。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物稍微更方便施用，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触时间段。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：将所述药剂或细胞掺入溶剂中，如掺入与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)的混合物中。
用于体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌性。
VI.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含此类定义不应一定被解释为代表与本领域通常所理解的含义有实质性差异。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。例如，“一种/一个(a)”或“一种/一个(an)”意指“至少一种/至少一个”或“一种或多种/一个或多个”。应理解，本文所述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
在整个本公开文本中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当将范围的描述视为已明确公开所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限与下限之间的每个中间值以及该所陈述范围中的任何其他所陈述值或中间值涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何明确排除的限值。在所陈述范围包括所述限值中的一个或两个的情况下，排除那些所包括限值中的任何一个或两个的范围也被包括在所要求保护的主题内。无论范围的广度如何，这都适用。
如本文所用术语“约”是指容易知道的相应值的常用误差范围。本文提及“约”一值或参数时包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(例如序列表中所述)是指，在使用标准比对算法(例如GAP算法)与所公开序列比对以使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，可以例如使用保守且相同的氨基酸残基作为指导来鉴定相应残基。通常，为了鉴定对应位置，比对氨基酸序列使得获得最高阶匹配(参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,纽约,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,纽约,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,新泽西州,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M StocktonPress,纽约,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们操作性地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。所述载体包括病毒载体，如逆转录病毒(例如，γ逆转录病毒)和慢病毒载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
如本文所用，细胞或细胞群对于特定标记呈“阳性”的陈述是指特定标记(通常是表面标记)在细胞上或在细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术所检测的表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色在如下水平下可通过流式细胞术检测，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平基本上相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对于特定标记呈“阴性”的陈述是指特定标记(通常是表面标记)在细胞上或在细胞中不存在实质可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术所检测的表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色在如下水平下通过流式细胞术没有被检测到，所述水平显著高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配的对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平显著低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平如与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平相比基本上相似。
如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分的情况下，候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以各种已知方式来实现，例如使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸取代可以包括用一个氨基酸替代多肽中的另一个氨基酸。所述取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。可以将氨基酸取代引入目的结合分子(例如，抗体)和针对所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选的产物中。
通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中，保守取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为同一类别的另一个成员。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为另一个类别。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。
VII.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在以下时间进行：(i)在开始暴露于所述刺激试剂之后24小时与120小时之间(包含端值)的时间；(ii)在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前的时间；(iii)在收获时活细胞的总数是受刺激的群体的总活细胞数量的大于或大于约三倍、两倍或者相同或大致相同之前的时间；和/或(iv)在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD3+T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，CD27+CCR7+所占百分比大于或大于约60％时的时间；从而产生工程化细胞的组合物。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述输入组合物包含至少300x106个活原代T细胞。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
4.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含至少300x106个活原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在以下时间进行：(i)在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间(包含端值)的时间；(ii)在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前的时间；(iii)在收获时活细胞的总数是受刺激的群体的总活细胞数量的大于或大于约三倍、两倍或者相同或大致相同之前的时间；和/或(iv)在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD3+细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％时的时间；从而产生工程化细胞的组合物。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述收获是在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定iVCN之前的时间进行。
6.根据实施方案5所述的方法，其中当所述iVCN达到峰值并保持不变或者在容许误差内不变持续大于24小时的时间段时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。
7.根据实施方案5所述的方法，其中当所述转化的细胞的群体的二倍体基因组中iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为或为约1.0或者在其容许误差内时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体中整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于0.8时的时间进行。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述幼稚样T细胞包含CD27+CCR7+T细胞。
10.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间(包含端值)的时间进行，其中在收获时，所述转化的细胞的群体的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约0.4个拷贝/二倍体基因组与2.0个拷贝/二倍体基因组之间；从而产生工程化细胞的组合物。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约2.0个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
12.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约1.5个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
13.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约1.0个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
14.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约0.75个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
15.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约0.5个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
16.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间(包含端值)的时间进行，其中在收获时，在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样细胞所占百分比大于或大于约60％；从而产生工程化细胞的组合物。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中在收获时：在所述群体的总重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达T细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％；在所述群体的总重组蛋白表达CD4+T细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约40％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达CD4+细胞的大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％；或者在所述群体的总重组蛋白表达CD8+T细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约40％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达CD8+细胞的大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中在所述引入之后且在所述收获之前，所述方法还包括将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行。
19.根据实施方案18所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行长达72小时。
20.根据实施方案18所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行长达48小时。
21.根据实施方案18所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行长达24小时。
22.根据实施方案18-21中任一项所述的方法，其中所述孵育进行至少18小时。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后96小时内进行。
24.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后72小时内进行。
25.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后48小时内进行。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述暴露和所述引入中的一者或两者是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。
27.根据实施方案18-26中任一项所述的方法，其中所述孵育是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。
28.根据实施方案18-26中任一项所述的方法，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行。
29.根据实施方案16-28中任一项所述的方法，其中所述幼稚样T细胞包含CD27+CCR7+细胞。
30.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，所述条件包括一种或多种重组细胞因子的存在，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行；(c)将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行；以及(c)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。
31.根据实施方案26-30中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子是人重组细胞因子。
32.根据实施方案26-31中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15，任选地在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；和/或在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。
33.根据实施方案26-32中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子是或包含重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15，任选地在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；以及在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述暴露和所述引入中的一者或两者是在无血清培养基中进行。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂包含(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
36.根据实施方案35所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂中的一种或两种包含抗体或其抗原结合片段。
37.根据实施方案35或36所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂包含抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
38.根据实施方案35-37中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂存在于或附着于固体支持物的表面上。
39.根据实施方案38所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠。
40.根据实施方案39所述的方法，其中珠与细胞的比率小于3:1。
41.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含珠的刺激试剂，所述珠附着有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中珠与细胞的比率小于3:1，并且所述暴露是在一定条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。
42.根据实施方案39-41所述的方法，其中珠与细胞的比率为或为约1:1。
43.根据实施方案39-42中任一项所述的方法，其中所述珠上附着有抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段。
44.根据实施方案35或实施方案36所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂可逆地结合在包含多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的表面上。
45.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，所述寡聚颗粒试剂可逆地结合有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中所述暴露是在一定条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体；以及(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间(包含端值)的时间进行，从而产生工程化细胞的组合物。
46.根据实施方案44或实施方案45所述的方法，其中所述暴露是用一定量的刺激试剂进行，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.1μg与20μg之间，包含端值。
47.一种用于刺激T细胞的方法，所述方法包括将包含T细胞的输入组合物暴露于一定量的刺激试剂，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.1μg与20μg之间，包含端值，所述刺激试剂包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂，其中所述暴露是在一定条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体。
48.一种用于刺激T细胞的方法，所述方法包括将包含T细胞的输入组合物暴露于一定量的刺激试剂，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.1μg与20μg之间，包含端值，所述刺激试剂包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂，所述寡聚颗粒试剂附着有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中所述暴露是在一定条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体。
49.根据实施方案48所述的方法，其中所述输入组合物包含原代T细胞。
50.根据实施方案41-47中任一项所述的方法，其中在所述引入之后且在所述收获之前，所述方法还包括将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行。
51.根据实施方案50所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行长达72小时。
52.根据实施方案50所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行长达48小时。
53.根据实施方案50所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行长达24小时。
54.根据实施方案41-46和50-53中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始将所述输入组合物暴露于所述刺激剂之后96小时内进行。
55.根据实施方案41-46和50-54中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始将所述输入组合物暴露于所述刺激剂之后72小时内进行。
56.根据实施方案42-47和52-55中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始将所述输入组合物暴露于所述刺激剂之后48小时内进行。
57.根据实施方案42-47和52-56中任一项所述的方法，其中所述暴露和所述引入中的一者或两者是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。
58.根据实施方案42-47和52-57中任一项所述的方法，其中所述孵育是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。
59.根据实施方案42-47和52-58中任一项所述的方法，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行。
60.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含珠的刺激试剂，所述珠附着有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中珠与细胞的比率小于3:1，并且所述暴露是在包括一种或多种重组细胞因子的存在的条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行；(c)将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行；以及(d)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。
61.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，所述寡聚颗粒试剂附着有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中所述暴露是在包括一种或多种重组细胞因子的存在的条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行；(c)将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行；以及(d)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。
62.根据实施方案46-59或61中任一项所述的方法，其中所述暴露是用一定量的刺激试剂进行，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.4μg与8μg之间，包含端值。
63.根据实施方案46-59、61或62中任一项所述的方法，其中所述暴露是用一定量的刺激试剂进行，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.8μg与4μg之间，包含端值。
64.根据实施方案46-59或61-63中任一项所述的方法，其中所述暴露是用一定量的刺激试剂进行，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞为或为约0.8μg。
65.根据实施方案57-64中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子是人重组细胞因子。
66.根据实施方案57-65中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15，任选地在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；和/或在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。
67.根据实施方案57-66中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子是或包含重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15，任选地在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；以及在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。
68.根据实施方案1-67中任一项所述的方法，其中所述暴露和所述引入中的一者或两者是在无血清培养基中进行。
69.根据实施方案18-68中任一项所述的方法，其中所述孵育是在无血清培养基中进行。
70.根据实施方案39-43、50-60或65-69中任一项所述的方法，其中珠与细胞的比率为从或从约2:1至0.5:1。
71.根据实施方案39-43、50-60或65-70中任一项所述的方法，其中珠与细胞的比率为或为约1:1。
72.根据实施方案39-43、50-60或65-71中任一项所述的方法，其中所述珠包含大于或大于约3.5μm但不超过约9μm或不超过约8μm或不超过约7μm或不超过约6μm或不超过约5μm的直径。
73.根据实施方案39-43、50-60或65-72中任一项所述的方法，其中所述珠包含为或约4.5μm的直径。
74.根据实施方案39-43、50-60或65-73中任一项所述的方法，其中所述珠是惰性的。
75.根据实施方案39-43、50-60或65-74中任一项所述的方法，其中所述珠是或包含聚苯乙烯表面。
76.根据实施方案39-43、50-60或65-75中任一项所述的方法，其中所述珠是顺磁性或超顺磁性的。
77.根据76所述的方法，所述方法还包括在所述收获之前，在所述孵育之后或期间将所述细胞暴露于磁场，从而从所述细胞去除所述刺激试剂。
78.根据实施方案44-59和61-69中任一项所述的方法，其中所述链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子结合至或能够结合至生物素、抗生物素蛋白、生物素类似物或突变蛋白、抗生物素蛋白类似物或突变蛋白和/或其生物活性片段。
79.根据实施方案44-59和61-69中任一项所述的方法，其中参考在SEQ ID NO:61所示氨基酸序列中的在链霉亲和素中的位置，在对应于位置44至47的序列位置，所述多个链霉亲和素突变蛋白分子各自包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47。
80.根据实施方案44-59和61-69中任一项所述的方法，其中所述多个链霉亲和素突变蛋白分子各自包含：a)SEQ ID NO:62、63、68、75-77或80-83中任一个所示的氨基酸序列；b)如下氨基酸序列：其与SEQ ID NO:62、63、68、75-77或80-83中任一个展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，并且含有对应于Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47的氨基酸序列，和/或可逆地结合至生物素、生物素类似物或链霉亲和素结合肽；或者c)a)或b)的功能片段，其可逆地结合至生物素、生物素类似物或链霉亲和素结合肽。
81.根据实施方案44-59、61-69或80中任一项所述的方法，其中所述多个链霉亲和素突变蛋白分子包含SEQ ID NO:63或68所示的氨基酸序列。
82.根据实施方案44-59、61-69、80或81中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂各自包含链霉亲和素结合肽。
83.根据实施方案82所述的方法，其中所述链霉亲和素结合肽选自Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:64)、Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gl n-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID N O:73)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-G ln-Phe-Glu-Lys(SEQ IDNO:65)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGl yGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:66)和Trp-Ser-Hi s-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:67)。
84.根据实施方案44-59、61-69或81-83中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂中的一种或两种包含抗体或其抗原结合片段。
85.根据实施方案84所述的方法，其中所述一种或多种药剂是或包含单价抗体片段。
86.根据实施方案84或实施方案85所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂中的一种或两种是或包含Fab。
87.根据实施方案44-59、61-69或81-86中任一项所述的方法，其中所述寡聚颗粒试剂包含大于60nm、大于70nm、大于80nm、或大于90nm的半径。
88.根据实施方案44-59、61-69或81-87中任一项所述的方法，其中所述寡聚颗粒试剂包含：在50nm与150nm之间、在75nm与125nm之间、在80nm与115nm之间、或在90nm与110nm之间(包含端值)的半径；或者
90nm±15nm或95nm±20-25nm的半径。
89.根据实施方案44-59、61-69或81-88中任一项所述的方法，其中所述寡聚颗粒试剂包含以下分子量：至少5x107g/mol、或至少1x108g/mol；和/或在5x07g/mol与5x108g/mol之间、在1x108g/mol与5x108g/mol之间、或在1x108g/mol与2x108g/mol之间。
90.根据实施方案44-59、61-69或81-89中任一项所述的方法，其中所述寡聚颗粒试剂包含至少500个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、至少1,000个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、至少1,500个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、或至少2,000个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体；和/或；在1,000个与20,000个之间的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、在1,000个与10,000个之间的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、或在2,000个与5,000个之间的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体。
91.根据实施方案44-59、61-69或81-90中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述孵育的至少一部分之后或期间将物质添加至所述细胞，其中所述物质能够逆转所述一级药剂和所述二级药剂与所述寡聚颗粒试剂之间的键。
92.根据实施方案91所述的方法，其中所述物质是自由结合配偶体和/或是竞争剂。
93.根据实施方案91或实施方案92所述的方法，其中所述物质的存在终止或减少所述一级药剂和所述二级药剂在所述T细胞中诱导或调节的信号。
94.根据实施方案91-93中任一项所述的方法，其中所述物质是或包含链霉亲和素结合肽、生物素或生物活性片段、或者生物素类似物或生物活性片段。
95.根据实施方案94所述的方法，其中所述物质是或包含链霉亲和素结合肽，并且所述链霉亲和素结合肽选自Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:64)、Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:73)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:65)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:66)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:67)。
96.根据实施方案94所述的方法，其中所述物质是或包含生物素或生物活性片段、或者生物素类似物或生物活性片段。
97.根据实施方案91-96中任一项所述的方法，其中所述物质是在开始暴露于所述刺激剂之后在或在约42小时与120小时之间(包含端值)添加。
98.根据实施方案91-97中任一项所述的方法，其中所述物质是在开始暴露于所述刺激剂之后在或在约72小时与96小时之间添加。
99.根据实施方案91-98中任一项所述的方法，其中所述物质是在暴露于所述刺激剂之后48小时或约48小时添加。
100.根据实施方案91-99中任一项所述的方法，其中所述物质是在暴露于所述刺激剂之后72小时或约72小时添加。
101.根据实施方案91-100中任一项所述的方法，其中所述物质是在暴露于所述刺激剂之后96小时或约96小时添加。
102.根据实施方案91-101中任一项所述的方法，其中所述物质是在所述孵育之后且在所述收获之前添加。
103.根据实施方案91-102中任一项所述的方法，其中所述物质是在所述孵育的至少一部分期间添加，并且其中所述孵育在添加所述物质之后继续进行。
104.根据实施方案102所述的方法，其中在添加所述物质之后，在缺少重组细胞因子的基础培养基的存在下进行所述孵育。
105.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于对于每106个细胞在或在约0.02μg与8μg之间的包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，所述寡聚颗粒试剂附着有：(i)与CD3特异性结合的一级药剂，和(ii)特异性结合CD28的二级药剂，其中所述暴露是在具有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在具有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行；(c)将所述转化的细胞的群体在静态条件下孵育24小时与96小时之间，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，并且在所述孵育的至少一部分期间添加包含生物素或其生物活性片段、任选地D-生物素，或者生物素类似物或其生物活性片段的物质；以及(d)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后72小时与96小时之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。
106.根据实施方案10-105中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含至少300x106个活原代T细胞。
107.根据实施方案10-106中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含或包含约600x106个活原代T细胞。
108.根据实施方案1-107中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率在1.5:1与2.0:1之间的CD4+与CD8+细胞。
109.根据实施方案1-108中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率在1.2:1与0.8:1之间的CD4+与CD8+细胞，任选地为或约1:1的CD4+与CD8+T细胞。
110.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含至少300x106个原代T细胞(所述原代T细胞包含比率为或为约1:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞)的输入组合物暴露于对于每106个细胞在或在约0.4μg与8μg之间的包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，所述寡聚颗粒试剂附着有：(i)与CD3特异性结合的一级药剂，和(ii)特异性结合CD28的二级药剂，其中所述输入组合物包含比率在2:1与1:2之间的CD4+与CD8+T细胞并且包含至少300x106个CD4+和CD8+T细胞，并且其中所述暴露是在包含重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在具有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行；(c)将所述转化的细胞的群体在静态条件下孵育在或在约24小时至72小时之间，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行；并且在所述孵育的至少一部分期间添加包含生物素或其生物活性片段、任选地D-生物素，或者生物素类似物或其生物活性片段的物质，其中所述添加是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与72小时之间(包含端值)的时间进行；以及(d)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后72小时与96小时之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。
111.根据实施方案105-110中任一项所述的方法，其中所述物质是在暴露于所述刺激剂之后48小时或约48小时添加。
112.根据实施方案105-110中任一项所述的方法，其中所述物质是在暴露于所述刺激剂之后72小时或约72小时添加。
113.根据实施方案105-110中任一项所述的方法，其中所述物质是在暴露于所述刺激剂之后96小时或约96小时添加。
114.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)将包含至少300x106个原代T细胞(所述原代T细胞包含比率为或为约1:1的CD4+T细胞与CD8+T细胞)的输入组合物暴露于包含顺磁珠的刺激试剂，珠与细胞的比率为从或从约2:1至0.5:1，其中所述珠是包含聚苯乙烯涂层和为或为约4.5μm的直径的惰性顺磁珠，所述珠附着有：(i)抗CD3抗体或其抗原结合片段和抗CD28抗体或其抗原结合片段，其中所述输入组合物包含比率在2:1与1:2之间的CD4+与CD8+T细胞并且包含至少300x106个CD4+和CD8+T细胞，并且其中所述暴露是在包含重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行，从而产生受刺激的群体；(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入包含编码重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在具有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行；(c)将所述转化的细胞的群体在静态条件下孵育48小时与72小时之间，包含端值，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行；(d)在所述孵育之后，将所述细胞暴露于磁场以从所述细胞去除所述刺激试剂，然后收获所述T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后72小时与96小时之间(包含端值)的时间进行；从而产生工程化细胞的组合物。
115.根据实施方案113或114所述的方法，其中所述孵育的至少一部分是在包含重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行。
116.根据实施方案113-115中任一项所述的方法，其中所述孵育是在缺少重组细胞因子的基础培养基中进行。
117.根据实施方案44-59、61-69、81-113、115或116中任一项所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行或进行约24小时。
118.根据实施方案18-117中任一项所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行或进行约48小时。
119.根据实施方案18-117中任一项所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行或进行约72小时。
120根据实施方案1-119中任一项所述的方法，其中在暴露于所述刺激试剂之前，从生物样品富集CD4+或CD8+T细胞，其中所述富集包括：(a)在封闭系统中进行第一选择，所述第一选择包括从含有原代人T细胞的样品富集(i)CD4+细胞和(ii)CD8+细胞中的一种，所述富集从而产生第一选择的群体和未选择的群体；以及(b)在所述封闭系统中进行第二选择，所述第二选择包括从所述未选择的群体富集(i)CD4+细胞和(ii)CD8+细胞中的另一种，所述富集从而产生第二选择的群体，其中所述富集产生CD4+T细胞和CD8+T细胞的单独富集群体，其中所述单独富集群体各自包含来自所述第一选择的群体或所述第二选择的群体中的一个的细胞，并且其中所述输入组合物包含来自CD4+T细胞的富集群体和CD8+T细胞的富集群体中的一个或多个的细胞。
121.根据实施方案120所述的方法，其中组合CD4+T细胞与CD8+T细胞的所述单独富集群体，从而产生所述输入组合物。
122.根据实施方案121所述的方法，其中所述组合是在所述封闭系统中进行，任选地其中所述封闭系统是自动化的。
123.根据实施方案120-122中任一项所述的方法，其中在所述第一选择和/或所述第二选择中富集细胞包括基于细胞表面标记的表达进行阳性选择或阴性选择。
124.根据实施方案120-123中任一项所述的方法，其中在所述第一选择或所述第二选择中富集细胞包括基于一种或多种细胞表面标记的表达进行多个阳性或阴性选择步骤，以富集CD4+或CD8+细胞。
125.根据实施方案120-124中任一项所述的方法，其中在所述第一选择和/或所述第二选择中富集细胞包括基于免疫亲和力的选择。
126.根据权利要求125所述的方法，其中在所述第一选择和所述第二选择中富集细胞包括基于免疫亲和力的选择。
127.根据实施方案120-126中任一项所述的方法，其中所述基于免疫亲和力的选择是通过使细胞与固定在或附着至亲和色谱基质上的抗体接触来实现，所述抗体能够与细胞表面标记特异性结合，以实现CD4+或CD8+细胞的阳性或阴性选择。
128.根据实施方案127所述的方法，其还包括，在使所述样品中的细胞与所述第一选择和/或所述第二选择中的亲和色谱基质接触之后，应用竞争试剂以破坏所述结合配偶体与所述结合试剂之间的键，从而从所述基质回收选择的细胞。
129.根据实施方案120-128中任一项所述的方法，其中：(a)富集所述CD4+细胞包括基于CD4的表面表达的阳性选择；(b)富集所述CD8+细胞包括基于CD8的表面表达的阳性选择；或者(a)和(b)两者。
130.根据实施方案1-119中任一项所述的方法，其中在暴露于所述刺激试剂之前，从生物样品富集CD4+或CD8+T细胞，其中所述富集包括使所述样品的细胞在一定条件下与孵育组合物中与CD4特异性结合的第一免疫亲和试剂和与CD8特异性结合的第二免疫亲和试剂接触，所述免疫亲和试剂借此分别与所述样品中的细胞表面上的CD4和CD8分子特异性结合；并且回收与所述第一免疫亲和试剂和/或所述第二免疫亲和试剂结合的细胞，从而产生包含CD4+细胞和CD8+细胞的富集组合物，并且其中所述输入组合物包含含有CD4+细胞和CD8+细胞的所述富集组合物的细胞。
131.根据实施方案130所述的方法，其中所述免疫亲和试剂各自包含抗体或其抗原结合片段。
132.根据实施方案130或131所述的方法，其中所述免疫亲和试剂固定在珠的外表面上。
133.根据实施方案132所述的方法，其中所述珠是磁珠。
134.根据实施方案133所述的方法，其中回收与所述第一免疫亲和试剂或所述第二免疫亲和试剂结合的细胞包括使所述细胞暴露于磁场。
134a.根据实施方案1-119中任一项所述的方法，其中所述方法包括在暴露于所述刺激试剂之前，从生物样品富集CD3+T细胞，其中所述富集包括：
在封闭系统中进行选择，所述选择包括从含有原代人T细胞的样品富集CD3+细胞，所述富集从而产生选择的群体和未选择的群体，
其中所述富集的群体包含来自所述选择的群体的细胞，并且
其中所述输入组合物包含来自CD3+T细胞的富集群体的细胞。
134b.根据实施方案1-119中任一项所述的方法，其中所述方法包括在暴露于所述刺激试剂之前，从生物样品富集CD3+T细胞，其中所述富集包括在一定条件下使所述样品的细胞与孵育组合物中特异性结合至CD3的免疫亲和试剂接触，借此所述免疫亲和试剂特异性结合至所述样品中细胞表面上的CD3；以及
回收结合至所述免疫亲和试剂的细胞，从而产生包含CD3+细胞的富集组合物，并且
其中所述输入组合物包含含有CD3+细胞的富集组合物的细胞。
134c.根据实施方案134b所述的方法，其中所述免疫亲和试剂包含特异性结合至CD3的抗体或其抗原结合片段。
134d.根据实施方案134b或134c所述的方法，其中将所述免疫亲和试剂固定在珠的外表面上。
134e.根据实施方案134d所述的方法，其中所述珠是磁珠。
134f.根据实施方案134e所述的方法，其中回收结合至所述免疫亲和试剂的细胞包括使所述细胞暴露于磁场。
134g.根据实施方案134a-134c中任一项所述的方法，其中在所述选择中富集细胞包括基于免疫亲和力的选择。
134h.根据实施方案134g所述的方法，其中所述基于免疫亲和力的选择是通过使细胞与固定在或附着至亲和色谱基质上的抗体或其抗原结合片段接触来实现，所述抗体或其抗原结合片段能够与细胞表面标记特异性结合以实现CD3+细胞的阳性或阴性选择。
134i.根据实施方案134h所述的方法，其还包括，在所述选择中使所述样品中的细胞与亲和色谱基质接触之后，应用竞争试剂以破坏结合配偶体与结合试剂之间的键，从而从所述基质回收选择的细胞。
134j.根据实施方案134a-134c中任一项所述的方法，其中富集所述CD3+细胞包括基于CD3的表面表达的阳性选择。
134k.根据实施方案134j所述的方法，其中富集所述CD3+T细胞不包括基于另一种T细胞标记的表面表达的阳性选择和/或阴性选择。
134l.根据实施方案134j或134k所述的方法，其中富集所述CD3+T细胞不包括基于CD4和/或CD8的表面表达的阳性选择。
135.根据实施方案120-134l中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含从受试者、任选地人受试者获得的原代T细胞。
136.根据实施方案120-135中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包含全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
137.根据实施方案44-59、61-69、81-113、115-136中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后为或为约48小时进行。
138.根据权利要求44-59、61-69、81-113、115-136中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后为或为约两天或者为或为约三天进行。
139.根据实施方案18-138中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后为或为约72小时进行。
140.根据实施方案18-138中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后为或为约48小时进行。
141.根据实施方案16-140中任一项所述的方法，其中所述收获是在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定iVCN之前的时间进行。
142.根据实施方案16-140中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体中整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于0.8时的时间进行。
143.根据实施方案16-142中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约2.0个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
144.根据实施方案16-142中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约1.5个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
145.根据实施方案16-142中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约1.0个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
146.根据实施方案16-142中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约0.75个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
147.根据实施方案16-142中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约0.5个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
148根据实施方案所述的方法，根据实施方案1-147中任一项所述的方法，其中收获细胞包括通过冲洗或洗涤细胞来去除细胞碎片。
149.根据实施方案30-148中任一项所述的方法，其中在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样细胞所占百分比大于或大于约60％时的时间收获所述细胞。
150.根据实施方案30-148中任一项所述的方法，其中在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％时的时间收获所述细胞。
151.根据实施方案150所述的方法，其中在收获时：在所述群体的总重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达T细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％；在所述群体的总重组蛋白表达CD4+T细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达CD4+细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％；或者在所述群体的总重组蛋白表达CD8+T细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达CD8+细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。
152.根据实施方案150或151所述的方法，其中所述幼稚样T细胞包含CD27+CCR7+T细胞。
153.根据实施方案1-152中任一项所述的方法，其还包括任选地在药学上可接受的赋形剂的存在下配制输出组合物的细胞以供冷冻保存和/或施用至受试者。
154.根据实施方案153所述的方法，其中所述输出组合物的细胞是在冷冻保护剂的存在下进行配制。
155.根据实施方案154所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含DMSO。
156.根据实施方案153-155中任一项所述的方法，其中输出组合物的细胞是在容器、任选地小瓶或袋子中进行配制。
157.根据实施方案1-156中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是能够与靶抗原结合的重组受体，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
158.根据实施方案157所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
159.根据实施方案158所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
160.根据实施方案156-158中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
161.根据实施方案1-47或50-160中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
162.根据实施方案1-47或50-161中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。
163.根据实施方案1-47或50-162中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是抗BCMA CAR。
164.根据实施方案1-47或50-162中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是抗CD19 CAR。
165.根据实施方案94-96中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含：包含抗原结合结构域、间隔子和/或铰链区的细胞外结构域、跨膜结构域，以及包含共刺激信号传导区的细胞内信号传导结构域。
166.根据实施方案165所述的方法，其中包含抗原结合结构域的所述细胞外结构域包含scFv。
167.根据实施方案165或166所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
168.根据实施方案167所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
169.根据实施方案166-168中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
170.根据实施方案34-40或68-169中任一项所述的方法，其中所述无血清培养基包含：
基础培养基中0.5mM至5mM的二肽形式的L-谷氨酰胺；
0.5mM至5mM L-谷氨酰胺；和
至少一种蛋白质，其中所述培养基不含血清。
171.根据实施方案28-169中任一项所述的方法，其中缺少一种或多种重组细胞因子的所述基础培养基包含L-谷氨酰胺，任选地浓度为约0.5mM至约5mM，任选地浓度为约2mM。
172.根据实施方案28-169和171中任一项所述的方法，其中缺少一种或多种重组细胞因子的所述基础培养基不含血清。
173.根据实施方案30-172中任一项所述的方法，其中所述基础培养基还包含选自白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选地人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种的至少一种蛋白质。
174.一种包含工程化细胞的组合物，所述组合物通过根据实施方案1-173中任一项所述的方法产生。
174.一种治疗性T细胞组合物，其通过根据实施方案1-173中任一项所述的方法产生。
175.根据实施方案174所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是幼稚样T细胞或者是对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。
176.根据实施方案175所述的治疗性T细胞组合物，其中所述幼稚样T细胞：
对选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7的T细胞激活标记呈表面阳性；和/或
对选自CD25、CD45RO、CD56、CD62L、KLRG1的标记呈表面阴性；和/或
具有CD95的低表达；和/或
对选自IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的细胞因子的细胞内表达呈阴性。
177.根据实施方案175所述的治疗性T细胞组合物，其中在幼稚样T细胞上表达的所述标记选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。
178.根据实施方案174-177中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。
179.根据实施方案174-178中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。
180.一种治疗性T细胞组合物，其包含表达重组受体的CD4+T细胞和表达重组受体的CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。
181.根据实施方案180所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是幼稚样T细胞或者是对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。
182.根据实施方案179-181中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少60％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中30％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。
183.根据实施方案179-181中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中40％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。
184.根据实施方案179-181中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中50％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。
185.根据实施方案179-181中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中60％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。
186.根据实施方案179-181中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性，并且所述组合物中70％的总受体+/CD4+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性。
187.根据实施方案179-186中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述幼稚样T细胞：
对选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7的T细胞激活标记呈表面阳性；和/或
对选自CD25、CD45RO、CD56、CD62L、KLRG1的标记呈表面阴性；和/或
具有CD95的低表达；和/或
对选自IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的细胞因子的细胞内表达呈阴性。
188.根据实施方案179-187中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中在幼稚样T细胞上表达的所述标记选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。
189.根据实施方案179-188中任一项所述的方法，其中所述受体+/CD4+T细胞或者作为幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述受体+/CD4+T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。
190.根据实施方案179-189中任一项所述的方法，其中所述受体+/CD4+T细胞或者作为幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述受体+/CD4+T细胞是CD27+CCR7+。
191.根据实施方案179-190中任一项所述的方法，其中所述受体+/CD8+T细胞或者作为幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述受体+/CD8+T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。
192.根据实施方案179-191中任一项所述的方法，其中所述受体+/CD8+T细胞或者作为幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述受体+/CD8+T细胞是CD27+CCR7+。
193.一种治疗性T细胞组合物，其包含表达重组受体的CD4+T细胞和表达重组受体的CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+，任选地其中所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD3+T细胞。
194.根据实施方案193所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。
195.根据实施方案193或194所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约60％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约40％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
196.根据实施方案193-195中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约65％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约45％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
197.根据实施方案193-196中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、或者至少或至少约85％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约50％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、或者至少或至少约65％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
198.根据实施方案193-197中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约75％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约55％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
199.根据实施方案193-198中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约80％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约60％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
200.根据实施方案193-199中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约85％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约65％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
201.根据实施方案193-200中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约70％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
202.根据实施方案193所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少60％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少40％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
203.根据实施方案193所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
204.根据实施方案193所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少60％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
205.根据实施方案193所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少70％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少70％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
206.根据实施方案193所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少95％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少80％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少80％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
207.根据实施方案193-206中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是CD27+CCR7+。
208.根据实施方案174-207中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中受体+/CD4+T细胞与受体+/CD8+T细胞的比率在约1:3与约3:1之间。
209.根据实施方案174-207中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中受体+/CD4+T细胞与受体+/CD8+T细胞的比率在约1:2与约2:1之间。
210.根据实施方案174-207中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中受体+/CD4+T细胞与受体+/CD8+T细胞的比率是为或约1:1。
211.根据实施方案174-210中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物包含一个或多个单位剂量的细胞。
212.根据实施方案211所述的治疗性T细胞组合物，其中所述单位剂量包含在或在约1x104个与50x106个之间的T细胞。
213.根据实施方案174-212中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述重组蛋白是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。
214.根据实施方案174-213中任一项所述的组合物，其中所述重组蛋白能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
215.根据实施方案214所述的组合物，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
216.根据实施方案214或实施方案215所述的组合物，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
217.根据实施方案214-216中任一项所述的组合物，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
218.根据实施方案174-217中任一项所述的组合物，其中所述重组蛋白是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
219.根据实施方案174-218中任一项所述的组合物，其中所述重组蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。
220.根据实施方案174-219中任一项所述的组合物，其中所述重组蛋白包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。
221.根据实施方案220所述的组合物，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
222.根据实施方案221所述的组合物，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
223.根据实施方案221或222所述的组合物，其中所述片段包含scFv。
224.根据实施方案174-223中任一项所述的组合物，其中所述重组蛋白包含细胞内信号传导区。
225.根据实施方案224所述的组合物，其中所述细胞内信号传导区包含细胞内信号传导结构域。
226.根据实施方案225所述的组合物，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
227.根据实施方案226所述的组合物，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-ζ(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
228.根据实施方案224-227中任一项所述的组合物，其中所述重组蛋白还包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区之间的跨膜结构域。
229.根据实施方案224-228中任一项所述的组合物，其中所述细胞内信号传导区还包含共刺激信号传导结构域。
230.根据实施方案229所述的组合物，其中所述共刺激信号传导结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
231.根据实施方案229或实施方案230所述的组合物，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
232.根据实施方案229-231中任一项所述的组合物，其中所述共刺激信号传导结构域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导结构域之间。
233.根据实施方案174-232中任一项所述的组合物，其中所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。
234.根据实施方案233所述的组合物，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
235.根据实施方案234所述的组合物，其中所述T细胞对于所述受试者是同种异体的。
236.根据实施方案174-235中任一项所述的组合物，其包含药学上可接受的赋形剂。
237.根据实施方案236所述的组合物，其中所述组合物中总T细胞、总CD4+T细胞或总CD8+T细胞、其重组蛋白表达细胞的至少60％是CD27+CCR7+。
238.一种制品，其包含根据实施方案174-229中任一项所述的组合物以及用于将所述输出组合物施用至受试者的说明书。
239.根据实施方案238所述的制品，其中所述受试者患有疾病或病症，任选地其中所述重组受体特异性识别或特异性结合至与所述疾病或病症相关或者在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原。
240.一种治疗患有或怀疑患有疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的来自根据实施方案174-237中任一项所述的组合物的T细胞。
241.根据实施方案240所述的方法，其中T细胞的所述剂量是作为单一剂量施用至所述受试者，或者是在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更久的时间段内仅施用一次。
242.根据实施方案240或241所述的方法，其中T细胞的所述剂量包含在为或约1x104个与50x106个之间(包含端值)的T细胞。
243.根据实施方案240-242中任一项所述的方法，其中T细胞的所述剂量包含少于50x106个T细胞、10x106个T细胞、5x106个T细胞、1x106个T细胞、0.5x106个T细胞或1x105个T细胞。
244.根据实施方案240-243中任一项所述的方法，其中T细胞的所述剂量包含或包含约20x106个T细胞。
245.根据实施方案240-243中任一项所述的方法，其中T细胞的所述剂量包含或包含约10x106个T细胞。
246.根据实施方案240-243中任一项所述的方法，其中T细胞的所述剂量包含或包含约2x106个T细胞。
247.根据实施方案240-243中任一项所述的方法，其中T细胞的所述剂量包含或包含约1x106个T细胞。
248.根据实施方案240-247中任一项所述的方法，其中所述剂量的T细胞是总T细胞、总活T细胞、总活重组受体表达T细胞、总活重组受体表达CD4+T细胞、或总活重组受体表达CD8+T细胞。
249.根据实施方案240-248中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
250.根据实施方案240-249中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。
251.根据实施方案240-250中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是B细胞恶性肿瘤和/或是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
VIII.实施例
本文仅出于说明性目的包括以下实施例，并不意图限制本发明的范围。
实施例1：用于制造含有CAR+T细胞的T细胞组合物的非扩增过程。
含有表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的原代T细胞的工程化组合物通过如下过程来产生：所述过程在用病毒载体转导之前利用由顺磁性聚苯乙烯包被的珠构成的刺激试剂来激活T细胞，所述珠附着有抗CD3和抗CD28抗体或抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚试剂，但是所述过程未涉及所述细胞的后续扩增。对于比较，通过包括扩增步骤的过程将来自同一供体的T细胞工程化。如实施例4中所述比较示例性非扩增过程和扩增过程的特征。
a.非扩增过程-抗CD3/抗CD28珠
从来自人供体的白细胞单采术样品的分离的PBMC选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物，并且将选择的细胞组合物低温冷冻。随后将CD4+和CD8+T细胞的单独组合物解冻，并且以1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合。通过将细胞以1:1的珠与细胞的比率在抗CD3/抗CD28抗体缀合的珠的存在下在无血清培养基中孵育18-30小时，刺激混合输入细胞组合物的大约300×106个T细胞(150×106个CD4+和150×106个CD8+T细胞)。培养基还含有重组IL-2、IL-7和IL-15。
刺激后，将细胞洗涤并重悬于含有添加剂以及重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中。然后通过以大约693g旋转接种30分钟，用编码抗BCMA CAR的慢病毒载体转导细胞。所述CAR含有对BCMA具有特异性的scFv抗原结合结构域、CD28跨膜区、4-1BB共刺激信号传导区和源自CD3-ζ的细胞内信号传导结构域。所述载体还编码截短的受体分子，所述截短的受体分子用作CAR表达的替代标记并且通过T2A序列与CAR构建体隔开。
在旋转接种后，将细胞洗涤并重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基(完全培养基)中或不含任何另外的添加剂或重组细胞因子的基础培养基(基础培养基)中。在约37.0℃下在孵育器中孵育每种重悬组合物的细胞。在开始刺激之后96小时，在磁场的存在下将细胞冲洗两次以去除抗CD3/抗CD28抗体缀合的顺磁珠，在含有10％DMSO的溶液中进行配制。将配制的细胞组合物转移到袋子或小瓶中，并且储存于大约-80℃下。
b.非扩增过程-抗CD3/抗CD28寡聚试剂
从来自与实施例1a中所述相同人供体的白细胞单采术样品的分离的PBMC选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物，并且将选择的细胞组合物低温冷冻。随后将CD4+和CD8+T细胞的单独组合物解冻，并且以1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合。通过与对于每106个细胞4μg如实施例2中所述产生的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂(其中4μg寡聚刺激试剂包括3μg寡聚颗粒和0.5μg抗CD3 Fab和0.5μg抗CD28 Fab)一起孵育，刺激混合输入组合物的大约300x106个T细胞(150x106个CD4+和150x106个CD8+T细胞)。所述孵育在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中进行18-30小时。
刺激后，将细胞洗涤并重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中。然后通过以693g旋转接种30分钟，用实施例1a中所述的编码抗BCMA CAR的慢病毒载体转导细胞。旋转接种后，将细胞洗涤并重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中。在约37.0℃下在孵育器中孵育细胞。在开始刺激之后24小时、48小时或96小时后，添加0.1mM或1mM D-生物素以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂与寡聚链霉亲和素试剂解离，然后如实施例1a中所述将细胞洗涤并在冷冻保护剂的存在下进行配制。
c.扩增过程
从来自与上述相同的人供体的白细胞单采术样品的分离的PBMC选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物，并且将选择的细胞组合物低温冷冻。随后将CD4+和CD8+T细胞的单独组合物解冻，并且以1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合。在附着有抗CD3和抗CD28抗体的顺磁性聚苯乙烯包被的珠以1:1的珠与细胞的比率的存在下，在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，将混合组合物的大约300x106个T细胞(150x106个CD4+和150x106个CD8+T细胞)刺激18至30小时。
在所述孵育后，在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中浓缩来自刺激的细胞组合物的大约100x106个活细胞。通过以大约1600g旋转接种60分钟，用编码与上述相同的抗BCMACAR的慢病毒载体转导细胞。旋转接种后，将细胞重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，并且在约37℃下孵育约18至30小时。
然后，通过转移到生物反应器(例如摇摆运动生物反应器)中的约500mL示例性无血清培养基中来培育细胞用于扩增，所述无血清培养基含有两倍于在孵育和转导步骤期间所用浓度的IL-2、IL-7和IL-15。当达到设定的活细胞密度时，开始灌注，其中在持续混合下通过半连续灌注更换培养基。第二天在生物反应器中培育细胞，直至达到约3×106个细胞/ml的阈值细胞密度为止，这通常发生在涉及6-7天扩增的过程中。通过暴露于磁场将抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠从细胞组合物中去除。然后收集细胞，如上所述进行配制和冷冻保护。
d.过程的总结
表E1概述使用如上所述方法产生的过程。
表E1：
Figure BDA0003008592730003351
Figure BDA0003008592730003361
实施例2：用于制备包含链霉亲和素突变蛋白的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚试 剂的方法。
通过聚合示例性链霉亲和素突变蛋白来制备寡聚试剂，所述链霉亲和素突变蛋白命名为
Figure BDA0003008592730003362
M2(含有SEQ ID NO:68所示突变蛋白氨基酸序列的链霉亲和素同源四聚体，参见例如美国专利号6,103,493；以及Voss和Skerra(1997)Protein Eng.,1:975-982；以及Argarana等人(1986)Nucleic Acids Research,1871-1882)。为了制备用于寡聚化的链霉亲和素突变蛋白，将含有一个或多个反应性硫醇基的链霉亲和素突变蛋白与马来酰亚胺激活的链霉亲和素突变蛋白一起孵育。为了制备硫醇化的链霉亲和素突变蛋白，通过在总体积为2.6mL的100mM硼酸盐缓冲液中与2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐以1:100的摩尔比在约8.5的pH下在24℃下一起孵育1小时，将约100mg链霉亲和素突变蛋白硫醇化。对于激活反应，在总体积为约10.4mL的磷酸钠缓冲液中将约400mg链霉亲和素突变蛋白与琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)以1:2的摩尔比在约7.2的pH下在24℃下一起孵育1小时。协调硫醇化和激活反应以在大致相同的时间开始，并且控制所述反应的持续时间。
在反应后，通过用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)单独进行样品的凝胶过滤，从样品去除2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐和SMPH。对于每2.5mL体积的样品，平衡1mL PD-10柱并加载硫醇化突变蛋白链霉亲和素或马来酰亚胺突变蛋白链霉亲和素，并且通过添加3.5mL偶联缓冲液(100mM NaH2PO4、150mM NaCl、5mM EDTA，pH 7.2)进行洗脱。在4个柱上进行马来酰亚胺突变蛋白链霉亲和素的凝胶过滤以占据>10mL体积，并合并洗脱物。谨慎控制激活和硫醇化反应的时间安排以及激活和硫醇化反应的结束与寡聚化反应的开始之间的时间安排。通常，从凝胶过滤的开始(即，激活和硫醇化反应的结束)至开始寡聚化反应时，允许经过不超过十分钟。
对于寡聚化，然后将马来酰亚胺链霉亲和素突变蛋白和硫醇化链霉亲和素突变蛋白样品组合为约17.5mL的总体积并在7.2的pH下在24℃下在约600rpm的搅拌条件下孵育1小时。因为与SMPH一起孵育的链霉亲和素突变蛋白是与2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐一起孵育的链霉亲和素突变蛋白的四倍，在寡聚化反应期间，硫醇化链霉亲和素突变蛋白与马来酰亚胺链霉亲和素突变蛋白的摩尔比为1:4。在反应后，通过与N-乙基马来酰亚胺(NEM)在24℃搅拌(约600rpm)下一起孵育15min，之后在4℃下一起再孵育16-20小时，使寡聚化的链霉亲和素突变蛋白试剂的剩余SH基团饱和。
在与NEM一起孵育后，将含有寡聚化的链霉亲和素突变蛋白的样品离心，并将上清液经由0.45μm膜(Millex-HP 0.45μm，来自Merck Millopore)过滤。然后将过滤的溶液加载至柱(Sephacryl S-300HR HiPrep26/60，GE Healthcare)中，用于使用AKTAExplorer色谱系统(GE Healthcare)进行尺寸排阻色谱(SEC)。合并毫吸光度单位(mAU)大于或等于1500mAU的级分。
将含有寡聚链霉亲和素突变蛋白的合并样品用100mM羟胺在6.35的pH下在室温下处理15分钟。为了在处理后去除羟胺，将样品加载至PD10柱(每个柱2.5mL)上并用3.5mL含有100mM NaH2PO4、140mM NaCl、1mM EDTA的缓冲液(pH 7.2)洗脱。将PD10洗脱液合并，并用0.45μm过滤器之后用0.22μm过滤器进行无菌过滤，然后将样品冷冻并储存于-80℃下。在冷冻前，测量寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的终浓度，并通过动态光散射(DLS)确定寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的大小。
为了评价寡聚化过程的一致性，使用上述方法从五批不同的链霉亲和素突变蛋白(SAM)制备10种寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂。评估寡聚物的平均大小、产率百分比(通过测量在280nm处的吸光度来确定，不进行基线校正)和活性(生物素结合)，并且将结果显示于表E2中。结果表明，所得寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的这些参数是一致的，其中平均半径为97nm±10nm，并且生物素结合为40nmol/mg±3nmol/mg。
表E2：来自不同批次的寡聚化的STREP-TACTIN的比较。
Figure BDA0003008592730003371
Figure BDA0003008592730003381
通过用HPLC系统(AGILENT 1100和Wyatt ECLIPSE DUALTEC)和UV检测(AgilentUV检测器，与MALLS DAWN HELEOS(Wyatt)偶联)进行的不对称流动场流分离(AF4)测量如上所述产生的三种寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的平均分子量(MW)。通过AF4进行测量允许计算每个寡聚试剂中链霉亲和素突变蛋白四聚体的平均数量，假定链霉亲和素突变蛋白四聚体的平均分子量为52,500g/mol(52.5kDa)(表E3)。
表E3：寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的大小和分子量
半径(nm) MW(g/mol) 四聚体的数量
102 1.65x10<sup>8</sup> 3150
82 1.08x10<sup>8</sup> 2050
92 1.26x10<sup>8</sup> 2280
通过与如上所述产生的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂可逆结合，将刺激剂(抗CD3和抗CD28 Fab片段)多聚化。抗CD3和抗CD28 Fab片段经由与每个Fab片段融合的链霉亲和素肽结合配偶体与链霉亲和素突变蛋白寡聚物可逆地结合。抗CD3 Fab片段源自由杂交瘤细胞系OKT3(
Figure BDA0003008592730003382
CRL-8001TM；还参见美国专利号4,361,549)产生的CD3结合单克隆抗体，并且含有Arakawa等人J.Biochem.120,657-662(1996)中所述的抗CD3抗体OKT3的重链可变结构域和轻链可变结构域。这些序列分别示于SEQ ID NO:89和90中。抗CD28 Fab片段源自抗体CD28.3(作为合成单链Fv构建体以GenBank登录号AF451974.1存放；还参见Vanhove等人,BLOOD,2003年7月15日,第102卷,第2期,第564-570页)，并且含有分别示于SEQ ID NO:91和92中的抗CD28抗体CD28.3的重链和轻链可变结构域。Fab片段在其重链的羧基末端处与链霉亲和素肽结合序列单独融合，所述链霉亲和素肽结合序列含有顺序排列的两个链霉亲和素结合模块，所述结合模块具有氨基酸序列SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:74)。带肽标签的Fab片段是重组产生的(参见国际专利申请公开号WO 2013/011011和WO2013/124474)。
为了实现可逆结合，将带肽标签的抗CD3和抗CD28 Fab片段与寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂在大约室温下混合，从而将所述片段经由Fab片段上的twin-strep-tag之间的相互作用与所述试剂可逆地结合，所述twin-strep-tag是能够可逆地结合至所述试剂上的结合位点的结合配偶体。在一些情况下，将带肽标签的Fab片段在固定至寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂上之前预混合，这在一些情况下可以导致不同Fab分子的更均匀的分布。带肽标签的抗CD3和抗CD28与寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的结合可能通过添加D-生物素而被破坏或逆转。D-生物素与所述药剂上的strep-tag竞争结合至链霉亲和素突变蛋白上的结合配偶体，从而破坏结合。
实施例3：对与链霉亲和素突变蛋白寡聚物可逆结合的寡聚化的抗CD3和抗CD28 Fab片段的活性评估。
评估通过实施例2中所述过程与来自表E1中所述每个批次的各种寡聚链霉亲和素试剂可逆结合的抗CD3和抗CD28 Fab片段刺激T细胞的能力。这些寡聚链霉亲和素试剂的平均半径为约95nm。通过比色法监测稳定四唑盐WST-1切割为可溶甲臜(formazan)染料复合物来评估细胞的代谢活性作为细胞增殖的指示物。
将来自三名不同供体的T细胞与可逆结合在寡聚链霉亲和素试剂上的抗CD3/抗CD28多聚化Fab片段一起孵育。还将细胞与对照寡聚试剂一起孵育，所述对照寡聚试剂的平均半径为101nm(内部参考)或36nm，它也与抗CD3/抗CD28 Fab片段可逆地结合。在孵育后，将WST-1试剂施加至细胞，并且通过测量作为读出的在450nm下的吸光度来评估代谢活性的水平。将结果针对所测定培养物中的细胞数量进行归一化，并且描绘为WST-1与细胞数量的比率。
如图1B所示，用所测试的每种试剂刺激的T细胞的平均WST-1活性是相当的。此外，刺激程度对于所测试的所有试剂是相似的，并且与大小类似的内部参考试剂相当(差异通常在±2个标准差内)。图1A显示每种试剂的描绘为单独数据点的WST-1活性。图1A和图1B表明，使用在较小36nm寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂骨架上多聚化的抗CD3/抗CD28 Fab时，如通过WST-1活性观察到的对T细胞的刺激较低。
实施例4：不同制造过程之间的T细胞组合物的特征。
针对各种表型和功能特征评估如实施例1中所述产生的T细胞组合物。
a)活力和细胞数量
在用于产生含有CAR+T细胞的T细胞组合物的工程化过程的不同阶段期间评估T细胞组合物的细胞总数和活细胞的百分比。对于每种过程，在刺激(stim)、转导(trans)、孵育(inc)、收获(收集)、细胞配制(form)和冷冻保存(Cyro)步骤开始时从T细胞组合物收集样品，并进行分析以确定组合物中的细胞总数和活细胞的百分比。结果示于图2A和图2B中。经历扩增工程化过程的细胞组合物展示比每种非扩增过程中产生的细胞组合物更大的总细胞数量和更大的活细胞百分比。该结果与其他过程中不包括的用于增加细胞总数和提高活力的培育步骤一致。
b)细胞溶解活性
将BCMA表达靶细胞系(RPMI-8226)与来自通过如实施例1中所述的扩增或非扩增过程产生的组合物的示例性抗BCMACAR T细胞以27:1、9:1、3:1或1:1的效应子与靶细胞(E:T)比率一起孵育。每组加载的总活细胞的数量是相同的。将来自每种条件的细胞一式三份铺板。将靶标RPMI-8226细胞用NucLight Red(NLR)标记，以允许通过显微镜检查对其进行追踪。通过测量在六天时间段内活靶细胞的损失来评估细胞溶解活性，如通过红色荧光信号(使用
Figure BDA0003008592730003401
活细胞分析系统，Essen Bioscience)来确定。通过将靶细胞计数除以每次培养开始时的细胞计数来产生归一化的靶细胞数量。通过以下方式来评估靶标杀伤的百分比：测量归一化靶细胞计数随时间变化的曲线下面积(AUC)，并通过定义0％值(仅靶细胞)和100％值(在媒介物对照中与靶细胞共培养的CAR+T细胞)将AUC倒数(1/AUC)值归一化。
如图3所示，当转导后在基础培养基中孵育细胞时，与在含有重组细胞因子的培养基中孵育相比，从非扩增过程用抗CD3/抗CD28缀合的珠产生的CAR-T细胞展现细胞溶解活性变大的趋势。细胞溶解活性与从扩增过程产生的CAR-T细胞类似。从非扩增过程用抗CD3/抗CD28寡聚试剂产生的CAR-T细胞展现细胞溶解活性的初始延迟，之后展现更强效的长期活性。
c)表型和分化标记
用识别表面标记(包括CD4、CD8、CCR7和CD27)的抗体对从扩增和非扩增工程化过程产生的T细胞组合物进行染色，并且通过流式细胞术对其进行定量。对CCR7和CD27染色两者呈阳性的CD4+CAR+和CD8+CAR+T细胞显示于图4A中。图4B和图4C分别描绘与在与抗CD3/抗CD28抗体缀合的珠刺激试剂(CMAT)一起孵育之前输入组合物中CCR7+CD27+细胞的百分比相比，所产生的T细胞组合物中CD4+CAR+T细胞或CD8+CAR+T细胞的CCR7+CD27+细胞的百分比。如图所示，如与扩增工程化过程相比，在从每种非扩增工程化过程产生的T细胞组合物中观察到CCR7+CD27+的百分比更大。这些结果与从非扩增工程化过程产生的工程化细胞组合物一致，其具有比通过扩增过程产生的细胞组合物更大份额的具有幼稚样的分化程度更低的表型的细胞。
在制造过程期间的不同天数(包括激活(AMAT)、转导(XMAT)或开始培育后的不同时间(inoc+2、inoc+4或inoc+5))对通过扩增过程从代表性供体产生的细胞的进一步分析显示，细胞的扩增与分化程度更高的表型相关，如通过减小的CCR7+CD27+细胞的百分比所确定(图4D)。
实施例5：对通过非扩增制造过程产生的抗BCMACAR-T细胞组合物的抗肿瘤活性的 评估。
在体内小鼠异种移植肿瘤模型中评价从实施例1中所述的非扩增和扩增工程化过程产生的CAR-T细胞组合物。在免疫受损的NOD-Scid-IL-2γ受体缺陷性(NSG)小鼠中植入2x106个工程化以表达萤火虫萤光素酶的OPM2细胞，以促进通过生物发光成像进行检测。在肿瘤植入后12天，将来自含有抗BCMACAR-T细胞的工程化T细胞组合物的大约2x106个CAR+T细胞施用至小鼠体内。对照包括仅注射肿瘤细胞的小鼠以及注射肿瘤细胞和模拟转导的T细胞组合物的小鼠。通过活体发光成像、体重和存活评估所有组的小鼠的肿瘤负荷。实验组总结于表E4中。
表E4：实验组
Figure BDA0003008592730003411
Figure BDA0003008592730003421
如图5A-图5F所示，如与对照相比，用含有CAR-T细胞的工程化细胞组合物治疗减小与肿瘤植入相关的肿瘤负荷。在用从扩增工程化过程产生的工程化CAR-T细胞治疗的小鼠中，肿瘤负荷最初如与CAR-T细胞施用时(第0天)相比有所减小，但截至50天可检测地增加(图5A)。相比之下，在用从每种非扩增工程化过程产生的CAR-T细胞治疗的小鼠中，肿瘤负荷的减小持续至至少第50天。所评估的每个治疗组中单独小鼠的结果显示于图5B(对照)、图5C(扩增过程)、图5D(非扩增寡聚物过程)、图5E(非扩增珠过程)和图5F(非扩增珠过程，基础培养基)中。在CAR T细胞治疗后所选天数的生物发光图像显示于图6A-图6E中，其显示在用来自非扩增工程化过程的CAR-T细胞治疗的小鼠中，直至第50天时间点，没有至极小可检测的肿瘤负荷，而在用来自扩增过程的CAR-T细胞治疗的小鼠中，在初始衰减后，肿瘤负荷增加。这些观察结果表明，从非扩增过程产生的CAR-T细胞具有稳健的抗肿瘤活性。
在CAR-T细胞治疗的小鼠中评价体内扩增和持久性。在施用CAR-T细胞之后33天从小鼠收集血液样品，并且用对截短的受体替代标记具有特异性的试剂对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。如图7所示，如与扩增过程相比，在从被施用从非扩增过程产生的CAR-T细胞的小鼠获得的样品中，每μL血液中T细胞和CAR+T细胞的总数量增加。在用通过非扩增过程产生的CAR-T细胞治疗的小鼠中更高程度的T细胞扩增与所产生细胞具有改进的增殖能力一致。
实施例6：对用于工程化CAR+T细胞的使用抗CD3和抗CD28 Fab寡聚试剂的非扩增 制造过程的评估。
通过非扩增过程使用如实施例2中所述产生的抗CD3/抗CD28Fab缀合的链霉亲和素突变蛋白寡聚物来产生含有抗CD19 CAR+T细胞的T细胞组合物。所述非扩增过程与实施例1中所述的过程类似，在添加D-生物素之前，进行48小时孵育。将此较短过程与在开始刺激之后将细胞孵育8天的较长过程(扩增过程)相比较。
为了在非扩增过程中产生T细胞组合物，从来自人供体的人白细胞单采术样品的分离的PBMC选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物，随后将其以1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合，不进行任何间歇性的冷冻保存。在一些情况下，将选择的CD4+和CD8+T细胞在混合之前单独低温冷冻，然后在即将激活之前解冻，并以1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合。通过与对于每106个细胞4μg如实施例2中所述产生的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂(其中4μg寡聚刺激试剂包括3μg寡聚颗粒和0.5μg抗CD3 Fab和0.5μg抗CD28 Fab)一起孵育，刺激来自混合CD4+和CD8+T细胞的大约3x107个活T细胞。所述孵育在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中进行大约22小时。
在所述孵育后，洗涤细胞，然后用编码抗CD19 CAR的慢病毒载体转导。CAR含有源自鼠抗体的抗CD19 scFv、免疫球蛋白间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。所述载体还编码截短的受体分子，所述截短的受体分子用作CAR表达的替代标记并且通过T2A序列与CAR构建体隔开。将刺激的T细胞通过以1600g旋转接种60分钟用慢病毒转导。在旋转接种后，洗涤T细胞并将其重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，并且在约37℃下在孵育器中孵育大约48小时。在孵育后，将1.0mM D-生物素与细胞混合以使抗CD3和抗CD28Fab从寡聚链霉亲和素试剂解离。在约2小时后，洗涤细胞以去除D-生物素和寡聚试剂，然后在与如实施例1中所述类似的冷冻保护剂的存在下进行配制。
对于比较，使用扩增过程产生抗CD19 CAR-T细胞，所述扩增过程利用实施例2中所述的抗CD3和抗CD28 Fab缀合的链霉亲和素寡聚物作为刺激试剂。所述过程规模较小，其中用抗CD3/抗CD28 Fab缀合的链霉亲和素寡聚物激活1:1混合的CD4+和CD8+T细胞的大约3x106个T细胞，之后在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中在约37℃下进行转导和培育。在开始刺激后大约48小时，添加1.0mM D-生物素并将细胞再孵育六天。然后，洗涤细胞以去除D-生物素和寡聚试剂，然后在冷冻保护剂的存在下进行配制。
非扩增和扩增工程化过程两者都涉及用编码与上文相同的抗CD19 CAR的慢病毒进行转导。
每天收集来自经历每种过程的细胞组合物的样品，并分析以确定总细胞数和活细胞的百分比。如图8A所示，在非扩增工程化过程期间从第0天(d0)至第2天(d2)，细胞总数和活细胞的百分比下降。在扩增工程化过程中，细胞展示细胞活力最初下降，但在临近所述过程结束时恢复。如图8B所示，从新鲜细胞或先前冷冻保护的细胞产生的工程化T细胞组合物显示类似的活力和CAR+T细胞数，且在从新鲜选择的T细胞产生的T细胞组合物中观察到活力和总CAR-T细胞数增加的趋势。
通过与工程化以表达CD19的HEK细胞共培养来评估通过非扩增过程和扩增对照过程产生的抗CD19 CAR-T细胞的抗原特异性活性。在与抗原表达细胞一起孵育期间的不同时间点评估T细胞组合物的活力和总CAR+T细胞数。如图9A所示，从加速过程产生的抗原刺激之后不同天数的活力和CAR-T细胞数量展示活力和总CAR+T细胞的百分比在用抗原刺激后增加的趋势。在此测定中，在刺激之前已经冷冻保存的T细胞组合物(冷冻的)与所比较的在选择后直接刺激的新鲜T细胞(未冷冻的)中，未观察到活力差异(图9B)。
还评估通过非扩增过程和扩增对照过程产生的含有抗CD19CAR+T细胞的T细胞组合物的细胞溶解活性。使冷冻保存的T细胞组合物解冻，并且在同一天或在解冻后1、3或6天，将T细胞与工程化以表达CD19的HEK细胞以10:1的效应子:靶细胞比率共培养。在解冻后的时间，来自通过非扩增工程化过程产生的T细胞组合物的细胞展示细胞溶解活性相对于通过扩增工程化过程产生的T细胞组合物有所提高的趋势(图10)。
在长期刺激测定中评估来自含有抗CD19 CAR-T细胞的T细胞组合物的细胞的活性，所述长期刺激测定涉及与抗原表达细胞的30天共培养，其模拟细胞在长期暴露于抗原(如在体内施用后可能发生)后存活的适合度和能力。将从非扩增和扩增对照过程产生的T细胞组合物与工程化以表达CD19的HEK细胞以5:1的效应子与靶细胞的比率在缺少另外的重组细胞因子的培养基中共培养。在孵育期间的不同时间点收集T细胞样品，并分析以确定细胞数量。如图11A所示，在30天孵育的持续时间中通过非扩增工程化过程产生的活T细胞在培养中是可检测的，而从扩增工程化过程产生的T细胞的数量随着抗原刺激的时间增加而降低。
在第11天和第19天从长期刺激培养物收集T细胞，并用针对表面蛋白(包括CD25、CD69、PD-1、LAG-3、TIM-3、CD45RA和TIGIT)的抗体以及针对CAR表达的替代标记进行染色。如图11B所示，在第11天，与来自通过扩增工程化过程产生的T细胞组合物的CAR+T细胞相比，来自通过非扩增工程化过程产生的T细胞组合物的CAR+T细胞展示消耗标记的通常更低的水平和/或更可变的水平。在第19天，从扩增工程化过程产生的T细胞过少而无法比较染色。
实施例7：对通过非扩增制造过程产生的抗CD19 CAR-T细胞组合物的抗肿瘤活性 的评估。
比较从实施例6中所述的扩增或非扩增工程化过程产生的含有抗CD19 CAR-T细胞的T细胞组合物的体内功效。在第-7天向免疫受损的NSG小鼠注射5x105个B细胞淋巴瘤细胞系(Raji)。在第0天，向小鼠注射1x106、0.5x106或0.25x106个来自通过非扩增或扩增过程产生的组合物的CAR+T细胞。这些剂量低于先前在该异种移植肿瘤模型中确定的抗CD19 CAR-T细胞的治愈剂量(1.5x106个CAR+细胞)。
在直至施用CAR-T细胞后49天的不同时间点，在体内通过活体发光成像测量肿瘤负荷。另外，在不同时间点收集血液样品并且评估肿瘤细胞、总T细胞和CAR+T细胞的存在。在该研究期间，由于人道原因将两只小鼠安乐死；两只小鼠已经用从扩增过程产生的CAR-T细胞组合物治疗(一只接受1x106个CAR+T细胞的剂量，另一只接受0.25x106个CAR+T细胞的剂量)。
如图12A所示，如与从扩增过程产生的CAR-T细胞组合物相比，在被施用从非扩增工程化过程产生的CAR-T细胞组合物的小鼠中观察到降低的肿瘤负荷和减少的循环T细胞。被施用最低剂量的从非扩增过程产生的细胞的小鼠展现降低的肿瘤负荷，而在被施用相同剂量的来自用扩增过程产生的工程化组合物的CAR-T细胞的小鼠中，肿瘤负荷没有显著变化。如与扩增工程化过程相比，在被施用从非扩增工程化过程产生的CAR-T细胞组合物的小鼠中还观察到血液中更大数量的循环T细胞，同时在组之间观察到类似数量的循环CAR+T细胞(图12B)。在用来自从非扩增过程产生的组合物的工程化细胞治疗的小鼠中，直至注射1x106个CAR-T细胞后第60天，小鼠的存活百分比为100％(图12C)。
实施例8：用于产生工程化T细胞组合物的非扩增过程的进一步设计。
使用实施例1中所述的非扩增过程产生含有表达CAR的T细胞的原代T细胞的工程化组合物，但是改变一个或多个步骤中的某些参数以评估与所述方法的适合性。作为比较，使用实施例1中所述的扩增过程产生CAR工程化的T细胞。
a.非扩增过程-抗CD3/抗CD28珠
使用实施例1.a中所述过程以抗CD3/抗CD28抗体缀合的珠进行非扩增过程，其中在旋转接种后，将细胞重悬于不含细胞因子的无血清培养基(基础培养基)中，并且允许在开始用抗CD3/抗CD28珠刺激之后在约37.0℃下在孵育器中孵育96小时。
另外，进行类似过程，但是在旋转接种后，将细胞重悬于不含细胞因子的无血清培养基(基础培养基)中，并且允许在开始用抗CD3/抗CD28珠刺激之后在约37.0℃下在孵育器中孵育72小时。
b.非扩增过程-抗CD3/抗CD28 Fab寡聚试剂
使用实施例1.b中所述的过程以抗CD3/抗CD28 Fab寡聚试剂进行非扩增过程，但是其中与实施例1中所述过程相比，在刺激期间使用的寡聚试剂的量减少5倍(0.2X；对于每106个细胞0.8μg)。
在所述过程的一个组中，选择CD4+和CD8+T细胞并以1:1比率混合，以产生含有大约600x106个T细胞(300x106个CD4+和300x106个CD8+T细胞)的输入组合物。通过以下方法刺激来自混合输入细胞组合物的细胞：与如实施例2中所述产生的480μg(或0.8μg/1x106个细胞)的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂一起孵育，所述孵育在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中进行了18-30小时之间。在刺激后，通过以693g旋转接种30分钟，用实施例1中所述的编码抗BCMA CAR的慢病毒载体转导细胞。在旋转接种后，洗涤细胞并将其重悬于不含重组细胞因子的无血清培养基(基础培养基)中，并且在约37.0℃下在孵育器中进行孵育。在开始转导后24小时后(在开始刺激后大约48小时)，添加1.0mM D-生物素并与细胞混合以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂从寡聚链霉亲和素试剂解离。将细胞再孵育约48小时(在开始刺激后96小时)，然后洗涤并用如实施例1A中所述的冷冻保护剂进行配制。
在所述过程的另一组中，选择CD4+和CD8+T细胞，以1:1的比率混合，以产生含有大约600x106个T细胞(300x106个CD4+和300x106个CD8+T细胞)的输入组合物，并且严格如上文所述进行刺激。在该组中，通过以693g旋转接种30分钟，用实施例1中所述的编码抗BCMACAR的慢病毒载体转导细胞。在旋转接种后，洗涤细胞并将其重悬于不含重组细胞因子的无血清培养基(基础培养基)中，并且在约37.0℃下在孵育器中进行孵育。在开始转导后24小时后，添加1.0mM D-生物素并与细胞混合以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂从寡聚链霉亲和素试剂解离。将细胞再孵育另外24小时(在开始刺激后72小时)，然后洗涤并用如实施例1A中所述的冷冻保护剂进行配制。
c.过程的总结
表E5概述使用如上所述的方法产生的过程，以及使用模拟空载体的方法。
表E5：
Figure BDA0003008592730003471
Figure BDA0003008592730003481
实施例9：对从用于产生工程化T细胞组合物的非扩增过程产生的细胞的表型和功 能的评估。
针对各种表型和功能特征评估如实施例8中所述产生的T细胞组合物。
a)表型和分化标记
将从如实施例8中所述的扩增和非扩增工程化过程产生的T细胞组合物用识别表面标记(包括CD4、CD8、CCR7和CD27)的抗体进行染色，并通过流式细胞术进行定量。CD4+CAR+T细胞的CCR7+CD27+细胞的百分比显示于图13A中。如图所示，如与扩增工程化过程相比，在从每种非扩增工程化过程产生的T细胞组合物中观察到CCR7+CD27+的百分比更大。对CCR7和CD27呈阳性的细胞的百分比与在刺激和转导之前输入组合物(CMAT)中存在的细胞的百分比相似。
将如实施例8中所述从扩增(第9天)和非扩增工程化过程产生的T细胞组合物用识别表面标记(包括CD4、CD8、CCR7、CD45RA)的抗体和针对CAR表达的替代标记进行染色，并通过流式细胞术进行定量。指示效应记忆CD45RA+细胞(CCR7-CD45RA+；EMRA)、幼稚样T细胞(CCR7+CD45RA+；幼稚)、效应记忆(CCR7-CD45RA-；EM)或中枢记忆(CCR7+CD45RA-；CM)的CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞的百分比显示于图13B中。在所述工程化过程后，结果显示，与从涉及转导后细胞扩增的扩增过程产生的细胞相比，从非扩增过程产生的T细胞中CD45RA+CCR7+幼稚样细胞和CCR7+CD45RA-细胞(中枢记忆)的百分比更大。类似地，与从涉及转导后细胞扩增的扩增过程产生的细胞相比，在从非扩增过程产生的细胞中效应记忆CCR7-CD45RA-和效应记忆CD45RA+(CCR7-CD45RA+)细胞有所减少。
这些结果与从非扩增工程化过程产生的工程化细胞组合物一致，所述工程化细胞组合物中具有幼稚样和中枢记忆样的分化程度更低的表型的细胞的份额大于通过扩增过程产生的细胞组合物。
b.细胞溶解活性
将K562细胞工程化以表达BCMA(K562-BCMA)，并且用作靶细胞。将K563-BCMA靶细胞与来自通过如实施例8中所述的扩增或非扩增过程产生的组合物的示例性抗BCMACAR T细胞以各种效应子与靶细胞(E:T)比率一起孵育0-96小时的持续时间。基于替代标记的表达调整效应细胞数量以反映总CAR+细胞。将靶K562-BCMA靶细胞用NucLight Red(NLR)标记以允许通过显微镜检查对其进行追踪。
通过在48小时、72小时或96小时的时间段内每4小时测量活靶细胞的损失来评估细胞溶解活性，如通过红色荧光信号(使用
Figure BDA0003008592730003491
活细胞分析系统，EssenBioscience)所确定。通过将靶细胞计数除以每次培养开始时的细胞计数来产生归一化的靶细胞数量。通过以下方式来评估靶标杀伤的百分比：测量归一化靶细胞计数随时间变化的曲线下面积(AUC)，并通过定义0％值(仅靶细胞)和100％值(在媒介物对照中与靶细胞共培养的CAR+T细胞)将AUC倒数(1/AUC)值归一化。杀伤的EC50由虚线显示。
Figure BDA0003008592730003492
Figure BDA0003008592730003493
如图14所示，在实施例8中产生的所有工程化T细胞组合物都展现功能的等效性，如通过该测定中类似的细胞溶解活性所确定。
c.慢性刺激
在长期刺激测定中评估来自如实施例8中所述产生的T细胞组合物的细胞的活性，所述长期刺激测定涉及在与重组BCMA Fc融合蛋白缀合的顺磁珠的存在下连续孵育6天以提供CAR依赖性刺激物，其模拟细胞在长期暴露于抗原(如在体内施用后可能发生)后存活的适合度和能力。
在各个时间点评估T细胞组合物中活细胞的总数量、在孵育的第1天至第6天测量的总活细胞的如定量为曲线下面积的扩增以及活力百分比，并且来自示例性实验的结果分别显示于图15A-图15C中。在长期刺激的过程期间观察到活细胞T细胞总数量的增加(图15A)。如图15B所示，与通过扩增过程产生的细胞相比，从非扩增细胞过程产生的T细胞组合物展现更大的细胞扩增，表明从所述非扩增过程产生的细胞的适合度有所提高。在该测定中，在从不同工程化过程产生的T细胞之间，活细胞的百分比是相似的(图15C)。
在第6天刺激结束时，将细胞去珠以去除BCMA-Fc珠，并确定CAR频率以归一化CAR+细胞，之后在细胞内细胞因子染色终点测定中评估所述细胞响应于第二抗原刺激物的能力。将尚未用BCMA-Fc珠刺激(D0)的细胞或已经用BCMA-Fc珠刺激的来自第6天(D6)的细胞与RPMI-8226细胞系以针对组间的CAR+细胞归一化的1:1的效应子与靶标比率一起培养。将培养物在高尔基体抑制剂(Golgi inhibitor)的存在下孵育5小时。然后将CAR+T细胞针对细胞因子的细胞内积累进行染色，并通过流式细胞术进行分析。
在慢性刺激后第0天(图16A)和第6天(图16B)两者，与从扩增过程产生的细胞相比，从非扩增过程产生的细胞展现类似的或更好的细胞因子谱。在针对IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-13进行细胞内细胞因子染色后，通过流式细胞术评估多功能细胞因子产生。在通过于供体内缩放将数据归一化之后，确定如在CD4+CAR+和CD8+CAR+细胞中确定的来自细胞因子的累积水平的多功能得分或IL-2包含性得分，图16C。从非扩增过程产生的细胞显示比从扩增过程产生的细胞更高的多功能性，包括在第二抗原刺激物之后。这些结果与以下观察结果一致：从非扩增过程产生的细胞展现提高的适合度。
实施例10：倍增数与细胞分化或患者反应之间的关系
产生含有表达对CD19具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞的示例性治疗性T细胞组合物。抗CD19 CAR含有源自鼠抗体的抗CD19 scFv(源自FMC63的可变区)、源自免疫球蛋白的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。
对于用于施用至患有复发性和难治性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者的细胞组合物的产生，经由白细胞单采术从所述受试者分离自体细胞。使白细胞单采术样品经受用于产生CAR表达细胞的过程。所述过程涉及使用自动化洗涤来洗涤细胞以及用于纯化CD4+和CD8+T细胞的基于免疫亲和力的选择，从而得到分别富含CD8+(其中中值为99％(四分位距(IQR)为98-100％)的细胞是CD8+)和CD4+(其中中值为99％(IQR为99-100％)的细胞是CD4+)细胞的两种组合物。
将富集CD4+和CD8+组合物的细胞用抗CD3/抗CD28顺磁珠激活，然后使其单独经受用编码具有4-1BB共刺激结构域的抗CD19 CAR的载体进行的慢病毒转导。然后将转导的群体在刺激试剂的存在下单独孵育以供细胞扩增。将扩增的CD8+和CD4+细胞单独配制和冷冻保存并在施用前储存。为了使批次和/或源自不同患者的细胞组合物(例如具有不同患者属性的那些)之间在指示细胞健康的参数方面的差异降至最低，在批次间将细胞保持在恒定的体积。细胞产物展现活细胞浓度的窄范围(基于对一组受试者的细胞组合物的评估，CD8+：中值为31x106个细胞/mL，IQR为28-40x106个细胞/mL，N＝38；CD4+：中值为35x106个细胞/mL，IQR为31-40x106，N＝36)。
使用产生的T细胞组合物在如下文所述的患有复发性和难治性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者中施用。
A.治疗性T细胞组合物的示例性属性
使用流式细胞术来评估产生的用于在下文所述的患有复发性和难治性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者中施用的治疗性T细胞组合物的CCR7和CD27。还评估用作替代标记的CD4和截短的受体的表面表达水平。
对于产生的每种治疗组合物，还基于细胞的总核计数(TNC)，通过以吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)或DAPI进行的双重荧光染色，使用以下公式确定产生的细胞组合物的倍增数：
Figure BDA0003008592730003511
图17A显示产生治疗组合物的过程中的倍增数与CD4+CAR+细胞中CD27+细胞的百分比之间的相关性。对于CD8+T细胞观察到类似结果。结果显示，通常，在用于产生治疗性T细胞组合物的过程期间的较低倍增数与增加的CD27+细胞的水平相关。不希望受限于理论，上述结果与以下观察结果一致：如上文实施例中所述产生的非扩增过程中增加的CD27+细胞的百分比可能受到这些过程中的有限倍增的影响。在同一研究的另一组患者中，显示类似结果(图17B)。
对基本上与上述相同的过程中扩增步骤期间的过程中接种密度进行建模的研究显示，预期与较低接种密度(例如0.05x106个细胞/mL或更低)相比，相对较高的接种密度(例如0.35x106个细胞/mL或更高)会降低达到收获标准的群体倍增数(图17C)。建模还揭示，预期与较低接种密度或较长过程持续时间相比，相对较高的接种密度(图17D)或较短的过程持续时间(图17E)也会分别导致输出治疗性T细胞组合物(例如，药物产品)中对CD27呈阳性的CD8+CAR+T细胞的百分比增加。这些数据与以下发现一致：在扩增步骤开始时细胞的较高接种密度或较短过程持续时间可以导致工程化治疗性T细胞组合物中中枢记忆细胞的比例增加。
B.抗CD19 CAR+T细胞组合物的施用
在临床研究中，将上述治疗性CAR+T细胞组合物施用至患有复发性或难治性(R/R)侵袭性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者。具体地，向患有R/R NHL的成年人类受试者群组施用抗CD19 CAR表达T细胞组合物，所述R/R NHL包括从头的或从惰性淋巴瘤转化的(NOS)弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、高级别B细胞淋巴瘤(包括双/三打击)、从慢性淋巴细胞白血病(CLL)或边缘区淋巴瘤(MZL)转化的DLBCL、原发性纵膈大b细胞淋巴瘤(PMBCL)和3b级滤泡性淋巴瘤(FLG3B)。单独评估完整群组内核心子集的受试者(不包括患有较差体能状态(ECOG 2)、从边缘区淋巴瘤(MZL)和/或慢性淋巴细胞白血病(CLL，里希特氏)转化的DLBCL的那些受试者，并且不包括患有原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(PMBCL)和3b级滤泡性淋巴瘤(FLG3B)的那些受试者(核心群组))的结果。核心群组包括如下受试者：患有DLBCL NOS型和转化的滤泡性淋巴瘤(tFL)或高级别B细胞淋巴瘤(双/三打击)或高级别B细胞淋巴瘤(具有MYC和BCL2和/或BCL6重排以及DLBCL组织学(双/三打击))并且东部肿瘤协作组体能状态(ECOG PS)为0或1。此实施例中呈现的此时间点的分析是基于已被施用抗CD19 CAR表达细胞的完整群组中的总计91名受试者(评估88名(65名来自核心群组)的反应，并评估91名(67名来自核心群组)的安全性)的评估。
在静脉内施用之前，将含有抗CD19 CAR表达细胞的冷冻保存的细胞组合物解冻。通过施用以大约1:1的目标比率单独施用的配制的CD4+CAR+细胞群和配制的CD8+CAR+群体，将治疗性T细胞剂量作为限定的细胞组合物来施用。向受试者施用CAR表达T细胞的单剂量或双剂量(每个单剂量通过分别单独输注CD4+CAR表达T细胞和CD8+CAR表达T细胞来施用)，如下：剂量水平1(DL1)的单剂量含有5x107个总CAR表达T细胞，或者剂量水平2(DL2)的单剂量含有1x108个总CAR表达T细胞。在一些情况下，向受试者施用DL1的双剂量，其中每个剂量相隔大约十四(14)天施用，在第1天和第14天施用，包括由于给药错误无意间按照双剂量时间表接受了两个DL2剂量的一名受试者。以DL1和DL2施用的组合物的T细胞子集的剂量水平和目标数量示于表E6中。在核心群组中，向34名受试者施用DL1，并且向27名受试者施用DL2。
Figure BDA0003008592730003531
表E7显示在两个剂量水平下完整群组和核心群组的总体反应和安全性结果。客观反应率(ORR)为74％，包括52％显示完全反应(CR)的受试者。任何等级的细胞因子释放综合征(CRS)的发生率为35％，其中有1％严重CRS；并且任何等级的神经毒性(NT)的发生率为19％，其中有1％严重NT。
Figure BDA0003008592730003532
a四名以DL1D(剂量水平1，双剂量时间表)治疗的患者具有类似结果。
b包括具有PD、死亡或28天重分期扫描事件的患者。一名患者未能进行重分期扫描。
c包括在数据快照日期前28天已接受至少一个剂量的合规CAR表达细胞产物或者死亡的所有受试者。
C.抗CD19 CAR表达T细胞的细胞属性与反应之间的关联
评估治疗组合物中CAR+T细胞的某些表型属性与有关临床反应结果的参数之间的关系。组合物中的记忆表型与功能之间的相关性被转换为中枢记忆子集组合物与所观察到的CAR+细胞的峰值体内扩增(ρ＝0.42，P＝0.002)和无进展存活期(PFS)(卡普兰-迈耶存活期估计，P＝0.0164)之间的正相关性。图18A-图18D显示被施用CAR+T细胞组合物的受试者的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线，将所述受试者分为被施用如下组合物的组：所述组合物所含的CD4+CAR+T细胞中(图18A关于无进展存活期，图18C关于反应持续时间)和CD8+CAR+T细胞中(图18B关于无进展存活期，图18D关于反应持续时间)CCR7+CD27+CAR+T细胞的频率高于或低于某个阈值水平。观察到组合物中较高的CCR7+CD27+记忆细胞与较长的无进展存活期相关联。
单变量分析揭示了在用于产生治疗性T细胞组合物的过程期间的T细胞群倍增(PDL)与非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者中无进展存活(PFS)的概率之间的负相关性。图18E显示对于在CD8+/CAR+T细胞中具有“高”(>6PDL)或“低”(<6PDL)PDL数的患者，基于最佳分割对数秩检验的PFS曲线。该结果与以下发现一致：在用于产生治疗性T细胞组合物的过程中可能限制T细胞的群体倍增数的因素可以提高受试者展现持久无进展存活的可能性。
实施例11：对通过非扩增制造过程产生的抗BCMA CAR-T细胞组合物的抗肿瘤活性 的评估。
用如实施例5中所述的体内小鼠异种移植肿瘤模型来评价从与实施例8中所述类似的非扩增和扩增工程化过程产生的CAR-T细胞组合物。在肿瘤植入后12天，将不同剂量的来自从扩增过程和非扩增过程产生的工程化T细胞组合物的抗BCMA CAR+T细胞施用至小鼠中。对照包括仅注射肿瘤细胞的小鼠以及注射肿瘤细胞和模拟转导的T细胞组合物的小鼠。实验组总结于表E8中。
表E8实验组的总结
Figure BDA0003008592730003541
Figure BDA0003008592730003551
通过活体发光成像、体重和存活评估所有组的小鼠的肿瘤负荷。如图19A和图19B中所示，如与被施用来自扩增过程的CAR T细胞的小鼠相比，用从非扩增过程(其中在第5天(图19A)或第4天(图19B)收集细胞)产生的CAR T细胞治疗的小鼠似乎在施用大约4x105个抗BCMA CAR+T细胞的中等剂量时展现减小的肿瘤负荷。.
在CAR-T细胞治疗的小鼠中评价体内扩增和持久性。在施用CAR-T细胞后5天(图20A)、13天(图20B)、19天(图20C)或26天(图20D)从小鼠收集血液样品，并且通过流式细胞术分析细胞。对于不同剂量中的每一种，如与扩增过程相比，在从被施用从非扩增过程产生的CAR+T细胞的小鼠获得的样品中，每μL血液中T细胞和CAR+T细胞的总数量有所增加。
实施例12：使用脉冲场凝胶电泳评估工程化以表达重组蛋白的细胞中的整合转基 因拷贝数的方法
研究了在用于评估用含有编码重组蛋白的转基因序列的病毒载体转导的细胞中的载体拷贝数的方法中使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)作为分离高分子量DNA的策略。
用含有编码重组蛋白(在这种情况下为嵌合抗原受体(CAR))的转基因序列的慢病毒制剂转导Jurkat T细胞系。将细胞培养3天，然后从细胞分离基因组DNA。作为对照，从未用编码转基因序列的慢病毒转导的细胞分离基因组DNA，并向所分离的基因组DNA加标已知量的编码重组蛋白的质粒和编码水疱性口炎印第安纳型病毒G蛋白的非整合病毒包装质粒(VSVg)。
使DNA样品经受自动化脉冲场凝胶电泳(PFGE)(例如BluePippin(Sage Science，马萨诸塞州贝弗利)装置)，以将高分子量DNA种类与低于15kb、17.5kb或20kb的阈值的低分子量非染色体DNA种类分离。
使用对转基因序列独有的序列具有特异性的引物(例如，对重组蛋白的调节元件具有特异性的引物)对高分子量DNA样品进行示例性定量聚合酶链反应(qPCR)方法，如微滴式数字PCR(ddPCR)。为了进行比较，还使用对VSVg编码序列(“包装质粒”)具有特异性的引物进行ddPCR，以检测预期不会整合到细胞染色体中的加标DNA或转导细胞中的残留包装质粒；并使用对管家基因具有特异性的引物(例如，编码核糖核酸酶P蛋白亚基p30的基因(RRP30；“基因组对照”)的引物)进行ddPCR，以检测所有样品中的基因组DNA。使用对作为归一化的参考的白蛋白(ALB)基因具有特异性的引物。还对未经受PFGE(凝胶前)的DNA样品进行了反应。为了进行ddPCR，将样品添加到含有每种引物组和探针的混合物中，使用微滴生成器产生微滴，将产生的微滴转移到PCR板，并在以下PCR条件下进行扩增：95℃ 10min；[94℃ 30sec；60℃ 1min]x 39个循环，以2℃/sec的速率渐变；98℃ 10min；以及4℃，不限时间。扩增后，在微滴读取器上测量来自微滴的信号。将每个基因的拷贝数针对二倍体基因组数量(cp/二倍体基因组，使用对作为参考的白蛋白(ALB)基因具有特异性的引物来扩增)或每50ng的基因组DNA进行归一化。
如图21上图所示，在含有加标CAR编码质粒和VSVg包装质粒的未转导样品中，仅在未经历PFGE(凝胶前)的样品中检测到转基因序列和VSVg序列。相比之下，在所有经受针对15kb、17.5kb或20kb或更高的高分子量DNA的PFGE的样品中检测到基因组对照序列。该结果证明，在所分离的DNA的PCR扩增之前进行PFGE实现了非整合低分子量质粒的分离。
在转导的样品中，在PFGE之前的样品(凝胶前)和经受高于15kb、17.5kb或20kb的PFGE的样品两者中检测到转基因序列(底部图)。VSVg包装质粒序列发现于凝胶前样品中并且在更高分子量的DNA中几乎不可检测。可能源自由病毒产生的残留质粒序列的这些序列预期不会整合到细胞的基因组中。在所有样品中也检测到包括染色体DNA在内的基因组DNA：观察到在所有样品中RRP30管家基因的拷贝数为每个二倍体基因组中大约2个拷贝。
包括PFGE的测定允许检测整合序列或基因组序列，同时去除非整合的低分子量核酸种类。因此，结果显示，在来自分离DNA的转基因序列的PCR扩增之前使用PFGE分离高分子量DNA，可以用作整合载体拷贝数(iVCN)测定以促进对已经整合至基因组中的转基因序列的拷贝数的特异性确定。
实施例13：在细胞制造过程期间的不同时间点通过使用或不使用脉冲场凝胶电泳 (PFGE)的微滴式数字PCR(ddPCR)评估的转基因拷贝数的比较。
在实施例12中描述的涉及在通过qPCR进行载体拷贝数分析之前通过PFGE分离高分子量种类的iVCN方法用于在细胞工程化过程期间的不同时间点评估在Jurkat T细胞系和原代T细胞两者中编码嵌合抗原受体(CAR)的示例性转基因序列的整合拷贝数。将所述方法与标准载体拷贝数(VCN)测定进行比较，所述标准载体拷贝数测定不包括通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)分离高分子量和低分子量DNA种类。
对于研究，从细胞制备基因组DNA并通过以下方法进行转基因序列拷贝数的评估：(1)iVCN方法，大体上如上文实施例12中所述，使用>15kb的分离阈值(“iVCN”)和PippinHT(Sage Science，马萨诸塞州贝弗利)装置；或者(2)标准VCN方法，其中并不首先通过PFGE分离基因组DNA(“VCN”)。在两种测定中，转基因拷贝数通过ddPCR使用对转基因特有的序列具有特异性的引物来确定，并针对如使用对参考基因(例如，白蛋白(ALB)基因)具有特异性的引物确定的二倍体基因组进行归一化。
A)Jurkat细胞系
将Jurkat T细胞用含有编码CAR的转基因序列的慢病毒制剂转导，大体上如上文实施例12中所述。在转导前(“之前”)，在转导后5分钟、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时和96小时获得细胞样品，并将其用于分析转基因拷贝数。
如图22A所示，在将Jurkat细胞工程化的过程中的不同时间点期间在进行PFGE的情况下的转基因拷贝数评估(iVCN)以检测在基因组中的整合拷贝数显示，在这些细胞中转基因整合直到约6小时才可检测到，并且直到约48小时才增加，此时拷贝数检测大体上趋于稳定。相比之下，通过标准VCN方法检测细胞中转基因拷贝数的在未进行PFGE的情况下的转基因拷贝数评估证明了从早得多的时间点开始大量检测到转基因序列。该观察结果与标准VCN方法在细胞工程化之后的这些早期时间点检测非整合转基因序列(如生产质粒、线性或环状互补DNA(cDNA)或自体整合体)的能力一致。在未进行PFGE的情况下确定的转基因拷贝数后来在约96小时下降到与通过iVCN整合拷贝数评估(进行PFGE)检测到的水平相似的水平，这表明尽管转基因整合在大约48小时完成，但未进行PFGE的标准VCN方法直到约96小时或在这些细胞中转导后才准确。
B)原代细胞工程化
使用示例性工程化过程，将来自人受试者的原代T细胞工程化为表达CAR。从来自白细胞单采术样品的分离的PBMC选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物，并且将选择的细胞组合物冷冻保存。随后将CD4+和CD8+T细胞的单独组合物解冻，并且以1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合。在存在以1:1珠与细胞比率的顺磁性聚苯乙烯包被珠与附着的抗CD3和抗CD28抗体的情况下在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中刺激混合组合物的大约300x106个T细胞(150x106个CD4+T细胞和150x106个CD8+T细胞)，持续18与30个小时之间。
在孵育后，洗涤来自刺激的细胞组合物的大约100x106个活细胞，并将其重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中。通过以大约1600g旋转接种60分钟用编码抗BCMA CAR的慢病毒制剂转导细胞。旋转接种后，将细胞洗涤并重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，并且在约37℃下孵育约18至30小时。所述抗BCMA CAR含有对BCMA具有特异性的scFv抗原结合结构域、CD28跨膜区、4-1BB共刺激信号传导区和CD3-ζ来源的细胞内信号传导结构域。
然后，通过转移到生物反应器(例如摇摆运动生物反应器)中的约500mL培养基中来培育细胞以进行扩增，所述培养基含有两倍于在孵育和转导步骤期间所用的浓度的细胞因子。当达到设定的活细胞密度时，开始灌注，其中在持续混合下通过半连续灌注更换培养基。将细胞在生物反应器中培育，直到达到约3x109个细胞的阈值细胞数量(TNC)，这通常发生在涉及6-7天扩增的过程中。通过暴露于磁场将抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠从细胞组合物中去除。然后收集细胞并将其用冷冻保护剂配制。
为了通过如上所述的iVCN和标准VCN方法分析DNA，在转导前(“之前”)，转导后24小时、48小时、72小时、96小时、120小时和在工程化过程完成时(“完成”)获得细胞样品。
如图22B所示，如在PFGE后确定的转基因拷贝数(iVCN)直到转导后约24小时才被检测到，并直到约48至72小时才增加。在未进行PFGE的测定(VCN)中，转基因拷贝数在早期时间点(24和48小时)要高得多，但后来在约96小时下降到与通过整合拷贝数评估(iVCN)检测到的水平相似的水平。在两种测定中，在转导后96小时或更长时间处获得的样品中，所评估的拷贝数是相似的。
结果证实，在进行PFGE的情况下的载体拷贝数评估(iVCN)揭示转基因整合在转导后的各时间点处的时间安排是一致的。观察结果进一步表明，通过不涉及PFGE的标准VCN方法进行的评估可以在发生整合到基因组中之前的时间检测细胞中的转基因序列，因此证明标准VCN方法可能不完全适合对转导后少于4天的样品评估载体拷贝数。
实施例14：在各种非扩增制造过程期间使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对整合转基因 拷贝数的评估
在用于产生基因工程化T细胞组合物的示例性过程期间的不同时间点，使用大体上如实施例12和13中所述的iVCN和VCN方法评估编码嵌合抗原受体(CAR)的转基因的拷贝数。示例性过程不涉及转导后的扩增步骤，并且在刺激试剂、培养基和收获时间方面是不同的。
对于每个过程，从两名不同的人受试者(供体A和供体B)从自人白细胞单采术样品分离的PBMC选择CD4+和CD8+原代人T细胞的单独组合物。将选择的细胞冷冻保存，随后解冻并以1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合。通过与如下刺激试剂一起孵育来刺激混合的细胞组合物：(1)抗CD3/抗CD28抗体缀合的顺磁珠(“珠”)，(2)浓度为4.0μg/106个细胞的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂，或者(3)浓度为0.8μg/106个细胞的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂。所述孵育在含有重组细胞因子的无血清培养基中进行大约18至30小时。
然后将细胞洗涤并通过旋转接种用含有编码CAR的转基因序列的慢病毒制剂转导。然后将细胞与不含血清、生长因子或重组细胞因子的基础培养基(“基础”)或含有重组IL-2、IL-5和IL-15细胞因子的无血清培养基(“完全”)一起孵育。在开始与珠试剂一起孵育后96小时后，将细胞暴露于磁场以去除顺磁珠。在开始与寡聚体刺激试剂一起孵育后24小时、48小时或96小时后，将细胞暴露于生物素持续10分钟以解离并去除寡聚物链霉亲和素试剂。将细胞洗涤并用冷冻保护剂配制。
解冻细胞并从收获的细胞制备基因组DNA。为了进行转基因拷贝数的评估，如上文实施例12和13中所述，使用对转基因序列具有特异性的引物对DNA进行ddPCR，所述DNA已经受>15kb的高分子量级分的PFGE。还通过流式细胞术、针对CAR、CD3和激活的半胱天冬酶3(aCas3)的表达的染色来评估细胞样品。
结果显示于图23A-图23B中。如图23A所示，对于使用寡聚试剂刺激的细胞，在开始刺激后进行孵育24小时或48小时的样品中，通过iVCN测量的整合转基因拷贝数增加，但不进一步增加。直到开始刺激后约96小时，如通过标准VCN(未进行PFGE)测量的转基因拷贝数仍大大高于如通过iVCN测量的整合转基因拷贝数。该结果与以下观察结果一致：标准VCN方法(未进行PFGE)直到该过程中96小时的时间点才是准确的。对于使用珠试剂刺激的细胞，在96小时，与用完全培养基孵育的细胞相比，对于用基础培养基孵育的细胞观察到更高的整合拷贝数。如图23B所示，整合转基因拷贝数与CAR表达细胞的百分比(如通过流式细胞术所得的CD3+细胞中CD3+/激活的Cas3-/CAR+细胞的百分比所确定)是相关的。该结果进一步支持iVCN测定用于评估整合拷贝数的实用性，特别是当评估不同参数(包括孵育时间、培养基或试剂)在用于将细胞工程化的过程中的影响时的实用性。
实施例15：在各种细胞制造过程期间在进行或未进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)的情 况下通过微滴式数字PCR(ddPCR)评估的整合和非整合转基因拷贝数的比较
编码嵌合抗原受体(CAR)的整合和非整合转基因的数量在进行或未进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)的情况下通过对DNA样品的ddPCR来评估，所述DNA样品是在用于产生基因工程化T细胞组合物的各种示例性过程期间获得的。
A)用于工程化T细胞的示例性过程
所述示例性过程包括使工程化细胞经受细胞扩增的过程(扩增过程)和未扩增细胞的过程(非扩增过程)。
1)扩增过程-抗CD3/抗CD28珠
进行了大体上如实施例13.B中所述的扩增过程。
2)非扩增过程-抗CD3/抗CD28珠
与实施例14中所述类似地进行了使用抗CD3/抗CD28抗体缀合的珠的非扩增过程。选择CD4+和CD8+T细胞并将其以1:1的比率混合，以产生含有大约600x106个T细胞(300x106个CD4+T细胞和300x106个CD8+T细胞)的输入组合物。通过以下方法刺激混合输入细胞组合物：在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，在存在抗CD3/抗CD28抗体缀合的珠的情况下以1:1的珠与细胞比率将细胞孵育18-30小时。刺激后，将细胞洗涤并重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中。然后通过以大约693g旋转接种30分钟用慢病毒载体转导细胞，所述慢病毒载体编码在扩增过程中使用的相同的抗BCMA CAR。
在一个组中，在旋转接种后，将细胞重悬于不含血清且不含添加的生长因子或重组细胞因子的基础培养基(基础培养基)中，并允许在开始用抗CD3/抗CD28珠刺激后在约37.0℃下在培养箱中孵育约96小时。在另一个组中，进行了类似的过程，不同之处在于，在旋转接种后，将细胞重悬于不含添加的生长因子或重组细胞因子的基础培养基(基础培养基)中，并允许在开始用抗CD3/抗CD28珠刺激后在约37.0℃下在培养箱中孵育约72小时。
3)非扩增过程-抗CD3/抗CD28 Fab寡聚试剂
与实施例14中所述类似地进行了使用抗CD3/抗CD28 Fab寡聚试剂的非扩增过程。选择CD4+和CD8+T细胞并将其以1:1的比率混合，以产生含有大约600x106个T细胞(300x106个CD4+T细胞和300x106个CD8+T细胞)的输入组合物。通过以下方法刺激来自混合输入细胞组合物的细胞：与如实施例2中所述产生的480μg(或0.8μg/1x106个细胞)的抗CD3/抗CD28Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂一起孵育，所述孵育在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中进行18-30小时。在刺激后，通过以693g旋转接种30分钟，用编码扩增过程中所用相同抗BCMA CAR的慢病毒载体转导细胞。
在所述过程的一个组中，在旋转接种后，将细胞洗涤并重悬于不含血清、添加的生长因子或重组细胞因子的基础培养基(基础培养基)中，并在约37.0℃下在培养箱中孵育。在开始转导后约24小时(开始刺激后大约48小时)，在孵育期间添加1.0mM D-生物素，并将其与细胞混合以从寡聚链霉亲和素试剂解离抗CD3和抗CD28 Fab试剂。将细胞进一步孵育约48小时(开始刺激后96小时)，然后洗涤并用冷冻保护剂配制。
在所述过程的另一个组中，在旋转接种后，将细胞洗涤并重悬于不含血清、添加的生长因子或重组细胞因子的基础培养基(基础培养基)中，并在约37.0℃下在培养箱中孵育。在开始转导后约24小时，在孵育期间添加1.0mM D-生物素，并将其与细胞混合以从寡聚链霉亲和素试剂解离抗CD3和抗CD28 Fab试剂。将细胞再进一步孵育24小时(开始刺激后72小时)，然后洗涤并用冷冻保护剂配制。
4)过程的总结
表E9概述如上所述的过程以及使用模拟空载体的过程的特征。
表E9：过程的总结
Figure BDA0003008592730003621
B)对转基因拷贝数的评估
解冻细胞并从收获的细胞制备基因组DNA。为了进行整合转基因拷贝数的评估，总体上如上文实施例12和13中所述，使用对转基因序列具有特异性的引物对DNA进行ddPCR，所述DNA已经受>15kb的高分子量级分的PFGE(“iVCN”)。为了进行比较，也对在未经受PFGE的DNA进行了使用对转基因序列具有特异性的引物的ddPCR(“VCN”，高分子量和低分子量DNA两者)。还通过流式细胞术评估细胞样品，通过针对替代标记或用特异性结合至CAR的一部分的抗独特型抗体染色来针对CAR的表达进行染色。
结果显示于图24A-图24E中。如图24A所示，每个较短的非扩增过程产生了如下细胞，所述细胞所展现出的由VCN(未进行PFGE)确定的拷贝数高于由iVCN(进行PFGE)确定的拷贝数，这表明在通过这些较短过程工程化的样品中存在非整合转基因序列。通过使用iVCN的拷贝数除以使用VCN的拷贝数来确定的整合转基因的分数在使用非扩增过程产生的细胞中明显较低(图24B)。类似地，按1-整合转基因的分数确定的非整合转基因的分数在使用非扩增过程产生的细胞中显著更高(图24C)。如图24D所示，在使用较短过程产生的细胞中，通过从VCN减去iVCN确定的非整合转基因拷贝数平均在约0.8与1.3之间。使用未进行PFGE的标准VCN，每个CAR+细胞的转基因拷贝数显示于图24E中。该结果进一步支持iVCN方法用于在将细胞工程化的过程中评估整合和非整合转基因拷贝数的实用性。
实施例16：在各种扩增细胞制造过程期间的整合和非整合转基因拷贝数的比较
在进行或未进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)的情况下在DNA中的转基因拷贝数是通过在用于将T细胞基因工程化的过程中的不同时间点进行ddPCR来评估的，所述过程包括在转导后扩增细胞的步骤。
如实施例13.B中所述，将来自不同人供体的原代T细胞工程化为表达CAR。从扩增过程的第0天开始至第8天每天获得样品，包括在解冻材料时(TMAT；第0天)、在激活时(AMAT；第1天)、在转导时(XMAT；第2天)或在开始培育以扩增细胞后的不同时间(inoc+1至inoc+6；表示所述过程的第3-8天)获得样品。从细胞样品制备基因组DNA。为了进行整合转基因拷贝数的评估，如上文实施例12和13中所述，使用对转基因序列具有特异性的引物对DNA进行ddPCR，所述DNA已经受高分子量级分的PFGE(“iVCN”)。为了进行比较，也对在未经受PFGE的DNA进行了使用对转基因序列具有特异性的引物的ddPCR(“VCN”，高分子量和低分子量DNA两者)。大体上如上文实施例15中所述，还确定了非整合转基因拷贝数、整合转基因的分数和非整合转基因的分数。
代表性结果显示于图25中。如图所示，在转导当天或转导后的早期时间点(例如，inoc+1、inoc+2)，如通过标准VCN方法确定的由未经受PFGE的基因组DNA样品确定的拷贝数包括很大分数的非整合转基因。在转导后的稍晚时间点，如通过iVCN(进行PFGE)和标准VCN(未进行PFGE)确定的拷贝数大致相同，这表明在这些时间点，细胞中不再存在转基因的非整合拷贝。
实施例17：使用测序和分析方法对T细胞克隆性的评估
在基因工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)之前和之后，使用T细胞受体(TCR)对的单细胞测序评估T细胞组合物的T细胞克隆丰度。
通过基于免疫亲和力的选择通过白细胞单采术从受试者分离自体T细胞用于CD4+和CD8+T细胞的纯化，从而得到分别富含CD8+和CD4+T细胞的两种组合物。将富集CD4+和CD8+组合物的细胞用抗CD3/抗CD28顺磁珠激活，然后使其单独经受用编码抗CD19 CAR的载体进行的慢病毒转导。抗CD19 CAR含有源自鼠抗体的抗CD19 scFv(源自FMC63的可变区)、源自免疫球蛋白的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。然后将转导的群体在刺激试剂的存在下单独孵育以供细胞扩增。将含有CAR表达T细胞的扩增的CD8+和CD4+组合物单独配制和冷冻保存，并且储存。
评估通过上述过程工程化(CMAT)之前分离的CD4+和CD8+T细胞组合物的T细胞克隆性，以及通过上述过程工程化之后CD4+和CD8+治疗性CAR+T细胞组合物的T细胞克隆性。为了评估T细胞克隆性，大体上如WO 2016044227、WO 2016176322和WO 2012048340中所述，使细胞经受单细胞αβ配对的TCR测序。基于TCR基因的条码化的单细胞测序，确定细胞群中已鉴定的克隆的T细胞克隆性和多样性。在一些情况下，使用香农指数作为阈值来过滤克隆(“香农调整的克隆性”)，其保留样品间关系同时消除样品噪声。参见，Chaara等人(2018)Front Immunol 9:1038。
图26显示在应用香农指数之后每个样品的克隆性。如图26所示，在基因工程化之前和之后，CD4和CD8细胞的克隆性在T细胞组合物之间不同，其中与用于工程化细胞的过程开始之前组合物中的T细胞相比，工程化CAR+T细胞组合物展现降低的克隆性。
将基因工程化后的CD4+和CD8+治疗性CAR+T细胞组合物通过流式细胞术针对指示细胞凋亡的因子的表达(如用膜联蛋白V(膜联蛋白V-)进行表面染色)或半胱天冬酶3切割(指示非凋亡细胞)，以及针对各种表面标记(包括CD45RA、CCR7、CD27、CD4和CD8)的表达进行分选。细胞的表型与细胞的克隆性程度相关。观察到在CD4+和CD8+治疗性CAR+T细胞组合物两者中，呈CCR7-/CD27-的凋亡标记阴性细胞的存在与组合物中细胞的克隆性高度正相关。同样，呈CCR7+或CCR7+/CD27+的凋亡标记阴性细胞的存在与每一种CD4+和CD8+治疗性CAR+T细胞组合物中细胞的克隆性负相关。这些结果与以下观察结果一致：细胞的克隆性可能与分化程度较低的幼稚样细胞逆相关，如通过CCR7和/或CD27阳性所确定。
实施例18：在不同浓度的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂和培养基组成下从用于产 生工程化T细胞组合物的非扩增过程产生的细胞的表型的比较。
通过将T细胞组合物与不同浓度的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂以及与不同培养基组成一起孵育并评估工程化细胞，来评估用于产生T细胞组合物的过程。
基本上如实施例8中所述使用抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂从非扩增工程化过程产生T细胞组合物，但是使用各种滴度的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂。通常，在用寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂刺激后将细胞转导24小时，在开始刺激后48小时添加D-生物素，并且在开始刺激之后96小时收获细胞。具体地，通过与0.4μg/1x106个细胞、0.24μg/1x106个细胞或0.08μg/1x106个细胞的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂一起孵育，来刺激来自混合输入细胞组合物的CD4+和CD8+T细胞。
在刺激后，将细胞洗涤并重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中。然后通过以693g旋转接种30分钟，用实施例1中所述的编码抗BCMA CAR的慢病毒载体转导细胞。在旋转接种后，将细胞洗涤并重悬于以下培养基组合物中以供进一步孵育，直至在开始刺激之后96小时收获：
(i)不含任何另外的添加剂或重组细胞因子的基础培养基(例如CTS OpTmizer基础培养基，Thermofisher)(“基础”)；
(ii)含有2mM谷氨酰胺的基础培养基(“基础+Gln”)；
(iii)含有2mM谷氨酰胺并且添加了100IU/mL IL-2、600IU/mL IL-7和100IU/mLIL-15细胞因子(Cyt)的基础培养基(“基础+Gln+Cyt”)；
(iv)含有2mM谷氨酰胺、100IU/mL IL-2、600IU/mL IL-7和100IU/mL IL-15细胞因子(Cyt)的基础培养基，以及T细胞补充剂(例如，2.5％
Figure BDA0003008592730003662
补充剂，Thermofisher)(Opt)(“基础+Gln+Cyt+Opt”)；或
(v)完全培养基(“完全”)，其含有具有2mM谷氨酰胺、100IU/mL IL-2、600IU/mLIL-7和100IU/mL IL-15细胞因子的基础培养基、T细胞补充剂(例如，2.5％
Figure BDA0003008592730003661
补充剂，Thermofisher)，以及血清取代蛋白。
在约37.0℃下在孵育器中孵育细胞。在开始刺激后48小时后，添加D-生物素以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂从寡聚链霉亲和素试剂解离。然后收集细胞，将其洗涤并在冷冻保护剂的存在下进行配制。
然后将来自所产生的T细胞组合物的T细胞用识别表面标记(包括CD4、CD8、CCR7和CD45RA)的抗体以及针对CAR进行染色，并且通过流式细胞术进行定量。在突变蛋白试剂浓度与培养基组成的各种组合下，指示效应记忆CD45RA+细胞(CCR7-CD45RA+；EMRA)、幼稚样T细胞(CCR7+CD45RA+；幼稚)、效应记忆(CCR7-CD45RA-；EM)或中枢记忆(CCR7+CD45RA-；CM)的CD8+CAR+T细胞的百分比显示于图27中。结果显示在不同浓度的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的存在下和/或在不同培养基组成的存在下，所产生的细胞组合物的表型差异。这些结果与在用于产生工程化T细胞组合物的过程中控制表型分布的能力一致，如基于抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的浓度和/或培养基组成的类型。
实施例19：使用非扩增过程从不同供体产生的工程化T细胞的比较。
使用非扩增过程从来自三名人供体中每一名的细胞，从三名不同人供体产生含有表达CAR的T细胞的原代T细胞的工程化组合物。来自供体1的细胞是使用基本上如实施例1中所述的过程来产生，并且来自供体2的细胞是使用基本上如实施例8中所述的过程来产生。来自供体3的细胞是使用与实施例8中所述过程(涉及在用病毒载体转导之前进行激活，即使用附着有抗CD3和抗CD28抗体(珠)的顺磁性聚苯乙烯包被的珠或抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚试剂(寡聚物)激活T细胞)类似的过程来产生，但是所述过程使用含有3×108个CD4细胞和3×108个CD8 T细胞的输入细胞数量来进行。还使用基本上如实施例1中所述的扩增过程从匹配的供体制备工程化细胞组合物。
将从不同过程产生的T细胞用识别表面标记(包括CD4、CD8、CCR7和CD27)的抗体以及针对CAR表达进行染色，并且通过流式细胞术进行定量。对于三名不同供体中的每一名，对CCR7和CD27染色两者呈阳性的CD4+CAR+和CD8+CAR+T细胞的百分比显示于图28中。将所产生的T细胞组合物中CD4+CAR+T细胞或CD8+CAR+T细胞的CCR7+CD27+细胞的百分比分别与在与刺激试剂一起孵育之前输入组合物(“起始材料”)中CCR7+CD27+细胞的百分比进行比较。对于所有供体，该实验的结果表明，在从非扩增工程化过程产生的T细胞组合物中观察到始终高的CCR7+CD27+的百分比，而在通过扩增过程从三名供体产生的工程化T细胞组合物中观察到CCR7+CD27+T细胞的百分比的更高可变性。
也将从三名供体产生的原代T细胞的工程化组合物用识别表面标记(包括CD4、CD8、CCR7和CD45RA)的抗体以及针对CAR表达进行染色，并且通过流式细胞术进行定量。指示效应记忆CD45RA+细胞(CCR7-CD45RA+；EMRA)、幼稚样T细胞(CCR7+CD45RA+；幼稚)、效应记忆(CCR7-CD45RA-；EM)或中枢记忆(CCR7+CD45RA-；CM)的CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞的百分比显示于图29中。
实施例20：对用于产生治疗性细胞组合物的过程中的所选(输入)细胞组合物的特 征的评估。
评估在通过实施例10中所述的过程用抗CD19 CAR工程化之前从患有复发性和难治性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者选择的T细胞的表型属性。从来自多名受试者的人外周血单核细胞(PBMC)的白细胞单采术通过基于免疫亲和力的富集来选择CD4+和CD8+T细胞。评估此类所选T细胞的组合物(在基因工程化之前，命名为“工程化前组合物”)中指示某些T细胞亚型(如效应记忆或中枢记忆细胞亚型)的细胞表面标记(包括C-C趋化因子受体7型(CCR7)、CD27和CD45RA)的表达，并且评估CD4或CD8的表面表达。
对富集的CD4+和CD8+组合物(例如，输入组合物)的评估揭示，如存在于中枢记忆T细胞子集上的对幼稚样标记呈阳性的T细胞(例如CD27+CD28+T细胞)的百分比在NHL患者之间高度可变(图18F)。该数据表明，在用于产生CAR+T细胞治疗性T细胞组合物的所选(输入)T细胞组合物中存在中枢记忆T细胞子集的患者间T细胞异质性。
基本上如实施例10中所述使用所选(输入)T细胞组合物来产生CD4+和CD8+治疗性T细胞组合物。还如实施例10中所述基于细胞的总核计数(TNC)来确定产生的细胞组合物的倍增数。确定所选(输入)T细胞组合物中细胞的表型属性与用于产生治疗组合物的过程中的倍增数之间的相关性。如图18G所示，富集的CD4+(输入)组合物中通过针对CD45RA和CCR7的阴性染色(CD45RA-CCR7-)鉴定的效应记忆CD4+T细胞的较高百分比与治疗性T细胞组合物的产生期间的群体倍增数正相关。对于CD8+T细胞观察到类似结果。
上文结果支持如下方式：其包括在用于产生工程化T细胞组合物的过程中使用的输入组合物中降低效应记忆T细胞的百分比和/或富集对幼稚样或中枢记忆细胞子集的标记呈阳性的T细胞。与上文结果一致，这种方式可以改进工程化治疗性T细胞组合物的一种或多种特征，如降低患者间可变性，降低用于产生工程化治疗性T细胞组合物的过程中的群体倍增数，和/或增加受试者可以展现持久PFS的可能性。
实施例21：对在小分子mTOR激酶抑制剂的存在下产生的工程化T细胞中的T细胞表 型和功能的评估。
通过基于免疫亲和力的富集从来自人供体受试者的白细胞单采术样品分离CD4+和CD8+T细胞。在第1天，将分离的CD4+和CD8+T细胞以1:1混合，并在无血清培养基中用如实施例2中所述产生的抗CD3/抗CD28寡聚刺激试剂进行刺激，所述无血清培养基补充有重组IL-2(100IU/mL)、重组IL-7(600IU/mL)和重组IL-15(100IU/mL)，且含有或不含1μM的2-(3-羟苯基)-9-(2-异丙基苯基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-甲酰胺(化合物63)。将与或不与化合物63一起培养的T细胞在37℃下孵育过夜(大约24hr)，然后在含有或不含化合物63(1mM)的无血清培养基中用编码抗CD19 CAR的慢病毒载体进行转导。CAR含有对CD19具有特异性的scFv抗原结合结构域(源自FMC63)、CD28跨膜区、4-1BB共刺激信号传导区域、和源自CD3-ζ的细胞内信号传导结构域。在转导后，在不含重组细胞因子并且含有或不含化合物63(1mM)的无血清培养基(基础培养基)中孵育细胞，并且允许在开始用抗CD3/抗CD28寡聚刺激试剂刺激之后在约37.0℃下在孵育器中孵育长达96小时(直至所述过程的第5天)。在开始孵育后大约24小时(所述过程的第3天)，添加1mM生物素。在孵育后，从每名供体收获CD4+和CD8+T细胞，对其进行配制和低温冷冻。
使低温冷冻的工程化CD4+和CD8+T细胞解冻，并且评估T细胞的细胞内S6磷酸化、核糖体蛋白和mTOR抑制的标记，并且针对CD4或CD8的表面表达和针对作为记忆子集的标记的CCR7和CD45RA进行共染色。通过CCR7和CD45RA的表达按记忆子集显示活CD8+T细胞中的pS6表达，如图30A所示。如图所示，与化合物63一起孵育减小刺激的记忆T细胞子集(即Temra、Tem和Tcm细胞)的平均荧光强度，表明对mTOR的抑制，同时对活细胞随时间变化的百分比或总数量没有显著影响。CD8+T细胞中PS6的平均荧光强度(MFI)显示于图30B中。如图30C和图30D所示，化合物63的存在分别未影响所产生组合物中活细胞的百分比或总活细胞。
在用PMA/离子霉素和高尔基体抑制剂刺激后，评估解冻的通过所述过程产生的细胞的细胞凋亡标记(例如，半胱天冬酶阳性CAR-T细胞的百分比)、表型谱以及产生细胞内细胞因子的能力。如图31A所示，来自与化合物63一起孵育的样品的T细胞展现的细胞内半胱天冬酶表达少于未与化合物63一起孵育的那些，表明在用于产生工程化细胞的过程期间化合物63的存在改进T细胞组合物的总体细胞健康。还通过流式细胞术将解冻细胞针对CD27和CCR7的表面表达进行染色。如图31B(CD8+T细胞)和图31D(CD4+T细胞)所示，与化合物63一起孵育没有显著改变细胞的表型子集谱，如通过CD27和/或CCR7的表达所评估。如通过细胞内细胞因子IL2、IFNg或TNF的水平所证明，在化合物63的存在下产生的CD4+和CD8+T细胞的功能活性在已经在化合物63的存在下产生的工程化CD8+T细胞(图31C)和CD4+T细胞(图31E)两者中都得到显著改进。
为了进一步评估细胞的功能活性，将所产生的T细胞组合物在12天中用与针对抗CD19 CAR的抗独特型(ID)抗体缀合的珠进行长期刺激，并且监测细胞的扩增和存活(图31F，左图)以及通过曲线下面积计算的总扩增度量(图31F，右图)。如图所示，在不存在化合物63的情况下刺激细胞导致与CAR的慢性刺激一致的随时间降低的细胞扩增，以及长期刺激后持续功能的损失。结果显示，在已经在化合物63的存在下产生的工程化细胞中，在长期CAR特异性刺激后，观察到改进的T细胞功能。
实施例22：在用于产生工程化T细胞组合物的非扩增过程中样品冷冻保存的作用。
在用于产生含有表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的原代T细胞的工程化组合物的过程中，对已经被冷冻保存的细胞进行不同过程，所述冷冻保存通过冷冻保存起始白细胞单采术样品或者通过冷冻保存已经从新鲜白细胞单采术样品分离的CD4+和CD8+T细胞来进行。从三名健康人供体收集白细胞单采术样品并洗涤。将每名供体的白细胞单采术样品的等分部分冷冻保存，而每个白细胞单采术样品的另一等分部分不进行冷冻保存，并且立即用于如下文所述来选择CD4+和CD8+T细胞。
在一种过程(冷冻保存的单采术)中，工程化T细胞组合物从冷冻保存的白细胞单采术样品的三个供体等分部分单独制造。使冷冻保存的白细胞单采术样品解冻，并且通过基于免疫亲和力的选择从每个样品选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物。将所选CD4+和CD8+T细胞立即用于工程化所述细胞的下游步骤中。
在另一过程(冷冻保存的T细胞材料)中，通过基于免疫亲和力的选择从尚未低温冷冻的白细胞单采术样品的三个等分部分直接选择CD4+和CD8+细胞。在选择后，将单独CD4+和CD8+T细胞组合物低温冷冻，然后在用于工程化所述细胞的后续下游步骤之前将其解冻。
在两种过程中，所述过程的下游步骤包括以1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合所选CD4+和CD8+T细胞以产生输入组合物。通过与0.2X(0.8μg/1x106个细胞)的如实施例2中所述产生的抗CD3/抗CD28Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中一起孵育18-30小时，刺激来自混合输入细胞组合物的细胞。在刺激后，通过旋转接种用编码CAR(在此情况下是实施例6中所述的示例性抗CD19CAR)的慢病毒载体来转导细胞。在旋转接种后，将细胞洗涤并以约0.75x106个细胞/mL的密度重悬于不含重组细胞因子的无血清培养基(基础培养基)中，并且在约37.0℃下在孵育器中进行孵育。在开始刺激后48小时后(在开始孵育后约24小时)，添加1.0mM D-生物素并与细胞混合，以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂从寡聚链霉亲和素试剂解离。将所述细胞再孵育另外约48小时(在开始刺激后约96小时±6小时或直至所述过程的第5天)，然后用冷冻保护剂进行配制。
表E10概述用于所评估的每个样品的过程的特征。
Figure BDA0003008592730003711
比较两种过程的细胞属性(活力、总活有核细胞、产率)，包括在下游过程步骤期间和在收获的制造的细胞组合物中。还通过流式细胞术评估收获时的细胞，针对CAR的表达使用作为细胞健康量度的抗独特型抗体激活的半胱天冬酶3(aCas3)以及针对各种表面标记(包括CD25、CD45RA、CCR7、CD27、CD28、CD62L、CD4和CD8)的表达进行染色。还评估产生细胞因子的能力。
结果显示，与从新鲜单采术选择的细胞相比，从冷冻保存的单采术样品选择的CD4+T细胞和CD8+T细胞的活力存在一些潜在下降。然而，在下游过程步骤后(如在刺激、转导后和在收获时)对细胞的比较显示，使用冷冻保存的单采术(CrAPH)的过程得到与使用冷冻保存的T细胞选择材料(CMAT)的过程中的细胞相比相似或改进的属性。例如，在选择之前对白细胞单采术样品的冷冻保存导致相似或更高的细胞活力(图32A)、类似或更高的总活有核细胞数量(图32B)以及类似或更高的累积产率(图32C)。
在收获时，对细胞表型的比较显示，与使用冷冻保存的T细胞选择材料相比，在选择前使用冷冻保存的单采术样品制造的细胞组合物展现类似或更高的CAR+细胞百分比(图32D)、更高的Cas-CAR+细胞百分比(图32E)以及类似或更高的CD25+细胞百分比(图32F)。来自两种过程的细胞组合物还展现类似的产生细胞因子的能力和类似的分化表型，且在通过两种过程产生的细胞之间Tem和Temra未增加(数据未显示)。
实施例23：对刺激孵育长度对T细胞表型的作用的评估。
从白细胞单采术样品选择CD4+和CD8+T细胞的单独组合物，然后进行低温冷冻。将选择的细胞解冻，随后以1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合以产生输入组合物。在转导前，通过与0.2X(0.8μg/1x106个细胞)的如实施例2中所述产生的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂一起孵育不同刺激孵育时间(包括0、16、24和48小时)，刺激输入组合物。
在一个组中，转导细胞后立即用寡聚刺激试剂刺激(0h)，而其他组包括在转导前用寡聚刺激试剂刺激16小时、24小时或48小时。转导通过用编码CAR(在此情况下是实施例6中所述的示例性抗CD19 CAR)的慢病毒载体旋转接种来进行。旋转接种后，将细胞洗涤并以约0.75x106个细胞/mL的密度重悬于不含重组细胞因子的无血清培养基(基础培养基)中，并且在约37.0℃下在孵育器中孵育大约72小时。例如，对于16h和24h样品，将细胞孵育直至开始刺激后约96小时±6小时。在开始孵育后约48小时，添加1.0mM D-生物素并与细胞混合，以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂从寡聚链霉亲和素试剂解离。由于刺激时间的差异，在第4天(0h刺激)、第5天(16h或24h刺激)或第6天(48h刺激)收获细胞；将收获时间错开，使得每组进行大致相同的72小时转导后孵育。针对CAR的表达使用作为细胞健康量度的抗独特型抗体激活的半胱天冬酶3(aCas3)以及针对各种表面标记(包括CD45RA、CCR7、CD4和CD8)，通过流式细胞术评估工程化细胞的表型。
图33显示以从开始刺激起0、16、24或48小时的刺激孵育时间产生的aCas3-CD4+CAR+细胞和aCas3-CD8+CAR+细胞的记忆表型谱。更长刺激孵育在CD4和CD8细胞两者中导致降低的幼稚表型(CD45RA+CCR7+)细胞的百分比，且在Cas3-CD8+CAR+细胞之间特定差异明显。
实施例24：不同制造过程之间的T细胞组合物的特征。
比较使用不同非扩增过程产生的T细胞组合物，所述非扩增过程在多种特征方面不同，包括起始细胞来源(冷冻保存的单采术或新鲜单采术)、寡聚刺激试剂的浓度和用于刺激的细胞数量。将两种过程与其中培育细胞以供扩增的两种不同的示例性过程进行比较。所述过程对健康供体或对患者供体进行。
A.非扩增过程
比较两种不同的非扩增过程，其被命名为非扩增过程A和非扩增过程B。
在非扩增过程A中，从人供体收集白细胞单采术样品并洗涤。通过基于免疫亲和力的选择从尚未低温冷冻的白细胞单采术样品直接选择CD4+和CD8+细胞。在选择后，将单独CD4+和CD8+T细胞组合物低温冷冻，然后解冻，然后将所选的CD4+和CD8+T细胞以1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合以产生输入组合物。通过与0.8μg/1x106个细胞的如实施例2中所述产生的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂一起孵育，刺激来自混合输入细胞组合物的约600x106个细胞(约300x106个CD4+和300x106个CD8+)。所述刺激在无血清完全培养基中进行18-30小时(24±6小时)，所述无血清完全培养基含有基础培养基(例如，CTSTMOpTmizer基础培养基，Thermo Fisher)、T细胞补充剂(例如，2.6％
Figure BDA0003008592730003731
T细胞扩增补充剂，Thermo Fisher)、免疫细胞血清替代物(例如，2.5％CTSTM免疫细胞血清替代物)、2mM L-谷氨酰胺、二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，1.0％GlutamaxTM，Thermo Fisher)、重组100IU/mL IL-2、重组600IU/mL IL-7和重组100IU/mL IL-15。在刺激后，通过用编码CAR(在此情况下是实施例1中所述的示例性抗BCMA CAR或实施例6中所述的示例性抗CD19 CAR)的慢病毒载体旋转接种，转导多达300x106个细胞。在旋转接种后，将细胞洗涤并以高达约0.75x106细胞/mL的密度重悬于含有2mM谷氨酰胺但未添加重组细胞因子的基础培养基(例如，CTSTMOpTmizer基础培养基，Thermo Fisher)中，并且在约37.0℃下在孵育器中进行孵育。在开始刺激后约48小时±6小时后(在开始孵育后约24小时)，添加1.0mM D-生物素并与细胞混合，以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂从寡聚链霉亲和素试剂解离。将细胞再孵育另外约48小时(在开始刺激后约96小时±6小时或直至所述过程的第5天)，然后用冷冻保护剂进行配制。
在非扩增过程B中，从人供体收集白细胞单采术样品，洗涤并冷冻保存。使冷冻保存的白细胞单采术样品解冻，并且通过基于免疫亲和力的选择从每个样品选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物，然后将CD4+和CD8+T细胞混合，目的是产生多达约900x106个活CD4+和CD8+T细胞的输入组合物，并且活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率可变。通过与1.2μg/1x106个细胞的如实施例2中所述产生的抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂(其中1.2μg寡聚刺激试剂包括0.9μg寡聚颗粒和0.15μg抗CD3 Fab和0.15μg抗CD28Fab)一起孵育，刺激混合的输入细胞组合物。所述刺激在针对过程A所述的相同无血清完全培养基中进行16-24小时(20±4小时)。在刺激后，通过用编码CAR(在此情况下是实施例1和实施例6中所述相同的示例性抗BCMA CAR或示例性抗CD19 CAR)的慢病毒载体旋转接种，转导多达约600x106个细胞。在此研究中，与较高浓度的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂一起孵育的细胞展现改进的转导效率(数据未显示)。在旋转接种后，将细胞洗涤并以0.75x106个细胞/mL的密度重悬于含有2mM谷氨酰胺和2.6％T细胞补充剂(例如2.6％
Figure BDA0003008592730003741
补充剂，Thermofisher)但未添加重组细胞因子的基础培养基(例如，CTSTMOpTmizer基础培养基，Thermo Fisher)中，并且在约37.0℃下在孵育器中进行孵育。在开始刺激后约48小时±6小时后(在开始孵育后约24小时)，添加1.0mM D-生物素并与细胞混合，以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂从寡聚链霉亲和素试剂解离。将细胞再孵育另外约48小时(在开始刺激后约96小时±6小时或直至所述过程的第5天)，然后用冷冻保护剂进行配制。
B.扩增过程
比较两种不同的扩增过程，其被命名为扩增过程X和非扩增过程Y。
在扩增过程X中，各自表达相同嵌合抗原受体(CAR)(抗CD19或抗BCMA)的工程化CD4+T细胞和工程化CD8+T细胞通过如下过程产生，所述过程涉及使富集的CD4+和富集的CD8+细胞群单独经受过程步骤，包括单独选择、冷冻保存、刺激、转导、扩增和收获步骤。将白细胞单采术样品洗涤并用于通过基于免疫亲和力的选择来分离CD4+和CD8+T细胞，得到富含CD4+T细胞的组合物和富含CD8+T细胞的组合物。用抗CD3/抗CD28顺磁珠激活富集的CD4+和CD8+组合物的细胞，然后使其单独经受使用实施例6中所述编码示例性抗CD19 CAR的载体进行的慢病毒转导。去除顺磁珠，然后将转导的群体在重组IL-2和IL-15细胞因子(以及另外地用于CD4+T细胞组合物的重组IL-7)的存在下单独孵育，并且在用于细胞扩增的摇摆运动生物反应器中培育直至达到约4倍扩增的阈值，如在从开始扩增起9天与13天之间。然后单独收获细胞，对其进行配制和低温冷冻。
在扩增过程Y中，从人白细胞单采术样品选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物并将其低温冷冻。随后使所选细胞组合物解冻并以1:1的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合。在附着有抗CD3和抗CD28抗体的顺磁性聚苯乙烯包被的珠以1:1的珠与细胞的比率的存在下，在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，将混合组合物的大约300x106个T细胞(150x106个CD4和150x106个CD8+T细胞)刺激18至30小时。在所述孵育后，将来自刺激的细胞组合物的大约100x106个活细胞在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中浓缩。通过以大约1600g旋转接种60分钟用编码示例性CAR(在此情况下是如实施例1中所述的抗BCMA CAR)的慢病毒载体转导细胞。在旋转接种后，将细胞重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，并且在约37℃下孵育约18至30小时。然后，通过转移到生物反应器(例如摇摆运动生物反应器)中的约500mL示例性无血清培养基中来培育细胞以进行扩增，所述无血清培养基含有两倍于在孵育和转导步骤期间所用的浓度的IL-2、IL-7和IL-15。当达到设定的活细胞密度时，开始灌注，其中在持续混合下通过半连续灌注更换培养基。第二天在生物反应器中培育细胞，直至达到约3x16个细胞/mL的阈值细胞密度，这通常发生在涉及6-7天扩增的过程中。通过暴露于磁场将抗CD3和抗CD28抗体缀合的顺磁珠从细胞组合物中去除。然后收集细胞，对其进行配制和冷冻保护。
C.工程化T细胞组合物的特征
a)CD4/CD8频率和CD4/CD8比率。
将从扩增和非扩增工程化过程产生的T细胞组合物用识别表面标记(包括CD3、CD4和CD8)的抗体染色，并且通过流式细胞术进行定量，如图34A和图34B所示。产生模拟转导的T细胞组合物并用作对照。如与从扩增过程Y产生的T细胞组合物相比，使用任一非扩增过程产生的细胞组合物展现关于CD4+和CD8+T细胞的百分比和CD4/CD8 T细胞比率在样品之间降低的可变性。因为扩增过程X产生单独的CD4和CD8组合物，CD4+或CD8+T细胞各自报告为在通过该过程产生的相应组合物中以100％存在。
b)倍数扩增/群体倍增。
对于产生的每种治疗组合物，还基于细胞的总核计数(TNC)，通过以吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)或DAPI进行的双重荧光染色，使用以下公式来确定所产生细胞组合物的倍增数：
Figure BDA0003008592730003761
图35显示，使用任一非扩增过程产生的细胞组合物不仅展现降低的倍数扩增。
c)记忆谱
将从扩增和非扩增工程化过程产生的T细胞组合物针对激活的半胱天冬酶3(aCas3)并用识别表面标记(包括CD4、CD8、CCR7、CD27和CD45RA)的抗体进行染色。确定指示幼稚/幼稚样T细胞(CD45RA+CCR7+)、中枢记忆(CD45RA-CCR7+)、效应记忆(CD45RA-CCR7-；TE+EM)和效应记忆CD45RA+细胞(CCR7-CD45RA+；TEMRA)的T细胞的百分比。如图36A所示，与扩增过程相比，非扩增过程一致地富集中枢记忆/幼稚样T细胞并且使TE+EM和TEMRA在终产物中的百分比降至最低。
在对CCR7和CD27染色两者呈阳性的aCas-T细胞中，CD4+CAR+和CD8+CAR+T细胞的百分比显示于图36B中。如图所示，与扩增过程相比，非扩增过程一致地富集CCR7+CD27+细胞。
这些结果进一步支持从非扩增过程产生的工程化细胞组合物的一致性产生，所述工程化细胞组合物中具有幼稚样的分化程度更低的表型的细胞的份额高于从扩增过程产生的细胞组合物。
实施例25：来自匹配的供体材料的非扩增和扩增过程的比较
使用离体制造T细胞的非扩增和扩增过程从八名匹配的供体产生含有表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的原代T细胞的工程化T细胞组合物，并且比较细胞组合物的属性。
A.工程化细胞组合物
从1名健康供体和患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)的三名患者(两名患者患有弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL；并且一名患者患有套细胞淋巴瘤MCL)收集白细胞单采术样品，并且进行制造运行以使用如实施例24中所述的非扩增过程A以抗CD19 CAR将T细胞工程化。将所述工程化T细胞组合物与使用基本上如实施例24中所示过程X中所述的扩增过程从供体匹配的过程运行产生的T细胞组合物进行比较。抗CD19 CAR含有源自鼠类抗体的抗CD19 scFv(源自FMC63的可变区，VL-接头-VH定向)、源自免疫球蛋白的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。病毒载体还含有编码截短的受体的序列，所述截短的受体用作CAR表达的替代标记；所述序列通过T2A核糖体跳跃序列与所述CAR序列隔开。
从1名健康供体和三名患者(患有多发性骨髓瘤)收集白细胞单采术样品，并且进行制造运行以使用如实施例24中所述的非扩增过程B以抗BCMA CAR将T细胞工程化。将工程化T细胞组合物与使用基本上如实施例24中所示过程Y中所述的扩增过程从供体匹配的过程运行产生的T细胞组合物进行比较。所述抗BCMA CAR含有对BCMA具有特异性的scFv抗原结合结构域、CD28跨膜区、4-1BB共刺激信号传导区和CD3-ζ来源的细胞内信号传导结构域。病毒载体还含有编码截短的受体的序列，所述截短的受体用作CAR表达的替代标记；所述序列通过T2A核糖体跳跃序列与所述CAR序列隔开。
将产生的细胞组合物用识别表面标记(包括CD4、CD8、CCR7、CD27和CD45RA)的抗体进行染色，并且通过流式细胞术进行定量。图37A中的结果显示，如与供体匹配的扩增工程化过程相比，在从每种非扩增工程化过程产生的T细胞组合物中，在CD4+组(p<0.01)和CD8+组(p<0.05)两者中观察到CD27+CCR7+细胞的百分比显著更高。另外，如与供体匹配的扩增工程化过程相比，在从每种非扩增工程化过程产生的T细胞组合物中，在CD4+组(p<0.01)和CD8+组(p<0.05)两者中观察到CD27+CCR7-细胞的百分比显著更低。如与供体匹配的扩增工程化过程相比，在从每种非扩增工程化过程产生的T细胞组合物中，还在CD4+组(p<0.01)中观察到CD27-CCR7-细胞的百分比显著更低。
图37B中的结果显示，从每种非扩增工程化过程产生的T细胞组合物富含CCR7+细胞(CCR7+CD45RA-细胞和CCR7+CD45RA+细胞)，且在CD4和CD8两组中CCR7-细胞(CCR7-CD45RA-细胞和CCR7-CD45RA+细胞)较少。
B.长期CAR依赖性刺激后的活性
在长期刺激测定中测定来自通过不同过程从匹配供体产生的工程化T细胞组合物的细胞的活性，所述长期刺激测定涉及在与针对CAR的拮抗性抗独特型抗体缀合的顺磁珠的存在下连续孵育9至14天以提供CAR依赖性刺激物，其模拟细胞在长期暴露于抗原(如在体内施用后可能发生)后存活的适合度和能力。
1.增殖能力
在如上所述用对CAR具有特异性的抗ID抗体进行持续10天的长期CAR依赖性刺激后，评估增殖能力。在长期刺激后，测量总活细胞的数量，以评估与在扩增过程中从匹配供体产生的细胞相比，从非扩增过程产生的细胞的效力和扩增潜力。如图38和图39所示，与供体匹配的扩增细胞产物中的工程化细胞相比，来自抗CD19或抗BCMA非扩增细胞产物的细胞分别展现显著增强的增殖能力。这些结果与以下观察结果一致：非扩增细胞产物含有更高相对比例的分化程度较低的T细胞(包括维持与中枢记忆和干细胞记忆T细胞类似的特征的细胞)，并且因此可能具有响应于经由其CAR的信号传导经历另外多轮分裂的能力。
2.细胞溶解活性
为了进行细胞溶解潜力的评估，将如上所述在非扩增或扩增过程中工程化的抗CD19 CAR T细胞用对CAR具有特异性的抗ID抗体刺激10-14天，并且基于至第10天观察到的增殖总结扩增数据。将被转导以表达CD19的K562细胞(K562-CD19)用NucLight Red(NLR)标记，以允许通过显微镜检查对其进行追踪。将在长期刺激之前或之后来自非扩增或扩增过程的工程化CAR-T细胞组合物与K562-CD19以1:1和0.5:1的效应子与靶细胞(E:T)比率一起共培养。通过测量在96小时时间段内活靶细胞的损失来评估细胞溶解活性，如通过红色荧光信号(使用
Figure BDA0003008592730003791
活细胞分析系统，Essen Bioscience)所确定。将数据转化为曲线下面积(AUC)，用于针对单独供体/过程或依据制造过程进行比较。
如图40A所示，如与使用扩增过程产生的T细胞组合物相比，使用非扩增过程产生的工程化CAR-T细胞组合物展现类似的细胞溶解活性，表明在制造后，所有细胞在其杀伤靶细胞的能力方面都表现出高效。然而，在长期刺激后，在效应子与靶标的低比率下，使用非扩增过程产生的CAR-T细胞展现的保留功能性细胞溶解活性的能力高于使用扩增过程产生的匹配供体细胞(图40B)。
3.细胞因子产生
为了进行细胞因子产生的评估，将如上所述在非扩增或扩增过程中工程化的抗CD19 CAR T细胞用对CAR具有特异性的抗ID抗体刺激9至14天。将在长期刺激之前或之后来自非扩增或扩增过程的工程化CAR-T细胞组合物在板结合的抗ID上孵育5小时。通过流式细胞术测量细胞内IL-2、IFNγ或TNF细胞因子产生。在CD4+CAR+或CD8+CAR+群体内确定表达单一细胞因子的CAR+细胞的频率。还通过三重阳性细胞的布尔逻辑门(Boolean logicgating)确定基于CD4+CAR+和CD8+CAR+细胞中三种细胞因子的同时产生的多功能得分。通过Mann-Whitney评估统计显著性，*p<0.05。
在长期刺激前，从非扩增和扩增过程两者产生的抗CD19CAR-T细胞的细胞因子产生是稳健的，并且在两种过程之间没有显著不同。两种产生的细胞组合物都展现产生多功能药物产品的能力，如通过IL-2、IFNγ和TNF的分泌所显示(图41)。在长期刺激后，与扩增过程相比，这些细胞因子的分泌(特别是多功能分泌)在使用非扩增过程产生的CAR-T细胞中通常较多(图41B)。
C.体内活性
1.BCMA+OPM-2骨髓瘤模型
在OPM-2小鼠异种移植骨髓瘤肿瘤模型中评价从非扩增和扩增匹配供体工程化过程产生的抗BCMA CAR-T细胞组合物。在免疫受损的NOD-Scid-IL-2γ受体缺陷性(NSG)小鼠中植入2x106个工程化以表达萤火虫萤光素酶的OPM2细胞，以促进通过生物发光成像进行检测。在肿瘤植入后约12天小鼠具有中等肿瘤负荷时，将小鼠随机化为多个组以平衡肿瘤负荷。将大约1x106个CAR-T细胞/小鼠(n＝8只小鼠/组)静脉内施用至小鼠。通过使FfLuc阳性生物发光(BLI)成像来评估肿瘤生长。
图42A(左图)显示所有组的生物发光辐射亮度(光子/秒[p/s]；y轴)(肿瘤负荷)的变化，并且图42A(右图)显示每组从BLI的曲线下面积(AUC)计算的从第-1天(治疗前)至治疗后第50天的肿瘤生长。如图所示，与通过扩增过程产生的匹配供体CAR-T细胞相比，在等效剂量下，从非扩增过程产生的CAR-T细胞显示更优的抗肿瘤活性。
在治疗后的不同天数监测血液中的循环CAR-T细胞。如图42B所示，在治疗后第5天，与非扩增过程相比，血液中每μL的CAR-T细胞的绝对计数对于通过扩增过程产生的CAR-T细胞而言更高。然而，在第5天之后，与用来自扩增过程的CAR-T细胞治疗的小鼠相比，用来自非扩增过程的CAR-T细胞治疗的小鼠显示更多的CAR-T细胞扩增。在最初的滞后之后，从非扩增过程产生的细胞的CAR-T细胞扩增展现更优的增殖能力，其扩增是使用扩增过程产生的细胞的约5-10倍。
2.CD19+Nalm6白血病模型
在Nalm-6急性淋巴细胞白血病(ALL)肿瘤模型中评价从非扩增和扩增匹配供体工程化过程产生的抗CD19 CAR-T细胞组合物。向NOD.Cg-PrkdcscidIL-2rgtm1Wjl/SzJ小鼠静脉内注射5.0x105个Nalm-6萤火虫萤光素酶-绿色荧光蛋白(FfLuc-GFP)淋巴细胞白血病细胞，并且在3天后，将小鼠随机化为多个组以平衡肿瘤负荷。该模型是缓慢生长的肿瘤模型，其中在未施用CAR-T细胞的小鼠中，小鼠截至大约第24天至第26天达到末期疾病。在植入后第4天，将大约1x106或2.5x105个CAR-T细胞/小鼠(n＝8只小鼠/组)静脉内施用至小鼠。通过使Nalm-6 FfLuc阳性生物发光(BLI)成像来评估播散性肿瘤生长。
图43A显示用较高1.0x106剂量(上图)和较低2.5x105剂量(下图)治疗的所有组的生物发光辐射亮度(光子/秒[p/s]；y轴)的变化。图43B(右图)显示用较高1.0x106剂量(上图)和较低2.5x105剂量(下图)治疗的每组从BLI的曲线下面积(AUC)计算的从第-1天(治疗前)至治疗后第50天的肿瘤生长。如图所示，在用从非扩增过程产生的CAR-T细胞治疗的小鼠中，无延迟地发生肿瘤完全消退直至第50天，而以使用扩增过程产生的CAR-T细胞治疗的小鼠最初显示肿瘤生长消退，但在许多动物中未能维持。
在治疗后的不同天数监测血液中的循环CAR-T细胞。如图43C所示，如通过血液中每μL的CAR-T细胞的绝对计数所确定，观察到CAR-T细胞的极低扩增，这与该模型中的较低肿瘤负荷一致。在第11天后，与扩增过程相比，在用来自非扩增过程的CAR-T细胞治疗的小鼠中观察到改进的CAR-T细胞的增殖能力。
D.结论
总之，所述结果支持，与通过扩增过程产生的CAR-T细胞相比，通过非扩增过程产生的CAR-T细胞具有富含幼稚样和中枢记忆T细胞的分化程度较低的表型。从非扩增过程产生的CAR-T细胞展现在用抗原进行长期或重复刺激后保留实质性功能活性的能力。另外，虽然展现较慢的初始体内扩增速率，但结果与以下发现一致：从非扩增过程产生的CAR-T细胞展现长期持久性并且能够介导长期抗肿瘤活性。
实施例26：非扩增和扩增工程化过程的动力学
在通过基本上如上文实施例中所述进行的多种非扩增或扩增过程的制造运行期间和之后，对细胞进行复合物分析。制造运行包括与实施例24中所述的那些类似的大规模运行。制造运行还包括规模缩小模型(SDM)，其中在用于工程化细胞的过程中使用较低细胞数量。通常，规模缩小制造运行共享表E11中所述的过程活动。
Figure BDA0003008592730003811
Figure BDA0003008592730003821
在制造运行期间的不同时间和结束时收集细胞，并对其进行计数，并在用识别表面标记(包括CD4、CD8、CCR7、CD27和CD45RA)的抗体染色后通过流式细胞术评估所述细胞的活力。
在制造运行期间监测过程度量，如总活细胞(图44A)和活力(图44B)。如图44A所示，在第5天时间点观察到最小细胞扩增，且稳健扩增在第5天之后开始。图44B显示制造运行中的细胞活力最初下降，并在所述过程的第5天之后随着细胞开始扩增而开始增加。在制造运行中的不同时间点比较记忆/分化表型的结果显示于图44CA(依据CD5RA和CCR7表达)和图44D(依据CD27和CCR7表达)中。如图所示，对制造运行期间早期的细胞的评估显示，与所述过程中的更早时间(例如第1天或第2天)或所述过程中的更晚时间(例如第9天)两者的细胞相比，约第5天的细胞显著更多地富含分化程度更低的细胞类型，如CCR7+CD45RA-或CCR7+CD27+细胞。
不希望受限于理论，这些结果与以下观察结果一致：在所述过程早期的细胞组合物中，用抗CD3/抗CD28刺激试剂刺激细胞可以导致分化程度更高的细胞(如效应子样细胞(CCR7-CD45RA-)和TEMRA(CCR7-C D45RA+))的激活诱导的细胞死亡(AICD)，从而导致细胞活力下降和分化程度更低细胞的富集。在一些方面，在细胞扩增可能导致进一步分化之前，在约第5天完成所述过程使富集群体的恢复最大化。此外，如实施例16和图25所示，第5天也是工程化细胞中CAR表达稳定的时间点，如通过标准VCN测定或iVCN测定确定的载体拷贝数的差异所证明。总之，这些结果支持缩短的用于工程化CAR-T细胞的制造过程的实用性。
实施例27：细胞制造过程期间标准VCN测定和iVCN测定与重组受体的表面表达的 相关性
上述载体拷贝数(VCN)和iVCN测定用于确定通过慢病毒转导引入T细胞中的编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的转基因的拷贝数，并且结果与CAR的表面表达相关。在该研究中，对由来自不同人供体的原代T细胞产生的细胞组合物进行所述测定，所述原代T细胞已使用大体上如实施例2.B中所述的扩增过程或大体上如实施例4.A.3中所述但具有如下修改的非扩增过程被工程化为表达CAR：其中将细胞用抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂激活，接着进行转导并在基础培养基(其不包括添加重组细胞因子，无细胞因子培养基)中短时间孵育，之后进行收获。
在用于在缩短的、非扩增过程或在扩增过程中工程化的过程结束时从细胞样品制备基因组DNA。如实施例1中所述进行VCN和iVCN测定，其使用>15kb的分离阈值(“iVCN”)和PippinHT(Sage Science，马萨诸塞州贝弗利)装置；或(2)标准VCN方法，其中基因组DNA首先不通过PFGE分离(“VCN”)。
结果表明，使用VCN测定评估的转基因拷贝数大体上与通过iVCN评估的转基因拷贝数相关(图45A)。然而，对于使用非扩增过程制造的细胞，通过VCN获得的值高于通过iVCN获得的值，这与检测可能存在于含有使用非扩增过程产生的细胞的样品中的非整合转基因序列的VCN测定一致。相比之下，对于使用扩增过程制造的细胞，通过VCN和iVCN获得的值几乎相同(在VCN＝iVCN线附近)。这些差异可能是由于与扩增过程相比，在较短的非扩增过程中样品中存在更大量的游离的、非整合转基因序列拷贝所致。这些结果与以下观察结果一致：与iVCN测定相比，能够检测高分子量和低分子量DNA两者的标准VCN测定具有局限性，特别是当用于在转基因引入后的早期评估细胞时，如在将T细胞工程化的缩短过程(其中游离的、非整合转基因序列拷贝可能仍存在于样品中)中。
为了评估iVCN或VCN测定与CAR的表面表达的相关性程度，通过流式细胞术评估来自非扩增或扩增过程的细胞样品的CD3、CD45和CAR的表达，以确定在活CD45+细胞中CD3+CAR+细胞的百分比。如图45B所示，与通过非扩增过程工程化相比，VCN测定展现出与通过扩增过程工程化的样品的CAR+细胞的百分比更好的相关性，这可能是由于存在未促进表面CAR表达的非整合CAR DNA序列。如图45C所示，在已通过非扩增或扩增过程工程化的细胞中，iVCN显示相似的与CAR表达的相关性。对于所有样品，与通过VCN测定(R2＝0.5903)确定的每个细胞中的拷贝数相比，CAR表达与通过iVCN测定(R2＝0.8952)确定的每个细胞中的拷贝数的相关性更高。
所述结果支持iVCN测定用于准确地确定特别是使用可保留游离、非整合转基因序列拷贝的非扩增过程产生的细胞的稳定整合的转基因序列的拷贝数的实用性。未区分整合转基因序列与非整合转基因序列的VCN测定在准确地确定稳定整合的转基因序列的数量方面受到限制，尤其是在较短的非扩增过程期间和之后。
本发明在范围上并不旨在受限于具体公开的实施方案，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。此类变化可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践，并且旨在落入本公开文本的范围内。
序列
Figure BDA0003008592730003851
Figure BDA0003008592730003861
Figure BDA0003008592730003871
Figure BDA0003008592730003881
Figure BDA0003008592730003891
Figure BDA0003008592730003901
Figure BDA0003008592730003911
Figure BDA0003008592730003921
Figure BDA0003008592730003931
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
<120> 产生工程化细胞的方法以及所述工程化细胞的组合物
<130> 73504-20174.40
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> 62/716,981
<151> 2018-08-09
<150> 62/742,249
<151> 2018-10-05
<150> 62/798,433
<151> 2019-01-29
<150> 62/842,402
<151> 2019-05-02
<150> 62/861,308
<151> 2019-06-13
<160> 123
<170> 用于Windows 4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子（IgG4铰链）
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔子（IgG4铰链）
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH3间隔子
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD28（登录号P10747的氨基酸153-179）
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD28（登录号P10747的氨基酸114-179）
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD28（P10747的氨基酸180-220）
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28（LL至GG）
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 4-1BB（Q07011.1的氨基酸214-255）
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD3ζ
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD3ζ
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD3ζ
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 20
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 21
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (5)...(9)
<223> SGGGG重复5次
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFRα链信号序列
<400> 24
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 25
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFRα链信号序列
<400> 25
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 28
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 29
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa是半胱氨酸或苏氨酸
<400> 31
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 32
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 33
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 34
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR L1
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR L2
<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR L3
<400> 37
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR H1
<400> 38
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR H2
<400> 39
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 CDR H3
<400> 40
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 43
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 scFv
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> KASQNVGTNVA人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SJ25C1 scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 HC-CDR3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 LC-CDR2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FMC63 LC-CDR3
<400> 56
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFv的序列
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 58
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 58
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 59
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 人IgG2 Fc (Uniprot P01859)
<400> 59
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 60
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 人IgG4 Fc (Uniprot P01861
<400> 60
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 61
<211> 159
<212> PRT
<213> 阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）
<220>
<223> UniProt编号P22629
<400> 61
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys
65 70 75 80
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr
85 90 95
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys
130 135 140
Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln
145 150 155
<210> 62
<211> 126
<212> PRT
<213> 阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）
<220>
<223> 最小链霉亲和素
<400> 62
Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser
20 25 30
Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
50 55 60
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val
100 105 110
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 63
<211> 126
<212> PRT
<213> 阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）
<220>
<223> 突变蛋白链霉亲和素Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47
<400> 63
Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly
20 25 30
Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
50 55 60
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val
100 105 110
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Strep-tag
<400> 64
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 65
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 65
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25
<210> 66
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 66
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20
<210> 67
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 67
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25
<210> 68
<211> 127
<212> PRT
<213> 阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）
<220>
<223> 突变蛋白链霉亲和素Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47
<400> 68
Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile
20 25 30
Gly Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr
50 55 60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp
65 70 75 80
Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp
85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu
100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链霉亲和素结合肽
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa是Gly或Glu
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> Xaa是Gly、Lys或Arg
<400> 69
Trp Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa
1 5
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链霉亲和素结合肽，Strep-tag
<400> 70
Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
<210> 71
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链霉亲和素结合肽的顺序模块
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> Xaa是任何氨基酸。
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa是任何氨基酸。
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Xaa是任何氨基酸。
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa是任何氨基酸。
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> Xaa是任何氨基酸。
<220>
<221> 变体
<222> (14)...(14)
<223> Xaa是任何氨基酸。
<220>
<221> 变体
<222> (15)...(15)
<223> Xaa是任何氨基酸。
<220>
<221> 变体
<222> (16)...(16)
<223> Xaa是任何氨基酸。
<220>
<221> 变体
<222> (17)...(17)
<223> Xaa是任何氨基酸或空。
<220>
<221> 变体
<222> (18)...(18)
<223> 如果位置17的Xaa是任何氨基酸，则位置18的Xaa是任何氨基酸。
如果位置17的Xaa是空，则位置18的Xaa是空。
<220>
<221> 变体
<222> (19)...(19)
<223> 如果位置17的Xaa是任何氨基酸，则位置19的Xaa是任何氨基酸。
如果位置17的Xaa是空，则位置19的Xaa是空。
<220>
<221> 变体
<222> (20)...(20)
<223> 如果位置17的Xaa是任何氨基酸，则位置20的Xaa是任何氨基酸。
如果位置17的Xaa是空，则位置20的Xaa是空。
<400> 71
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25
<210> 72
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链霉亲和素结合肽的顺序模块
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> Xaa是Gly或空。
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> 如果位置17的Xaa是Gly，则位置18的Xaa是Gly。
如果位置17的Xaa是空，则位置18的Xaa是空。
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> 如果位置17的Xaa是Gly，则位置19的Xaa是Gly。
如果位置17的Xaa是空，则位置19的Xaa是空。
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> 如果位置17的Xaa是Gly，则位置20的Xaa是Ser。
如果位置17的Xaa是空，则位置20的Xaa是空。
<400> 72
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25
<210> 73
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 73
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25 30
<210> 74
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 74
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25 30
<210> 75
<211> 159
<212> PRT
<213> 阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）
<220>
<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47
<400> 75
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys
65 70 75 80
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr
85 90 95
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys
130 135 140
Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln
145 150 155
<210> 76
<211> 126
<212> PRT
<213> 阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）
<220>
<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47
<400> 76
Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr
20 25 30
Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
50 55 60
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val
100 105 110
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 77
<211> 127
<212> PRT
<213> 阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）
<220>
<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47
<400> 77
Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val
20 25 30
Thr Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr
50 55 60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp
65 70 75 80
Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp
85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu
100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 78
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链霉亲和素结合肽
<400> 78
His Pro Gln Phe
1
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链霉亲和素结合肽
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa是Trp、Lys或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa是Gly或Glu
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> Xaa是Gly、Lys或Arg
<400> 79
Xaa Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa
1 5
<210> 80
<211> 159
<212> PRT
<213> 阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）
<220>
<223> 突变蛋白链霉亲和素Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47
<400> 80
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ala Arg Gly
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys
65 70 75 80
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr
85 90 95
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys
130 135 140
Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln
145 150 155
<210> 81
<211> 126
<212> PRT
<213> 阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）
<220>
<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47和
Glu117、Gly120、Try121（突变蛋白m1-9）
<400> 81
Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr
20 25 30
Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
50 55 60
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val
100 105 110
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 82
<211> 139
<212> PRT
<213> 阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）
<220>
<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47和
Glu117、Gly120、Try121（突变蛋白m1-9）
<400> 82
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys
65 70 75 80
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr
85 90 95
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val Gly His Asp
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
130 135
<210> 83
<211> 127
<212> PRT
<213> 阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）
<220>
<223> 最小链霉亲和素
<400> 83
Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu
20 25 30
Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr
50 55 60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp
65 70 75 80
Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp
85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu
100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FKBP
<400> 84
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Met Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FKBP12v36
<400> 85
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的酰化基序
<400> 86
Met Gly Ser Asn Lys Ser Lys Pro Lys Asp Ala Ser Gln Arg Arg Arg
1 5 10 15
<210> 87
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双重酰化基序
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 87
Met Gly Cys Xaa Cys
1 5
<210> 88
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 酰化区
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 88
Cys Ala Ala Xaa
1
<210> 89
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3抗体OKT3的可变重链
<400> 89
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 90
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3抗体OKT3的可变轻链
<400> 90
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
100 105
<210> 91
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD28抗体CD28.3的可变重链
<400> 91
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg
1 5 10 15
Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His
20 25 30
Trp Ile Lys Leu Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe
35 40 45
Tyr Pro Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys
50 55 60
Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu
65 70 75 80
Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg
85 90 95
Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val
115
<210> 92
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD28抗体CD28.3的可变轻链
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Cys
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 93
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链霉亲和素结合肽
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa是Gln、Asp或Met
<400> 93
His Pro Xaa
1
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HA-标签
<400> 94
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VSV-G-标签
<400> 95
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1 5 10
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSV-标签
<400> 96
Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp
1 5 10
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T7表位
<400> 97
Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly
1 5 10
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSV表位
<400> 98
Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp
1 5 10
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myc表位
<400> 99
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 100
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V5-标签
<400> 100
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 101
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab片段m13B8.2的可变重链
<400> 101
Ala Met Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
20 25 30
Thr Phe Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Val Pro
50 55 60
Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
65 70 75 80
Phe Phe Lys Leu Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Asn Asp Pro Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser
210 215 220
Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
245 250
<210> 102
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab片段m13B8.2的可变轻链
<400> 102
Ala Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Glu Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Glu Met Ile Tyr
20 25 30
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu
35 40 45
Leu Val His Asp Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Thr Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala His Tyr Gly Asn
85 90 95
Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ile
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser
210 215
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAT标签
<400> 103
His Asn His Arg His Lys His Gly Gly Gly Cys
1 5 10
<210> 104
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huOKT8的可变重链
<400> 104
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 105
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huOKT8的可变轻链
<400> 105
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 106
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链（VH）抗BCMA
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 107
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链（VL）抗BCMA
<400> 107
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 108
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 108
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 109
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链（VH）抗BCMA
<400> 109
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 110
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链（VL）抗BCMA
<400> 110
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 111
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链（VH）抗BCMA
<400> 111
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met
35 40 45
Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 112
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链（VL）抗BCMA
<400> 112
Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 113
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链（VH）抗BCMA
<400> 113
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 114
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链（VL）抗BCMA
<400> 114
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 115
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 116
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 116
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 117
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 117
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 118
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链（VH）抗BCMA
<400> 118
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Ser Lys Ser Ile Val Ser Tyr Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 119
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链（VL）抗BCMA
<400> 119
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Val Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Val Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 120
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链（VH）抗BCMA
<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Ser Tyr Arg Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 121
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链（VL）抗BCMA
<400> 121
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 122
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链（VH）抗BCMA
<400> 122
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Ile Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Tyr Ser Gly Val Leu Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 123
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链（VL）抗BCMA
<400> 123
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Phe Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110

Claims (225)

1.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体；
(c)将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行；以及
(c)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间且包含端值的时间进行；
从而产生工程化细胞的组合物。
2.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体；以及
(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在以下时间进行：
(i)在开始暴露于所述刺激试剂之后24小时与120小时之间且包含端值的时间；
(ii)在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前的时间；
(iii)在所述收获时活细胞的总数是所述受刺激的群体的总活细胞数量的大于或大于约三倍、两倍或者相同或大致相同之前的时间；和/或
(iv)在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD3+T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，CD27+CCR7+所占百分比大于或大于约60％时的时间；
从而产生工程化细胞的组合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述输入组合物包含至少300x106个活原代T细胞。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
5.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含至少300x106个活原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体；以及
(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在以下时间进行：
(i)在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间且包含端值的时间；
(ii)在所述转化的群体的基因组中检测到整合载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前的时间；
(iii)在所述收获时活细胞的总数是所述受刺激的群体的总活细胞数量的大于或大于约三倍、两倍或者相同或大致相同之前的时间；和/或
(iv)在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD3+细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％时的时间；
从而产生工程化细胞的组合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述收获是在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定iVCN之前的时间进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其中当所述iVCN达到峰值并保持不变或者在容许误差内不变持续大于24小时的时间段时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。
8.根据权利要求6所述的方法，其中当所述转化的细胞的群体的二倍体基因组中iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为或为约1.0或者在其容许误差内时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体中整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于0.8时的时间进行。
10.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体；以及
(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间且包含端值的时间进行，其中在收获时，所述转化的细胞的群体的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约0.4个拷贝/二倍体基因组与2.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值；
从而产生工程化细胞的组合物。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约2.0个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
12.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体；以及
(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间且包含端值的时间进行，其中在收获时，在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约60％；
从而产生工程化细胞的组合物。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中在收获时：
在所述群体的总重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达T细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％；
在所述群体的总重组蛋白表达CD4+T细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约40％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达CD4+细胞的大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％；或者
在所述群体的总重组蛋白表达CD8+T细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约40％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达CD8+细胞的大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其中在收获时：
在所述群体的总重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约60％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达T细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％；
在所述群体的总重组蛋白表达CD4+T细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约40％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达CD4+细胞的大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％；或者
在所述群体的总重组蛋白表达CD8+T细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约40％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达CD8+细胞的大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％。
15.根据权利要求2-14中任一项所述的方法，其中在所述引入之后且在所述收获之前，所述方法还包括将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行。
16.根据权利要求1或权利要求15所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行长达72小时。
17.根据权利要求1或权利要求15所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行长达48小时。
18.根据权利要求1或权利要求15所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行长达24小时。
19.根据权利要求1和15-18中任一项所述的方法，其中所述孵育进行至少18小时。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后96小时内进行。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后72小时内进行。
22.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激剂之后48小时内进行。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中(a)中的所述暴露和(b)中的所述引入中的一者或两者是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中(a)中的所述暴露和(b)中的所述引入是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。
25.根据权利要求15-24中任一项所述的方法，其中所述孵育是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。
26.根据权利要求15-24中任一项所述的方法，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行。
27.根据权利要求5-9和12-26中任一项所述的方法，其中所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。
28.根据权利要求5-9和12-27中任一项所述的方法，其中所述幼稚样T细胞包含CD27+CCR7+细胞。
29.根据权利要求5-9和12-28中任一项所述的方法，其中所述幼稚样T细胞包含CCR7+CD45RA+T细胞。
30.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物在一定条件下暴露于刺激试剂以刺激T细胞，所述条件包括一种或多种重组细胞因子的存在，从而产生受刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行；
(c)将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行；以及
(c)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间且包含端值的时间进行；
从而产生工程化细胞的组合物。
31.根据权利要求1和23-30中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子是人重组细胞因子。
32.根据权利要求1和23-31中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15，任选地在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；和/或在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。
33.根据权利要求1和23-32中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子是或包含重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15，任选地在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；以及在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中(a)中的所述暴露和(b)中的所述引入中的一者或两者是在无血清培养基中进行。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中(a)中的所述暴露和(b)中的所述引入是在无血清培养基中进行。
36.根据权利要求1、6-9、11、13、14、16-24和32-35中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂包含(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
37.根据权利要求2-35中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂包含(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂中的一种或两种包含抗体或其抗原结合片段。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂包含抗体，任选地其中所述刺激试剂包含抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂存在于或附着于固体支持物的表面上。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠。
42.根据权利要求41所述的方法，其中珠与细胞的比率小于3:1。
43.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含珠的刺激试剂，所述珠附着有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中珠与细胞的比率小于3:1，并且所述暴露是在一定条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体；以及
(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间且包含端值的时间进行；
从而产生工程化细胞的组合物。
44.根据权利要求41-43所述的方法，其中珠与细胞的比率为或为约1:1。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其中所述珠上附着有抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段。
46.根据权利要求36、权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂可逆地结合在包含多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的表面上。
47.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，所述寡聚颗粒试剂可逆地结合有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中所述暴露是在一定条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体；以及
(c)收获所述转化的群体的T细胞，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间且包含端值的时间进行，
从而产生工程化细胞的组合物。
48.根据权利要求1、权利要求46或权利要求47所述的方法，其中(a)中的所述暴露是用一定量的所述刺激试剂进行，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.1μg与20μg之间，包含端值。
49.一种用于刺激T细胞的方法，所述方法包括将包含T细胞的输入组合物暴露于一定量的刺激试剂，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.1μg与20μg之间，包含端值，所述刺激试剂包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂，其中所述暴露是在一定条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体。
50.一种用于刺激T细胞的方法，所述方法包括将包含T细胞的输入组合物暴露于一定量的刺激试剂，所述量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.1μg与2μg之间，包含端值，所述刺激试剂包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂，所述寡聚颗粒试剂附着有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中所述暴露是在一定条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体。
51.根据权利要求49或权利要求50所述的方法，其中所述输入组合物包含原代T细胞。
52.根据权利要求48、权利要求49和权利要求51所述的方法，其中所述刺激试剂的量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约1.0μg与2μg之间，包含端值。
53.根据权利要求43-48和52中任一项所述的方法，其中在所述引入之后且在所述收获之前，所述方法还包括将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行。
54.根据权利要求53所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行长达72小时。
55.根据权利要求53所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行长达48小时。
56.根据权利要求53所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行长达24小时。
57.根据权利要求43-48和52-56中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始将所述输入组合物暴露于所述刺激剂之后96小时内进行。
58.根据权利要求43-48和52-57中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始将所述输入组合物暴露于所述刺激剂之后72小时内进行。
59.根据权利要求43-48和52-58中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始将所述输入组合物暴露于所述刺激剂之后48小时内进行。
60.根据权利要求43-48和52-59中任一项所述的方法，其中(a)中的所述暴露和(b)中的所述引入中的一者或两者是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。
61.根据权利要求43-48和52-59中任一项所述的方法，其中(a)中的所述暴露和(b)中的所述引入是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。
62.根据权利要求43-48和52-61中任一项所述的方法，其中所述孵育是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行。
63.根据权利要求43-48和52-61中任一项所述的方法，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行。
64.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含珠的刺激试剂，所述珠附着有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中珠与细胞的比率小于3:1，并且所述暴露是在包括一种或多种重组细胞因子的存在的条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行；
(c)将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行；以及
(d)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间且包含端值的时间进行；
从而产生工程化细胞的组合物。
65.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，所述寡聚颗粒试剂附着有：(i)一级药剂，所述一级药剂与TCR复合物的成员特异性结合，任选地与CD3特异性结合，以及(ii)二级药剂，所述二级药剂与T细胞共刺激分子特异性结合，其中所述暴露是在包括一种或多种重组细胞因子的存在的条件下进行以刺激T细胞，从而产生受刺激的群体；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在一种或多种重组细胞因子的存在下进行；
(c)将所述转化的细胞的群体孵育长达96小时，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，其中所述孵育是在缺少一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行；以及
(d)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间且包含端值的时间进行；
从而产生工程化细胞的组合物。
66.根据权利要求48-63和65中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂的量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.4μg与8μg之间，包含端值。
67.根据权利要求48-63、65和66中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂的量为对于所述输入组合物中每106个细胞在或在约0.8μg与4μg之间，包含端值。
68.根据权利要求48-63和65-67中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂的量对于所述输入组合物中每106个细胞为或为约0.8μg。
69.根据权利要求48-63和65-68中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂的量对于每106个细胞为或为约1.2μg。
70.根据权利要求48-63和65-68中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂的量对于每106个细胞为或为约1.8μg。
71.根据权利要求60-70中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子是人重组细胞因子。
72.根据权利要求60-71中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15，任选地在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；和/或在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。
73.根据权利要求60-72中任一项所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子是或包含重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15，任选地在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-2；在100IU/mL与1,000IU/mL之间的重组IL-7；以及在10IU/mL与200IU/mL之间的重组IL-15。
74.根据权利要求1-48和52-73中任一项所述的方法，其中(a)中的所述暴露和(b)中的所述引入中的一者或两者是在无血清培养基中进行。
75.根据权利要求1-48和52-74中任一项所述的方法，其中(a)中的所述暴露和(b)中的所述引入是在无血清培养基中进行。
76.根据权利要求1、15-48和52-75中任一项所述的方法，其中所述孵育是在无血清培养基中进行。
77.根据权利要求41-45、53-64和71-76中任一项所述的方法，其中珠与细胞的比率为从或从约2:1至0.5:1。
78.根据权利要求41-45、53-64和71-77中任一项所述的方法，其中珠与细胞的比率为或为约1:1。
79.根据权利要求41-45、53-64和71-78中任一项所述的方法，其中所述珠包含大于或大于约3.5μm但不超过约9μm或不超过约8μm或不超过约7μm或不超过约6μm或不超过约5μm的直径。
80.根据权利要求41-45、53-64和71-79中任一项所述的方法，其中所述珠包含为或约4.5μm的直径。
81.根据权利要求41-45、53-64和71-80中任一项所述的方法，其中所述珠是惰性的。
82.根据权利要求41-45、53-64和71-81中任一项所述的方法，其中所述珠是或包含聚苯乙烯表面。
83.根据权利要求41-45、53-64和71-82中任一项所述的方法，其中所述珠是顺磁性或超顺磁性的。
84.根据83所述的方法，所述方法还包括在所述收获之前，在所述孵育之后或期间将所述细胞暴露于磁场，从而从所述细胞去除所述刺激试剂。
85.根据权利要求1、46-63和65-76中任一项所述的方法，其中所述链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子结合至或能够结合至生物素、抗生物素蛋白、生物素类似物或突变蛋白、抗生物素蛋白类似物或突变蛋白和/或其生物活性片段。
86.根据权利要求1、46-63、65-76和85中任一项所述的方法，其中参考在SEQ ID NO:61所示氨基酸序列中的在链霉亲和素中的位置，在对应于位置44至47的序列位置，所述多个链霉亲和素突变蛋白分子各自包含氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47。
87.根据权利要求1、46-63、65-76、85和86中任一项所述的方法，其中所述多个链霉亲和素突变蛋白分子各自包含：
a)SEQ ID NO:62、63、68、75-77或80-83中任一个所示的氨基酸序列；
b)如下氨基酸序列：其与SEQ ID NO:62、63、68、75-77或80-83中任一个展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，并且含有对应于Va144-Thr45-Ala46-Arg47或lle44-Gly45-Ala46-Arg47的氨基酸序列，和/或可逆地结合至生物素、生物素类似物或链霉亲和素结合肽；或者
c)a)或b)的功能片段，其可逆地结合至生物素、生物素类似物或链霉亲和素结合肽。
88.根据权利要求1、46-63、65-76和85-87中任一项所述的方法，其中所述多个链霉亲和素突变蛋白分子包含SEQ ID NO:63或68所示的氨基酸序列。
89.根据权利要求46-63、65-76和85-88中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂各自包含链霉亲和素结合肽。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述链霉亲和素结合肽选自Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:64)、Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:73)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Se r-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ IDNO:65)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID N O:66)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:67)。
91.根据权利要求46-63、65-76和85-90中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂中的一种或两种包含抗体或其抗原结合片段。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述一种或多种药剂是或包含单价抗体片段。
93.根据权利要求91或权利要求92所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂中的一种或两种是或包含Fab。
94.根据权利要求1、46-63、65-76和85-93中任一项所述的方法，其中所述寡聚颗粒试剂包含：
大于60nm、大于70nm、大于80nm、或大于90nm的半径；
在50nm与150nm之间、在75nm与125nm之间、在80nm与115nm之间、或在90nm与110nm之间且包含端值的半径；或者
90nm±15nm或95nm±20-25nm的半径。
95.根据权利要求1、46-63、65-76和85-94中任一项所述的方法，其中所述寡聚颗粒试剂包含以下分子量：
至少5x107g/mol、或至少1x108g/mol；和/或
在5x107g/mol与5x108g/mol之间、在1x108g/mol与5x108g/mol之间、或在1x108g/mol与2x108g/mol之间。
96.根据权利要求1、46-63、65-76和85-88中任一项所述的方法，其中所述寡聚颗粒试剂包含至少500个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、至少1,000个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、至少1,500个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、或至少2,000个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体；和/或；
在1,000个与20,000个之间的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、在1,000个与10,000个之间的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体、或在2,000个与5,000个之间的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体。
97.根据权利要求1、46-63、65-76和85-96中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述孵育的至少一部分之后或期间将物质添加至所述细胞，其中所述物质终止或减少所述刺激试剂对所述T细胞的刺激。
98.根据权利要求46-63、65-76和85-97中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述孵育的至少一部分之后或期间将物质添加至所述细胞，其中所述物质能够逆转所述一级药剂和所述二级药剂与所述寡聚颗粒试剂之间的键。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述物质是自由结合配偶体和/或是竞争试剂。
100.根据权利要求98或权利要求99所述的方法，其中所述物质的存在终止或减少所述一级药剂和所述二级药剂在所述T细胞中诱导或调节的信号。
101.根据权利要求97-100中任一项所述的方法，其中所述物质是或包含链霉亲和素结合肽、生物素或生物活性片段、或者生物素类似物或生物活性片段。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述物质是或包含链霉亲和素结合肽，并且所述链霉亲和素结合肽选自Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(S EQ ID NO:64)、Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlyS er)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:73)、Trp-Ser-His-P ro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(S EQ ID NO:65)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:66)和Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:67)。
103.根据权利要求101所述的方法，其中所述物质是或包含生物素或生物活性片段、或者生物素类似物或生物活性片段。
104.根据权利要求97-103中任一项所述的方法，其中所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒刺激试剂之后在或在约42小时与120小时之间且包含端值时添加。
105.根据权利要求97-104中任一项所述的方法，其中所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒试剂之后在或在约72小时与96小时之间添加。
106.根据权利要求97-105中任一项所述的方法，其中所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒试剂之后48小时或约48小时添加。
107.根据权利要求97-106中任一项所述的方法，其中所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒试剂之后72小时或约72小时添加。
108.根据权利要求97-107中任一项所述的方法，其中所述物质是在开始暴露于所述寡聚颗粒试剂之后96小时或约96小时添加。
109.根据权利要求97-108中任一项所述的方法，其中所述物质是在所述孵育之后且在所述收获之前添加。
110.根据权利要求97-109中任一项所述的方法，其中所述物质是在所述孵育的至少一部分期间添加，并且其中所述孵育在添加所述物质之后继续进行。
111.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于对于每106个细胞在或在约0.2μg与8μg之间的包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，所述寡聚颗粒试剂附着有：(i)与CD3特异性结合的一级药剂，和(ii)特异性结合CD28的二级药剂，其中所述暴露是在具有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行，从而产生受刺激的群体；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在具有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行；
(c)将所述转化的细胞的群体在静态条件下孵育24小时与96小时之间，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行，并且在所述孵育的至少一部分期间添加包含生物素或其生物活性片段、任选地D-生物素，或者生物素类似物或其生物活性片段的物质；以及
(d)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后72小时与96小时之间且包含端值的时间进行；
从而产生工程化细胞的组合物。
112.根据权利要求1-111中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含至少300x106个活原代T细胞。
113.根据权利要求1-112中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含或包含约600x106个活原代T细胞。
114.根据权利要求1-113中任一项所述的方法，其中所述输入组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD3+T细胞。
115.根据权利要求1-114中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。
116.根据权利要求1-115中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率在1.5:1与2.0:1之间的CD4+与CD8+细胞。
117.根据权利要求1-116中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含比率在1.2:1与0.8:1之间的CD4+与CD8+细胞，任选地为或约1:1的CD4+与CD8+T细胞。
118.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于对于每106个细胞在或在约0.4μg与8μg之间的包含含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂，所述寡聚颗粒试剂附着有：(i)与CD3特异性结合的一级药剂，和(ii)特异性结合CD28的二级药剂，其中所述输入组合物包含比率在2:1与1:2之间的CD4+与CD8+T细胞并且包含至少300x106个CD4+和CD8+T细胞，并且其中所述暴露是在包含重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行，从而产生受刺激的群体；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在具有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行；
(c)将所述转化的细胞的群体在静态条件下孵育在或在约24小时至72小时之间，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行；并且在所述孵育的至少一部分期间添加包含生物素或其生物活性片段、任选地D-生物素，或者生物素类似物或其生物活性片段的物质，其中所述添加是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与72小时之间且包含端值的时间进行；以及
(d)在所述孵育之后，收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后72小时与96小时之间且包含端值的时间进行；
从而产生工程化细胞的组合物。
119.根据权利要求111-118中任一项所述的方法，其中所述物质是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时或约48小时添加。
120.根据权利要求111-118中任一项所述的方法，其中所述物质是在开始暴露于所述刺激试剂之后72小时或约72小时添加。
121.根据权利要求111-118中任一项所述的方法，其中所述物质是在开始暴露于所述刺激试剂之后96小时或约96小时添加。
122.一种用于产生工程化T细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将包含原代T细胞的输入组合物暴露于以从或从约2:1至0.5:1的珠与细胞的比率包含顺磁珠的刺激试剂，其中所述珠是包含聚苯乙烯涂层和为或为约4.5μm的直径的惰性顺磁珠，所述珠附着有：(i)抗CD3抗体或其抗原结合片段和抗CD28抗体或其抗原结合片段，
其中所述输入组合物包含比率在2:1与1:2之间的CD4+与CD8+T细胞并且包含至少300x106个CD4+和CD8+T细胞，并且其中所述暴露是在包含重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行，从而产生受刺激的群体；
(b)向所述受刺激的群体的T细胞中引入编码重组蛋白的异源多核苷酸，从而产生转化的细胞的群体，其中所述引入是在具有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行；
(c)将所述转化的细胞的群体在静态条件下孵育48小时与72小时之间，包含端值，任选地其中所述孵育是在约37℃的温度下进行；
(d)在所述孵育之后，将所述细胞暴露于磁场以从所述细胞去除所述刺激试剂，然后收获所述T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后72小时与96小时之间且包含端值的时间进行；
从而产生工程化细胞的组合物。
123.根据权利要求111-122中任一项所述的方法，其中所述孵育的至少一部分是在包含重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基的存在下进行。
124.根据权利要求111-123中任一项所述的方法，其中所述孵育是在缺少重组细胞因子的基础培养基中进行。
125.根据权利要求1-124中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含为或约450x106个活原代T细胞、为或约500x106个活原代T细胞、为或约550x106个活原代T细胞、为或约600x106个活原代T细胞、为或约700x106个活原代T细胞、为或约800x106个活原代T细胞、为或约900x106个活原代T细胞、或者为或约1,000x106个活原代T细胞，或者任何前述值之间的任何值。
126.根据权利要求1-125中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含或包含至少或至少约600x106个活原代T细胞。
127.根据权利要求1-126中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含或包含多达900x106个活原代T细胞。
128.根据权利要求1-125中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含或包含为或约900x106个活原代T细胞。
129.根据权利要求44-59、61-69、81-113、115和116中任一项所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行或进行约24小时。
130.根据权利要求1和15-129中任一项所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行或进行约48小时。
131.根据权利要求1和15-130中任一项所述的方法，其中在所述引入之后，所述孵育进行或进行约72小时。
132.根据权利要求1-131中任一项所述的方法，其中所述方法包括在暴露于所述刺激试剂之前，从生物样品富集CD3+T细胞或CD4+T细胞和/或CD8+T细胞以产生所述输入组合物。
133.根据权利要求1-132中任一项所述的方法，其中所述方法包括在暴露于所述刺激试剂之前，从生物样品富集CD3+T细胞以产生所述输入组合物。
134.根据权利要求132或权利要求133所述的方法，其中所述富集是通过基于免疫亲和力的选择来进行。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述基于免疫亲和力的选择是通过使细胞与固定在或附着至亲和色谱基质上的抗体接触来实现，所述抗体能够与细胞表面标记特异性结合以实现CD3+细胞的阳性选择。
136.根据权利要求1-132中任一项所述的方法，其中所述方法包括在暴露于所述刺激试剂之前，从生物样品富集CD4+或CD8+T细胞以产生所述输入组合物。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述富集包括：
(a)在封闭系统中进行第一选择，所述第一选择包括从含有原代人T细胞的样品富集(i)CD4+细胞和(ii)CD8+细胞中的一种，所述富集从而产生第一选择的群体和未选择的群体；以及
(b)在所述封闭系统中进行第二选择，所述第二选择包括从所述未选择的群体富集(i)CD4+细胞和(ii)CD8+细胞中的另一种，所述富集从而产生第二选择的群体，其中所述富集产生CD4+T细胞和CD8+T细胞的单独富集群体，
其中所述单独富集群体各自包含来自所述第一选择的群体或所述第二选择的群体中的一个的细胞，并且
其中所述输入组合物包含来自CD4+T细胞的富集群体和CD8+T细胞的富集群体中的一个或多个的细胞。
138.根据权利要求136或权利要求137所述的方法，其中组合CD4+T细胞和CD8+T细胞的所述单独富集群体，从而产生所述输入组合物。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述组合是在所述封闭系统中进行，任选地其中所述封闭系统是自动化的。
140.根据权利要求136-139中任一项所述的方法，其中在所述第一选择和/或所述第二选择中富集细胞包括基于细胞表面标记的表达进行阳性选择或阴性选择。
141.根据权利要求136-140中任一项所述的方法，其中在所述第一选择或所述第二选择中富集细胞包括基于一种或多种细胞表面标记的表达进行多个阳性或阴性选择步骤，以富集CD4+或CD8+细胞。
142.根据权利要求136-141中任一项所述的方法，其中在所述第一选择和/或所述第二选择中富集细胞包括基于免疫亲和力的选择。
143.根据权利要求142所述的方法，其中在所述第一选择和所述第二选择中富集细胞包括基于免疫亲和力的选择。
144.根据权利要求142或权利要求143所述的方法，其中所述基于免疫亲和力的选择是通过使细胞与固定在或附着至亲和色谱基质上的抗体接触来实现，所述抗体能够与细胞表面标记特异性结合，以实现CD4+或CD8+细胞的阳性或阴性选择。
145.根据权利要求135或权利要求144所述的方法，其中所述抗体还包含能够与固定在所述基质上的结合试剂形成可逆键的一种或多种结合配偶体，所述抗体借此在所述接触期间与所述色谱基质可逆地结合；并且
表达由所述基质上的抗体特异性结合的细胞表面标记的细胞能够通过破坏所述结合试剂与所述结合配偶体之间的可逆结合而从所述基质进行回收。
146.根据权利要求145所述的方法，其中：
所述结合配偶体选自生物素、生物素类似物和能够与所述结合试剂结合的肽；并且
所述结合试剂选自链霉亲和素、链霉亲和素类似物或突变蛋白、抗生物素蛋白和抗生物素蛋白类似物或突变蛋白。
147.根据权利要求145或权利要求146所述的方法，其中：
所述结合配偶体包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列；和/或
所述结合试剂是包含SEQ ID NO:75、80、76或63所示氨基酸序列的链霉亲和素突变蛋白。
148.根据权利要求145-147中任一项所述的方法，其还包括，在使所述样品中的细胞与亲和色谱基质接触之后，应用竞争试剂以破坏所述结合配偶体与所述结合试剂之间的键，从而从所述基质回收选择的细胞。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述竞争试剂是生物素或生物素类似物。
150.根据权利要求135和144-149中任一项所述的方法，其中所述一个或多个选择中的所述一种或多种抗体与所述细胞表面标记结合的解离速率常数(k解离)大于或大于约3x10- 5sec-1。
151.根据权利要求135和144-150中任一项所述的方法，其中所述一个或多个选择中的所述一种或多种抗体对所述细胞表面标记的亲和力为解离常数(Kd)在约10-3至10-7范围内或在约10-7至约10-10范围内。
152.根据权利要求135和144-151中任一项所述的方法，其中所述色谱基质填充于分离容器中，所述分离容器是柱。
153.根据权利要求136-152中任一项所述的方法，其中从所述生物样品富集CD4+或CD8+T细胞包括：
(a)富集所述CD4+细胞包括基于CD4的表面表达的阳性选择；
(b)富集所述CD8+细胞包括基于CD8的表面表达的阳性选择；或者
(a)和(b)两者。
154.根据权利要求1-153中任一项所述的方法，其中所述方法包括在暴露于所述刺激试剂之前，从生物样品富集CD4+或CD8+T细胞，其中所述富集包括使所述样品的细胞在一定条件下与孵育组合物中与CD4特异性结合的第一免疫亲和试剂和与CD8特异性结合的第二免疫亲和试剂接触，所述免疫亲和试剂借此分别与所述样品中的细胞表面上的CD4和CD8分子特异性结合；以及
回收与所述第一免疫亲和试剂和/或所述第二免疫亲和试剂结合的细胞，从而产生包含CD4+细胞和CD8+细胞的富集组合物，并且
其中所述输入组合物包含含有CD4+细胞和CD8+细胞的所述富集组合物的细胞。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述免疫亲和试剂各自包含抗体或其抗原结合片段。
156.根据权利要求154或权利要求155所述的方法，其中所述免疫亲和试剂固定在珠的外表面上。
157.根据权利要求156所述的方法，其中所述珠是磁珠。
158.根据权利要求157所述的方法，其中回收与所述第一免疫亲和试剂或所述第二免疫亲和试剂结合的细胞包括使所述细胞暴露于磁场。
159.根据权利要求132-158中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含从受试者、任选地人受试者获得的原代T细胞。
160.根据权利要求132-159中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包含全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
161.根据权利要求132-160中任一项所述的方法，其中所述生物样品是在所述富集之前已经预先低温冷冻的单采术或白细胞单采术产物。
162.根据权利要求1-48和52-161中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后为或为约96小时进行。
163.根据权利要求1-48和52-161中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后为或为约两天或者为或为约三天进行。
164.根据权利要求1-48和52-161中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后为或为约72小时进行。
165.根据权利要求1-48和52-161中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后为或为约48小时进行。
166.根据权利要求1和12-165中任一项所述的方法，其中所述收获是在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定iVCN之前的时间进行。
167.根据权利要求1和12-166中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体中整合载体拷贝数(iVCN)与总VCN的分数平均小于0.8时的时间进行。
168.根据权利要求1和12-167中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述转化的细胞的群体的iVCN平均小于或小于约2.0个拷贝/二倍体基因组时的时间进行。
169.根据权利要求所述的方法，根据权利要求1-168中任一项所述的方法，其中收获所述细胞包括通过冲洗或洗涤所述细胞来去除细胞碎片。
170.根据权利要求1和30-169中任一项所述的方法，其中在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样细胞所占百分比大于或大于约60％时的时间收获所述细胞。
171.根据权利要求1和30-169中任一项所述的方法，其中在所述群体中的总T细胞、所述群体中的总CD4+T细胞或者所述群体中的总CD8+T细胞或其重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约60％时的时间收获所述细胞。
172.根据权利要求170或权利要求171所述的方法，其中在收获时：
在所述群体的总重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达T细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％；
在所述群体的总重组蛋白表达CD4+T细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达CD4+细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％；或者
在所述群体的总重组蛋白表达CD8+T细胞中，幼稚样T细胞所占百分比大于或大于约60％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达CD8+细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。
173.根据权利要求171所述的方法，其中在收获时：
在所述群体的总重组蛋白表达细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约60％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达T细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％；
在所述群体的总重组蛋白表达CD4+T细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约60％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达CD4+细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％；或者
在所述群体的总重组蛋白表达CD8+T细胞中，幼稚样T细胞和/或中枢记忆T细胞所占百分比大于或大于约60％，任选地占所述群体中总重组蛋白表达CD8+细胞的大于或大于约65％、70％、80％、90％或95％。
174.根据权利要求170-173中任一项所述的方法，其中所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。
175.根据权利要求170-174中任一项所述的方法，其中所述幼稚样T细胞包含CD27+CCR7+T细胞。
176.根据权利要求170-175中任一项所述的方法，其中所述幼稚样T细胞包含CCR7+CD45RA+T细胞。
177.根据权利要求1-176中任一项所述的方法，其还包括任选地在药学上可接受的赋形剂的存在下，配制所述工程化细胞的组合物的细胞用于冷冻保存和/或施用至受试者。
178.根据权利要求177所述的方法，其中在冷冻保护剂的存在下配制所述工程化细胞的组合物的细胞。
179.根据权利要求178所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含DMSO。
180.根据权利要求177-179中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞的组合物的细胞是在容器、任选地小瓶或袋子中进行配制。
181.根据权利要求1-180中任一项所述的方法，其中将包含编码所述重组蛋白的异源多核苷酸的病毒载体引入所述T细胞中。
182.根据权利要求181所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
183.根据权利要求180或权利要求181所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
184.根据权利要求1-183中任一项所述的方法，其中所述引入是在转导佐剂的存在下进行。
185.根据权利要求184所述的方法，其中所述转导佐剂是硫酸鱼精蛋白，任选地从或从约1μg/ml至50μg/ml硫酸鱼精蛋白；源自纤连蛋白的转导佐剂；或RetroNectin。
186.根据权利要求1-185中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是能够与靶抗原结合的重组受体，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
187.根据权利要求186所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
188.根据权利要求187所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
189.根据权利要求186-188中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、肾母细胞瘤1(WT-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
190.根据权利要求1-48或52-189中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
191.根据权利要求1-48或52-190中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。
192.根据权利要求34-42或74-191中任一项所述的方法，其中所述无血清培养基包含：
基础培养基中0.5mM至5mM的二肽形式的L-谷氨酰胺；
0.5mM至5mM L-谷氨酰胺；和
至少一种蛋白质，其中所述培养基不含血清。
193.根据权利要求1和26-192中任一项所述的方法，其中缺少一种或多种重组细胞因子的所述基础培养基包含L-谷氨酰胺，任选地浓度为约0.5mM至约5mM，任选地浓度为约2mM。
194.根据权利要求1和26-191和193中任一项所述的方法，其中缺少一种或多种重组细胞因子的所述基础培养基不含血清。
195.根据权利要求1、26-191和193-194中任一项所述的方法，其中所述基础培养基包含选自白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选地人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种的至少一种蛋白质。
196.一种治疗性T细胞组合物，其通过根据权利要求1-195中任一项所述的方法产生。
197.根据权利要求196所述的治疗性T细胞组合物，其中平均而言，在通过所述方法产生的多种组合物中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是幼稚样T细胞或者是对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。
198.根据权利要求196所述的治疗性T细胞组合物，其中平均而言，在通过所述方法产生的多种组合物中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约50％是中枢记忆T细胞或者是对中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。
199.根据权利要求196所述的治疗性T细胞组合物，其中平均而言，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组蛋白的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约50％是幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞，或者是对幼稚样T细胞或中枢记忆T细胞上表达的标记呈表面阳性的T细胞。
200.根据权利要求197或权利要求199所述的治疗性T细胞组合物，其中幼稚样T细胞上表达的所述标记选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。
201.根据权利要求197、199和200中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞是CCR7+CD45RA+、CD27+CCR7+或CD62L-CCR7+。
202.根据权利要求197和199-201中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞包含CD27+CCR7+T细胞，其中所述组合物中至少70％、80％、85％或90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+。
203.根据权利要求197和199-202中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞包含CD27+CCR7+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％、85％或90％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
204.根据权利要求197和199-203中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记呈表面阳性的所述T细胞包含CD27+CCR7+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％、85％或90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％、85％或90％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
205.一种治疗性T细胞组合物，其包含表达重组受体的CD4+T细胞和表达重组受体的CD8+T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
206.根据权利要求196-205中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD3+T细胞。
207.根据权利要求196-206中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞。
208.根据权利要求205-207中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD4+T细胞和CD8+T细胞，所述组合物中至少或至少约60％的总受体+/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约60％的总受体+/CD4+细胞是CD27+CCR7+。
209.根据权利要求205-208中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达所述重组受体的T细胞的总数量的至少为或约或者为或约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％是CD27+CCR7+。
210.根据权利要求197-209中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中受体+/CD4+T细胞与受体+/CD8+T细胞的比率在约1:3与约3:1之间。
211.根据权利要求196-210中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中受体+/CD4+T细胞与受体+/CD8+T细胞的比率在约1:2与约2:1之间。
212.根据权利要求196-211中任一项所述的治疗性T细胞组合物，其中所述组合物中受体+/CD4+T细胞与受体+/CD8+T细胞的比率是为或约1:1。
213.根据权利要求196-212中任一项所述的治疗组合物，其中所述重组蛋白是或包含能够与靶蛋白结合的重组受体，所述靶蛋白与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
214.根据权利要求196-213中任一项所述的治疗组合物，其中所述重组蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。
215.根据权利要求196-214中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物中活T细胞的数量在为或约25x106个细胞与为或约200x106个细胞之间，任选地其中所述组合物中活T细胞的数量在为或约25x106个细胞与为或约100x106个细胞之间、为或约25x106个细胞与为或约70x106个细胞之间、为或约25x106个细胞与为或约50x106个细胞之间、为或约50x106个细胞与为或约200x106个细胞之间、为或约50x106个细胞与为或约100x106个细胞之间、为或约50x106个细胞与为或约70x106个细胞之间、为或约70x106个细胞与为或约200x106个细胞之间、为或约70x106个细胞与为或约100x106个细胞之间、或者为或约100x106个细胞与为或约200x106个细胞之间，每个都包含端值。
216.根据权利要求196-215中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物的体积在1.0mL与10mL之间，包含端值，任选地为或约2mL、为或约3mL、为或约4mL、为或约5mL、为或约6mL、为或约7mL、为或约8mL、为或约9mL、或者为或约10mL，或者任何前述值之间的任何值。
217.一种制品，其包含根据权利要求196-216中任一项所述的组合物以及用于将所述组合物施用至受试者的说明书。
218.根据权利要求217所述的制品，其中所述受试者患有疾病或病症，任选地其中所述重组受体特异性识别或特异性结合至与所述疾病或病症相关或者在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原。
219.一种治疗患有或怀疑患有疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的来自根据权利要求196-216中任一项所述的组合物的T细胞。
220.根据权利要求219所述的方法，其中T细胞的所述剂量包含在为或约1x104个与50x106个之间且包含端值的T细胞。
221.根据权利要求219或权利要求220所述的方法，其中T细胞的所述剂量的T细胞是总T细胞、总活T细胞、总活重组受体表达T细胞、总活重组受体表达CD4+T细胞、或总活重组受体表达CD8+T细胞。
222.根据权利要求219-221中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
223.根据权利要求196-216中任一项所述的组合物，用于治疗患有疾病或病症的受试者的方法中，任选地其中所述疾病或病症是癌症。
224.根据权利要求196-216中任一项所述的组合物用于制造用以治疗患有疾病或病症的受试者的药物的用途，任选地其中所述疾病或病症是癌症。
225.根据权利要求223所述的用于所述用途的组合物或根据权利要求224所述的用途，其中所述组合物的细胞表达特异性识别或特异性结合至与所述疾病或病症相关或者在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原的重组受体，任选地其中所述重组受体是嵌合抗原受体。
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