DE69332120T2

DE69332120T2 - Verwendung von mit polysacchariden überzogenen superparamagnetischen oxid-kolloiden

Info

Publication number: DE69332120T2
Application number: DE69332120T
Authority: DE
Inventors: V. Groman; Lee Josephson; Stephen Palmacci
Original assignee: Advanced Magnetics Inc
Current assignee: Amag Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-08-12
Filing date: 1993-08-12
Publication date: 2003-02-27
Anticipated expiration: 2013-08-13
Also published as: JPH09501675A; JP3854631B2; EP0713602A1; EP0713602B1; DE69332120D1; WO1995005669A1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Polysaccharid-beschichteten superparamagnetischen Eisenoxid-Kolloiden als MR-Kontrastmittel

Technischer Hintergrund

A. Einleitung

Eine große Vielzahl von Verfahren wurde bereits bei der Synthese von magnetischen Teilchen oder Kolloiden angewendet, die oftmals als MR-Kontrastmittel verwendet wurden. Klaveness, US-Patent Nr. 4 863 715; Owen, US-Patent Nr. 4 795 698; Widder, US-Patent Nr. 4 849 210; Hasegawa, US-Patent Nr. 4 101 435; Groman, US-Patent Nr. 4 827 945; Groman, US-Patent Nr. 4 770 183; Menz, E. T., Internationale Anmeldung, veröffentlicht unter dem PCT, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 90/01295, eingereicht am 3. August 1981, veröffentlicht am 22. Februar 1990, und Lewis, Internationale Anmeldung, veröffentlicht unter dem PCT, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 90/01899. Diese Synthesen erzeugten Kolloide, die heterogen sind und die schnell durch phagozytische Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) entfernt (oder beseitigt) werden.

B. Probleme mit heterogenen magnetischen Kolloiden

Die magnetischen Kolloide und Teilchen, die früher beschrieben wurden, sind entweder zu groß oder bestehen in einigen Fällen aus zu vielen unterschiedlich großen Teilchen, d. h. zeigen eine Heterogenität, um durch eine Durchführung durch einen 220 nm Filter sterilisiert werden zu können. Eine Filtration durch einen 220 nm Filter entspricht den gegenwärtigen Rechtsvorschriften für die Sterilität parenteraler pharmazeutischer Erzeugnisse. Die mangelnde Fähigkeit, steril zu filtrieren, kann sich ergeben, wenn ein sehr kleiner Anteil des Kolloidmaterials so ausreichend groß ist, dass er auf dem Filter eingefangen wird, wodurch eine weitere Filtration blockiert wird.
Heterogene Kolloide oder Kolloide, die aus vielen Subpopulationen mit einem breiten Bereich an Eigenschaften zusammengesetzt sind, sind schwer zu charakterisieren. Eine Heterogenität kann den Nachweis kleiner atypischer Populationen, wie beispielsweise atypischer Populationen, die entweder zum Zeitpunkt der Herstellung oder der Entwicklung bei der Lagerung vorliegen, verdecken. Bei homogenen Kolloiden umfaßt eine einzelne Population mit einem engen Bereich an Eigenschaften das Kolloid und der Nachweis kleiner, atypischer Subpopulationen wird erleichtert. Bei der Herstellung superparamagnetischer Eisenoxid-Kolloide zur Injektion in Menschen werden atypische Subpopulationen von Kolloidmaterialien als potentielle Toxizitätsquellen betrachtet. Folglich verbessert die Fähigkeit, die Abwesenheit derartiger Subpopulationen sicherzustellen, die Qualität des Kolloids, das erzeugt werden kann.
Homogene Kolloide wurden früher durch Fraktionierung heterogener Kolloide hergestellt. Beispielsweise wurde das heterogene Kolloid AMI-25 durch Sepharose 4B Säulen- Chromatographie fraktioniert, so dass sich 4 Kolloide unterschiedlicher Größe ergaben, siehe Tabelle 1 von Lewis et at., WO-A-90/01899. AMI-25 wird gemäß Beispiel 7.10 von US-Patent Nr. 4 827 945 hergestellt. Diese Experimente zeigten, dass die Größe der superparamagnetischen Eisenoxid-Kolloide eine Rolle bei der Steuerung der Pharmakokinetik spielen kann. Wenn die Größe des Kolloidteilchens unter ungefähr 100 nm abfiel, nahm die Clearance ab, d. h. die Plasmahalbwertszeit nahm zu.
Dextranmagnetit, hergestellt wie beschrieben (Hasegawa, US-Patent Nr. 4 101 435) ist ein weiteres Beispiel für ein heterogenes Kolloid. Dextranmagnetit enthält Teilchen mit Durchmessern von 20-520 nm, mit einem Median von 160 nm. Wie AMI-25 wurde Dextranmagnetit einer Größenfraktionierung unterworfen, wobei kleinere Fraktionen eine längere Bluthalbwertszeit zeigten. Die Gesamtzubereitung weist eine sehr kurze Plasmahalbwertszeit von 3,5 Minuten auf und die kleinste Fraktion weist eine Halbwertszeit von 19 Minuten und die größte eine von 0,9 Minuten auf Ionnone, N. A. und Magin, R. L. et al., "Blood Clearance of Dextran Magnetite Determined by a Non-Invasive ESR Method", eingereicht beim J. Mag. Res. Med.; Magin, R. L., Bacic G. et al. "Dextran Magnetite as a Liver Contrast Agent", eingereicht bei J. Mag. Res. Med.
Bei der von Molday (US-Patent Nr. 4 452 773) beschriebenen Synthese wird ein heterogenes Kolloid erzeugt, wobei die großen Aggregate durch Zentrifugation entfernt und verworfen wurden (Spalte 8, Zeile 40). Die Herstellung von homogenen Kolloiden aus heterogenen Kolloiden bringt viel Abfall mit sich, weil unerwünschte kolloidale Materialien verworfen werden. Zusätzlich ist der Fraktionierungsschritt selbst zeitaufwendig und teuer.
Ein zweites Problem bei den magnetischen Kolloiden und Teilchen, die oben genannt wurden besteht darin, dass sie nach einer Injektion eine schnelle Clearance durch die Gewebe des retikuloendothelialen Systems (RES) zeigen. Eine schnelle Clearance (eine kurze Plasmahalbwertszeit) limitiert die Zeit, die das injizierte Material im Blutpool eines Tieres vorhanden ist. Bei einigen MR-Bildgebungsanwendungen, beispielsweise bei der Beschreibung bzw. Darstellung der Kapillar-Blutvolumina unterschiedlicher Teile des Gehirns, wird der Bildkontrast durch Vorhandensein von superparamagnetischem Eisenoxid im Blut gesteigert. Bradley et al. (1989) Stroke 20, Seiten 1.032-1.036. Eine lange Plasmahalbwertszeit senkt die benötigte Dosis des Kolloids und verlängert die Zeitspanne, in der ein kontrastverbessertes MR-Bild erzielt werden kann.
Die schnelle Clearance von magnetischen Kolloiden oder Teilchen gemäß dem Stand der Technik aus dem Blut folgt aus ihrer Aufnahme durch die Leber und Milz, den beiden Hauptgeweben des RES. Bei schnell geclearten bzw. beseitigten Teilchen wird typischerweise ungefähr 90% des injizierten Materials durch diese beiden Organe aus dem Blut extrahiert. Deswegen limitiert die schnelle Blutclearance die Menge des Kolloids, die auf andere Zellen als Phagozyten und andere Gewebe als die Leber und die Milz abzielt oder an diese geliefert bzw. transportiert werden kann.
Es existieren Berichte, dass die Oberflächenchemie das Schicksal der Kolloide nach der Injektion beeinflussen kann, beispielsweise Ergebnisse mit heterogenen Kolloiden, die mit Arabinogalactan hergestellt wurden. Josephson et al. (1990) Mag. Res. Imag. 8, Seiten 637-646; und Beispiel 6.10.1 von Menz E. T., Internationale Anmeldung, veröffentlicht unter dem PCT, Internationale Veröffentlichungs-Nr. WO 90/01295, eingereicht am 3. August 1989, veröffentlicht am 22. Februar 1990. In ähnlicher Weise existierten Berichte, dass die Anlagerung von Antikörpern an Eisenoxidteilchen eine gewisse spezifische Aufnahme des Eisens erreichen kann. Renshaw et al. (1986) Mag. Res. Imag. 4, Seiten 351- 357; und Cerdan et al., (1989) Mag. Res. Med. 12, Seiten 151-163. Jedoch sind derartige Zubereitungen oftmals heterogen, können nicht steril filtriert werden oder zeigen eine beträchtliche Aufnahme durch die Leber und die Milz. Eine Aufnahme durch die Leber und die Milz limitiert die Menge des Eisens, die auf andere Gewebe gerichtet werden kann.
Die JP-A-3-141119 offenbart feine magnetische Teilchen zur Bindung an biologische Teilchen wie beispielsweise Zellen oder Viren. Die Teilchen weisen eine organische Deckschicht auf und werden durch den Zusatz von wässrigem Ammoniak zu einer Lösung, die Eisen (II)- und Eisen (III)-Ionen enthält, hergestellt.
EP-A-0 600 529, mit dem Prioritätsdatum 2. Dezember 1992, eingereicht am 12. November 1993 und veröffentlicht am 8. Juni 1994, beschreibt Teilchen, die ein magnetisch responsives Material und ein Dispersionsmittel bzw. Tensid, wie beispielsweise ein Dextran, umfassen.
Die EP-A-0 656 368 mit dem Prioritätsdatum 5. August 1992, eingereicht am 4. August 1993 und veröffentlicht am 17. Februar 1994 lehrt wasserlösliche Komplexe aus Carboxypolysaccharid und magnetischem Eisen und deren Verwendung als MRI-Kontrastmedien.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Kolloides als MR-Kontrastmittel bereit, das ein superparamagnetisches Metalloxid einschließt, das mit einem Polymer beschichtet ist. Die vorliegende Verwendung ist in Anspruch 1 definiert, wobei bevorzugte Merkmale in den Unteransprüchen 2-10 genau bestimmt sind. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden eine saure Lösung eines Metallsalzes und eines Polymers abgekühlt und dann durch kontrollierte Zugabe einer kalten Lösung einer Base neutralisiert und können dann durch Anwendung von Hitze in ein homogenes superparamagnetisches Metalloxidkolloid umgewandelt werden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Polymer ein Polysaccharid sein. Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird eine saure Lösung eines Polysaccharids und eines Metallsalz auf 0-12ºC abgekühlt. Die abgekühlte Lösung kann dann durch kontrollierte Zugabe einer Base, die auf 0-12ºC abgekühlt wurde, neutralisiert werden. Die sich ergebende Lösung kann dann für nicht weniger als 30 Minuten auf zwischen 60 und 100ºC erhitzt werden, um ein homogenes superparamagnetisches Metalloxidkolloid zu erzeugen. Die Basen, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, schließen Ammoniumhydroxid und Natriumkarbonat ein. Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Polysaccharid Dextran sein und das Metallsalz kann ein Eisen (II)- oder ein Eisen (III)- Salz sein, das erfindungsgemäß ein superparamagnetisches Eisenoxid-Kolloid mit einer verlängerten Plasmahalbwertszeit erzeugt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die vorgenannten Merkmale der vorliegenden Erfindung sind leichter unter Bezugnahme auf die nachfolgende ausführliche Beschreibung verständlich, wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen zur Hand genommen wird, bei denen:
Fig. 1 ein Sepharose 2B Gel-Filtrations-Chromatogramm gemäß Beispiel 1 ist;
Fig. 2 ein Sepharose 2B Gel-Filtrations-Chromatogramm gemäß Beispiel 2 ist;
Fig. 3 ein Sepharose 2B Gel-Filtrations-Chromatogramm gemäß Beispiel 3 ist;
Fig. 4 ein Sepharose 2B Gel-Filtrations-Chromatogramm von AMI-25 ist;
Fig. 5 eine Darstellung eines Reaktors für das Kaltgelierungsverfahren der vorhergehenden Beispiele ist; und
Fig. 6 eine schematische Darstellung zweiter Dextran-beschichteter superparamagnetischer Eisenoxid-Kolloide unterschiedlicher Größe ist.

Ausführliche Beschreibung spezieller Ausführungsformen

A. Allgemeines

Die vorliegende Erfindung sieht eine Verwendung eines Kolloids, das ein superparamagnetisches Metalloxid, beschichtet mit einem Polymer einschließt, als ein MR- Kontrastmittel vor. Gemäß der Erfindung wird eine saure Lösung eines Metallsalzes und eines Polymers bereitgestellt, die abgekühlt und dann durch kontrollierte Zugabe einer kalten Lösung einer Base neutralisiert wird, um ein schwach magnetisches oder unmagnetisches Gel zu erzeugen, das dann durch Anwendung von Hitze in ein homogenes superparamagnetisches Metalloxidkolloid umgewandelt wird. Dieses Verfahren wird als Kaltgelierungsverfahren bezeichnet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Polymer ein Polysaccharid sein. Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird eine saure Lösung aus einem Polysaccharid und aus einem Metallsalz auf 0-12ºC abgekühlt. Die abgekühlte Lösung kann dann durch kontrollierte Zugabe einer Base neutralisiert werden, die auf 0-12ºC abgekühlt wurde, so dass ein unmagnetisches oder schwach magnetisches Gel erzeugt wird. Das sich ergebende Gel wird dann vorzugsweise für nicht weniger als 30 Minuten auf zwischen 60-100ºC erhitzt, um ein stark magnetisches oder superparamagnetisches homogenes Metalloxidkolloid zu erzeugen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließen die Basen, die verwendet werden können, Ammoniumhydroxid und Natriumkarbonat ein. Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Polysaccharid Dextran sein und die Metallsalze können Eisen (II)- und Eisen (III)-Salze sein, was erfindungsgemäß ein superparamagnetisches Eisenoxid-Kolloid mit einer verlängerten Plasmahalbwertszeit erzeugt.
Der Begriff "Kolloid", wie er in der Beschreibung und in den nachfolgenden Ansprüchen verwendet wird, schließt jedes Makromolekül oder Teilchen mit einer Größe von weniger als ungefähr 220 nm ein. Die Kolloide weisen eine wesentlich gesteigerte Homogenität im Vergleich zu den früher beschriebenen Materialien auf. Die Homogenität ergibt sich in klarer Weise aus der Tatsache, dass die Kolloide einen einzigen, wohl definierten Peak durch Gel-Ausschluß-Chromatographie zeigen (Fig. 1-3). Im Gegensatz hierzu erzeugt ein Kolloid, das durch ein früheres Verfahren hergestellt wurde, nämlich AMI-25, zwei Peaks, die sich aus Teilchengrößen von nur 5 nm und sogar mehreren hundert Nanometern ergeben (Fig. 4).
Das Verfahren kann Kolloide mit einer Vielzahl von Größen ergeben, obwohl die Größe ein wenig von der für die Größenmessung angewendeten Technik abhängt. Die Größe, wie sie durch Gelfitration gemessen wird (Fig. 1-4) ist die Größe, die für den Komplex des Polymers und des Metalloxidkristalls in Lösung erzielt wird oder die hydrodynamische Größe. Die hydrodynamische Größe hängt in großem Maße von der Anzahl der Eisenkristalle pro Teilchen und dem Volumen ab, das von der Polysaccharid-Beschichtung eingenommen wird (siehe Fig. 6 für eine schematische Darstellung der Teilchenarchitektur). Die durch Gelfiltration gemessene Größe ist größer als die Größe, wie sie durch die meisten elektronenmikroskopischen Techniken zu sehen ist, bei denen nur der elektronendichte superparamagnetische Eisenoxid (SPIO)-Kem visualisiert wird.
Das Verfahren wird so eingestellt, dass homogene Kolloide verschiedener Größen erzielt werden, d. h. Kolloide, die eine variierende Anzahl von Eisenoxidkristallen pro Kolloidteilchen umfassen. Das gemäß Beispiel 1 produzierte Kolloid weist eine hydrodynamische Teilchengröße von ungefähr 10-20 nm auf, was sogar die größten, vorliegenden atypischen kolloidalen Teilchen einschließt. Weil die 10-20 nm Figur eine hydrodynamische Größe ist und weil die Größe des Bestandteils superparamagnetisches Eisenoxidkristall in Beispiel 1 ungefähr 6 nm beträgt, ist das Kolloid größtenteils aus Teilchen hergestellt, die ein Kristall pro Teilchen enthalten. Somit ist das Kolloid aus Beispiel 1 extrem gut dispergiert, d. h. ist im wesentlichen ein monodispergiertes Eisenoxid. Andererseits erreicht das gemäß Beispiel 2 hergestellte Kolloid eine größere Größe bzw. Abmessung, indem eine größere Anzahl von Kristallen pro Kolloidpartikel eingebaut wird (Dextran T-10 wird als Polysaccharid-Beschichtung in den Beispielen 1 und 2 verwendet und begründet den Unterschied der Teilchengrößen, die durch Beispiele 1 und 2 erreicht wurden, nicht).
Eine schematische Darstellung der kolloidalen Teilchen mit unterschiedlicher Größe, die hergestellt werden können, ist in Fig. 6 dargestellt. Eine mit dem T-10 Dextran verbundenes monodispergiertes Eisenoxidkristall ist in Fig. 6A dargestellt; es ist ein typisches Teilchen, das sich aus einer Synthese ergibt, wie sie beispielsweise in Beispiel 1 beschrieben ist. Ein Cluster einer kleinen Anzahl von Eisenoxidkristallen, die mit Dextran T-10 verbunden sind, ist in Fig. 6B dargestellt; es ist ein übliches kolloidales Teilchen, das sich aus einer Synthese wie beispielsweise Beispiel 2 ergibt.
Das Verfahren kann so eingestellt werden, dass sich homogene Kolloide mit hydrodynamischen Größen bis zu ungefähr nur 300 kd (ungefähr 5 nm) oder bis zu einem Maximum von ungefähr 10.000 kd (100-200 nm) ergeben. Die Größe des Kolloids kann insbesondere durch Zunahme der Menge eines Polysaccharids bezüglich der Menge an Eisensalzen, die für jede Synthese vorliegt, gesenkt werden. An der Grenze der unteren Größe kann eine reine Zubereitung eines monodispergierten, Polysaccharid-beschichteten superparamagnetischen Eisenoxidkolloids erzielt werden. An der Grenze der oberen Größe werden Aggregate superparamagnetischer Eisenoxidkristalle erzeugt, jedoch variieren die Aggregate über einen engen Größenbereich. Dieser enge Größenbereich erlaubt, dass die Kolloide steril filtriert werden können.
Wenn Dextran in dem Verfahren verwendet wird, wird ein Kolloid mit einer langen Plasmahalbwertszeit nach Injektion erzielt und das Kolloid wird als ein MR Kontrastmittel verwendet. Die Plasmahalbwertszeiten und Größen einiger der besser beschriebenen Kolloide und Teilchen, die als MR Kontrastmittel verwendet werden, werden in Tabelle 1 mit denjenigen verglichen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden. In einigen Fällen sind direkte, quantitative Daten bezüglich der Bluthalbwertszeit nicht vorgesehen, jedoch kann im allgemeinen eine kurze Bluthalbwertszeit aus den Daten gefolgert werden, die eine schnelle Akkumulation von Teilchen in der Leber und in der Milz anzeigen. Im Falle der Teilchen, die durch das Molday-Verfahren synthetisiert wurden verbleiben nur 20% des injizierten Eisens zwei Stunden nach Injektion im Blut, was erneut auf eine kurze Plasmahalbwertszeit des Kolloids hinweist (siehe Fig. 3 von Pouliquen et al. (1989) Mag. Res. Imag. 7, Seiten 619-627), was eine sehr kurze Halbwertszeit impliziert. Im Gegensatz hierzu sind die Plasmahalbwertszeiten der Dextran-beschichteten superparamagnetischen Eisenoxide, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, größer als 100 Minuten. Tabelle 1: Vergleich zwischen der vorliegenden Erfindung und weiteren Materialien, die als MR-Kontrastmittel verwendet werden
t1/2 ist die Plasmahalbwertszeit des Materials im Blut. Für AMI-25, USPIO und die Beispiele 1-3 wurde die Plasmahalbwertszeit wie beschrieben (Josephson et al., (1990) Mag. Res. Imag. 8 Seiten 637-646), gemessen.
Wenn Dextran im Kaltgelierungsverfahren verwendet wird, wird die Oberfläche des superparamagnetischen Eisenoxids mit Dextran in einer Art und Weise beschichtet, die die Plasmahalbwertszeit des Kolloids verlängert. Die Fähigkeit des Dextrans, die Plasmahalbwertszeit zu verlängern ermöglicht es, Dextran-beschichtete Kolloide von den früher beschriebenen magnetischen Materialien, die Dextran einschließen, zu unterscheiden, siehe Tabelle 2 nachstehend. Diese Beobachtung kann als Test für die Unterscheidung der Dextran-beschichteten Kolloide von anderen Materialien verwendet werden, siehe nachstehend. Der physiologische Mechanismus, durch den die Dextran-Beschichtung die Plasmahalbwertszeit des injizierten Eisenoxids verlängert, ist wie folgt.
Nach Injektion werden die früher beschriebenen superparamagnetischen Eisenoxidkolloide (und genauso die nicht magnetischen Teilchen) schnell beseitigt, weil Proteine im Blut, die als Opsonine bezeichnete werden, die Oberfläche des Eisenoxids beschichten oder sich auf dieser ablagern. Die Opsonin-Beschichtung markiert das Kolloid für eine Clearance- bzw. Beseitigung durch phagozytische Zellen des RES in einem Verfahren, das als Nicht- Immun-Opsonisierung bezeichnet wird. Die Nicht-Immun-Opsonisierung und die anschließende Phagozytose sind die Mechanismen, durch die eine Vielzahl von Teilchen und Kolloiden durch das RES beseitigt werden. Das Hauptplasmaopsonin ist ein Protein, das als Fibronektin bekannt ist (für eine Erörterung siehe E. A. Jones und J. A. Summerfield in "The Liver, Biology and Pathobiology", I. Arias, H. Popper, D. Schater und D. A. Schafritz, Hrsg. Raven Press, New York, 1982, Seiten 510-512).
Wir haben herausgefunden, dass es ein allgemeines Merkmal des Kaltgelierungsverfahrens ist, dass die Polysaccharid-Beschichtung des Eisenoxids die Pharmakokinetik nach Injektion bestimmen kann. Im Falle des Dextrans erhöht die Beschichtung die Plasmahalbwertszeit (Tabelle 2). Wenn Arabinogalactan Dextran als Polysaccharid-Beschichtung im Kaltgelierungsverfahren (Beispiel 3) ersetzt, dient das Polysaccharid wiederum dazu, die Pharmakokinetik zu bestimmen, die sich nach Injektion ergibt. Das Arabinogalactanbeschichtete superparamagnetische Eisenoxid wird aus dem Blut entfernt, weil Arabinogalactan durch den Asialoglycoprotein-Rezeptor erkannt wird, der auf Leberzellen zu finden ist. Das Arabinogalactan-beschichtete Kolloid weist eine Bluthalbwertszeit von weniger als 10 Minuten auf und ist im einzigen Organ mit Leberzellen zu finden, nämlich der Leber. Im Gegensatz hierzu weisen die Dextran-beschichteten Kolloide Halbwertszeiten von mehr als 100 Minuten auf (Tabelle 1) und sind in der Milz ebenso wie in der Leber zu finden.
Wir haben ebenfalls herausgefunden, dass sich ein Test, ob ein Kolloid beschichtet ist, durch die Reaktion des Kolloids auf Hitzestress ergibt. Wenn ein superparamagnetisches Eisenoxidkolloid einem Hitzestress ausgesetzt wird, bleibt die Größe des Kolloids unverändert, jedoch dissoziiert das Dextran von der Oberfläche des Eisenoxids. Die Dextran- Dissoziation ist direkt durch eine Zunahme der Menge an dialysierbarem, niedermolekularem Dextran ersichtlich, das mit dem Kolloid vorliegt (siehe Tabelle 3 unten). Die funktioneue Folge des Dissoziierens des Dextrans von der Oberfläche des superparamagnetischen Eisenoxids ist eine Abnahme der Plasmahalbwertszeit. In Tabelle 2 wurden Dextranbeschichtete Kolloide (Beispiel 1 und 2 der vorliegenden Erfindung) und ein früheres, superparamagnetisches Kolloid (AMI-25) erhitzt (121ºC, 30 Minuten) und zwar bei Eisenkonzentrationen zwischen 5 und 50 mg/ml bei einem pH von 8 in 5 mM Citrat und 300 mM Mannitol. Es ist hierbei zu sehen, dass die Clearance von AMI-25 schnell und durch Hitzestress unverändert ist. Dies ergibt sich, weil AMI-25 nicht Dextran-beschichtet ist und dessen Eisenoxid mit Opsoninen reagiert und eine schnelle Blut-Clearance sich vor oder nach dem Hitzestress zeigt. Andererseits wird die Clearance der Dextranbeschichteten Kolloide normalerweise verlangsamt und wird dramatisch durch Hitzestress erhöht. Dies ergibt sich, weil die Dextran-Beschichtung dieser Materialien eine Opsonisierung verhindert und von der Oberfläche durch Hitzestress entfernt oder dissoziiert wird. Ein weiterer Beweis der Rolle des Dextrans bei der Verlängerung der Plasmahalbwertszeit ergibt sich, wenn die Dextran-Dissoziation, die sich normalerweise durch eine Hitzebehandlung ergibt, durch Vernetzung blockiert wird (siehe Tabelle 3 unten).
Somit bedeutet der Begriff "beschichtet" oder "Beschichtungen", wie er in der Beschreibung und den nachfolgenden Ansprüchen in Verbindung mit Dextran oder anderen Polysacchariden oder einem anderen Polymer verwendet wird, dass Dextran oder das andere Polymer mit der Oberfläche des superparamagnetischen Metalloxids in einer derartigen Weise verbunden ist, dass das Polymer die Opsonisierung blockiert und die Plasmahalbwertszeit des Metalloxids erhöht (außer, wenn das Polymer selbst durch einen Zellrezeptor erkannt wird und erlaubt, dass das Metalloxid durch Rezeptor-vermittelte Endozytose in die Zelle aufgenommen wird). Wenn Dextran als Polysaccharid im Kaltgelierungsverfahren verwendet wird, weist das sich ergebende Kolloid eine einzigartige Oberfläche, d. h. sie ist Dextran-beschichtet, und eine einzigartige Funktion auf, d. h. eine lange Plasmahalbwertszeit.
Bei einer weiteren Ausführungsform können die Kolloide durch Verfahren stabilisiert werden, die eine Vernetzung von Polysaccharid zur Folge haben. Bei der Vernetzung wird das Kolloid mit Mitteln behandelt, die mit zwei oder mehreren Polysaccharid-Molekülen auf der Oberfläche des Eisenoxids reagieren. Wie unten erklärt, hat die Vernetzung eine engere Verbindung zwischen dem Polysaccharid und dem Eisenoxid zur Folge.
Viele Mittel mit mehr als einem reaktiven Zentrum können für die Vernetzung verwendet werden, wie beispielsweise Glutaraldehyd, Disuccinimidylsuberat (DSS) und Diethylentriaminpentaessigsäureanhydrid (DTPA Anhydrid). Es können Mittel verwendet werden, die zur Aktivierung von Polysaccharid-Teilchen zur Immobilisierung biologischer Moleküle, die sich häufig in einem signifikanten Ausmaß vernetzen, verwendet werden. Mittel dieser Art schließen Bromcyan, Ethylchlorformiat und Divinylsulfon ein. Das bevorzugte Vernetzungsmittel ist Epichlorhydrin. Das Dextran-beschichtete Kolloid, das gemäß Beispiel 1 hergestellt ist, wird in Beispiel 4 mit Epichlorhydrin vernetzt.
Die stabilisierenden Wirkungen der Vernetzung werden gezeigt, wenn das Kolloid einem Hitzestress unterworfen wird, siehe Tabelle 3. Die Wirkung der Vernetzung wurde wie folgt gemessen: (i) die Fähigkeit der Vernetzung, die Hitze induzierte Dissoziation des Dextrans von der Oberfläche des Eisenoxids zu blockieren und (ii) die Fähigkeit des Vernetzens, die Hitze induzierte Abnahme der Plasmahalbwertszeit zu blockieren.
Das Kolloid aus Beispiel 4,11 mg/ml Fe in 25 mM Natriumcitrat, pH 8, wurde einem Hitzestress ausgesetzt (121ºC für 30 Minuten). Die Assoziation bzw. Bindung des Dextrans von dem Kolloid wird gemessen, wenn das Dextran durch eine Mikrokonzentrator- Ultrafiltrationsmembran mit einem Cutoff von 100 kd hindurch geleitet wird (Amicon, Danvers, MA). Der Prozentsatz an freiem Dextran ist die Konzentration an freiem Dextran geteilt durch die Dextrankonzentration des Kolloids vor der Ultrafiltration (die freien und gebundenen Fraktionen zusammengenommen).
Bei dem nicht vernetzten Kolloid wird das Dextran von der Oberfläche des Eisenoxids durch Hitzestress dissoziiert, wie es durch die Zunahme an freiem Dextran von 5,6%-28% des Gesamt-Dextrans angezeigt wird. Bei dem vernetzten Kolloid wurde eine Zunahme des freien Dextrans von 5,5% auf nur 8% erreicht. Dies zeigt an, dass eine Epichlorhydrin- Behandlung eine engere Bindung zwischen dem Dextran und dem Eisenoxid zur Folge hat.
Wenn das Kolloid einem Hitzestress ausgesetzt wird, zeigt das vernetzte Kolloid keine Abnahme der Plasmahalbwertszeit.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass eine Vernetzung die Hitze induzierte Dextran- Dissoziation und den damit verbundenen Abfall der Plasmahalbwertszeit blockiert. Die Fähigkeit des Vernetzens, sowohl die Dextran-Dissoziation als auch den Abfall der Plasmahalbwertszeit zu blockieren stützt die Ansicht weiterhin, dass das Dextran die Oberfläche des Eisenoxids bedeckt, die nicht die Immun-Opsonisierung blockiert und die Plasmahalbwertszeit verlängert. Tabelle 2: Test der Dextran-Beschichtung eines superparamagnetischen Eisenoxidkolloids
* sehr heterogenes Kolloid. Die Größe ist eine Schätzung auf Grundlage des Volumenmedian-Durchmessers durch Lichtstreuung typischer Zubereitungen. Tabelle 3: Wirkung der Hitze auf durch vernetztes und nicht vernetztes Dextran beschichtetes superparamagnetisches Eisenoxidkolloid

B. Das Kaltgelierungsverfahren: Allgemeines Verfahren

Die Synthese von superparamagnetischen Eisenoxiden durch das Kaltgelierungsverfahren schließt zwei Schritte ein. Diese sind: (i) die Neutralisierung von Eisensalzen mit einer Base bei 0-12ºC zur Bildung einer schwach magnetischen oder paramagnetischen Aufschlemmung oder Gels und gefolgt von (ii) einem Erhitzen zur Umwandlung des paramagnetischen Gels zu einem superparamagnetischen Kolloid. Die Bildung einer paramagnetischen Aufschlemmung in Schritt (i) ist ein einzigartiges Merkmal des Kaltgelierungsverfahrens. Die gebildete Aufschlemmung wird wegen der großen Mengen paramagnetischer Ionen, die dieses eingebaut aufweist, als "paramagnetisch" bezeichnet, sie zeigt jedoch keine erkennbaren magnetischen Eigenschaften wie beispielsweise die Anziehung eines externen, tragbaren Magneten.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Kaltgelierungsverfahren wird ein Gemisch von Eisen (II)- und Eisen (III)-Salzen und eines Polysaccharids in Wasser gelöst. Die Mischung wird auf unter ungefähr 12ºC, im allgemeinen zwischen 2 und 4ºC abgekühlt.
Eine Base wird langsam zugesetzt, die verursacht, dass ionisches Eisen ein grünes Gel oder eine Aufschlemmung eines Eisenoxids bildet. Ammoniumhydroxid und Natriumkarbonat sind die bevorzugten Basen. Wenn sich das Eisenoxid in der Kälte entwickelt, bildet es sich unter Bedingungen, die sich von denjenigen unterscheiden, die früher von Anderen verwendet wurden. Typischerweise schließt der Erhitzungsschritt eine Erhöhung der Temperatur der paramagnetischen Aufschlemmung auf zwischen 60ºC und 90ºC für zumindest ungefähr 0,5 Stunden ein. Während des Erhitzens wird die paramagnetische Aufschlemmung aus einer grünen, schwach magnetischen Aufschlemmung zu einem schwarzen, stark paramagnetischen Kolloid umgewandelt.
Nach dem Erhitzungsschritt enthält das Gemisch in einem bestimmten Verhältnis: (i) das superparamagnetische Eisenoxidkolloid, beschichtet mit Polysaccharid; (ii) Polysaccharid; (iii) lösliche Spurenmengen an Eisenionen und NH&sub4;Cl. Das Gemisch wird dann einem Fraktionierungsschritt unterworfen, um das gesamte kolloidale Eisen mit hohem Molekulargewicht (> 100 kd oder Kilodalton) von den Polysacchariden mit niedrigem Molekulargewicht, Eisenionen, Ammoniak- und Chloridionen (< 100 kd) zu trennen.
Das Kaltgelierungsverfahren kann in unterschiedlichen Arten von Reaktoren erreicht werden, von denen einer in Fig. 5 dargestellt ist. Hier wird eine Neutralisierung durch Verwendung einer Pumpe (7) erreicht, um die Base (5) durch ein Rohr (6) einem ummantelten Rührreaktionsgefäß zuzusetzen, das ein Rührgerät (8) und eine Lösung von Eisensalzen und Polysaccharid (4) enthält. Die Temperatur wird bei 0-12ºC, vorzugsweise bei 2-4ºC gehalten, indem kaltes Wasser vom Einlaß (1) durch den Mantel des Reaktors (3) zum Auslaß (2) fließt. Ein Erhitzen wird durch Erhöhung der Temperatur des Wassers im Mantel auf zwischen 80ºC und 100ºC nach dem Gelbildungsschritt erreicht. Als Folge nimmt die Temperatur der nicht magnetischen Aufschlemmung auf bis zu 70ºC bis 80ºC über eine Zeitspanne von ungefähr 1 Stunde zu. Während dieses Schrittes wird das hoch magnetische und superparamagnetische homogene Kolloid gebildet. Eine Stickstoffatmosphäre wird durch Spülen mit diesem Gas durch ein Rohr (9) aufrecht erhalten.
Lösungen, die Eisensalze und Dextran enthalten, werden durch 220 nm Filter durchgeleitet, um teilchenförmiges Material zu entfernen und um die biologische Belastung des sich ergebenden Kolloids zu reduzieren. Zusätzliche Filtrationsschritte können während des Verfahrens durchgeführt werden, beispielsweise bevor die Ultrafiltration das überschüssige Polysaccharid entfernt. Dies begrenzt weiterhin die biologische Belastung und reduziert die mögliche Kontamination bzw. Verunreinigung des Endkolloids mit Endotoxin. Das schwach magnetische Gel oder die Aufschlemmung, die sich sofort nach Neutralisation in der Kälte gebildet hat, kann nicht filtriert werden.
Durch Auswahl geeigneter Bedingungen kann das Kaltgelierungsverfahren homogene Kolloide unterschiedlicher Größen ergeben. Besonders bedeutende Bedingungen schließen das Verhältnis der drei Reaktionspartner (d. h. Eisen (II)-Ion, Eisen (III)-Ion und Polysaccharid) und die Gesamtkonzentrationen (d. h. die Menge von Wasser die zugesetzt wird) ein. Für Beispiel 1 wird ein homogenes, Dextran beschichtetes Kolloid von zwischen 600 und 900 kd (zwischen ungefähr 10 bis 20 nm) erzeugt. (Für ein Chromatogramm, siehe Fig. 1). In Beispiel 2 wird ein homogenes, Dextran beschichtetes Kolloid von ungefähr 1.000 bis ungefähr 1.500 kd (zwischen 30-50 nm) erzeugt. In Beispiel 3 wird ein homogenes, Arabinogalactan-beschichtetes Kolloid ungefähr der selben Größe wie in Beispiel 2 erzeugt (Fig. 3). Zum Vergleich ist das Chromatogramm von AMI-25, einem heterogenen Kolloid, das durch ein früheres Verfahren hergestellt wurde, in Fig. 4 dargestellt.
Die gemäß dem Beispiel 1 und 2 hergestellten Kolloide sind Dextran-beschichtet, wie es durch die Fähigkeit des Hitzestresses angezeigt wird, ihre Plasmahalbwertszeit zu verkürzen (Tabelle 2). Das Arabinogalactan-beschichtete Kolloid, das gemäß Beispiel 3 hergestellt wurde, weist eine sehr kurze Plasmahalbwertszeit auf, da das Arabinogalactan durch den Asialoglycoprotein-Rezeptor von Leberzellen erkannt wird. Es wird schnell aus dem Plasma durch die Wirkung dieses Rezeptors entfernt.
Zur Herstellung reproduzierbarer Kolloide und hoch magnetischer Kolloide muß die Umsetzung von Sauerstoff mit Eisen (II)-Ionen minimiert und kontrolliert bzw. gesteuert werden. Ein Fehlschlagen der Kontrolle der Sauerstoffexposition kann zu einer unkontrollierten Oxidation des Eisen (II)-Iones zu einem Eisen (III)-Ion führen, das die magnetischen Eigenschaften des sich ergebenden Kolloids verringern kann. Die Verfügbarkeit von Sauerstoff kann durch Beschichtung des Mantelreaktors (Fig. 5) und durch Durchspülen mit einem Sauerstoff freien Gas, vorzugsweise Stickstoff, minimiert werden. Bei einer Ausführungsform wird der Sauerstoffgehalt durch Durchspülen einer Lösung von Eisen (III)- Chlorid und Dextran mit Stickstoff für 10-24 Stunden minimiert. Die Lösung wird im Reaktor angeordnet und gerührt, während Wasser bei 4ºC durch den Mantel des Reaktors fließt bzw. strömt. Dies hat eine Sauerstoff freie Lösung bei der Temperatur des ummantelten Wassers zur Folge. Diesem wird eine feste Form eines Eisen (II)-Salzes zugesetzt, die knapp vor der Neutralisierung aufgelöst wird. Die Stickstoffspülung wird während des Erhitzungsschrittes durchgeführt, wird jedoch während des Zusatzes von flüchtigen Basen wie beispielsweise Ammoniumhydroxid vermieden. Nach den Schritten der Neutralisation und des Erhitzens weist eine Sauerstoffexposition und eine anschließende Oxidation eine nur geringe Wirkung auf das Kolloid auf, wie unten diskutiert wird.

C. Alternativen und Substitutionen:

Eine Reihe von Substitutionen und Alternativen liegen innerhalb des Umfangs und der Lehren der vorliegenden Erfindung. Einige von diesen werden nachstehend dargestellt.
Als eine Alternative zum diskontinuierlichen Reaktor, der in Fig. 5 dargestellt ist, kann das Mischen zwischen der kalten Base einerseits und der kalten Lösungen des Eisensalzes und des Dextrans andererseits in einem kontinuierlichen Reaktor erreicht werden. Eine Zweikanalpumpe zieht jede Lösung ab und verursacht, dass diese an der Kreuzung eines "Y"-Rohres vermischt werden. Die sich ergebende paramagnetische Aufschlemmung (kaltes Gel) kann durch Einsammeln von diesem in einer oder zwei Arten erhitzt werden. Sie kann in einem Mantelreaktor gesammelt werden, wie er in Fig. 5 dargestellt ist oder durch Pumpen der Lösung durch eine Rohrschlange, die von Wasser bei ungefähr 95ºC umgeben ist. Wenn eine Heizschlange verwendet wird, muß sie lang genug sein, um die paramagnetische Aufschlemmung für zumindest ungefähr 30 Minuten zu erhitzen, bevor das Produkt den Auslaß der Heizschlange bzw. Heizspirale verläßt.
Polysaccharide, die in Verbindung mit dem Kaltgelierungsverfahren verwendet werden können, schließen die Dextrane, die Arabinogalactane, Dextrine, Hydroxyethylstärken, Mannane, Galactane, sulfatierten Dextran und Diethylaminodextrane ein. Andere Polymere als Polysaccharide können verwendet werden, wenn sie den Anforderungen des Kaltgelierungsverfahren entsprechen. Das Polymer muß stabil gegenüber der Säureumgebung sein, die erforderlich ist, um das Eisen (III)-Ion in Lösung zu halten, der unterhalb pH 3 liegt und das Polymer muß der Belastung des Erhitzungsschrittes widerstehen und darf nicht Eisen (III)- oder Eisen (II)-Ionen binden, was die Bildung von Eisenoxid nach Basenzusatz hemmt. Das Polymer muß ebenfalls an die Eisenoxid-Oberfläche adsorbieren.
Andere Metalle als Eisen können in das Kolloid eingebaut werden, indem sie als Salze vor dem Neutralisationsschritt zugesetzt werden. Insbesondere CO²&spplus; oder Mn²&spplus; kann Fe²&spplus; teilweise ersetzen. Wie Eisen weisen diese Metalle eine biologische Funktion und nur minimale Toxizität auf. Natriumkarbonat, das als eine 26% G/G Lösung des Monohydrat- Salzes hergestellt wird, kann anstelle von Ammoniumhydroxid verwendet werden.
Die Ultrafiltration wird dazu verwendet, freies Polysaccacharid vom Polysaccharidbeschichteten superparamagnetischen Eisenoxid-Kolloid abzutrennen. Der Cutoff der Ultrafiltrationsmembran muß derartig sein, dass das Polysaccharid im Filtrat entfernt und das Polysaccharid-beschichtete superparamagnetische Kolloid zurückgehalten wird. Für die in den nachstehenden Beispielen verwendeten Polysaccharide ist eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Cutoff von 100 kd oder 300 kd zufriedenstellend. Eine Ultrafiltration ist die bevorzugte Technik für diesen Trennschritt, jedoch schließen andere praktische Verfahren die Zentrifugation und die Gelpermeationschromatographie ein.
Nach dem Erhitzungsschritt, der das homogene superparamagnetische Eisenoxid-Kolloid aus der nicht magnetischen Aufschlemmung bildet, existiert das Eisen (II)-Eisen in einem Magnetit- oder gamma-Eisen (III)-Oxid-Kristalltyp. Diese beiden Oxide des Eisens weisen ähnliche magnetische Eigenschaften auf. Folglich erzeugt in diesem Stadium eine vollständige Oxidation des Magnetits zu gamma-Eisen-(III)-Oxid (Fe²&spplus; zu Fe³&spplus;) eine geringe Veränderung der magnetischen Eigenschaften des Kolloids. Eine Oxidation kann durch Exposition des Kolloids gegenüber Oxidationsmitteln wie beispielsweise H&sub2;O&sub2; bei Temperaturen wie beispielsweise 25-50ºC und für Inkubationszeitspannen von zwischen 10 und 50 Stunden erreicht werden. Das sich ergebende Kolloid weist eher die rotbraune Farbe von gamma-Eisen (III)-Oxid (Gamma Fe&sub2;O&sub3;) als die braune oder schwarze Farbe von Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;) auf, das Eisen (II)-Ionen enthält (Fe²&spplus;).
Die Kolloide können lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet und ohne Veränderung ihrer Größenverteilung und ohne Bildung von teilchenförmigem Material wieder hergestellt werden. Um eine maximale Stabilität für das Kolloid zu erreichen, können Trägerstoffe wie beispielsweise Dextran oder Natriumcitrat zugesetzt werden.
Die Alternative zur Filtersterilisation (erörtert in Teil B des obigen technischen Hintergrundes) ist eine Endsterilisation, die ein Unterwerfen des Kolloids gegenüber einer hohen Temperatur (beispielsweise 30 Minuten, 121ºC) einschließt. Die Endsterilisation erfüllt die Rechtsvorschrift für die Sterilität von parenteralen Produkten. Wir haben jedoch herausgefunden, dass die Endsterilisation auch unerwünschte Wirkungen auf die magnetischen Kolloide und Teilchen erzeugt. Die Endsterilisation kann ein Kolloid ergeben, das ein Absenken des Blutdruckes nach der Injektion mit sich bringt (siehe Tabelle 1 der CA- A-2 075 994). Dies ist eine sehr unerwünschte abträgliche Reaktion und bereits eine geringe Inzidenz derartiger Reaktionen kann die Zulassung durch die Aufsichtsbehörde, die für den Verkauf eines pharmazeutischen Produktes erforderlich ist, verhindern. Daher werden die Verfahren ebenso als bedeutend angesehen, um eine Sterilisation ohne dem Risiko einer erhöhten Toxizität zu erreichen.

D. Weitere Chemie der Polysaccharid-beschichteten Kolloide

Eine weitere chemische Verfahren können mit den Dextran-beschichteten Kolloiden durchgeführt werden, die entweder ohne Vernetzen (siehe Beispiel 1 und 2) hergestellt wurden oder die durch Vernetzen stabilisiert wurden (siehe Beispiel 4). Weil beide Dextran-beschichteten Kolloidtypen lange Plasmahalbwertszeiten aufweisen, kann das Eisen, das sie aufweisen, auf Zellen oder Gewebe durch die Anlagerung einiger Antikörper, Proteine, Peptide, Steroide, Bindungsproteine oder anderer Materialien an das Dextran, gerichtet werden. Die lange Plasmahalbwertszeit ermöglicht das effiziente Targeting von superparamagnetischen Eisenkristallen auf Zellen, die Antigene und Rezeptoren besitzen. Die Anlagerung von Proteinen an Dextran eines magnetischen Eisenoxidkolloids wurde von Molday im US-Patent Nr. 4 452 773 beschrieben; jedoch weisen die Eisenoxid- Kolloide, die durch das Molday-Verfahren hergestellt wurden, eine kurze Bluthalbwertszeit auf (siehe oben und Tabelle 2). Wie oben erklärt ist dies auf die schnelle Clearance des injizierten Eisens durch die Phagozyten der Leber und der Milz zurückzuführen und reduziert die Menge an Eisen, die auf andere Stellen gerichtet werden kann. Somit bedeutet die Oberflächen-Derivatisierung der Eisenoxide vom Molday-Typ keinen Ansatz, der für das Targeting von Eisen auf Zellen nach der Injektion gut geeignet wäre.

Beispiele

Beispiel 1: Ein kleines Dextran-beschichtetes Kolloid.

1.005 ml einer 0,2 um (Mikron) filtrierten wässrigen Lösung von 450 g Dextran, T-10 und 31,56 g (116,76 mmol) von Eisen (III)-Chloridhexahydrat werden auf 2-4ºC abgekühlt. Dem oben genannten abgekühlten Gemisch wird eine frisch zubereitete (15-30 Minuten) 0,2 um (Mikron) filtrierte wässrige Lösung zugesetzt, die 12,55 g (63,13 mmol) Eisen (II)- Chloridtetrahydrat gelöst in Wasser zu einem Gesamtvolumen von 43 ml enthält. Während sie rasch gerührt wird, wird die obige saure Lösung durch den tropfenweisen Zusatz von 45 ml 2-4ºC gekühlter 28-30% Ammoniumhydroxid-Lösung neutralisiert. Die grünliche Suspension wird dann über ein einstündiges Erhitzungsintervall hinweg auf zwischen 75 und 85ºC erhitzt. Das Gemisch wird in diesem Temperaturbereich für 75 Minuten gehalten, während das Rühren konstant fortgesetzt wird.
Das Ammoniumchlorid zusammen mit überschüssigem Dextran und Ammoniumhydroxid wird durch Ultrafiltration auf einem 2 Liter CH-2-Gerät (Amicon, Inc., Danvers, MA), das mit 300 kd Hohlfaserkartuschen ausgestattet ist, entfernt. Nach ungefähr sechs Waschungen zeigt sich, dass das Elutionsmittel frei von Verunreinigungen ist. Das kolloidale Produkt wird durch Ultrafiltration (< 40 mg/ml) konzentriert und 0,2 um Mikron-filtriert. Das sich ergebende Kolloid zeigt einen einzigen Peak von ungefähr 700 kd durch Gelchromatographie auf Sepharose 2B, was einer Größe von grob 10-20 nm und einem Molekulargewicht von zwischen 600 und 900 kd entspricht. Dies weist darauf hin, dass ein homogenes Kolloid erzeugt wurde (Fig. 1).
Das Kolloid hat ein Aufnahmevermögen von mehr als 2,5 · 10&supmin;&sup6; tesla (25.000 · 10&supmin;&sup6; (c.g.s.)) pro Gramm Fe, was darauf hinweist, dass das Eisen superparamagnetisch ist (siehe Josephson et al., (1990) Mag. Res. Imag. 8, Seiten 637-646 für Einzelheiten bezüglich der Aufnahmefähigkeits-Messung. Paramagnetisches Eisen würde eine Aufnahmefähigkeit von weniger als 5.000 in ähnlichen Einheiten aufweisen). Das Kolloid ist Dextranbeschichtet und weist eine Plasmahalbwertszeit von mehr als 200 Minuten auf (Tabelle 2)).

Beispiel 2: Ein großes Dextran beschichtetes Kolloid.

381 ml einer 0,2 um (Mikron)- filtrierten wässrigen Lösung von 170,5 g Dextran, T-10 und 31,56 g (116,76 mmol) von Eisen (III)-Chlorid-Hexahydrat wird auf 2-4ºC abgekühlt. Dem obigen abgekühlten Gemisch wird frisch zubereitete (15-30 Minuten) 0,2 um (Mikron) filtrierte wässrige Lösung zugesetzt, die 12,55 g (63,13 mmol) an Eisen (II)- Chloridtetrahydrat, gelöst in einem Gesamtvolumen von 43 ml, enthält. Während rasch gerührt wird, wird die obige saure Lösung durch die tropfenweise Zugabe von 2-4ºC gekühlter 28-30% Ammoniumhydroxid-Lösung neutralisiert. Die grünliche Suspension wird dann auf zwischen 75 und 85ºC über eine Stunde eines Erhitzungsintervalls hinweg erhitzt. Das Gemisch wird in diesem Temperaturbereich für 75 Minuten gehalten, während konstant gerührt wird.
Das Ammoniumchlorid zusammen mit überschüssigem Dextran und Ammoniumhydroxid werden durch Ultrafiltration auf einem 2 Liter CH-2-Gerät (Amicon, Inc., Danvers, MA), das mit 300 kd Hohlfaserkartuschen ausgestattet ist, entfernt. Nach ungefähr sechs Waschungen zeigt sich das Elutionsmittel als frei von allen Verunreinigungen. Das kolloidale Produkt wird durch Ultrafiltration (< 40 mg/ml) konzentriert und wird anschließend durch Filter einer abnehmenden Porosität von 800 nm, 450 nm und 220 nm hindurch geleitet.
Das sich ergebende Kolloid zeigt einen einzigen Peak von grob 1.000 bis 1.500 kd durch Gelchromatographie auf Sepharose 2B, was einer Größe von grob 30-50 nm entspricht und es wird ein homogenes Kolloid produziert, wie es in Fig. 2 dargestellt ist. Das Kolloid weist ein Aufnahmevermögen von mehr als 2,5 · 10&supmin;&sup6; tesla (2.500 · 10&supmin;&sup6;(c.g.s.)) pro Gramm Eisen auf, was darauf hinweist, dass das Eisen superparamagnetisch ist. Das Kolloid weist eine Plasmahalbwertszeit von mehr als 100 Minuten auf und ist mit Dextran beschichtet (Tabelle 2).

Beispiel 3: Ein Arabinogalactan-beschichtetes Kolloid.

1.300 ml einer 0,2 um (Mikron) filtrierten wässrigen Lösung von 325 g gereinigtem Lärchenholz-Arabinogalactan und 24,25 g (89,72 mmol) Eisen (III)-Chloridhexahydrat wird auf 2-4ºC abgekühlt. Der obigen gekühlten Lösung wird eine frisch zubereitete (15-30 Minuten) 0,2 um (Mikron)- filtrierte wässrige Lösung, die 18,84 g (89,72 mmol) Eisen (II)-Chloridtetrahydrat, gelöst in Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 33,3 ml, enthält, zugesetzt. Während rasch gerührt wird, wird die obige saure Lösung durch tropfenweise Zugabe von 49,7 ml 2-4ºC gekühlter 28-30% Ammoniumhydroxid-Lösung neutralisiert. Die sich ergebende grünliche Suspension wird dann über eine 1-stündiges Erhitzungsintervall auf 85-90ºC erhitzt. Das Gemisch wird in diesem Temperaturbereich für 75 Minuten gehalten, während konstant gerührt wird.
Das Ammoniumchlorid zusammen mit überschüssigem Arabinogalactan und Ammoniumhydroxid werden durch Ultrafiltration auf einem 2 Liter CH-2-Gerät (Amicon, Inc., Danvers, MA),. ausgestattet mit 300 kd Hohlfaser- bzw. Ionenaustauschermembran- Kartuschen, entfernt. Nach ungefähr sechs Waschungen zeigt sich das Elutionsmittel als frei von Kontaminationen. Das kolloidale Produkt wird durch Ultrafiltration (< 40 mg/ml) konzentriert und wird anschließend durch Filter einer abnehmenden Porosität von 800 nm, 450 nm und 220 nm hindurch geleitet.
Das sich ergebende Kolloid zeigt einen einzigen Peak von grob 1.000-1.500 kd durch Gelchromatographie auf Sepharose 2B, was einer Größe von grob 30-50 nm entspricht. Ein homogenes Kolloid wurde, wie in Fig. 3 dargestellt, produziert. Das Kolloid weist eine Aufnahmefähigkeit von mehr als 2,5 · 10&supmin;&sup6; tesla (25.000 · 10&supmin;&sup6; (c.g.s.)) pro Gramm Fe auf, was darauf hinweist, dass das Eisen superparamagnetisch ist. Das Kolloid weist eine Plasmahalbwertszeit von weniger als 10 Minuten (Tabelle 2) wegen der Rezeptorvermittelten Aufnahme durch den Asialoglycoprotein-Rezeptor auf.

Beispiel 4: Vernetzung eines Dextran-beschichteten Kolloids.

Das Dextran-beschichtete Kolloid wurde im wesentlichen gemäß Beispiel 1 hergestellt. In einer Abzugshaube werden zu 20 ml Kolloid (12 mmol Fe) 100 ml 5 M NaOH, 40 ml destilliertes Wasser und 40 ml Epichlorhydrin zugesetzt. Eine gewisse Gasfreisetzung tritt ein. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für ungefähr 24 Stunden unter Schütteln inkubiert, um die Interaktion der organischen Phase (Epichlorhydrin) und der wässrigen Phase zu fördern, die das Dextran-beschichtete Kolloid einschließt. Epichlorhydrin wird durch Anordnen des Kolloids in einem Dialyse-Beutel und durch Dialysieren gegen 20 Wechsel von destilliertem Wasser von jeweils 20 Litern entfernt.
Die Größe und die magnetischen Eigenschaften des Kolloids werden durch diese Behandlung nicht beeinträchtigt, und sind so wie Beispiel 1 beschrieben. Das Dextran des vernetzten Kolloides wird durch die Hochtemperatur-Behandlung, die das Dextran von der Oberfläche des Dextran-beschichteten Stammkolloids (Tabelle 3) dissoziiert, nicht dissozüert.

Claims

1. Verwendung eines MR - Kontrastmittels aus einem Kolloid, das aus superparamagnetischen Metalloxid-Teilchen homogener Größe gebildet wird, die mit einem Polymer derart beschichtet sind, dass die Polymerbeschichtung eine Opsonierung hemmt, dadurch gekennzeichnet, dass das Kolloid durch ein Verfahren synthetisiert wird, das Folgendes umfasst:

(i) Bereitstellen einer sauren Lösung, die das Polymer, ein Eisen(11)-Salz und ein Eisen(III)-Salz umfasst;

(ii) Abkühlen der Lösung, die in (i) gewonnen wurde, auf 0º bis 12ºC;

(iii) Neutralisieren der in (II) gewonnenen Lösung durch kontrollierte Zugabe einer Lösung einer Base bei 0º bis 12ºC zur Bildung eines schwach magnetischen oder unmagnetischen Gels; und

(iv) Erhitzen der in (III) gewonnenen Lösung auf eine Temperatur über der Umgebungstemperatur unter kontinuierlichem Rühren zur Gewinnung des polymerbeschichteten superparamagnetischen Metalloxid-teilchenhaltigen Kolloids, wobei die Homogenität der Größe der Teilchen als ein einziger Peak durch Gel Ausschluß-Chromatographie bestimmt wird.

2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der das Polymer ein Polysacharid ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei der das Polysacharid aus Arabinogalactan, Dextran, Hydroxyethylstärke, Dextrin, Manan, Galaktan, sulfiertem Dextran und Diethylaminodextran ausgewählt ist.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der (iv) ein Erhitzen der Lösung auf zwischen 60º und 100ºC für nicht weniger als 30 Minuten umfasst, um das superparamagnetische Metalloxid-Kolloid zu gewinnen.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der in (IV) ein superparamagnetisches Eisenoxid-Kolloid gewonnen wird.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei der das Kolloid dazu in der Lage ist, mit einem Zellrezeptor in Wechselwirkung zu treten und eine Rezeptor-vermittelte Endozytose in einer speziellen Zellpopulation durchzumachen.

7. Verwendung nach Anspruch 6, bei der das Polysacharid Arabinogalaktan ist und die Zellen Leberzellen sind.

8. Verwendung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, bei der die Plasma-Clearance durch Asialoglycoproteine gehemmt wird.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der das Verfahren weiter umfasst:

(v) Befestigen eines Materials an das Polysacharid, wobei das Material aus einem Antikörper, einem Protein, einem Peptid, einem Steroid und einem Bindungsprotein ausgewählt ist.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei der das Polymer Dextran ist und das Kolloid eine Plasmahalbwertszeit aufweist, die größer als 20 Minuten ist.