JPH05503538A

JPH05503538A - コロイド状超常磁性ｍｒ造影剤製造のためのフィルター滅菌法

Info

Publication number: JPH05503538A
Application number: JP3505954A
Authority: JP
Inventors: ジョセフソン、リー; 沓ロマン、アーネスト・ブイ; パルマッシ、ステファン
Original assignee: アドバンスド・マグネティクス・インク
Priority date: 1990-02-15
Filing date: 1991-02-06
Publication date: 1993-06-10
Also published as: EP0514493A1; EP0707856A2; EP0707856A3; DE69118367D1; WO1991012025A1; EP0514493B1; ATE135920T1; DE69118367T2; CA2075994A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】コロイド状超常磁性ＭＲ造影剤製造のためのフィルター滅菌法発明の分野本発明は、一般には、磁気共鳴（ＭＲ）造影剤とその製造方法に関し、特にかかる造影剤製造のための滅菌法に関する。

発明の背景Ａ、有害反応を起こす可能性が最小のＭＲ造影剤を製造する必要性超常磁性コロイドの非経口的ＭＲ造影剤としての効果（米国特許第４．８２７．９４５号：同第４．７７０．１８３号；　５ｔａｒｋ他、　Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ　１６８：　２９７−３０１　（１９８８）　；　ＨｅｍｍｉＨｅｍｍ１ｎ他。

Ａｃｔａ　Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａ　２８：　７０３−７０５　（１９８７））から、これらの物質を滅菌した形で、しかもその投与に起因する有害反応発生率（又はその程度）が最小となるように製造する必要性が生れた。有害反応とは、造影剤投与後に起こる望ましくない生理的応答、感覚又は徴候をいう。有害反応の例としては、血圧の変調、発疹、嘔吐、頭痛などが挙げられる（　ｒｃｏｎｔｒａｓｔ　Ｍｅｄｉａ：　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｆｆｅｃｔｓａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＪ　（Ｐａｒｖｅｚ、　Ｚ、、　Ｍｏｎｃａｄａ、　Ｒ及び５ｏｖａｋ、　Ｍ、編、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ）第１巻６９− ７５頁の、Ｄｅａｎ。

Ｐ、　Ｂ、及びＰａａｊａｎｅｎ、　Ｈ，著、　”Ｕｎｄｅｓｉｒａｂｌｅ　Ｃｏｎ５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆＩｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　Ｃｏｎｔｒａｓｔ　Ｍｅｄｉａ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ”参照）。

超常磁性コロイドの非経口的ＭＲ造影剤としての商業的価値は、ある特定の活性成分の効能や急性毒性のないことだけによって決定されるものではなく、当該成分が滅菌に関する厳重な諸要件を満足するような状態で製造できてしかも有害反応の発生率（又はその程度）が最小となるように製造できるか否かによっても左右される。

ＭＲ造影剤について有害反応を最小限に抑えることの必要性には二つの理由が絡んでいる。策−に、医薬品の販売を管轄する官庁は、医薬品の販売を製造業者に許可するには有害反応の発生率（又はその程度）が十分に低いものでなければならないと確信せざるを得ないこと。

第二に、競争の激しい市場においては、個々に販売を認可されかつ類似した医学的用途を有する各種薬剤については、それらの示す相対的な有害反応発生率が、個々の薬剤の市場占有率（又は価格）を決定する可能性があること。

医薬品販売を取締る官庁からの認可を得る上で、有害反応発生率の非常に低い造影剤が要求されるということは、病気の疑いのある人に実際はそうでなくともかかる薬剤が投与される可能性があるという事実を反映したものである。一般に、治療薬はある種の病理的状態を示す集団に与えられ、各個人はその治療薬の投与による恩恵を受ける。治療薬について、相当大きな有害反応が黙認されることもある。例えば、癌の化学療法に用いられる薬剤の多くは数多くの有害反応や副作用を起こす。

造影剤が十分に安全で管轄官庁により人体での使用が認可されるような場合であっても、競合製品の相対的な有害反応発生率が市場占有率又は特定薬剤についての価格を左右することがある。例えばいわゆる非イオン性血管造影剤が開発されたが、これはイオン性造影剤よりも高価であるにもかかわらず有害反応発生率か低いとされているため（ＭｃＣｌｅｎｎａｎ、　Ｂ、Ｌ、、　Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ　１６２：　１−８（１９８７））　、市場ではイオン性造影剤よりも優位に販売されている。診断用造影剤の市場においては、低い有害反応発生率（例えば、投与した人数の０．０１〜１０．Ｏ％程度の反応）をさらに低く抑えることができれば、その製品の市場での地位を他の製品に比べて上げることができる。

Ｂ、非経口的薬剤の滅菌法医薬品に関して、確保すべき滅菌の度合い並びに滅菌法の選択は投与経路によって大幅に左右される。非経口的に投与される薬剤とは、静脈内、皮下又は腹腔的投与などで、皮膚を通して投与されるものをいう。滅菌要件は、皮膚を通して投与され、体内の無菌環境下に導入される薬剤について最も厳しい。非経口投与用の溶液を滅菌する方法として広く認められているのは僅か２通りしかない。第一の方法（フィルター滅菌法）は、溶液を０、２２　ミクロン（２２０ｎｍ）のフィルターに通すものである。

第二の方法（いわゆるターミナル滅菌法）は、熱の使用（通常、１２１’Ｃで３０分間）を伴うものである。０．４５　ミクロン濾過（以前はこれで十分だと考えられていた）に代えて、現行の０．２２　ミクロン濾過が滅菌に用いられるようになったのは、０．４５　ミクロンのフィルターを楽に通過するほど小さな細菌が存在するという最近の研究結果を反映したものである。

０、２ミクロン台のフィルターを通過し得る何種類かのＭＲ造影剤が知られており（米国特許第４．７７０．１８３号第１２欄５９〜６１行：同第４．８２７．９４５号第１７欄５１〜５３行；同第４、７９５．６９８号第３欄５５〜５７行）、従ってフィルター滅菌し得る。しかし、後述の理由により、フィルター滅菌には向かない。さらに、先行技術の方法でもＭＲ造影剤を濾過性にすることができるが、例えばフィルターの目詰りその他の問題のために、かかる物質の収率が許容できないほど低くなったり、効率が悪くなったりすることが多い。

滅菌の確実さから、管轄官庁はフィルター滅菌法よりもターミナル滅菌法を勧める。フィルター滅菌法は、滅菌溶液を滅菌バイアルに加えなければならずそのバイアルも無菌状態で密封しなければならないということから、ある程度の失敗率を伴っている。ターミナル滅菌法はフィルター滅菌法よりも滅菌の確実さが高い。ターミナル滅菌法では、密閉容器内で乾熱滅菌が起こり、この容器は消費者の手に渡るまで開封されない。フィルター滅菌においては、瓶詰め工程時の空気伝染微生物による汚染のため、失敗の公算が低いとはいえ不可避的に存在する。多数のバイアルを製造する場合には、滅菌の失敗率が低くても相当数の非滅菌バイアルが生まれる。最初のうちは非滅菌バイアル中の微生物の数も少なくて注射しても安全であると考えられるが、時間、温度及び貯蔵液次第では、かかる非滅菌バイアル中に存在する少数の微生物が増殖する場合があり、これを注射すれば激烈な反応を引き起こすであろう。

近年、活性成分が熱応力に耐え得る場合、ターミナル滅菌法が選ばれることのほうが次第に多くなってきた。

これは、非滅菌バイアルをたまたま製造した業者が直面する可能性のある責任問題が費用及び複雑さを増しつつあるためである。加えて、医薬品取締りの管轄官庁は、製造業者に要求する安全性、品質及び製品の均一性に関する基準を年々増す傾向にある。非経口的に投与する超常磁性酸化鉄コロイドについては、鉄の高い着色性のためにさもなければ微生物で酷く汚染されたバイアルの検出に用いることのできる目視検査が行えないので、ターミナル滅菌法が特に望ましいと思われる。目視検査は、透明なフィルター滅菌溶液中の微生物コロニーの検出に用いることができる。

各種の酸化鉄コロイドにターミナル滅菌が用いられており、得られる化合物は優れた毒物学的特性を有すると広く信じられている。例えば、貧血の治療に用いられる常磁性鉄−デキストランは３０分間のオートクレーブ滅菌で少なくとも８００■／ｋｇの静脈ＬＤ、　ｏを有する（米国特許第２、８２０．７４０号の例１参照）。（注：我々は鉄の量を■Ｆｅ又はμｍｏｌｅＦｅいずれかの刊行物又は特許に記載された通り報告する。１■Ｆｅは約２０μｍｏｌｅＦｅに等しい。）デキストリン・酸化鉄についても同様の結果が報告されており、オートクレーブ標品はマウスで３８０ｏ■Ｆｅ／ｋｇを超えるＬＤ、。

を有する（米国特許第３．５３５．６９６号の例１参照）。デキストラン・マグネタイトは４１００■Ｆｅ／ｋｇ体重のＬＤ、ｏを有する（米国特許第４．１０１．４３５号の例１参照）。この化合物は１１０℃で１５分間低温殺菌されたゾルとして上記特許権者によって供給されている。最後に、クエン酸塩安定化生分解性超常磁性コロイドはその物理状態を保持したままオートクレーブ滅菌できる（米国特許第４．８２７．９４５号の例７．９参照）。このクエン酸塩安定化超常磁性コロイドはネズミにおいて少なくとも３０００μｍｏｌｅＦｅ／ｋｇのしＤ５ｏを有しくＷｅｉｓｓｌｅｄｅｒ他、　Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｒｏｅｎｔ、１５２：　１６７−１７３（１９８９））　、人体での臨床研究が認可されたほど安全な全体的毒物学的特性を有している（　５ｔａｒｋ他、　ＲａｄｉｏｌｏｇＹｌ　６３：　２９７−３０１　（１９８８））。

滅菌の確実さの点でターミナル滅菌法のほうがフィルター滅菌法よりも好ましいこと、ターミナル滅菌した酸化鉄標品では一般に低い急性毒性しか観察されないこと、並びに微生物汚染を目視的に検出することが困難であることなどを総合的に勘案すれば、非経口的超常磁性酸化鉄コロイドに関してはターミナル滅菌法を選択すべきであると思われる。

発明の概要本発明は、ＭＲ造影剤として用いられる物質の安全性を含め、これまで認識されていなかった問題の認識に関連している。本発明は、ターミナル滅菌が超常磁性酸化鉄コロイドを変性させることがあり、その結果その投与によって血圧の降下（極めて望ましくない有害反応）が引き起こされるらしいという驚くべき観察結果に関連する。各種のターミナル滅菌酸化鉄コロイドはネズミ　（その他の動物）に対して非常に低い急性毒性しかもたず、概して卓越した毒物学的特性を有していると思われていたことからすれば、この観察結果は正に驚くべきことである。ある化合物の急性毒性が物質の全体毒性を示すものと見做されることが多々ある。さらに、ターミナル滅菌は非滅菌容器を生ずる可能性が最も低いので非経口薬剤の滅菌法として一般に好まれている。ターミナル滅菌をフィルター滅菌に置き換えると、上記コロイドの注射による血圧降下がみられなくなる。フィルター滅菌法を用いる超常磁性酸化鉄コロイドの製造方法が本発明の主題である。

本発明によれば、生理学的に許容できるキャリヤー中に分散した超常磁性金属酸化物粒子を含むコロイドが、ターミナル滅菌後のコロイドの投与に伴う毒性に比して毒性が低下するような方式で製造される。本発明によれば、コロイドは濾過によって滅菌し得る。コロイドは凍結乾燥によっても保存でき、凍結乾燥時にデキストラン又はクエン酸陰イオンなどの試形剤を導入することかできる。

図面の簡単な説明本発明の上記の諸特徴は、添付図面と共に以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解できるであろう。

図１は、実施例４に記載の、凍結乾燥を行っていない超常磁性酸化鉄コロイドのセファロース４Ｂクロマトグラフである。

図２は、実施例４に記載の、５０ｍＭクエン酸塩と共に５．６■Ｆｅ／ｍｌで凍結乾燥した超常磁性酸化鉄コロイドのセファロース４Ｂクロマトグラフである。

図３は、実施例４に記載の、２６．７■／ｍ＋デキストランＴ−１０と共に３．７３■Ｆｅ／ｍｌで凍結乾燥した超常磁性酸化鉄コロイドのセファロース４Ｂクロマトグラフである。

特定具体的態様の詳細な説明Ａ１本発明の範躊に入る活性成分の粒度範囲本発明で使用することのできる活性成分には、コロイド状超常磁性金属酸化物、例えば鉄、コバルト及びマンガンの酸化物が含まれる。本発明は、金属酸化物粒子が高分子物質を伴っているようなコロイドにも同様に応用できる。かかる活性成分には、米国特許第４．、８２７．９４５号、同第４．７７０．１８３号、同第４．１０１．４３５号、同第４．７９５．６９８号、同第４．８６３．７１５号及び同第４．５０１．７２６号に記載された組成物が含まれるが、これらに限定されるものではない。

超常磁性化合物は磁界の存在下で高い磁気モーメント（例えば５〜９０　ＥＭＵ／ｇ酸化鉄）を有するが、磁界が存在しない磁気モーメントを全くもたなくなる。「コロイド状」という用語は、（１）静置しても溶液から沈殿せず、（２）従来の濾過技術では回収できず、しかも（３）無視できる程度もしくは低い浸透圧しか有さない物質を意味する。超常磁性酸化鉄は、その粒度範囲がレーザー光散乱法で測定して約５〜５００ｎｍにあるときに、これら３つの性質を獲得する。

これよりも大きな物質、即ちミクロン大の粒度範囲の物質は、静置すると溶液から沈殿を生してしまうし、コロイド状というよりもむしろ粒子と呼ばれる。磁気粒子のその他の一般的性質としては、磁石を用いて即座に溶液から回収できる点がある。

本発明の方法に付すためには（即ち、フィルター滅菌するためには）、超常磁性コロイドは０．２２　ミクロン（２２０ｎｍ）のフィルターを通過し得るものでなければならない。この要件は、（１）平均的な粒子の大きさが２２０ｎｍ未満であって、しかも（２）コロイドが粒度に関して均一で、フィルターの目詰りを起こす可能性のある約２２０ｎｍ以上の物質を含まない場合に満足される。

典型的な磁気粒子（即ち、粒度範囲がミクロン大の物質）は平均粒度が大きすぎて０．２２　ミクロンフィルターを通過し得ない。磁気粒子は、ミクロン大のシラン化クラスター（Ｓａｉｎｉ他、　Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ　１６２：　２１１− ２１６　（１９８７））、０．５ミクロンのデンプンマトリックス粒子（ＨｅｍｍｉＨｅｍｍ１ｎ他、　Ａｃｔａ　［ｉａｄｉｏｌｏｇｉｃａ　２８：　７０３ −７０５　（１９８７））及び１〜５ミクロン大のアルブミン微小球（Ｗｉｄｄｅｒ他、　Ａｒｌ１ｅｒ、　Ｊ。

Ｒｏｅｎｔ、　１４８　：　３９９−４０４　（１９８７））を含め、ＭＲ造影剤として有効であることが証明されている。

粒度の均一さに欠けるため、大多数の超常磁性酸化鉄コロイドは、たとえ溶液中での粒度中央値又は平均値が２２０ｎＩＩ１未満であっても、フィルターを容易には通過しない。例えば、米国特許第４．８２７．９４５号の例７．１０に従って製造した超常磁性コロイドは光散乱法で５０から１０　Ｏｒ＋ｍの体積平均粒径を有する。しかし、このコロイドは約２２０ｎｍ以上の大きさの物質か少量存在してフィルターの目を詰らせるために２２０ｎｍフィルターで滅菌することができない。このような大粒子を遠心分離で除去すれば、この超常磁性酸化鉄コロイドは濾過性となる（後述の実施例３参照）。これまでＭＲ造影剤として用いられてきた多くの物質は、上記の２２０ｎｍフィルターを通過しなければならないという要件を満足しない。

Ｂ、実施例：フィルター滅菌可能な超常磁性酸化鉄コロイドの製造方法フィルター滅菌可能な超常磁性コロイドを製造する方法は一般に２通り存在する。第一の方法は、フィルター滅菌が十分にできるほど平均粒度の小さいコロイドを直接合成するものである。第二の方法であるサイズ分粒法（ｓｉｚｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）は、コロイドがフィルター滅菌できるような（即ち、２２０ｎｍよりも十分量さい）平均粒度を有するものの２２０ｎｍフィルター滅菌を試みるとフィルターの目詰りを起こしてしまうような場合に用いることができる。このような場合、コロイドから約２２０ｎｍ以上の物質を除去することかでき、２２０ｎｍ濾過を行うことができる。超常磁性コロイドのフィルター滅菌の障害となっている大粒子を除去するため、少なくとも４通りの商業的に実施し得る分離法が存在する。即ち、（１）孔径が段々と小さくなって遂には滅菌用２２０ｎｍ濾過に至るようなフィルターを通しての濾過。

（２）磁気フィルターとして知られる磁化グリッドに引き付けて大粒子を選択的に除去する磁気濾過。

（３）ゲルクロマトグラフィーの通常の原理によっである大きさ以上の粒子を除去するカラムクロマトグラフィー、特にゲル浸透クロマトグラフィー。

（４）大きな粒子を沈殿させて廃棄し、後で上溝を濾過する遠心。

上記の諸方法は互いに組み合わせて用いることもできるし、その他の分別又は分離法と組み合わせて用いることもできる。

実施例１ニデキストランを用いての、フィルター滅菌可能な超常磁性コロイドの直接合成ＦｅＣｌ３・６Ｈ２０（３５ｇ　）及びＦｅＣｌ２・４Ｈ２０（１６ｇ　）の水溶液（２５０ｍｌ）に、溶液のｐＨが約２．３となるように十分量の炭酸ナトリウム水溶液を加えた。次に固体デキストラン（１５０ｇ）を加えた。溶液を撹拌し、約６０〜７０℃で１５分間加熱して、約４０〜４５℃まで放冷した。赤みがかった溶液が生じるが、続いてこれを９５〜１００℃に１５分間加熱した。（本実施例及び以降の実施例においてプロセスの一部として熱を加えているか、これはターミナル滅菌に関して一般的に認められた基準を満足しておらず、本発明の方法か一般にターミナル滅菌を行わない条件下での滅菌に必要とされることに留意すべきである。）　得られた黒色の懸濁液を、公称遮断分子量１００キロダルトンのカートリッジを取付けたＡｍ１ｃｏｎ　ＲＡ　２０００中空繊維透析装置を用いての限外濾過工程に付した。光散乱法による測実施例２：炭水化物アラビノガラクタンを用いての、フィルター滅菌可能な超常磁性コロイドの合成以下の量のハロゲン化２価鉄及び３価鉄塩を用いて２価及び３価金属塩の水溶液を調製した：　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２０（１５，８ｇ　、５８．５ｍｍｏｌ）　とＦｅＣｌ２・４Ｈ２０（６，２４ｇ、３１．６ｍｍｏｌ）を蒸留水（２００ｍｌ）中で混合し、得られた溶液を０．２２μｍのガラス繊維フィルターに通して濾過して大きな残渣を取り除いた。同容積の、上記ハロゲン化金属溶液と、カラマツのアラビノガラクタン（６０ｇ、　Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ。

製）を１２０ｍ１に溶解して得た炭水化物溶液とを激しく撹拌しながら室温で混合した。これに、３０％水酸化アンモニウム溶液を混合物のｐｆｌが約１０となるまでゆっくりと滴下して加えた。この段階で、混合物を約１５分間９０〜１００℃に加熱した。混合物を放冷して黒色のコロイド状超常磁性酸化鉄を形成させた。冷めた混合物を目の粗いガラスフィルターに通し、次いで、０．８ＩＩｍから、０．４５ａｍ、最後に０．２２４ＩＩ＋フイルターと孔径を段々と小さくした一連のフィルターに通した。

公称遮断分子量３００キロダルトンの中空繊維透析装置（＾ｍ１ｃｏｎ　Ｉｎｃ、製、マサチューセラ州ダンヴアー）を用いての以下に述べる限外濾過で、過剰のアラビノガラクタンを除去した二上記工程で得られた濾過物を上記限外濾過装置に入れ、２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，５）で稀釈しかつ洗浄した。この洗浄工程を透明な溶出液が得られるまで繰返した（約５回）。洗浄した生成物を、上記金属と炭水化物との混合物の最初の容積にほぼ等しくなるような最終容積まで濃縮した。生成物は２２０ｎｍフィルターに通すことによってフィルター滅菌することができ、必要な時まで２〜８℃で貯蔵することができる。

実施例３　遠心による、フィルター滅菌可能な超常磁性コロイドの調製米国特許第４．８２７．９４５号の例７．１０に従って超常磁性酸化鉄コロイドを作成した。この特許に記載の通りクエン酸塩を加えることができてコロイドをオートクレーブすることもできたが、限外濾過後にコロイドをフィルター滅菌することはできなかった。限外濾過コロイド（ただしオートクレーブしていないコロイド）が１００■／ｍｌ　Ｆｅで得られたが、これを３００ｆＣｇで３０分間遠心した。ペレッ・　トを捨てた。上溝のコロイドを１０ｍｇ／ｍｌ　Ｆｅまで稀釈して、０、２２　ミクロンフィルターで容易かつ迅速に濾過した。

上記いずれかの方法で作成したフィルター滅菌超常磁性コロイドは、約０．５〜４■Ｆｅ／ｋＨの投与量で動物（又はヒト）に注射することができる。これは肝臓及び膵臓に蓄積して、Ｔ２荷重パルス・シーフェンスでのＭ　Ｒ画像機中でこれらの組織に深い影がつく。米国特許第４．８２７゜９４５号の図２の、これらの物質のＭＲ造影剤としての効果を示す結果と本質的に同じ結果が得られる。

Ｃ１超常磁性酸化鉄コロイドに関して、ターミナル滅菌をフィルター滅菌に置き換えたときに表れる有害反応の欠如各種超常磁性酸化鉄コロイドが有害反応を起こす可能性について半定量的に検定した結果を以下に示す。ある化合物の注入に反応した動物の血圧降下をモニターし、注入された化合物が人体中で血圧降下を引き起こす可能性の指標とした。

モルモット（約３５０ｇ）を麻酔した（ペンタパルビタールナトリウム３５■／ｋｇ）。頚静脈及び頚動脈を外科的に露出させ、ヘパリン添加生理的食塩水を満たした管を挿入した。モルモットを小さな檻に入れ、角膜反射及び刺激反射が回復するように覚醒させておいた。頚動脈のカニユーレを動脈圧トランスデユーサ −につなぎ、これをレコーダーに接続した。収縮期圧及び拡張期圧を２０分間記録して、その動物のベースライン値を得た。試験液を静脈カニユーレを介して毎分１ｍｌずつ加え、血圧を３０分間記録した。注入後の最初の３０分間に記録された最低動脈血圧で１分間以上持続したものを用いて、ベー　′スラインから平均動脈血圧を算出した。変化の程度を次のように等吸付けた。変化なしく０）　：　０〜１５％の低下；軽微（＋）　：　１６〜２０％の低下；中程度（＋＋）・３１〜４５％の低下：激烈（＋＋＋）　：　４５％を超える低下。

表１に、加熱滅菌又はフィルター滅菌に付した超常磁性コロイドについて得られた血行力学的反応を示す。使用した超常磁性酸化鉄コロイドは米国特許第４．８２７．９４５号の例７．１０に従って製造し、ターミナル滅菌又はフィルター滅菌のいずれかに付した。ターミナル滅菌は、上記米国特許第４．８２７．９４５号に記載の通り、クエン酸塩存在下でオートクレーブにかけることによって行った。種々の毒物学的研究結果は、ターミナル滅菌したクエン酸塩安定化コロイドが、３０００ａｍｏｌｅＦｅ／ｋｇ以上のＬＤ、。値及びその他の毒性研究の示す通り（Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ他、　Ａｍｅｒ、Ｊ。

Ｒｏｅｎｔ、　１５２：　１６７−１７３　（１９８９）参照）、高度に安定なコロイドであることを示唆していた。このコロイドは米国食品医薬８局（ＦＤＡ）によって十分に安定であると判断され、人体での臨床試験が認可されている。

限外濾過後に得た超常磁性酸化鉄コロイドのフィルター滅菌は、実施例３に記載の通り、０．２２　ミクロン濾過前に遠心することによって行った。ターミナル滅菌コロイド及びフィルター滅菌コロイドについて観察された血行力学的反応の結果は表１で比較されている。５匹のモルモットで得られた血圧反応を示しである。

ターミナル滅菌した超常磁性コロイドが、熱応力を除いた場合（即ち、フィルター滅菌を用いた場合）に得られる血圧降下よりも格段に大きな血圧降下を引き起こすことが分かる。表１に基づけば、フィルター滅菌超常磁性コロイドは、人の集団に投与したときに、ターミナル滅菌コロイドよりも血圧降下反応発生率が低いと予想される。

米国特許第４．１０１．４３５号に従って製造したターミナル滅菌デキストランマグネタイトの有害反応について、表１に記載したターミナル滅菌コロイドと同様の手法で研究した。驚くべきことに、この物質のＬＤ、。は４１００■Ｆｅ／眩体重と比較的高いにもかかわらず、表１に示したターミナル滅菌組成物に匹敵する有害反応を示すことを見出だした。これらの結果並びに表１の結果からすると、活性成分を熱応力に付さずに製造したフィルター滅菌デキストランマグネタイトは、ターミナル滅菌組成物でみられる有害反応よりも有害反応が実質的に低くなると予想した。

表１は、ターミナル滅菌した超常磁性コロイドの非経口的に投与する医薬品としての使用を排斥するものと理解すべきではなく、ましてこの研究に用いた特定のターミナル滅菌コ０イドの使用を排斥するものでもない。表１のターミナル滅菌コロイドについては、血行力学的な変化を生ずるのに用いられる投与量が４００ μｍｏｌｅＦｅ／ｋｇであるのに対して、ＭＲ像の画質の向上には５〜３０ａｍｏｌｅＦｅ／ｋｇの投与量で十分である。表１のターミナル滅菌コロイドは、効能的に選択された投与量で十分に許容できる有害反応発生率を有すると証明し得る。加えて、ターミナル滅菌は、滅菌の確実性の点では、依然として好ましい。

しかし、表１の結果からは、フィルター滅菌したコロイドは、ターミナル滅菌コロイドよりも、人体内でより低い血圧降下反応を示すと予想される。

表　１ターミナル滅菌並びにフィルター滅菌に付したコロイドに対する血行力学的反応滅菌法　投与量　反応の等級ターミナル　４００　＋＋十フィルター　４０００　０フイルター　５ｏｏｏ　。

投与量はμｍｏｌｅＦｅ／ｋｇである。反応の等級は上述の通り測定した血圧降下の程度を示す。

Ｄ、超常磁性酸化鉄コロイドの保存本発明に従って製造した組成物は、即座に使用しても良いし、保存寿命を高めるために（即ち、効能を保ち、かつ微生物の増殖を防止するために）さらに処理してもよい。最も簡単な方法は組成物を冷凍条件下に置くことであるが、冷凍条件は必ずしも完全に静菌的な環境を提供しない。

超常磁性酸化鉄コロイドの非経口製剤が製造された時点では、これらの製剤は微生物増殖に極めて都合のよい環境を提供する。活性成分は鉄源を提供するが、鉄の欠乏は微生物の増殖を制限する場合が多い。炭水化物又はタンパク質がコロイド由来のコーティングとして又は賦形剤として存在する場合もある。窒素源は、製造時に鉄塩を中和するために用いられた痕跡量のアンモニアによって供給され得る。コロイドが注入に際して刺激を与えないように中性ｐＨ付近の水性媒質が提供される。コロイド状酸化鉄の暗褐色のために非着色非経口剤の場合のようには微生物コロニーを観察できないことから、微生物の増殖の検知に関する問題は複雑である。このように、フィルター滅菌法は血行力学的反応を生ずる可能性はずっと低い（表１）が、微生物増殖の危険性並びにその増殖を検知できないということがこれらの製剤にフィルター滅菌法を使用した場合の欠点である。

医薬品における微生物増殖の問題の一般的な解決法の一つは、防腐剤の使用である。よく使われる防腐剤としては、Ｍ、Ｊ、　Ａｋｅｒｓの、Ｐｈａｒｍ、　Ｔｅｃｈ、（１９８４年５月号）掲載の論文”Ｃｏｎ５ｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ　ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ　Ａｅｎｔｓ　ｆｏｒ　Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　ＰｒｏｄｕｃｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”で論じられているように、フェノール、ベンジルアルコール及びチメリソールが挙げられる。防腐剤の使用による主な問題は、防腐剤が時間経過に従って活性成分（超常磁性酸化鉄コロイド）と相互作用する可能性があることである。これによって防腐剤又はコロイドいずれかの化学変化が起こる可能性がある。さらに、防腐剤自体の注入によって、活性成分の安全性又は効能を台無しにするような生理的効果を生ずることもあり得る。従って、防腐剤を使用する場合には、組成物の効果を低下させたりそれ自体で有害反応を起こしたりすることのないものを選ぶべきである。

もう一つの方法は組成物を凍結乾燥することであり、その組成物は使用時に適当な水性組成物（例えば生理的食塩水）で再構成する。驚くべきことに、我々は、ある条件下で再構成生成物が元の組成物の性質を保持していることを見出だした。特に、組成物がデキストランのような炭水化物ポリマー又はクエン酸ナトリウム又はこれらの組合せを含むときに、凍結乾燥が満足に達成されることを見出だした。

実施例４．凍結乾燥によるフィルター滅菌超常磁性酸化鉄コロイドの保存凍結乾燥は防腐剤を使わずに静菌環境を生みだす方法を提供する。水分含量約２％未満の凍結乾燥粉末が静菌的であると考えられる。従って、フィルター減菌コロイドを凍結乾燥することによって、保存中の微生物増殖の　。

危険性が除かれる。超常磁性酸化鉄コロイドに関して、凍結乾燥はフィルター滅菌によって得られる利点（即ち、血行力学的反応のないこと）を生かし、フィルター滅菌の最大の欠点（即ち、空気伝染などの各種原因に起因する瓶詰め時の汚染の危険性）を最小限にする。

しかし、粒子及びコロイドの凍結乾燥は、粒子又はコロイドの大きさの増大として観察されるような、粒子又はコロイド間の凝集を伴うことが多い。例えば、シラン化磁気粒子の製造においては、酸化鉄表面にシランを結合させるために脱水工程が用いられる。これは、粒子のスラリーをグリセロールに加え、加熱して水をとばすことによって達成される。風乾は粒子が凝集する傾向があるために避けられる（米国特許第４．５５４．０８８号第１３欄１６〜３３行並びに米国特許第４．８２７．９４５号第１７欄１５〜３５行参照）。我々は、クエン酸ナトリウム、デキストランＴ−１０又はデキストランＴ−１などの賦形剤の添加が、凍結乾燥プロセス時の超常磁性酸化鉄コロイドの凝集を低減もしくはなくすことを見出だした。

フィルター滅菌した超常磁性酸化鉄コロイドの凍結乾燥には、凍結段階、第１次乾燥段階及び第２次乾燥段階を利用する。医薬品の凍結乾燥には上記３つの標準的段階が存在する（ｌｌｉｌｌｉａｒｎｓ、　Ｎ、Ａ、及びＰｏ１ｌｉ、　Ｇ、Ｐ、、　Ｊ。

凍結段階に関しては、実施例１に従って製造したコロイド１０ｍ１をガラス瓶に入れる。コロイドは２０■Ｆｅ／ｍｌから成っており、賦形剤として３０■／ｍｌデキストランＴ−１０及び１０ｍＭクエン酸ナトリウムが含まれていた。コロイドを、貯蔵温度を一４０℃から一５０℃の間にセットした凍結乾燥装置に入れた。コロイドは８時間後に貯蔵温度に達した（即ち、凍結した）。

第１次乾燥段階に関しては、真空度を最大にセットして、貯蔵温度を４８時間０ ℃に上げた。第１次乾燥の間に真空度が減少して、その最終値は約１００ミクロンとなった。

第２次乾燥に関しては、真空度を維持して、貯蔵温度を２４時間＋２０℃に上げた。

凍結乾燥の結果、元のコロイドと同じ体積をもつ、多孔質で疎水性のマトリックスができた。マトリックスは水、塩類溶液、デキストロース又はその他の生理的液体に容易に溶解する。

図１〜図３に、本願実施例３又は米国特許第４．８２７．９４５号の例７．１０に従って作成した超常磁性酸化鉄コロイドの粒度分布に及ぼす凍結乾燥の影響を示す。超常磁性酸化鉄コロイドの粒度分布はセファロース４Ｂのゲル濾過で測定することができるが、以下で示すクロマトグラムは同一物質についての他の結果（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ他、　ＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｉ＋ｎａｇｉｎｇ　８：　６３７−６４６　（１９９０）の図４参照）と比較し得る。図１は凍結乾燥前のコロイドを示す。図２においては、コロイド（５，６ｍｇ　Ｆｅ／　ｍｌ、即ち、１００＋ｎ１ｌ）を５０ｍＭクエン酸塩中で凍結乾燥した。図３においては、コロイド（３，７３ｍｇ　Ｆｅ／　ｍｌ、即ち、６６、８ｍＭ）を２６．７ｍｇ／ｍｌデキストランＴ−１０中で凍結乾燥した。

使用した超常磁性酸化鉄コロイド及び凍結乾燥条件によっては、上記コロイド安定化用賦形剤の添加を怠ると望ましくない変化が起こることがある。かがる変化には、（１）クロマトグラフィーの小さなピークに比べて大きなピークの面積が増大すること、並びに（１１）濾過のときにみられた粒度が増大することが含まれる。粒度は、顕微鏡を用いて０．８ミクロンフィルターに保持される粒子の数を計数することによって測定される。

超常磁性酸化鉄コロイドは、鉄濃度が約０．５〜４０■／ｍｌであるとき、賦形剤としてデキストランが鉄１■当り０．３〜１０■で存在するとき、並びに賦形剤としてクエン酸塩が鉄１０００ｍＭ当り１０ｍＭクエン酸塩〜鉄１０００ｍＭ当り５００ｍＭクエン酸塩で存在するときに、凍結乾燥し得る。どちらの賦形剤も、コロイド生成物を安定化するために、単独又は組合せて凍結乾燥プロセスに使用し得る。コロイド配合物の例の幾つかを以下の表２に示す。示したデキストラン及びクエン酸塩濃度は、活性成分合成後に賦形剤として加えたときのものである。分子量１０００から７００００の間のデキストランを使用し得る。クエン酸塩はクエン酸ナトリウム又はアンモニウムでよい。コロイドのｐ［ｌは凍結乾燥前は６．５から９．０の間である。上記の手法での凍結ＦＩＧ、　２保持時間ＦｆＧ、３要　約動物又はヒトの体の器官又は組織のインビボでのＭＲ像を得るための方法に、生理学的に許容できるキャリヤー中に分散した超常磁性金属酸化物粒子からなる有効量のコロイドを、ＭＲ像の画質を高めるための造影剤として、動物又はヒトの体に投与することからなる種類の、動物又はヒトの体の器官又は組織のインビボでのＭＲ像を得るための方法に改良点を提供する。この改良点に従うと、上記方法には、ターミナル滅菌後のコロイドの投与に伴う毒性に比して毒性が低下するようにコロイドを調製することが含まれる。改良点には、コロイドを濾過により滅菌することが含まれる。付加的な具体的態様においては、コロイドは濾過により滅菌され、かつ凍結乾燥により保存される。コロイドは混和性賦形剤存在下で凍結乾燥してもよい。使用される賦形剤には、デキストラン又はクエン酸陰イオンが含まれる。他の具体的太陽には、関連する組成物並びに諸方法が含まれる。

国際調査報告　ＰＣＴ／ＵＳ　９１１００８２４、、、ｍｌ＋ｍｗＮｅ　ＰＣＴ／ＵＳ　９１１００８２４国際調査報告ＵＳ９１００Ｂ２４

Claims

【特許請求の範囲】

１．動物又はヒトの体の器官又は組織のインビボでのＭＲ像を得るための改良方法にして、生理学的に許容できるキャリヤー中に分散した超常磁性金属酸化物粒子からなる有効量のコロイドを、ＭＲ像の画質を高めるための造影剤として、ターミナル滅菌後のコロイドの投与に伴う毒性に比して毒性が低下するようにして、上記体に投与することからなる種類の方法であり、得られる活性成分を熱応力に付さないようにコロイドを調製及び滅菌することを改良点とする方法。
２．請求項１記載の方法において、コロイドの調製及び滅菌が、コロイドを濾過により滅菌する段階を含むことを特徴とする方法。
３．請求項２記載の方法において、コロイドを濾過により滅菌する段階が、濾過に用いるフィルターを目詰りさせてしまうような物質をコロイドから除去する段階を含むことを特徴とする方法。
４．請求項３記載の方法において、コロイドを濾過により滅菌する段階が、最小の孔径のフィルターが約２２０ｎｍ以下であるような複数の孔径の段々と小さくなるフィルターにコロイドを通過させることを含むことを特徴とする方法。
５．請求項３記載の方法において、コロイドを濾過により滅菌する段階が、大きな粒子を選択的に取り除くための磁気フィルターを用いることを含むことを特徴とする方法。
６．請求項３記載の方法において、コロイドを濾過により滅菌する段階が、コロイドから大きな粒子を選択的に取り除くためのカラムクロマトグラフィーを用いることを含むことを特徴とする方法。
７．請求項３記載の方法において、コロイドを濾過により滅菌する段階が、コロイドを遠心し、かつ上清を孔径約２２０ｎｍ以下のフィルターに通過させることを含むことを特徴とする方法。
８．請求項１記載の方法において、前記金属酸化物粒子が結晶からなり、個々の結晶の直径が約１０〜約５００オングストロームで光散乱法で測定した全体の直径が約１０から約４０００オングストロームまでの範囲にあることを特徴とする方法。
９．請求項２記載の方法において、前記金属酸化物粒子が結晶からなり、個々の結晶の直径が約１０〜約５００オングストロームで光散乱法で測定した全体の直径が約１０から約４０００オングストロームまでの範囲にあることを特徴とする方法。
１０．請求項３記載の方法において、前記金属酸化物粒子が結晶からなり、個々の結晶の直径が約１０〜約５００オングストロームで光散乱法で測定した全体の直径が約１０から約４０００オングストロームまでの範囲にあることを特徴とする方法。
１１．請求項１記載の方法において、前記金属酸化物粒子が高分子物質を伴うことを特徴とする方法。
１２．請求項２記載の方法において、前記金属酸化物粒子が高分子物質を伴うことを特徴とする方法。
１３．請求項３記載の方法において、前記金属酸化物粒子が高分子物質を伴うことを特徴とする方法。
１４．請求項１記載の方法において、前記コロイドがデキストランマグネタイトを含むことを特徴とする方法。
１５．請求項２記載の方法において、前記コロイドがデキストランマグネタイトを含むことを特徴とする方法。
１６．請求項３記載の方法において、前記コロイドがデキストランマグネタイトを含むことを特徴とする方法。
１７．超常磁性金属酸化物コロイド状ＭＲ造影剤を、ターミナル滅菌後のコロイドの投与に伴う毒性に比して毒性が低下するように製造するための改良方法にして、得られる活性成分を熱応力に付さないようにコロイドを調製及び滅菌することを改良点とする方法。
１８．請求項１７記載の方法において、コロイドの調製及び滅菌が、コロイドを濾過により滅菌する段階を含むことを特徴とする方法。
１９．請求項１８記載の方法において、コロイドを濾過により滅菌する段階が、濾過に用いるフィルターを目詰りさせてしまうような物質をコロイドから除去する段階を含むことを特徴とする方法。
２０．請求項１９記載の方法において、コロイドを濾過により滅菌する段階が、最小の孔径のフィルターが約２２０ｎｍ以下であるような複数の孔径の段々と小さくなるフィルターにコロイドを通過させることを含むことを特徴とする方法。
２１．請求項１９記載の方法において、コロイドを濾過により滅菌する段階が、大きな粒子を選択的に取り除くための磁気フィルターを用いることを含むことを特徴とする方法。
２２．請求項１９記載の方法において、コロイドを濾過により滅菌する段階が、コロイドから大きな粒子を選択的に取り除くためのカラムクロマトグラフィーを用いることを含むことを特徴とする方法。
２３．請求項１９記載の方法において、コロイドを濾過により滅菌する段階が、コロイドを遠心し、かつ上清を孔径約２２０ｎｍ以下のフィルターに通過させることを含むことを特徴とする方法。
２４．請求項１７記載の方法において、前記金属酸化物粒子が結晶からなり、個々の結晶の直径が約１０〜約５００オングストロームで光散乱法で測定した全体の直径が約１０から約４０００オングストロームまでの範囲にあることを特徴とする方法。
２５．請求項１８記載の方法において、前記金属酸化物粒子が結晶からなり、個々の結晶の直径が約１０〜約５００オングストロームで光散乱法で測定した全体の直径が約１０から約４０００オングストロームまでの範囲にあることを特徴とする方法。
２６．請求項１９記載の方法において、前記金属酸化物粒子が結晶からなり、個々の結晶の直径が約１０〜約５００オングストロームで光散乱法で測定した全体の直径が約１０から約４０００オングストロームまでの範囲にあることを特徴とする方法。
２７．請求項１７記載の方法において、前記金属酸化物粒子が高分子物質を伴うことを特徴とする方法。
２８．請求項１８記載の方法において、前記金属酸化物粒子が高分子物質を伴うことを特徴とする方法。
２９．請求項１９記載の方法において、前記金属酸化物粒子が高分子物質を伴うことを特徴とする方法。
３０．請求項１７記載の方法において、前記コロイドがデキストランマグネタイトを含むことを特徴とする方法。
３１．請求項１８記載の方法において、前記コロイドがデキストランマグネタイトを含むことを特徴とする方法。
３２．請求項１９記載の方法において、前記コロイドがデキストランマグネタイトを含むことを特徴とする方法。
３３．請求項２記載の方法において、前記フィルター滅菌したコロイドを凍結乾燥することをさらに含むことを特徴とする方法。
３４．請求項３３記載の方法において、前記フィルター滅菌したコロイドを混和性賦形剤の存在下で凍結乾燥することを特徴とする方法。
３５．請求項３４記載の方法において、前記賦形剤がデキストラン及びクエン酸陰イオンからなる群から選択される１種以上の組成物を含むことを特徴とする方法。
３６．請求項３５記載の方法において、前記凍結乾燥コロイドを水性組成物で再構成することをさらに含むことを特徴とする方法。
３７．請求項３２記載の方法において、前記フィルター滅菌したコロイドを凍結乾燥することをさらに含むことを特徴とする方法。
３８．生理学的に許容できるキャリヤー中に分散した超常磁性金属酸化物粒子からなるコロイドを保存するための方法にして、コロイドを凍結乾燥することを含んでなる方法。
３９．請求項３８記載の方法において、前記コロイドを混和性賦形剤の存在下で凍結乾燥することを特徴とする方法。
４０．請求項３９記載の方法において、前記賦形剤がデキストラン及びクエン酸陰イオンからなる群から選択される１種以上の組成物を含むことを特徴とする方法。
４１．請求項４０記載の方法において、前記金属酸化物粒子が酸化鉄粒子を含むことを特徴とする方法。
４２．請求項４１記載の方法において、前記コロイドが診断薬であることを特徴とする方法。
４３．請求項４２記載の方法において、前記診断薬がＭＲ造影剤であることを特徴とする方法。
４４．請求項４０記載の方法において、前記賦形剤が分子量約１０００ダルトン以上のデキストランを含むことを特徴とする方法。
４５．請求項４０記載の方法において、前記金属酸化物粒子がコバルトを含むことを特徴とする方法。
４６．請求項４０記載の方法において、前記金属酸化物粒子がマンガンを含むことを特徴とする方法。
４７．生理学的に許容できるキャリヤー中に分散した超常磁性金属酸化物粒子からなるコロイドを滅菌及び保存するための方法にして、（ｉ）コロイドを濾過により滅菌すること、及び（ｉｉ）コロイドを凍結乾燥により保存することを含んでなる方法。
４８．請求項４７記載の方法において、前記コロイドを混和性賦形剤の存在下で凍結乾燥することを特徴とする方法。
４９．請求項４８記載の方法において、前記賦形剤がデキストラン及びクエン酸陰イオンからなる群から選択される１種以上の組成物を含むことを特徴とする方法。
５０．請求項４９記載の方法において、前記金属酸化物粒子が酸化鉄粒子を含むことを特徴とする方法。
５１．請求項５０記載の方法において、前記コロイドが診断薬であることを特徴とする方法。
５２．請求項５１記載の方法において、前記診断薬がＭＲ造形剤であることを特徴とする方法。
５３．請求項４９記載の方法において、前記賦形剤が分子量約１０００ダルトン以上のデキストランを含むことを特徴とする方法。
５４．請求項４９記載の方法において、前記金属酸化物粒子がコバルトを含むことを特徴とする方法。
５５．請求項４９記載の方法において、前記金属酸化物粒子がマンガンを含むことを特徴とする方法。
５６．生理学的に許容できるキャリヤー中に分散した超常磁性金属酸化物粒子からなるコロイドにして、該コロイドが凍結乾燥により保存されることを特徴とするコロイド。
５７．請求項５６記載のコロイドにおいて、前記コロイドが混和性賦形剤の存在下で凍結乾燥されていることを特徴とするコロイド。
５８．請求項５７記載のコロイドにおいて、前記賦形剤がデキストラン及びクエン酸陰イオンからなる群から選択される１種以上の組成物を含むことを特徴とするコロイド。
５９．請求項５８記載のコロイドにおいて、前記金属酸化物粒子が酸化鉄粒子を含むことを特徴とするコロイド。
６０．請求項５９記載のコロイドにおいて、前記コロイドが診断薬であることを特徴とするコロイド。
６１．請求項６０記載のコロイドにおいて、前記診断薬がＭＲ造影剤であることを特徴とするコロイド。
６２．請求項５８記載のコロイドにおいて、前記賦形剤が分子量約１０００ダルトン以上のデキストランを含むことを特徴とするコロイド。
６３．請求項５８記載のコロイドにおいて、前記金属酸化物粒子がコバルトを含むことを特徴とするコロイド。
６４．請求項５８記載のコロイドにおいて、前記金属酸化物粒子がマンガンを含むことを特徴とするコロイド。
６５．生理学的に許容できるキャリヤー中に分散した超常磁性金属酸化物粒子からなるコロイドにして、該コロイドが濾過により滅菌されかつ凍結乾燥により保存されることを特徴とするコロイド。
６６．請求項６５記載のコロイドにおいて、前記コロイドが混和性賦形剤の存在下で凍結乾燥されていることを特徴とするコロイド。
６７．請求項６６記載のコロイドにおいて、前記賦形剤がデキストラン及びクエン酸陰イオンからなる群から選択される１種以上の組成物を含むことを特徴とするコロイド。
６８．請求項６７記載のコロイドにおいて、前記金属酸化物粒子が酸化鉄粒子を含むことを特徴とするコロイド。
６９．請求項６８記載のコロイドにおいて、前記コロイドが診断薬であることを特徴とするコロイド。
７０．請求項６９記載のコロイドにおいて、前記診断薬がＭＲ造影剤であることを特徴とするコロイド。
７１．請求項６７記載のコロイドにおいて、前記賦形剤が分子量約１０００ダルトン以上のデキストランを含むことを特徴とするコロイド。
７２．請求項６７記載のコロイドにおいて、前記金属酸化物粒子がコバルトを含むことを特徴とするコロイド。
７３．請求項６７記載のコロイドにおいて、前記金属酸化物粒子がマンガンを含むことを特徴とするコロイド。