KR20070119611A - 장치 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에서는 적어도 하나의 멤브레노필릭 영역을 포함하는 적어도 하나의 지지 고체면; 적어도 부분적으로 상기 멤브레노필릭 영역에 고정되며, (ⅰ)계면활성 막, (ⅱ)지질 유사 폴리머, (ⅲ)계면활성 또는 에멀젼 시스템 또는 (ⅳ)액정으로 이루어진 장치; 및 상기 덮개층에 포함되거나 묶이거나, 또는 연결되거나 결합된 물질이 개시된다. 또한, 상기 장치가 사용되는 방법 및 상기 장치의 용도가 개시된다.
멤브레노필릭, 멤브레노포빅, 기판, 지질 이중층, 단백질, 펩티드
Description
본 발명은 평면의 및/또는 토포그래픽(topographic) 기판을 포함하는 지질이중층 장치에 관한 것이다. 상기 장치는 가변적(scalable)이며 예를 들어 막-결합 단백질(membrane-associated protein)과 같은 막-결합 구조의 고정, 조작, 분리 및 분류용으로 사용하기 위해 의도되었다. 생물학적 물질 및 화학물질이 예를 들어 분류 및/또는 MALDI-TOF 질량분석법에 의한 분석과 같은 다양한 목적을 위해 상기 지질이중층 장치에 도입될 수 있다. 본 발명은 또한 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 기록에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 결합 상호작용, 확산, 반응(reaction)의 기초 연구뿐만 아니라 화학컴퓨터(chemical computer), 및 이식형 장치에서의 사용을 포함하는 다른 적용 분야도 갖는다.
생체 분자의 분리 및 분류를 위한 분석 장치는 흔히 크로마토그래피 또는 겔전기영동에 기초한다. 이들은 상(phase) 사이를 차별적으로 분리하는(이들이 다른 분자 구조를 갖기 때문) 분석의 수단으로 선택된 분리매체 및 이동매체의 사용에 의존하여 시차 이동(differential migration) 속도를 얻는다. 따라서, 분석의 물리 화학적 구성에 의존하여(즉, 전하, 소수성, 크기 등), 다른 분석적 플랫폼(platform)이 사용될 수 있다. 특정한 종류의 분자는 백 년 이상의 분석 과학 이후에도 여전히 분리, 정량, 및 분석에 어려움이 있다. 특히, 이온 채널, GPCR's(G-단백질 연관 수용체)와 같은 막단백질, 및 다른 수용체들이 이 종류에 속한다. 이는 의약 개발에 있어서 가장 중요한 목표의 일부를 나타내고 심장, 위장관 및 뇌와 같은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다. 그들의 특성화를 가능하게 하는 새로운 장치는 매우 가치있을 것이다.
자연형(native form) 막 단백질은 지질이중층막에 박혀있다. 상기 복합적인 합성 구조는 전반적인 단백질의 기능을 특징 짓는다. 따라서 상기 지질이중층막은 단순한 매트릭스가 아니라 기능적인 지질-단백질 집합체의 필수적 부분이다. 본 발명자들은 복합적 지질-이중층 막 장치를 만들기 위한 방법을 발견하였다. 이는 이중층막의 독특한 지질 결정 특성 및 이들의 기계적 특성에 의존한다. 본 발명자들은 이들이 막단백질 발현, 나노유체역학(nanofluidics), 및 반응 장치와 같은 수많은 적용에 유용함을 나타내었다. 상기 기술의 주된 한계는 조작법, 노동집약적인 제조뿐만 아니라 상대적으로 작은 스케일이다(Microscopic Networks of Containers and Nanotubes, WO 02/26616 또는 PCT/SE01/02116).
본 발명의 개요
특정 표면에 지질막 장치의 제조를 위한 가변적인 방법 및 장치가 개시된다. 상기 방법은 잘-정의된 기하학, 토포그래피(topography), 물질, 및 화학으로 완전하게 혹은 부분적으로 표면-고정된 평면 또는 삼차원(즉, 관 혹은 구형의) 막을 표면에 형성함에 의존한다. 지질이중층막이(예컨데, 소포 이중층 또는 평면 이중창) 기판을 완전히 덮고 있거나 이들이 흩어져 있거나, 또는 결합하여 특정한 미리-결정된 패턴을 형성하는 기판에 만들어질 수 있다. 이중층막과 그 주변 매질 사이를 구분하는 막-결합 단백질, 또는 그 밖의 물질이 다양한 기술로 시스템에 도입될 수 있다. 상기 표면은 또한 예컨데 전기영동(electrophoresis)과 같은 후속적인 조작 및 분석의 다양한 수단에 의해 상기 지질 계면활성제 구조에 걸쳐 전기장을 부여하기 위한 전극, 또는 상기 이중층 장치 또는 다른 물질에 미세유체(microfluidics) 투여를 위한 채널과 같은 추가 구조를 가질 수 있다. 또한, 상기 표면은 분류된(fractionated) 샘플의 수집을 위한 부분이 장착되거나, 또는 MALDI-TOF 분석의 수행을 위한 특별한 도메인을 함유할 수 있다.
다른 적용을 위한 상기 장치의 용도 또한 개시된다.
보다 상세하게 본 발명은 하기를 포함하는 장치에 관한 것이다:
적어도 하나의 멤브레노필릭(membraneophilic) 영역을 포함하는 적어도 하나의 지지 고체면;
적어도 부분적으로 멤브레노필릭 영역에 고정되며, (ⅰ)계면활성 막, (ⅱ)지질 유사 폴리머, (ⅲ)계면활성 또는 에멀젼 시스템, (ⅳ)액정, 또는 이들의 조합으 로 구성된 덮개층; 및
상기 덮개층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질.
본 명세서에서 멤브레노필릭(membraneophilic) 표면이라는 표현은 막이 끌리는 모든 면을 내포하는 것으로 의도되며, 또한 표면과 막 사이에서 인력을 발생시키는 모든 면으로 설명될 수 있다. 상기 막은 하기에서 더욱 설명되는 바와 같이, 예를 들어 지질 이중층막, 지질 소포체, 프로테오베시클(proteovesicle), 지질 나노튜브, 지질 단층, 세포 조각, 세포소기관 및 이들의 어떠한 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게 상기 장치는 적어도 두 개의 지지 고체면을 포함한다.
각각의 지지 고체면은 한 개, 두 개 또는 여러 개의 멤브레노필릭 영역을 포함할 수 있다. 각각의 멤브레노필릭 영역은 유사하거나 상이한 덮개층(covering layer)으로 덮어질 수 있다.
상기 덮개층에 하나 또는 두 개의 물질이 결합된다. 바람직하게는, 이러한 물질은 예를 들어 막 단백질을 갖는 이중층 계면활성막 또는 지질 이중층막, 지질 소포, 프로테오베시클, 지질 나노튜브, 지질 단층, 세포 조각, 세포소기관 및 이들의 어떠한 조합 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된 막과 같은 덮개층 내의 지질 부(moiety)를 통해 덮개층에 묶이거나 연결된다.
멤브레노필릭 영역(membraneophilic region)이란 표현은 표면 또는 표면의 일부가 막에 결합된 영역으로 의도된다. 따라서 이는 막결합 영역 또는 표면의 일부라고도 지칭될 수 있다.
상기 덮개층, 바람직하게는 계면활성층, 및 그에 결합된 상기 물질은 독특한 특성을 갖고, 이는 예를 들어 덮개층 내의 지질 부에 연결되거나 결합된 물질의 화학적 조작, 분류, 분리 또는 동정의 목적으로 화학적 혹은 물리학적 조절 혹은 조작을 가능하게 한다. 상기 물리학적 혹은 화학적 수정 또는 조작은 하기의 행위 중 적어도 하나를 포함할 수 있다:막의 일부를 분해(cleaving), 지질 부와 연결되거나 결합된 물질의 일부를 분해, 막의 분쇄(disrupting).
지지 고체면의 멤브레노필릭 영역에 더하여, 상기 장치는 또한 수용액 내 고체 입자로 구성된 추가의 멤브레노필릭 영역을 포함할 수 있다. 상기 고체 입자는 멤브레노필릭 특성을 가지고 (a)막, (b)지질 유사 폴리머 또는 (c)계면활성 혹은 에멀젼 시스템으로 덮여있다. 상기 고체 입자는 고정된다.
상기 장치는 지지 고체면과 덮개층 사이에 갇힌 수용성 층을 더 포함할 수 있다.
상기 장치는 또한 덮개층을 덮는 수용액을 포함할 수 있다.
나아가, 상기 장치는 겔 또는 폴리머 구조로 형성된 층을 포함할 수 있다. 상기 층은 예를 들어 pH 구배의 도입 또는 예컨데 항체와 같은 분자 및 작용기의 부착을 위한 이차 고정 매트릭스의 제공을 위해 사용될 수 있다. 상기 층은 덮개층의 위 및/또는 아래에 위치할 수 있다.
상기 장치는 지지 고체면 상에 금속 필름을 더 포함할 수 있다. 상기 메탈 필름은 바람직하게는 지지 고체면 위에 직접 위치한다. 금속 필름의 목적은 형광 측정을 하는 동안 배경형광 또는 자가형광을 감소시키는 것이다.
상기 장치의 지지 고체면은 또한 적어도 하나의 멤브레노포빅 영역을 포함할 수 있다. 멤브레노포빅 영역으로 막-배척의 영역 또는 면의 일부가 의도된다.
본 발명에 따라 사용된 상기 멤브레노필릭 영역은 어떠한 형태 혹은 기하학의 멤브레노필릭 영역으로 구성 혹은 형성되거나, 또는 표면은 화학적 및/또는 물리학적 수정 혹은 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들 수 있다.
상기 화학적 수정 혹은 조작은 예를 들어 산 또는 염기 또는 산화제 또는 다른 적절한 방법으로 처리하여 수행될 수 있다.
상기 물리학적 수정 혹은 조작은 예를 들어 플라즈마-처리 또는 다른 적절한 방법으로 수행될 수 있다.
상기 언급된 멤브레노필릭 영역은 실리콘 디옥사이드(SiO2), 유리, 운모(Mica) 또는 폴리머-변형 표면으로 구성된 그룹으로부터 선택된 물질로 이루어진 표면으로 형성될 수 있고 화학적 및/또는 물리학적 수정 혹은 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만든다. 바람직하게 상기 표면은 플라즈마-처리로 처리된다. 이는 지질 이중층막이 상기 멤브레노필릭 영역에 부착하는 것을 가능하게 한다.
상술한 멤브레노필릭 영역은 또한 예를 들어 알루미늄 옥사이드(Al2O3), 다른 금속 옥사이드 또는 금으로 구성된 그룹으로부터 선택된 물질과 같은 금속 옥사이드 및 금속으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 물질로 구성된 면으로 형성될 수 있고 화학적 및/또는 물리학적 수정 혹은 조작을 통해 멤브레노필릭을 만든다. 바람직하게 상기 표면은 플라즈마로 처리된다. 이는 온전한 지질 소포가 상기 멤브레노필릭 영역에 부착되고 고정되는 것을 가능하게 한다.
본 장치의 상기 이중층은 막으로 구성될 수 있다. 상기 막은 지질 이중층막, 지질 베시클, 프로테오베시클-즉, 재구성된 막 단백질 함유 소포, 지질 나노튜브, 자발 형성된 단층과 같은 지질 단층, SAMs, 세포 소기관 및 이들의 어떠한 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 막은 조절 가능한 형태로, 적어도 하나의 지질 막 컨테이너에 연결된 적어도 하나의 지질 나노튜브 네트워크로서 형성될 수 있다.
하나의 멤브레노필릭 영역은 상이한 부분을 갖는 덮개층으로 덮혀질 수 있다. 상기 멤브레노필릭 영역은 다른 지질 또는 지질/지질 혼합물로 덮혀질 수 있으며, 여기서 멤브레노필릭 영역 특정 부분 상의 상기 지질 또는 상기 지질/지질 혼합물은 한 가지 유형의 지질 또는 지질/지질 혼합물일 수 있으며, 반면 멤브레노필릭 영역 특정한 다른 부분 상의 상기 지질 또는 상기 지질/지질 혼합물은 다른 유형의 지질이거나 지질/지질 혼합물일 수 있다. 상기 지질/지질 혼합물은 다른 유형의 지질 또는 동일한 표면 상에 공존하는 다른 상(phase) 상태의 지질을 함유할 수 있다. 상기 막이 지질 이중층막인 경우 마이크로 피펫 또는 광학집게(Optical tweezer)를 사용한 다층라멜라 베시클의 침착(deposition), 표면에 걸쳐 지질 물질로 충전된 피펫의 번역에 의한 피펫-라이팅(writing) 기술을 사용한 지질의 침착, 유체 채널 및 흐름 세포(flow cell)를 통한 지질 이중층막의 침착, 또는 용해된 지질의 직접 주입에 의해 멤브레노필릭 표면쪽으로 도입될 수 있다. 상기 지질 이중층막의 지지 고체면으로의 흡착는 예를 들어 지지 고체면의 부착 잠재력(adhesion potential)과 같은 다양한 수단으로 조절될 수 있다. 상기 부착 잠재력은 정적이고 하기의 어떠한 상호작용에 의해 조절될 수 있다: 반데르발스, 소수성, 정전기적, pi-pi 상호작용, 수소 결합 및 공유 결합성 상호작용. 택일적으로, 상기 부착 잠재력은 동적이고 하기의 어떠한 상호작용에 의해 조절될 수 있다: 전기습윤(electrowetting) 및 전기력. 자기력 또한 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
덮개 층이 지질 이중층막, 지질 베시클, 프로테오베시클, 지질 나노튜브, 지질 단층, 세포 조각, 세포 소기관 및 이들의 어떠한 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 막으로 이루어진 경우 상기 덮개 층에 묶인, 연결 혹은 결합된 상기 물질이 덮개 층 내 혹은 덮개 층 위의 지질 부에 묶이거나 연결되거나 결합된다.
특히 상기 덮개 층이 지질 이중층막, 지질 베시클, 프로테오베시클, 지질 나노튜브, 지질 단층, 세포 조각, 세포 소기관 및 이들의 어떠한 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 막에 의해 이루어지는 경우 덮개층의 지지 고체면에 대한 고정을 향상시키기 위해 2가 양이온이 사용될 수 있다. 이러한 2가 양이온의 일 예는 칼슘 이온이다.
본 발명에 따른 상기 장치의 덮개 층은 또한 온전한 세포 혹은 온전한 세포 소기관에 의해 구성될 수 있다.
나아가, 상기 덮개 층은 지질 유사(mimicking) 폴리머에 의해 구성될 수 있다. 이러한 폴리머의 일 예는 다이(di)-블록-폴리머이다.
게다가 상기 덮개 층은 계면활성 혹은 에멀젼 시스템에 의해 구성될 수 있다. 상기 계면활성 혹은 에멀젼 시스템은 미셀(micelle) 형성 시스템, 오일, 스펀지-상(phase) 및 자연 출처 혹은 합성 지질의 추출물과 같은 이액성(lyotropic) 지질로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 상기 물질은 외재성 및 관통 막 단백질, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-고정 단백질, 포스포리피드, 스핑고리피드, 약물, 양쪽성제(amphiphilic agent), 친지질성제, 스테롤, 당, 올리고뉴클레오티드 및 폴리머로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 상기 물질은 비오틴-아비딘 상호작용과 같은 비-공유성 상호작용에 의해 덮개 층에 연결될 수 있는 어떠한 분자일 수 있다.
상기 물질은 나아가 비드(bead)에 연결될 수 있다. 상기 비드는 다른 특성을 가질 수 있다. 예를 들어 자기 비드는 자기장과 관련하여 사용될 수 있고, 전하를 띠는 비드는 전기장과 관련하여 사용될 수 있으며 크거나 부피가 큰 비드는 유체역학적 흐름을 위해 사용될 수 있다. 자기 비드의 상기 용도는 자기장에 기초한 분리, 즉 자기영동(magnetophoresis)을 가능하게 한다.
상기 물질은 또한 운반 표지(transport marker)에 연결될 수 있다. 상기 물질은 덮개 층 내로 도입되거나, 상기 물질은 전기주입, 전기융합, 광융합, 열에 의해 도입된 융합, 전자기 방사에 의해 도입된 융합, 화학적 작용제에 의해 도입된 융합 및 디터젼트 불안정화(detergent destabilization)로 구성된 그룹으로부터 선택된 기술에 의해 상기 덮개 층을 형성한다. 이는 상기 덮개 층을 형성하는 동안 이루어질 수 있다.
나아가, 본 발명에 의한 상기 장치는 또한 덮개 층의 전기장 적용을 위해 적어도 하나의 전극을 포함할 수 있다. 이는 전기영동, 전기엔도오스모시스(electroendoosmosis), 유전영동(dielectrophoresis), 아이소타코포레시스(Isotachophoresis) 또는 등전 초점법(isoelectric focusing)을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 상기 장치는 또한 덮개 층의 자기장 적용을 위한 적어도 하나의 자석을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 장치는 덮개 층을 덮는 수용액의 흐름을 만들기 위한 적어도 하나의 입구 및 적어도 하나의 출구 연결부를 포함할 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 상기 장치는 상기 덮개 층 주변의 추가적인 막, 단백질-지질 혼합물, 세척액, 염색액, 소화액 및 다른 용액 혹은 서스펜션의 교환을 위한 적어도 하나의 입구 및 적어도 하나의 출구 연결부를 포함할 수 있다.
나아가, 상기 장치는 시료의 농축 및 단리를 수행하기 위해 분류된 시료 또는 특수화된 도메인의 수집을 위한 부분을 포함할 수 있다.
상기 장치는 또한 물질을 상기 장치로 및 상기 장치로부터 운반하기 위한 적어도 하나의 유체 채널을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 장치의 구성은 적어도 하나의 전극, 적어도 하나의 자석 및/또는 유체 흐름의 발생을 위한 적어도 하나의 입구 및 적어도 하나의 출구 연결부뿐만 아니라 덮개 층 주변의 추가의 막, 단백질-지질 혼합물, 세척액, 염색액, 소화액 및 다른 용액 혹은 서스펜션의 교환을 위한 적어도 하나의 입구 및 적어도 하나의 출구 연결부, 및 임의로 샘플 농축 및 분리를 위해 분획된 샘플 혹은 특수화된 도메인의 수집을 위한 부분 및/또는 상기 장치가 상기 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 분리, 단리 및/또는 농축에 적합하게 하며 상기 장치로 및 상기 장치에서 물질을 운반하기 위한 적어도 하나의 유체 채널을 포함한다. 상기 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 상기 물질은 그 후 화학적 혹은 물리학적 수정 혹은 조작을 가능하게 할 수 있는 특정 성질에 의하여 선택된다.
나아가, 상기 장치는 상기 지지 고체면에 상기 덮개 층은 고정하기 위한 테터(tether)와 같은 분자를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 상기 덮개 층과 상기 지지 고체면 사이의 고리 또는 스페이서로 작용한다. 이들은 상기 덮개 층 또는 지지 고체면 어느 쪽의 부분일 수 있다.
상기 장치의 지지 고체면은 평면일 수 있고 상기 멤브레노필릭 표면 영역은 예를 들어 고립형, 통로(lane), 사형(serpentine)을 포함한 특수한 이차원 기하학 형태를 갖는다.
상기 장치의 지지 고체면은 삼차원 구조일 수 있다. 그리고 상기 멤브레노필릭 영역은 예를 들어 웰(well) 혹은 채널 내에 위치하는 것과 같은 오목한 구조 내에 위치할 수 있다. 상기 멤브레노필릭 영역은 또한 예를 들어 기둥(pillar), 통로, 피라미드-형, 계단식 피라미드-형, 사형(serpentine), 굴곡-가장자리형(meander-border)과 같은 높은 구조의 최상부에만 위치하는 것과 같이 전체 또는 하나 혹은 여러 부분에 위치할 수 있다. 상기 지지 고체면이 삼차원인 경우, 상기 덮개 층은 이차원 혹은 삼차원일 수 있다. 이는 흔히 삼차원이지만, 때로는 예를 들어 표면을 증가시키기 위해 주름지게 될 수 있고, 이 경우는 물론 삼차원이다.
상기 멤브레노포빅(membraneophobic) 영역은 이에 제한하는 것은 아니지만 예컨데 SU-8, 테플론, 플라스틱들, 고무들, 폴리머들 및 지질막들과 같은 포토레지스트(photoresistance) 물질로 형성될 수 있다. 이는 또한 하나의 플라스틱, 폴리머 또는 지질막으로 형성될 수 있다.
상기 지지 고체면은 하나의 멤브레노필릭 그리고 하나의 멤브레노포빅의 두 개의 다른 표면 영역의 무늬가 있을 수 있다.
상기 지지 고체면은 또한 하나 이상의 멤브레노필릭 영역 및 하나 이상의 멤브레노포빅 영역을 포함할 수 있으며, 상기 영역들은 복합적이거나 평행한 패턴으로 배열될 수 있다. 상기 패턴은 동일한 멤브레노필릭 또는 멤브레노포빅 표면 영역의 기하학적 구조를 포함할 수 있다. 상기 패턴은 또한 상이한 멤브레노필릭 또는 멤브레노포빅 표면 영역의 기하학적 구조를 포함할 수 있다.
결국, 본 발명에 따른 상기 장치의 수용성 층은 폴리머를 포함할 수 있다. 그 후 이들은 이른바 폴리머 쿠션(polymer cushion)으로 작용한다.
본 발명에 따른 장치의 바람직한 구현이 도 16 및 17에 나타나고, 이들은 또한 하기에서 더욱 자세히 설명된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 장치의 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 분리 또는 동정 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (ⅰ)상기 장치를 상기 물질의 조절된 소화적 분해를 수행하는 적어도 하나의 소화액과 접촉하여, 그 후 상기 물질이 실질적으로 이동성 부분 및 여전히 상기 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 고정부분으로 구성되는 제 1단계;, 및 (ⅱ) 실질적으로 이동성 부분이 탐지 또는 분석을 위해 운반되는 제 2단계를 포함한다. 이는 상이한 소화 화합물로 한번 또는 여러 번 반복될 수 있다. 상기 방법은 또한 (ⅲ) 상기 장치가 상기 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 잔존하는 고정 부분을 적재하는 덮개 층의 구조를 분쇄하는 최소 하나의 분쇄제(disruptive agent)와 접촉하여, 그 후 실질적으로 이동성인 기초 성분으로 구성되는 제 3단계; 및 (ⅳ) 덮개 층으로부터 방출된 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 잔존 부분이 이동하여 탐지 또는 분석되는 제 4단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 하기 및 첨부된 청구항에서 더욱 설명된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 장치 내의 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 분리 및 동정 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (ⅰ) 상기 장치가 용해성 물질을 함유하는 수용액과 접촉하는 제 1단계, (ⅱ) 상기 장치가 수용액 내의 용해성 물질의 분해를 수행하는 적어도 하나의 소화제 또는 분쇄(cleavage agent)와 접촉하는 제 2단계; 및 (ⅲ) 상기 용해성 물질의 분쇄가 탐지 또는 분석되는 제 3단계를 포함한다. 이 방법은 또한 하기 및 첨부된 청구항에서 더욱 설명된다.
나아가, 본 발명은 상술한 장치 및/또는 방법의 용도에 관한 것이다. 상기 장치 및 방법은 하기에 적합하다:
본 발명에 따른 장치 내의 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 분리,
본 발명에 따른 장치 내의 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 수집,
본 발명에 따른 장치 내의 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 동정,
예를 들어 펩타이드, 당, 지질 또는 DNA의 분리를 수행하는 분리 컬럼으로의 통합,
탐지 또는 분석 시스템으로의 통합,
탈염(desalting) 및 농축 컬럼과의 결합,
결합 상호작용에 대한 연구,
확산의 연구,
화학적 상호작용의 연구,
단백질-약물 상호작용의 연구,
화학적 컴퓨터의 제조,
이식형 장치의 제조,
본 발명에 따른 장치의 멤브레노필릭 영역에서 성장하는 살아있는 세포에 대한 소위 마랑고니 유동(Marangoni flow) 및 다른 막 특성과 결합,
예를 들어, 본 발명에 따른 장치의 멤브레노필릭 또는 멤브레노포빅 영역에 부착된 또는 나노미터 내지 마이크로미터의 직경을 갖는 비드에 부착된 항체와의 결합, 및/또는 마크로분자의 집중 및 농축 또는 마크로분자 집합체의 형성.
상술한 방법에 관련되어 사용된 장치의 경우, 그 중에서도 하기 적용의 막 단백질의 분석 및 연구를 위한 기술 및 프로토콜이 가능하다:
ㆍ 단백질의 상기 동정 및 특징 부여는 서열 커버리지 연구(sequence coverage study)를 포함하며, 가능한 많은 아미노산 서열에 대응하는 단백질 서열 내의 가능한 많은 펩타이드를 검출 및 동정하기 위해 최적화된 프로토콜에 관여한다. 번역-후 수정에 대한 연구 또한 이와 관련하여 적용가능하다.
ㆍ 상이한 세포 시료로부터의 막 단백질 매핑(mapping)-막 프로테옴(proteom) 프로파일링. 넓은 범위의 존재비 수준의 고도로 복잡한 시료가 소화 및 분석된다. MS 분석에 앞서 상기 만들어진 펩티드가 일차원(예를 들어, 역상 HPLC) 또는 이차원(예를 들어, 이온 교환 HPLC(SCX-강한 양이온 교환) 후속적으로 예를 들어 역상 HPLC)으로 분리된다. 이는 또한 높은 존재비 단백질의 연구 및 새로운 약물 목표의 발견을 가능하게 한다.
ㆍ 막 단백질의 기능적 연구-예시는 목표 낚기(target fishing) 및 G-단백질 연관 수용체(GPCR) 디오르파니제이션(deorphanization)과 같은 수용체 디오르파니제이션. 목표 낚기의 경우 그 목적은 리간드 결합 연구를 어떤 리간드가 어떤 단백질에 결합하는지를 동정하는데 사용하는 것이다. 수용체 디오르파니제이션의 경우, 그 목적은 수용체의 기능 및 가능한 그들의 리간드를 해명하는 것이다. 작용이 알려지지 않은 많은 수용체가 있으며, 따라서 그 이름이 오르판(orphan) 수용체 이다.
ㆍ 질병에 걸린 상태 및/또는 약물 치료하는 동안 단백질 발현 수준의 업(up)-및-다운(down) 조절의 조사, 이른바 발현 프로파일링. 이러한 연구는 상이한 시료들의 비교 및 상기 시료 간의 차이점에 대한 평가를 수반한다.
전통적인 방법을 사용하는 경우와 비교하면, 상술한 방법, 기술 및 프로토콜과 관련하여 사용된 상기 설명된 장치를 통해 획득되는 향상된 자료 산출은 하기와 같다:
ㆍ 칩 상의 최적화된 프로토콜을 보증하기 위해 복합적인 화학적 상호작용 및/또는 세척 단계가 수행될 수 있다. 이러한 단계들은 또한 시료의 희석 없이 수행될 수 있다.
ㆍ 막 단백질의 외재성 및 막관통 부분이 동일한 시료를 사용하여 상이한 단계들로 목표되고 수집될 수 있다.
ㆍ 단일의 시료가 순차적으로 및/또는 병행하여 상이한 효소에 도입되어 동일한 시료의 다양한 부분을 소화시킬 수 있다.
ㆍ 순차적인 소화 등과 관련하여 상기 칩 내의 높은 표면-대-부피 비는 최소의 시료 손실을 갖는 펩티드의 창출을 이끌며, 이는 보다 높은 민감성을 가능하게 한다. 이는 서열 커버리지(sequence coverage) 연구 및 시료 내의 낮은 존재비의 막 단백질 검출을 촉진시킨다.
ㆍ 세포에서의 상이한 세포하 분획(subcellular fraction)이 칩 상에서 병행하여 다루어질 수 있다.
ㆍ 리간드 결합, 교차결합(crosslinking) 및/또는 소화는 펩티드 결합 부위의 잠재적인 목표를 제공할 수 있다. 결합된 리간드가 있는 및 결합된 리간드가 없는 단백질은 효소적인 소화 후 상이한 펩티드 지도를 산출할 것이며, 여기서 상기 리간드는 결합하는 동안 효소의 분리를 입체적으로 방해하거나 구조의 변화를 부가한다.
나아가 상술한 방법, 기술 및 프로토콜과 관련하여 본 발명에 따른 칩 장치를 사용함에 따른 몇몇의 일반적인 장점들은 하기와 같다:
ㆍ 시료는 표면으로 한정되며, 즉 분석을 하는 동안 고정된 매트릭스에 붙어있고, 그 때문에 복합적인 단계의 라벨링(labeling), 화학적 수정, 소화 등이 가능하다.
ㆍ MS, 형광, 전기화학, SPR, QCM, 등을 포함하는 검출 기술 온(on)-및-오프(off) 칩의 축적과 관련하여 사용할 수 있는 역량,
ㆍ 칩을 현존하는 칩-기초 플랫폼(platform) 및 전통적인 분석 도구와 통합할 수 있는 가능성,
ㆍ 시료의 취급이 자동화에 용이함.
동시에, 상술한 방법, 기술 및 프로토콜과 관련하여 사용된 본 발명이 따른 장치 내의 지질 매트릭스의 사용의 장점은 하기와 같다:
ㆍ 막 단백질과 같은 막 결합 화합물이 그들의 본래의 지질 이중층 환경에 유지된다,
ㆍ 막에 결합된 구성분의 구조와 기능이 보존된다,
ㆍ 본 발명이 막 단백질을 그들의 자연적 지질 이중층막 환경으로 유지할 수 있기 때문에, 막에 결합된 단백질과 같은 구성분을 함유하는 막 베시클의 제조, 수송, 침착 및 처리는 디터전트(detergent)의 사용을 요구하지 않는다. 디터전트는 변성 (denaturing)과 같은 유해한 효과를 가질 수 있기 때문에 이는 하나의 장점이다. 또한, 예를 들어 더 순수한 막 단백질 제조 사전 분석의 획득을 위해 본 발명과 관련하여 소수의 단계 또는 모든 단계에서 디터전트를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 상세한 설명
지질 이중층 막은 특정 형태 및 기하학을 채용할 수 있다. 평형 조건에서 발견되는 자발적인 형태는 위상기하학(topolgy), 상(phase), 및 기하학(geometry)에 의해 제한된다. 본 발명자들은 굽힘 탄성계수(bending modulus), 자발적인 구부러짐 등과 같은 특정의 주된 시스템 매개변수의 함수로서 형태의 해석을 위해 헬프리치(Helfrich) 방정식을 참조한다. 지질 지중층 막은 열방성 액정(Thermotropic Liquid Crystal)이고 전이 온도 위에서 2-차원적 유체로서 행동한다. 액정 매질은 막 단백질 및 다른 양친성, 및 친유성 분자와 같은 특정한 분자를 위한 용매로서 매우 흥미롭다. 그러나 이러한 유체의 조절에 대한 제한 때문에, 장치들을 기술적 적용을 위한 액정 매질을 이용하도록 만드는 것이 어렵다. 이중층 막은 계면의(interfacial) 유체이다. 따라서, 이들은 언제나 경계에 존재하거나 경계를 한정한다. 막은 상이한 방법을 이용하여 에너지적으로 불리한 구조로 강제될 수 있다. 상기 결과 구조는 따라서 동역학적으로(kinetically) 저지되고, 매우 높은 에지 에너지(valence band edge energy)로서 특징을 가질 수 있다. 본 발명자들이 지질 이중층 막에 의해 스스로 어떠한 특정 구조에 제한하는 것이 아님에 주의한다. 따라서 구형 베시클, 랭뮤어-브로젯(Langmuir-Blodgett) 형의 평면 이중층이거나, 또는 관(tubular) 구조이거나 다른 형태의 구조일 수 있다. 본 발명자들은 본 발명을 어떠한 특정한 유형의 지질 상(phase)으로 제한하지 않는다.
에너지적으로 긴장된(strained) 기하학의 일 예는 나노튜브 또는 얇은 테터(tether)에 의해 접합된 지질 막 베시클이다(Karlsson et al. Nature, 409, 150-152(2001)). 상기 베시클이 표면에 고정된 경우 이러한 구조들은 연장된 기간에 대해서만 존재한다. 상기 베시클이 상기 표면에서 방출되면, 상기 시스템은 곧 하나의 단일 구로 붕괴된다.
본 발명의 일 구현은 표면 상 지질 이중층 구조의 형태를 조절하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 예를 들어 지질 이중층 막(또는 이러한 막 집합을 형성하는 구성 부분)과 상호작용하여 조절된 종점(end-point) 지형학 및 기하학을 갖는 접합 구조를 형성하는 화학적 또는 지형학(topographical)적 특성과 같은 특정한 특성을 갖는 본질적으로 평면인 기판 상의 표면을 설계하는 방법을 개발하였다. 근본적인 착상은 예를 들어 상기 표면의 이중층 막의 퍼짐 또는 형성을 상기 결과 이중층 구조가 기술적 문제를 해결하기 위해 유용한 형태를 갖는 방식으로 제어하는 것이다. 이에 제한하는 것은 아니나 이러한 하나의 문제는 막 단백질의 분리 및 분석 능력을 갖는 것이고, 나아가 예를 들어 동적 방식으로 단백질-약물 상호작용 등을 위해 단백질을 기능적으로 탐지하는 능력을 갖는 것이다.
본 발명자들은 상이한 표면 및 그들의 제조를 보는 것으로 시작한다. 어떠한 유형의 막과 막 물질을 포획하도록 설계된, 상기 멤브레노필릭 영역은 어떠한 형태 또는 기하학의 어떠한 멤브레노필릭 표면으로 형성될 수 있거나 표면은 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만든다.
이러한 표면은 예를 들어 막 단백질의 분리 및 조작과 같은 일부 유용한 기하학을 갖는 이중층 막 구조를 우세하게 적재하는 영역을 만드는데 사용될 것이다. 가장 단순한 사례에서 본 발명자들은 표면을 이중층 막으로 완전하게 덮고자 한다. 그 다음 사례에서 본 발명자들은 지질 이중층 막으로 덮힌 표면의 선 또는 면을 한정하고자 한다. 상기 막-덮힌 면은 적어도 하나의 평면 방향이어야 하고(즉, 일반적인 확장이 아님) 바람직하게는 이중층 막으로 덮히지 않은 면으로 둘러쌓여야 한다. 따라서 상기 두 면은 이들을 분리하는 상이한 표면 특성 또는 물리학적 경계를 가져야한다. 가장 단순한 계획안에서, 본 발명자들은 상기 표면에 대한 막의 부착을 조절하여 이중층 막에 대한 이러한 상이한 차등 흡수(differential adsorption)를 제어한다. 상기 사례에서 상기 지질이 전하를 띠고 친수성인 경우, 바람직하게는 막으로 덮힐 상기 표면 또한 전하를 띠고 친수성일 수 있다. 이러한 목적으로 이용될 수 있는 반데르발스, 소수성, 정전기, π-π 상호작용, 수소 결합 및 공유결합성 상호작용 범위의 상호작용 잠재력을 제어하는데 이용될 수 있는 다수의 화학적 및 물리학적 요소가 있다. 일부 상호작용은 자연에서 정적일 수 있는 반면, 다른 것은 동적일 수 있다. 동적 상호작용의 예는 전기습윤(electrowetting), 자기력 및 전기력이다.
지질 이중층은 상이한 방법을 이용하여 표면에 흡착될 수 있다. 예를 들어, 실리콘 디옥사이드 상에서 단층라멜라 베시클의 붕괴로부터의 연속적인 이중층 , 및 랭뮤어-브로젯(Langmuir-Blodgett) 필름(Reimhult et al. J. Chem. Phys. 117, 7401-7404(2002), Stelze et al. J. Phys. Chem. 97, 2974-2981(1993)) 형성에 대한 보고가 있다. 본 발명에 따르면, 상기 설계된 구조(도 7 참조) 상의 지질 침착을 위해 몇몇의 기술이 제안된다. 일 예는 예를 들어 피펫-운반 기술을 이용한 다층라멜라베시클의 제어된 침착을 포함한다. 이러한 베시클은 과량의 막 물질을 함유하고, 하나의 10 μm-직경 다층라멜라 베시클은 1000sq. 마이크로미터의 지질 막을 함유할 수 있다. 이러한 과량의 막은 하기에서 설명하는 바와 같이 호의적인 조건에서 표면에 수여될 수 있다.
단순한 사례에서, 기판에 대한 막 부착은 소수성 상호작용을 이용하여 제어될 수 있다. 수용성 환경에서 지질 이중층 막 결합이 유리한 영역을 갖는 평면 기판이 제공된다. 따라서 전형적인 경우에서 본 발명자들은 a)고체 지지체 b)계면 액정 물질(예를 들어 지질 이중층 필름), 및 c)대부분은 전형적으로 물인 액체를 갖는 층 구조를 포함하는 시스템을 만들 것이다. 상기 평면 기판은 지질 막이 퍼짐을 선호하는 영역 및 막 결합과 퍼짐에 불리한 영역을 갖는다. 이러한 표면의 예는 플라즈마-처리된 금 또는 Al2O3-표면이며, 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만든 표면들은 프라즈마-처리된 SU-8로 각각 덮힌다. 이러한 표면의 결합은 대두 기름 막, 및 포스파티딜콜린, 뿐만 아니라 대부분의 진핵 세포 막과 같은 세포 막 등의 중성 지질 막에 대해서 만족스럽게 작용한다. 또한 기판은 Al2O3 또는 금으로 완전히 덮어서 만들어질 수 있고, 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭을 만들며, 따라서 베시클 또는 연속적인 이중층 필름 형태의 막으로 완전히 덮힌 상응하는 표면을 만드는데 이용될 수 있다. 표면의 이중층 막의 패턴을 만드는데 이용될 수 있는 특이적 또는 비특이적 표면 상호작용이 다수 존재한다. 표면의 제조는 본 목적으로 이용될 수 있는 자발형성(self assemble)된 단층, 및 에칭, 증착법(vapor deposition), 스핀 코팅 등과 같은 다양한 도구를 포함한다. 표면은 당해 기술 분야에서 마이크로- 및 나노-가공(fabrication)으로 알려진 상이한 특성으로 제조될 수 있다. 상기 표면은 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어질 수 있다. 이러한 기술로 생산된 상이한 표면의 예가 하기에 주어지고, 나아가 이러한 표면을 생산하기 위한 가공 기술이 실험의 단락에 주어진다.
일부 목적 및 적용을 위해, 상기 표면은 예를 들어, 금 또는 Al2O3-표면 같은 멤브레노필릭 특성만을 가질 수 있고(도 1), 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만든다. 이러한 멤브레노필릭 표면은 온전한 베시클(예를 들어 작은 단층라멜라 베시클 SUVs) 또는 연속적인 지질 이중층 막으로 덮힐 수 있다. 일부 적용은 본 기술로부터 실현될 수 있다. 막 단백질은 이러한 지질 시스템 및 기술로 재구성될 수 있으며, 마이크로어레이(microarray) 또는 플레이트 리더(plate reader) 등이 예를 들어 이온 패널 또는 G-단백질-연결 수용체 단백질(GPCRs)과 같은 목표 단백질에 대한 리간드 결합의 연구를 위해 형광-기초 검출 기술과 함께 이용될 수 있다. 이 것은 예를 들어 지질 이중층 막 시스템 내의 흥미있는 이온 채널(베시클 그대로 또는 연속적인 지질 이중층 막 형태) 및 지질 이중층 막 내부의 수용체 탐침을 가지고 수행될 수 있다. 상기 탐침은 리간드가 결합한 경우 상기 채널이 특이적으로 통과시키는 이온의 농도의 변화를 보고해야 한다. 따라서, 잠재적인 약물 후보인 리간드는 예를 들어 형광의 증가에 의한 이러한 기술을 이용하여 스크린 할 수 있다. 결합에 의해, 상기 이온 채널이 열리고 상기 이온을 특이적인 상기 지질 이중층 막으로 들어가도록 한다. 상기 리포터 탐침은 그에 따라 형광을 내고 신호가 관찰된다. 이러한 목적으로 이용될 수 있는 다른 기술은 칩 표면에 부착된 질량의 변화를 탐지하는 기술인, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 탐지에 기초한다. 리간드는 지질 매트릭스 내의 막 단백질에 부착하고 그에 따라 칩 위의 질량의 증가가 관찰된다. 상기 멤브레노필릭 표면은 또한 베시클 그대로 또는 연속적인 지질 이중층 막의 형태로 지질 이중층 막 매트릭스에 리보좀을 부착하기 위해 이용될 수 있다. 이는 예를 들어 막 단백질의 무세포 합성(cell-free synthesis)을 위해 사용될 수 있다. 아미노산 및 리보좀에 의한 번역을 위해 요구되는 코딩 유전자뿐만 아니라 다른 물질 또는 작용제가 막 매트릭스에 고정된 리보좀에 첨가된다. 상기 코딩 유전자는 관심있는 막 단백질로 번역되고, 이는 이어서 막 매트릭스 내로 삽입된다(매우 중요한 사실로, 막 단백질은 물-기초 환경에서 합성될 수 없기 때문이다). 삽입된 단백질의 높은 농도가 획득되면, 상기 단백질은 나아간 분석을 위해 수집될 수 있다. 새롭게 합성된 이온 채널, GPCRs 및 다른 단백질의 기능성 연구 등은 막 단백질이 합성된 상기 칩 위에서 직접 수행될 수 있다. 표면 위 지질 매트릭스 내의 리보좀을 이용하여 수행될 수 있는 다른 연구는 어떤 유전자가 어떤 단백질을 코딩하는지 조사하기 위한, 게놈(genome) 및 프로테옴(proteom) 간의 연결이다. 상기 게놈은 알려지지 않은 기능을 가질 수 있는 단백질로 번역되고 충분히 높은 농도에 이른 경우, 기능성 연구가 수행될 수 있다. 또한, 상기 단백질은 예를 들어 질량 분석기를 이용한 동정 및 분석을 위해 수집될 수 있다. 이는 다수의 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 소화 용액(예를 들어 트립신 같은 효소를 함유)이 상기 용액에 첨가될 수 있고, 지질 이중층 막 외부로 나온 막 단백질 부분을 분해하며, 따라서 상기 막 단백질로부터 펩티드 단편을 형성한다. 상기 소화 용액은 또한 막 매트릭스를 붕괴하고 단백질은 변성시키기 위한 용제 또는 유기 변형제를 함유할 수 있으며, 이는 또한 막 관통 단백질 단편이 상기 소화 작용제로부터 형성되도록 한다. 상기 펩티드 단편이 수집되고 예를 들어 매트릭스-보조 레이져-탈착-비행시간(matrix-assisted laser -desorption ionization-time of flight)(MALDI-TOF) 질량 분석기(도 15 참조 및 보다 상세한 설명을 위해 본문의 문단을 결합)에 의해 분석된다.
다른 목적 및 적용으로, 멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 특성을 모두 갖는 표면을 만들기 위해, 상기 표면은 마이크로- 및 나노 가공 기술을 이용하여 구조화될 수 있다, 따라서, 선, 평면 또는 특정한 표면 기하학 또는 상이한 표면 특성들의 결합을 갖는 평면이 만들어질 수 있다. 예를 들어, 부착을 촉진시키는 영역이 지질 퍼짐을 지지하지 않는 다른 면으로 둘러 쌓일 수 있다. 다른 표면 패턴의 예가 도 1에 나타난다. 도 1d 및 1e는 멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 도메인을 각각 갖는 평면 표면의 도식적 그림을 나타낸다. 도 1d에서, 두 멤브레노필릭 고립 부분이 단일의 멤브레노필릭 통로로 연결되고 도 1e에서는 두 멤브레노필릭 고립 부분이 세 개의 멤브레노필릭 통로로 연결된다. 도 1f 및 1g는 도1d 및 도 1e 각각에 대응하는 이미지를 나타내며, 여기서 상기 멤브레노필릭 영역은 지질 이중층 막으로 덮힌다.
도 1h 및 도 1i는 멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 도메인을 각각과 표면 기하학을 갖는 평면 표면의 도식적 그림을 나타낸다. 오목한 기하학을 갖는 이러한 구조는 미세가공(microfabrication)으로 생산될 수 있다. 또한, 멤브레노필릭 지지체 상에 퍼지는 지질 이중층 막과 함께 사용되도록 의도되었고, 도 1j 및 1k는 지질 필름의 성장 또는 부착 후의 대응 이미지를 나타낸다. 도 11은 멤브레노필릭/멤브레노포빅 도메인 및 멤브레노필릭 도메인이 높은 구조의 최상부 표면에 위치하는 표면 기하학을 갖는 일 예를 나타낸다. 높은 기하학을 갖는 이러한 구조는 미세가공 방법으로 생산될 수 있다. 이러한 특정의 경우에 두 개의 높은 구형 기둥이 단일의 통로로 연결되었다. 도 1m은 멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 도메인을 각각 갖고 상기 친수성 도메인이 높은 구조의 최상부에 위치하는 표면 기하학을 갖는 표면의 예를 나타낸다. 이 특정한 경우에 두 개의 높은 구형 기둥은 세 개의 통로로 연결된다. 도 1l에서 친수성 표면은 덮지만 소수성 표면은 덮지 않는 평면 지지체 막이 도 1n에 나타나고, 도 1m에서 멤브레노필릭 표면은 덮지만 멤브레노포빅 표면은 덮지 않는 평면 지지체 막이 도 1o에 나타난다. 부유 평면 막이 세 개의 통로 사이를 맞물리게 함에 유의한다. 보여지는 바와 같이, 이 기술은 본질적으로 평면인 막을 표면 기하학에 기인하여 지지체 기판으로부터 상이한 간격을 갖는 표면에 침착하는데 이용된다. 이러한 구조의 높이에서 상기 차이, 즉 Al2O3 표면 최상부의 SU8 층의 두께는 나노미터에서 밀리미터까지의 범위를 가질 수 있고, 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만든다. 도1p는 도 1d, 1h, 및 1l과 유사한 표면 상의 낭-관(vesico-tubular) 막 구조를 나타낸다. 이들은 설명된 과정(참고 특허)에 따라 생산된 나노튜브-베시클 네트워크이다. 따라서, 상기 방법은 본질적으로 평면인 막의 침착에 한정되지 않는다. 이들은 사용된 미세가공 및 표면 침착/표면 화학 방법에 의해 궁극적으로 제한되는 특정한 패턴 형성에 있어서 여러 종류의 자유가 존재한다.
모든 표면은 작은 베시클 고정에 이용될 수 있다. 표면을 맞추기 위해 사용될 수 있는 많은 특이적 또는 비-특이적 상호작용이 있다. 이는 상기 내용에서 암시되고, 예를 들어 지질로 덮히게 될 상기 영역이 스트렙트아비딘(streptavidin) 부를 함유하고 상기 지질이 비오틴 부를 함유하는 화학적으로 패턴화된 표면에 대해 참고될 수 있다. 다른 예들은 렉틴-코팅된 영역을 포함할 수 있고 상기 지질 막은 당(또는 렉틴 코팅된 영역에 붙은 이러한 당 잔기를 갖는 단백질)을 적재할 수 있다. 다른 전략은 특히 관심있는 표면을 만들기 위해 SAMs(self-assembled monolayers)의 사용을 포함할 수 있다. 따라서, 지질 이중층의 소정의 화학적 및 물리학적 다양성에서, 본 발명자들은 유개념(generic concept)의 일반화를 강조하기 위해 멤브레노필릭 및 멤브레노포빅이란 용어를 사용한다. 가장 중요한 문제는 이러한 방법이 막-단백질 분리 같은 기술적 적용을 위한 최적화된 구조를 얻기 위한 특정한 설계 및 특징적인 크기의 지질-막-코팅된 표면을 차별적으로 형성하도록 하는 것이다. 또한 상기 방법은 평면 막, 베시클 등의 상이한 형태의 지질-이중층 형성 계면활성제에 제한되지 않으며, 다른 계면활성제 또는 미셀(micelle)-형성 시스템, 오일, 스펀지 상 및 유방성(lyotropic) 지질 등을 포함하는 에멀젼 시스템을 포함할 수 있는 것을 언급하는 것도 중요하다. 또한, 일부 사례에서, 동일한 표면 상에 상이한 상(phase) 상태 지질의 국부적 조성물이 공존하는 마이크로 칩이 만들어질 수 있다.
차별적인 멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 단백질 특성을 갖는 상기 패턴화된 표면은 또한 세포 배양의 플랫폼(platform)으로 이용될 수 있다. 이러한 방법으로 개체군 또는 단일의 세포가 상이한 지점에서 배양될 수 있다. 연결 통로는 예를 들어 세포 사이의 시냅스 결합(synaptic coupling)이 일어날 수 있는 장소를 제공한다.
멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 영역을 갖는 삼차원적 그레이-스케일(gray scale) 기판을 포함하지만 이에 제한되지 않는 상이한 기판의 일곱 개의 예시가 지질 이중층 막으로 코팅된 멤브레노필릭 영역을 갖는 대응하는 기판과 함께 도 2a-2m에 나타난다. 이들은 상기 장치들의 설계에 있어서 큰 자유도가 있음을 설명하기 위해 나타낸다. 상기 구조들은 가변적이고 길이 스케일에 대한 참고는 본 도면에서 주어지지 않았다. 그러나, 가장 작은 특징적 크기, 즉 형성 가능한 최소 통로는 대략 5 nm이고 만들어질 수 있는 최대는 거시적인 차원이다. 도 2a는 멤브레노포빅 기판 상의 멤브레노필릭 굴곡-가장자리(meander-border)형의 패턴을 나타내고 2b는 이중층 막으로 코팅된 2a 표면을 나타낸다. 도 2c는 멤브레노포빅 기판 상의 멤브레노픽릭 사(serpentine)형 패턴을 나타내고 도 2d는 상기 동일 기판이 이중층 막으로 코팅된 것을 나타낸다. 도 2e는 3-차원적 멤브레노포빅 피라미드-형 기판의 상부 표면의 멤브레노필릭 패턴을 나타내고 도 2f는 상기 동일 기판이 이중층 막으로 코팅된 것을 나타낸다. 도 2g는 3-차원적 멤브레노포빅 계단식-피라미드-형 기판의 상부 표면의 멤브레노필릭 패턴을 나타내고 도 2h는 상기 동일 기판이 이중층 막으로 코팅된 것을 나타낸다. 도 2i는 3-차원적 멤브레노포빅 사-형 기판의 상부 표면의 멤브레노필릭 패턴을 나타내고 도 2j는 상기 동일 기판이 이중층 막으로 코팅된 것을 나타낸다. 도 2k는 멤브레노포빅 기판 상의 멤브레노필릭 나선(circular serpentine) 미로 형 패턴을 나타내고 도 2l는 상기 동일 기판이 이중층 막으로 코팅된 것을 나타낸다. 도 2m는 멤브레노포빅 기판 상의 멤브레노필릭 사각-나선(square-shaped serpentine) 미로 형 패턴을 나타내고 도 2n는 상기 동일 기판이 이중층 막으로 코팅된 것을 나타낸다. 이들은 모두 이에 제한되지 않는 실시예이다.
추가적으로, 병행적인 또는 복합적인 장치의 제조를 위해 단일의 칩 위에 몇몇의 구조가 위치할 수 있다. 동일한 구조의 설계가 여러 개이거나 동일 칩 위에 몇몇의 상이한 기판이 있을 수 있다. 도 3은 다수의 기판 특성을 갖는 상이한 칩의 예를 나타내나 이에 제한되지는 않는다. 도 3a는 멤브레노포빅 기판 상의 단일의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역으로 이루어진 열여섯 개의 동일한 멤브레노필릭 패턴의 배열을 나타낸다. 도 3b는 멤브레노포빅 기판 상의 세 개의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역으로 이루어진 열여섯 개의 동일한 멤브레노필릭 패턴의 배열을 나타낸다. 도 3c는 멤브레노포빅 기판 상의 사형 패턴으로 배열된 단일의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역으로 이루어진 열여섯 개의 동일한 멤브레노필릭 패턴의 배열을 나타낸다. 도 3 d는 멤브레노포빅 기판 상의 미로 패턴으로 배열된 단일의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역으로 이루어진 열여섯 개의 동일한 멤브레노필릭 패턴의 배열을 나타낸다. 도 3e는 멤브레노포빅 기판 상의 ⅰ)사형 패턴으로 배열된 단일의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역 ⅱ)세 개의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역으로 이루어진 두 개의 상이한 유형의 열여섯 개 멤브레노필릭 패턴의 배열을 나타낸다. 도 3f는 멤브레노포빅 기판 상의 ⅰ) 미로형 패턴으로 배열된 단일의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역 ⅱ) 세 개의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역으로 이루어진 두 개의 상이한 유형의 열여섯 개 멤브레노필릭 패턴의 배열을 나타낸다. 상기 칩은 나아가 하기에서 설명되는 특별한 기능성을 지지하기 위한 전극 또는 미세유체 채널과 같은 보조 특징을 가질 수 있다. 상술한 마이크로칩은 상기 지질 필름 내에 용해된 물질, 또는 상기 지질 필름 자체의 조작을 가능케 하는 추가 구조 및 특성과 같은 특정한 특징을 가질 수 있다. 이러한 특징 중 하나는 예를 들어 지질 필름 또는 상기 지질 필름에 함유된 물질을 전기화학적으로 바꾸기 위한 또는 예를 들어 전기영동, 전기오스모시스(electroosmosis), 및 유전영동(dielectrophoresis)과 같은 전기이동 방법으로 물질을 이동시키는데 사용하기 위한 전기장을 형성을 위해 사용될 수 있는 전극이다. 칩은 하나 혹은 여러개의 전극을 적재할 수 있고 상기 전극은 칩의 표면에 통합되거나 또는 상기 전극은 마이크로칩 상의 특정 위치에 있는 탐침일 수 있다. 전극은 막 또는 막 단백질과 같은 막 결합 물질의 전기이동을 유도하기 위해 이용될 수 있다.
멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 영역 그리고 보조 전극을 갖는 다른 칩이 도 4A-K에 나타난다.
도 4a는 중심의 끝-점과 주변의 시작-점이 있는 나선형 통로를 갖는 여섯 개의 구조를 나타낸다. 전기장 적용을 위해 전극이 상기 두 지점에 연결된다. 도 4b는 세 개의 통로로 연결된 두 지점으로 이루어진 여섯 개의 동일한 멤브레노필릭 영역이 있는 칩을 보여준다. 전기장 적용을 위해 전극이 상기 두 지점으로 연결된다. 도 4c는 일곱 개의 통로로 연결된 두 지점으로 이루어진 여섯 개의 동일한 멤브레노필릭 영역이 있는 칩을 보여준다. 전기장 적용을 위해 전극이 상기 두 지점으로 연결된다. 도 4d는 두 갈래로 갈라진 네트워크 통로로 연결된 두 지점으로 이루어진 멤브레노필릭 영역을 갖는 하나의 패턴을 가진 칩이다. 전기장 적용을 위해 전극이 외부에서 상기 두 지점에 연결된다. 전극은 또한 전기장 적용을 위해 상기 네트워크의 두 갈래로 갈라진 지점에도 각각 연결된다. 도 4e는 두 갈래로 갈라진 네트워크 통로로 연결된 두 지점으로 이루어진 멤브레노필릭 영역을 갖는 하나의 패턴을 가진 칩을 나타낸다. 전기장 적용을 위해 전극이 외부에서 상기 두 지점에 연결된다. 전극은 또한 전기장 적용을 위해 상기 네트워크의 두 갈래로 갈라진 지점에서도 각각 연결된다. 도 4f는 두 개의 삽입된 전극에 연결된 원형 멤브레노필릭 영역이다. 도 4g는 두 개의 외부 전극에 인접하여 위치한 원형 멤브레노필릭 영역을 나타낸다. 도 4h는 한 개의 중앙 전극 및 여섯 개의 주변 전극을 갖는 원형 멤브레노필릭 영역을 나타낸다. 도 4i 쿼드러폴(quadrapole) 전극 배열로 위치한 원형 멤브레노필릭 영역을 나타낸다. 도 4j는 옥타폴(octapole) 전극 배열로 위치한 원형 멤브레노필릭 영역을 나타낸다. 도 4k는 둘 혹은 그 이상의 차원에서 분리를 일어나게 하는 전기장의 스위치(switch)를 위해 외부 전극이 어떻게 이용될 수 있는지를 나타낸다.
상기 전극은 칩 구조로 통합되거나 외부에 존재할 수 있고 집중되거나 균질한 장(field)을 형성하고 예를 들어 횡단시 특정 통로로의 단백질 이동에 직접(switch) 사용될 수 있다.
상기 칩은 또한 상이한 설계의 미세유체 채널과 결합할 수 있다. 상기 채널은 상기 기판과 통합되거나 멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 패턴을 각각 함유하는 기판에 결합된 분리된 층(다층 장치)의 일부일 수 있다. 상기 채널은 막 단백질 또는 지질 이중층막 또는 국부적(칩 또는 지질 필름 상의 특정 위치) 혹은 전체적으로(즉, 칩 전체 또는 단일 또는 복수 장치 내의 지질 필름 전체에 영향을 미침) 상기 이중층 막에 함유된 막 단백질을 포함하는 물질에 화학적 또는 물리학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 염색제 혹은 약 혹은 다른 작용제와 같은 다른 시약을 통제하기 위해 이용될 수 있다. 미세유체 채널은 또한 막-지질 또는 베시클의 이동에 의해 멤브레노필릭 영역에 막 필름을 만드는데 이용될 수 있다. 미세유체 칩의 일 설계가 도 5a에 나타나나 이에 제한되지 않는다. 본 칩은 세 개의 막-코팅된 통로로 연결된 두 지점으로 이루어진 오목한 멤브레노필릭 영역을 갖는다. 상기 두 개의 바깥쪽 통로, 및 상기 두 지점은 저장소에 차례로 연결된 미세유체 채널로 연결된다. 이 경우 상기 미세유체 운반은 압력(P)에 의해 조절된다. 일반적으로, 상기 채널은 다른 차원 및 기하학을 가질 수 있고 상기 칩에 통합되거나 외부에서 제공될 수 있다. 일 구현에서 상기 채널은 PDMS, PMMA, PC, 또는 다른 고무 혹은 플라스틱 물질에서 생산된다. 저장소가 있는 칩 또한 만들어질 수 있다. 상기 저장소는 미세유체 채널에 연결될 수 있거나 각각 시약, 약, 단백질 등의 저장 장치로 사용될 수 있다.
상술한 다른 기술 및 실시예의 자세한 설명, 및 상술한 특정한 특성에 의해 제공된 분리된 멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 영역을 갖는 패턴화된 기판은 침착(deposition)의 화학적 또는 물리학적 방법을 이용하여 베시클, 또는 다른 적절한 계면활성제 필름을 포함하는 적절한 이중층 필름으로 코팅될 것을 필요로 한다. 전형적으로, 상기 기판은 수용액 또는 생리학적 완충제와 같은 물-기초 용액에서 이용된다. 본 발명자들은 하기에서 상기 표면에 지질을 도입하거나 침착하기 위한 몇몇의 다른 기술을 검토할 것이다. 먼저 본 발명자들은 SU-8에 의해 둘러 쌓이고(도 6), 멤브레노필릭이 화학적 및/또는 물리학적 변형 또는 조작을 통해 만들어지는, 플라즈마-처리된 금 또는 Al2O3로 이루어진 두 개의 다른 패턴화된 모델 표면 위의 대두 다층라멜라 라이포좀의 상기 지질 퍼짐 특성을 설명한다. 도 6a는 시간에 대해, 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진, 플라즈마-처리된 금 표면 상의 대두기름 퍼짐을 나타내는 플롯이다. 상기 지질 지점의 초기 면적은 0.1 × 104 μm2이고, 4.8s 후 상기 지질 면적은 1.8 × 104 μm2을 차지한다. 상기 지질은 원래 다층라멜라 라이포좀으로서 표면 위에 침착된다. 도 6b는 현미경을 통해 보여지는 바와 같이, 화학적 및/또는 물리학적 수정 혹은 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진, 플라즈마-처리된 금 표면 상의 대두기름 퍼짐이다. 왼쪽 이미지에 대한 시점은 라이포좀(liposome)의 침착 후 t=0.4s이고 두 번째 이미지는 라이포좀 침착 후 t=5.2s를 나타낸다. 이러한 도면들은 도 6a에 나타난 그래프의 처음 및 마지막 지점에 대응한다. 도 6c에서는 시간에 대해 플라즈마-처리된 SU-8 표면 상의 대두기름 퍼짐을 나타내는 플롯이 나타난다. 상기 지점의 초기 면적은 327μm2이며, 13분 후 상기 지질 물질은 퍼짐을 보이지 않는다. 상기 지질 면적의 외견상 감소는 광표백(photobleaching) 효과에 기인한다. 상기 지질은 원래 다층라멜라 라이포좀으로 상기 표면에 침착된다. 도 6d는, 13분의 시간 간격으로 SU8-플라즈마-처리된 표면의 대두기름 라이포좀 퍼짐을 나타내는 형광 현미경 이미지이다. 이러한 도면은 도 6c의 처음(왼쪽 이미지) 및 마지막(오른쪽 이미지) 지점에 대응한다. 패턴화된 표면의 멤브레노필릭 영역에 지질 이중층 막 물질을 도입하고 침착하는 몇몇의 가능한 방법이 있다. 일 견지에서 지질 막 물질은 미세피펫 또는 다른 이동 수단을 이용하여 다층라멜라 또는 단일라멜라 베시클을 상기 멤브레노필릭 영역에 침착하여 상기 칩 기판에 제공될 수 있다. 상기 기판의 번역을 위해 예를 들어 자동화된 및 컴퓨터-조절된 스캐닝 단계와 같은 스캐닝(scanning) 단계가 이용될 수 있다. 상기 미세피펫의 작용은 또한 로봇을 이용하여 조절될 수 있다. 상기 과정은 도 7a에 약술되어있다. 예컨데 (Karlsson et al. Langmuir, 17, 6754-6758(2001))에 설명된 프로토콜에 의해 생산된 다층라멜라 라이포좀이 유리 미세피펫의 구멍에 부분적으로 또는 완전히 주입된다(예컨데 Scott et al. Langmuir, 19, 3904-3910(2003) 참조). 상기 미세피펫은 바람직하게는 고급 미세조작기(high-graduation micromanipulators)(Narishige MWH-3, Tokyo, Japan은 이러한 미세조작기의 일 예이나 이에 제한되지 않음)와 같은 마이크로포지셔너(micropositioner)에 의해 조절된다. 상기 다층라멜라 베시클은 그 후 상기 기판의 멤브레노필릭 영역과 접촉되게 된다. 상기 라이포좀이 상기 표면과 접촉하면서 부분적으로 혹은 완전히 지질막으로 코팅될 때까지 멤브레노포빅 영역 상에 퍼지기 시작한다. 지질 필름의 상기 특정 구조는 이용된 라이포좀의 특정한 유형에 의존하고 상이한 지질 조성을 갖는 단일 혹은 다층라멜라일 수 있다. 상기 지질 막은 상기 지질 침착 기술을 이용한 많은 경우에서 랭뮤어 블로젯(Langmuir Blodgett) 필름 같이 완벽한 이중층 막이 아닐 것이다. 다층라멜라 라이포좀으로부터 지질 필름의 서서히 움직임 및 퍼짐은 상기 막 물질이 멤브레노필릭 표면에 대해 갖는 높은 결합 친화력에 기인하며 이는 초기 구형 라이포좀 형태를 유지하게 위해 필요한 에너지를 초과한다. 대신, 다층라멜라 라이포좀은 도 7b에 개시된 광학 집게(optical tweezer)을 이용하여 멤브레노필릭 영역에 침착될 수 있다. 광학 집게는 수용액에서 다층라멜라 라이포좀을 잡아서 목표 영역으로 이동시킬 수 있다. 광학 집게는 또한 상기 베시클이 상기 주변 용액보다 높은 굴절률의 물질로 채워진 경우라면 단일라멜라 베시클도 잡는다.
멤브레노필릭 영역에 지질 막의 침착은 또한 표면에 걸쳐 지질 물질로 충전된 피펫의 번역에 의한 피펫-라이팅 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 상기 기술은 베시클-나노튜브 네트워크의 형성에 대한 Scott et al. Langmuir, 19, 3904-3910(2003)에 설명되어 있고, 다층 혹은 단일라멜라 라이포좀으로부터 지질 물질을 이동시키는데 이용될 수 있다. 상기 과정은 도 7c에 약술되어 있다. 상기와 같이 여기서 얻을 수 있는 적어도 세 개의 상이한 결과 구조의 예는 a)부유 관 구조를 갖는 베시클, b)표면-고정된 관 구조를 갖는 베시클, 및 c)이중층 막의 다른 유형이다. 상술한 방법은 바람직하게는 독특하게 코팅된 기판 위의 2-차원 지질 막 필름을 생산을 위해 이용되는 반면, 이들은 또한 상기 표면의 베시클-나노튜브 네트워크를 고정 및 지지하는데 이용될 수 있다. 이러한 네트워크 형성을 위한 방법은 알려져 있고 특정 표면 위의 특정한 지질 막의 지질의 서서히 움직임 또는 퍼짐 특성이 불충분하거나 또는 다른 이유로 불만족스러운 경우에 특히 성공적일 수 있다. 막 단백질의 확산이 나노튜브를 가로질러 관찰된 것은 특히 언급 할만 하다(Davidson et al. J. Am. Chem. Soc. 125, 374-378(2003)). 흡착이 매우 높은 상술한 나노튜브-베시클 네트워크로부터의 이중층 장치의 형성은 지질 이중층 필름이 덮힌 장치에 도달하는 매우 매력적인 또 다른 수단이다.
상기 기판의 멤브레노필릭 영역은 또한 도 7d에 개시된 바와 같은 작은 표면-흡착 베시클의 융합을 이용한 지질의 침착을 통해 지질 막 필름으로 덮힐 수 있다. 이러한 베시클은 예컨데 수용액에서 상기 기판에 첨가될 수 있다. 상기 기판 표면에 침전 후, 이들은 우선적으로 상기 패턴화된 멤브레노필릭 영역에 결합하고 이들이 터지게 될 정도로 매우 높은(표면 장력이 용해 장력보다 높은) 흡착 잠재력으로 고정된다. 잉여의 온전한 베시클은 씻겨진다.
지질 이중층 막의 침전은 또한 도 7e에 개시된 미세유체 채널에 의한 처리를 통해 획득될 수 있다. 예를 들어, 단일라멜라 및 다층라멜라 베시클은 미세유체 채널에 의해 독특하게 코팅된 기판에 의해 제시될 수 있다. 다층라멜라 및 단일라멜라 베시클 또한 독특하게 패턴화된 기판의 특정 위치로 유도될 수 있다.
또 다른 대안으로, 패턴화된 기판 상의 멤브레노필릭 영역의 지질 이중층 막 형성은 도 7g에 도식적으로 나타난 바와 같이 용해된 지질의 직접 주입에 의해 획득될 수 있다. 이 과정은 그 후 라이포좀의 형성을 위한 직접 주입 방법과 유사하다. 유기 용매 내의 부유 인지질이 수용액에서 간단히 기판으로 주입될 수 있다. 상기 방법으로 용액 내에 작은 그리고 큰 라이포좀이 형성될 수 있고 그에 따라 멤브레노필릭 영역에 부착하고 퍼진다. 대신, 상기 지질은 패턴회된 구조(SAM) 상에서 단층 구조로 조립될 수 있고, 후속적으로 지질의 두 번째 층이 형성되어 지질 이중층 막을 만든다. 온전한 베시클 또한 상기 표면에 부착될 수 있다.
도 8은 상이한 크기 및 특징을 갖는 멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 영역을 갖는 미세가공된 몇몇의 상이한 구조의 DIC 현미경 사진 및 형광 이미지를 나타낸다. 이러한 장치의 상기 구조적 특징은 연결 통로의 최적화된 기능적 크기 및 형태를 찾기 위해서 그리고 가공 프로토콜 해상도의 한계를 조사하기 위해 다양할 수 있다. 이러한 이미지에서, 상기 패턴은 금 표면 또는 Al2O3 표면 최상부의 SU8(현미경 사진에서 짙은 회색으로 나타남)로 이루어질 수 있고, 화학적 및/또는 물리학적 변형 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진다. 화학적 및/또는 물리학적 변형 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진, 상기 금 표면 및 상기 Al2O3 표면은 멤브레노필릭 표면을 나타내고 SU8은 멤브레노포빅 표면을 나탄낸다. 도 8a는 얇은 금 통로로 연결된 두 개의 구형 금 영역으로 이루어진 단순한 구조를 나타낸다. 연결 통로의 넓이는 0.5 내지 10 마이크로미터 사이에서 다양하다. 이 경우 상기 통로는 1 마이크로미터 넓이였다. 도 8a는 2 마이크로미터 넓이 통로를 갖는 도 8a에서와 유사한 패턴을 나타낸다. 이러한 이미지는 또한 기판 표면의 반복적인 패턴 간격에 의해 이러한 가공 방법의 상응하는 성능을 나타낸다. 도 8c는 하나의 기판 위에 많은 다른 미세가공된 패턴을 나타낸다. 이 경우, 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어지고, 1 내지 10 마이크로미터 사이의 다양한 간격으로 분리되며, 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진 상기 두 개의 원형 금 영역을 연결하는 두 개의 금 통로가 가공된다. 역시 상기 통로의 넓이는 다양할 수 있다. 이 특정 구조는 1 마이크로미터 넓이의 통로를 갖는다. 도 8d는 도 8c의 구조 중 하나의 확대도이다. 상기 도면은 상기 가공 프로토콜이 윤곽이 뚜렷한(well-define) 통로 및 높은 가로세로비(aspect ratio) 구조를 만들 능력이 있음을 나타낸다. 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진, Al2O3 표면 최상부의 SU-8 층의 두께에 대응하는 이러한 패턴의 깊이는 나노미터 내지 밀리미터 사이에서 변하지만 , 그 깊이는 전형적으로 1 마이크로미터이다. 도 8e는 굴곡 구조, 즉 상기 통로들이 90도의 회전을 갖고 그에 따라 두 세트의 평행한 선을 형성하는 구조를 나타낸다. 이러한 구조 유형은 전극 세트와 함께 이용될 수 있고 2 차원에서 전기영동 분리를 수행할 수 있도록 만든다. 도 8f는 e의 구조 중 하나의 확대도를 나타낸다. 도 8 g는 상이한 분지 또는 수렴 구조를 나타낸다. 도 8h는 화학적 및/또는 물리학적 변형 및 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진, 금 패턴에 한정된 지질의 범위(coverage)를 설명하는 형광 이미지이다. 상기 지질은 대두의 지질로부터 만들어진 다층라멜라 라이포좀의 침착에 의해 상기 표면에 침착된다. 다층라멜라 라이포좀은 탈수화/재수화 기술을 이용하여 제조되고 상기 퍼짐을 더욱 제어가능하도록 가시화하기 위해 형광 막 염료, DiO로 염색(dope)되었다. 도 8k는 화학적 및/또는 물리학적 조절 및 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진, 멤브레노필릭 Al2O3-코팅된 패턴(도면에서 밝은 회색으로 나타남) 및 SU-8 코팅된 멤브레노포빅 영역(도면에서 어두운 회색으로 나타남)을 갖는 칩을 나타낸다. 상기 Al2O3로 덮힌 원형 지점은 50 마이크로미터 직경이고, Al2O3의 연결 통로는 약 2 마이크로미터 두께 및 50 마이크로미터의 길이이다.
도 8l은 도 8k에 나타난 미세 가공된 구조 중 하나 위에, 화학적 및/또는 물리학적 조절 및 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진, Al2O3-코팅된 패턴에 한정된 지질의 범위(coverage)를 설명하는 형광 이미지를 나타낸다. 상기 지질 막은 퍼짐을 가시화하기 위해 형광 막 염료로 염색되었다. 이 사례에서, 상기 지질 커버리지(coverage)는 작은 단일라멜라 베시클(SUVs)의 서스펜션을 이용하여 수행되었다.
멤브레노필릭 영역 위에 이중층 막을 형성한 후, 침착 또는 막 매트릭스로 지질, 막 단백질(왜재성 및 막관통), 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-연결 단백질 또는 예컨데 비오틴-아비딘 상호작용 등에 의해 상기 이중층 막에 결합된 다른 단백질을 포함한 다양한 구성 요소의 도입이 몇몇의 다른 기술로 수행될 수 있다.
전기 주입(electroinjection)은 도 9a에 나타난 바와 같이 막-코팅된 표면에 인접한, 예컨데 지질 서스펜션, 라이포좀 표본(preparation) 등의 외부 공급원으로부터의 잉여 또는 과잉의 막 물질의 침전을 포함한다. 상기 잉여 막 물질은 운반 표지를 함유하고 도 9b에서 나타난 바와 같이 상기 두 막을 지나 하나 또는 몇몇의 전기적 펄스(pulse)의 후속적인 적용으로 막 코팅된 영역에 편입될 수 있다. 상기 전기적 시뮬레이션은 막 융합을 유발 및 유도하고 한편으로는 펄스 발생기에 양자 모두 연결된 탄소 섬유 전극 및 상기 마이크로피펫 내부에 위치하는 플래티늄 전선의 사용으로 만들어진다. 융합 후 상기 운반 표지는 상기 원형 지점 중 하나에 위치한다(도 9c).
다른 기술은 예를 들어 광학 집게 및 마이크로피펫 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 막-코딩된 영역 옆에 상기 운반 표지를 함유하는 잉여 막 물질의 침전을 포함한다(도 9d). 상기 두 막은 펄스 발생기에 연결된 두 탄소 섬유 전극을 이용하여 그 후 융합된다(도 9e). 이 기술은 전기융합(electrofusion)이라고 언급된다. 도 9a에서와 같이, 융합 후 상기 운반 표지는 구형 지점 중 하나에 위치한다(도 9Bc).
막 융합은 또한 광학 융합으로 나타내는, 전자기 방사(radiation)에 의해 유발되거나 유도될 수 있다. 이 경우 상기 두 개의 막 구획 사이의 접촉 부분은 상기 막을 불안정화 하고 융합을 유도하기 위해 도 9Ca-c에 나타난 바와 같이, 광(통상적으로 UV-광)에 조사된다.
유사하게, 도 9Da-c에 나타난 바와 같이, 상기 막의 융합은 디터전트(detergent), 칼슘 이온, 및 다른 2가 금속 이온과 같은 다양한 화학 작용제뿐만 아니라 폴리머, 니스타틴(nystatin)/에르고스테롤(ergosterol), 예컨데 양이온 지질 또는 미리스테이트(myristate)와 같이 특수화된 융합성(fusogenic) 지질 유사체, 및 막 융합을 유발하는 것으로 입증된 특정 펩티드의 첨가에 의해서도 촉진될 수 있다.
대신, 도 9Ea-c에 나타난 바와 같이, 지질의 퍼짐 또는 작은 베시클의 멤브레노필릭 표면에 대한 융합을 이용한 지질의 침전은 상기 지질 제조에서 운반 표지를 포함할 수 있고 그에 따라 패턴화된 표면에 걸쳐 운반 표지를 갖는 지질 표면을 만든다.
도 7Ea-e와 유사한 방식으로, 도 9 Fa-c에 나타난 바와 같이, 막 및 막 단백질과 같은 막-구성 요소 또한 미세유체 공학(microfluidics)의 이용으로 지질 매트릭스에 도입될 수 있다. 예를 들어 작은 융합성 베시클을 함유하는, 용액은 다른 구조 또는 같은 구조의 동일한 부분에 걸쳐 흘려질 수 있다. 막 단백질와 같은 막-구성 요소를 포함하는 상기 융합성 베시클은 미리 형성된 지질 이중층 매트릭스와 융합된다. 이에 따라, 예를 들어 막 단백질의 주입은 고도로 국부적일 수 있고 칩 표면의 특정 위치로 표적된다.
상기에서 논의한 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 지질 막 장치는 막 매트릭스에 박힌 막 단백질의 분리에 이용될 수 있다. 막에 포함된 막 단백질의 분리를 성취하기 위한 하나의 분명한 방법은 전기장을 이용하는 것이다. 상기 전기장은 막 단백질에 직접 영향을 미치거나 단백질과 결합한 특수화된 지질과 같은 상기 지질 매트릭스의 다른 구성 요소에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명자들은 막-결합 물질을 MAM's라 지칭하고, 이것은 막 단백질을 포함하는 어떠한 분자 또는 미립자 물질일 수 있다. 본 발명자들은 막 물질을 MM's라 지칭하고 이는 어떠한 지질 또는 액정 상일 수 있으며, 본 발명자들은 결합된 분자 또는 물질을 함유하는 막 패치(patch)를 MP라 지칭한다. 이론상으로, 막 물질에 함유된 종(species)의 전기영동적 이동은 그 종의 전하-대-마찰 저항 비의 작용이다. 따라서, MAM's, MP's 및 MM's 모두는 각각의 본질에 따른 순 전하 및 크기에 따라 개별적으로 또는 집단적으로 이동할 수 있다. 이는 하기에서 보다 상세하게 설명된다. 또한 상기 지질 구조가 관(tubular) 구조 또는 2-차원 시트인지 여부 및 이러한 시스템의 표면 전하에 의존한다면, 전기삼투적(electroendoomotic) 운반 또는 이동은 상이한 정도로 효율적일 수 있다. 따라서 전기적 이동 방법은 예를 들어 MM에 용해된 막 단백질 등의 차별적인 이동 속도를 부과하기 위해 이용될 수 있고 이동 시간의 분석으로부터 이러한 단백질을 분별 및 동정하는 방법으로서 이용될 수 있다. 특정 단백질의 상기 이동 속도는 예를 들어 MAM's의 크기, 전하 및 MAM의 지질 상호작용과 같은 몇몇 요소의 복합적 작용인 것을 명확히 해야한다.
그러나, 두 번째 경우에서, 막 단백질의 분리는 열적 요동(thermal fluctuation) 또는 확산에만 기초할 수 있다. 이것은 특히 상기 장치의 길이 스케일이 충분히 작아서 열적 이동에 의한 이동이 상대적으로 큰 경우에 효율적이다. 상이한 막 단백질은 단백질의 크기 및 주변 지질 이중층 매트릭스와의 상호작용 정도에 따라 다른 확산 속도를 갖는다. 예를 들어, 나노미터-내지-마이크로미터 크기의 방사형 팔을 갖는 지질-덮힌 장치가 확산에 기초한 MAM's의 분리에 이용될 수 있다. 도 10은 네 개의 방사형 통로로 연결된 단일의 통로로 이루어진 빗 구조 패턴 내의 DiO-표지된 지질 막 광표백-후-형광-회복(FRAP) 실험의 일 예를 나타낸다. 상기 통로의 넓이는 5 μm이고 방사 통로의 길이는 25 μm이다. 1 mol% DiO로 도핑된 작은 단일라멜라 대두 라이포좀 형태의 지질 침착 후, 상기 빗-구조의 통로는 수은 램프로부터 생산되고 필터를 통해 선택된 강한 여기 광(488nm)에 의해 표백된다. 광표백 후, 상기 회복의 속(snap shot)사가 저속도 촬영(time-lapse)의 일련의 사진으로 기록된다. 도 10의 각각의 도면 사이의 시간 간격은 4 분이다. 상기 도면은 DiO 분자가 지질 이중층 내에서 확산적으로 움직임에 따라 균형적이고 대칭적인 형광의 회복을 설명한다. 상기 패턴은 수 분 내에 형광으로 완전하게 재충전된다. 상이한 측방향 확산계수(lateral diffusion coefficient)를 갖는 몇몇의 다른 지질 막 결합 종이 이러한 빗-유사 구조 내의 지질 이중층 매트릭스에 존재하는 경우, 이러한 종의 분류가 실현될 수 있다. 분별될 상이한 종이 빗-유사 구조 한 편에 위치하는 경우, 상술한 기술 중 하나에 의해 보충되어, 이들은 상이한 속도로 상기 통로 속으로 확산될 것이며, 이에 따라 차례로 상기 상이한 통로를 빗 구조 속으로 한번에 하나씩 더욱 채운다. 이는 상기 막-결합 종을 분류시키는 결과를 가져오며, 가장 빠르게 확산하는 종이 방출된 원 지점으로부터 가장 멀리 떨어진 방사형 팔 중 하나에 위치하고, 그 다음 방사형 팔은 상기 두 개의 가장 빠른 종의 혼합물로 이루어질 수 있는 등이다. 순수하게 열운동 또는 측면확산에 기초한 이러한 상기 패턴화된 지질 막 내의 분류 메카니즘은 다른 방법으로는 서로 분리가 어려운 막 단백질을 정화하는 투박하지만 단순한 방법을 제공한다. 주목할만하게, 이러한 분류는 빗-구조의 설계로 수, 방사형 팔의 길이 및 넓이, 통로의 길이 및 넓이, 방사형 팔 사이의 분리 거리 등과 같은 매개변수의 변화에 의해 최적화되고 조정될 수 있다.
이러한 칩 구조에서 수행될 수 있는 다른 분리 메카니즘은 예컨데 미세유체공학을 이용하여 상기 지질 매트릭스에 걸쳐 유체의 흐름을 만드는데에 의존한다. 막-결합 종은 상기 지질 매트릭스에 걸쳐 흐르면서 그들의 구조 및 상기 이중층과의 상호작용에 의존하여 상이한 항력(drag force)을 겪는다. 만약 상기 지질 이중층 막 위의 상기 용액으로 튀어나와 노출된 큰 부분을 갖는 막 단백질의 경우, 유체 운동의 영향을 받을 것이고 따라서 유체역학 항력(hydrodynamic drag force), 또는 스톡스(Stokes) 항력을 격는다. 돌출 부분의 크기 및 형태, 상기 지질 상호작용 및 상기 유체 흐름 속도에 따라, 상이한 막-결합 종은 다른 항력을 격을 수 있고 따라서 지질 매트릭스에서 분리된다.
막-결합 종의 속도는 리간드, 항체, 또는 수정된 비드 등에 결합하는 경우 수정될 수 있다. 따라서, 상기 종은 예컨데 특정한 목표 분자에 결합시 이동 속도의 변화에 따라 동정/검출될 수 있다. 이용된 분리 방법의 유형(전기장/자기장, 확산, 흐름 등)에 따라 상기 속도는 증기 혹은 감소할 수 있다. 이러한 조사의 유형은 약물 후보들이 하나 또는 여러 다른 목표 분자를 함유하는 지질 막 장치에 걸쳐 흘려지고 동시에 그들의 속도 변화를 기록하는 약물 발견(drug discovery)의 적용에 적용될 수 있다. 속도에서의 변화는 따라서 상기 목표 분자와 상기 약물 후보 사이 결합의 증거이다.
예를 들어 전기장을 이용한 분리 원리와 동일한 원리를 이용하여 이러한 장치의 구조에 걸쳐 자기장을 유도하는 것도 가능하다. 자기 비드는 예컨데 목표 막 단백질에 대한 항체를 이용하여 관심 막 단백질과 연결될 수 있다. 이러한 자기 비드는 상업적으로 입수가능하고 다수의 막 단백질에 대한 특정 항체와 쉽게 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 지질 매트릭스 내부에 위치하는 막 단백질은 단순히 상기 용액을 예컨데 특정 항체로 변형된 상기 자기 비드를 함유하는 용액과 함께 상기 지질 장치에 구조에 흘려주어 자기 비드에 부착될 수 있다(도 11). 자기 비드가 상기 지질 이중층 내의 목표 막 단백질에 부착 후, 이중층 내의 나머지 막 단백질에 영향을 미치지 않고 상기 목표 단백질의 이동을 우발하기 위해 자기장이 상기 시스템에 결쳐 적용될 수 있다(도 11d). 이 방법은 상기 지질 매트릭스 내 상이한 단백질의 반복적인 추출 및 단편의 수집에 의한 몇몇 막 단백질의 분리를 위해 이용될 수 있다. 이 방법은 또한 풍부한 막 단백질의 추출에 이용될 수 있고 따라서 낮은 수로 존재하는 다른 막 단백질의 정화를 향상시키기 위한 추출이 용이하다.
동일하거나 다른 차원에서 동시에 또는 단계적으로 다른 분리 기술이 함께 이용될 수 있다. 이는 또한 어떤 유형의 분리가 사용될 것인지(확산-기초, 전기장-기초, 자기장-기초 등), 시료의 크기 및 어떤 유형의 시료인지(순수 추출물, 막 단편, 정화된 단백질 등)와 같은 요소와 함께 상기 장치 구조의 설계에 영향을 미친다. 일부 경우에 있어서, 분리는 일 차원에서 일어날 수 있고 상기 상이한 단편은 통로 또는 최초의 분리 통로로부터 반대편으로 분지된 삼각형으로 수집될 수 있다. 이것은 상기 첫 번째 분리와 동일한 분리 기술 또는 반대 방향의 다른 분리 기술 이용으로 수행될 수 있다. 분지 삼각형의 이용은 또한 분석에 앞서 단편을 작은 지점 또는 통로로 농축하기 위해 이용된다(도 12). 분리 기술의 결합의 예는 전기장과 유체 흐름을 동시에 사용하는 것이다. 전기영동 이론으로부터 전기삼투적 흐름(또는 전기장으로부터 만들어진 유체 흐름)이 일부 전하를 띤 종의 전기적 이동의 반대 방향으로 유도된다. 이 경우 막 내의 상이한 종은 다른 기술에 의해 다르게 영향을 받게 될 것이며 이것은 다르게 대전된 종의 보다 최적화된 분리를 이끌어낼 수 있다.
상기 칩은 또한 상기 칩의 다른 부분 또는 같은 구조의 다른 부분에 pH-구배와 같은 화학적 구배를 갖기 위해 완성될 수 있다. 일반적인 겔-기초 분리 방법은 흔히 예를 들어 1 차원에서의 전기장과 후속적으로 pH-구배와 결합한 2 차원에서의 분리와 같은 2 차원에서의 단백질의 분리에 의존한다. 상기 단백질이 등전점(pI)에서 일어나는 중성 전하(neutral charge)에 이르는 경우, 상기 단백질은 전기장에서의 이동을 멈춘다. 막 단백질의 한가지 문제는 등전점에서의 침전이다. 그러나, 지질 이중층의 보호된 소수성 내부에 놓여지는 경우, 이는 동등한 정도로 일어나지는 않을 것이다. 상기 칩 구조는 2-차원-겔 분리에 일반적으로 적용된 것과 동일한 원리를 이용하여 막 단백질의 분리를 촉진하기 위해 pH-구배와 결합될 수 있다. 이러한 pH-구배는 상기 칩 구조와 상기 지질 매트릭스 위에 pH-구배를 만들 수 있는 겔의 결합으로 만들어질 수 있다. 또한, 미세유체역학은 칩-구조의 일부를 다양한 pH의 다른 용액으로 흘려줄 수 있도록 칩-구조와 결합될 수 있다(도 13). 이러한 방식으로, 단백질은 전기장에서 상술한 바와 같이 등전점(pI)에서 일어날 수 있는 상기 단백질의 전하가 중성이 될 때까지 이동한다.
도 14는 상기 지질 매트릭스가 패턴화된 구조상에 형성된 후 시약, 항체 및 리간드 등의 첨가를 설명한다. 본 예에서, 상기 지질 매트릭스는 2 mol% 비오틴 X DHPE 지질로 도핑된, 대두로부터의 극성 지질 추출물로 이루어진다. 상기 지질 매트릭스는 상기 조성물의 압출된 지질 표본을 칩-구조에 30-60분간 첨가하여 형성되었다. 따라서 상기 지질 표본은 표면에 부착되고 상기 표면으로 퍼지는, 100nm 직경의 작은 단일라멜라 라이포좀(SUVs)으로 이루어진다. 상기 지질 매트릭스의 형성 후, 상기 잉여 지질 서스펜션은 흐름 세포를 라이포좀 표본과 동일한 완충제와 함께 3-5회 흘려주어 씻겨진다. 씻은 후, 베타-피코에리트린 용액(상기와 동일한 완충제 내 0.2 mg/ml)이 상기 칩-구조에 첨가되었고 30분 후 상기 잉여 베타-피코에리트린은 상기와 동일한 프로토콜을 이용하여 씻겨진다. 또한, 상기 흐름 세포는 짧은 시간 간격으로 2-3회 완전히 용액이 비워지고 SU8 표면에 비특이적으로 결합한 물질을 제거한다. 도 14는 상기 장치 구조 중 하나의 결과 형광 이미지를 나타내고, 따라서 리간드, 항체 및 다른 시약이 상기 지질 매트릭스가 형성된 후 추가될 수 있음을 설명한다. 이것은 예를 들어 다양한 막 단백질을 함유하는 지질 매트릭스의 다른 패치(patch)가 특정의 항체와 같은 시약으로 흘려져서 특정 목표 단백질을 찾을 수 있도록 하는, 마이크로어레이 프로토콜 등의 약물 스크리닝과 같은 적용에 특히 관심을 끈다. 또한, 이러한 유형의 접근은 특정 단백질이 발견될 수 있는 지점의 국지화를 위해, 지질 매트릭스 내의 막 단백질의 분리 후 후-표지화 과정(post-labeling procedure)으로 사용될 수 있다. 최종적으로, 상술한 바와 같이, 나아간 공정 및 예컨데 MALDI-TOF를 이용한 동정을 위해 막 단백질로부터 조각을 쪼개기 위한 특정한 소화제가 상기 지질 매트릭스 위 상기 용액에 첨가될 수 있다.
지질 이중층 네트워크 구조를 막-결합 종에 대한 분리 베드로 사용하는 것은 또한 다른 여러 분리 메카니즘을 야기할 수 있으며, 이는 분리를 유도하기 위해 함께 또는 개별적으로 수행된다. 이러한 유형의 네트워크는 라이포좀 유형(다층라멜라, 단일라멜라), 및 표면 상호작용의 특성 등에 의존하여 다양한 방법으로 생산될 수 있다. 막 단백질 같은 일부 막-결합 종은 이들이 우선적으로 평면 지질 이중층에 존재하는 방식으로 구부러지는 변화에 대하여 민감할 수 있다. 또한, 일부 막 단백질은 지질 뗏목(lipid raft)과 같은 특정한 지질 또는 지질 복합체에 대한 선호를 갖는다. 이러한 뗏목은 또한 다양한 막 굴곡 영역에 대한 다른 친화력을 나타낼 수 있다. 이를 통해, 막-결합 종을 네트워크 구조 내의 관 영역으로 추출하고, 따라서 관 영역에서 발견되며 고도의 막 굴곡 영역에 존재하지 않는 경향의 다른 종으로부터의 분리가 일어날 수 있다. 이러한 유형의 분리 전략은 또한 지질 네트워크 구조를 직접 살아 있는 세포에 연결하여 적용될 수 있다. 이러한 접금을 통한 막 단백질의 추출은 다양한 막 단백질을 세포막으로부터 구별하도록 이끌 수 있다.
지질 나노튜브를 통한 종의 이동은 미리 상이한 막 장력의 시스템에 걸친 지질 흐름을 설립하여 성취될 수 있다. 지질은 낮은 장력 영역에서 높은 장력 영역으로 흐른다. 막 단백질과 같은 막-결합 종은 상기 지질 나노튜브의 지질 매트릭스에서 지질 매트릭스와 다른 상호작용(내재성 또는 외재성 막 단백질) 및 크기(주변 용액으로부터의 다른 유체 항력) 등을 통해 분리될 수 있다. 지질의 흐름에서, 상기 지질 나노튜브 내의 막-결합된 종은 상기 지질 매트릭스 및 상기 주변 용액과 다른 항력을 격을 수 있고, 이는 이러한 종의 분리를 유도할 수 있다.
자연의 지질 매트릭스에 박힌 단백질을 상기 칩 위에 주입하는 것이 가능하므로, 서로 결합된 막 단백질 복합체를 분리하는 것이 가능하다. 이는 막 단백질 복합체의 기능성의 유지가 꼭 필요한 연구에 중요할 뿐만 아니라, 어떤 단백질들이 서로 결합되어 있는지 동정하는 것을 가능하게 한다. 이것은 예를 들어 분지 구조 또는 굴곡 특성의 구조 등에 의해 두-단계 분리를 수행하는 것을 가능하게 하는 구조를 설계하여 성취된다. 먼저, 상기 막 단백질 복합체는 일 단계 또는 일 차원의 단위로서 분리된다. 그 후, 상기 복합체는 환경에 노출되어 상기 복합체가 다른 단백질 서브유닛으로 분해되도록 한다. 상기 분해는 요소 처리에 의해 성취될 수 있다. 상기 칩은 미세유체 시스템 또는 흐름-세포 유형의 시스템과 통합될 수 있으며, 예를 들어 단백질 복합체의 분해가 가능하도록 요소를 첨가하기 위해, 상기 지질 이중층 막 주변의 외부 유체가 교환되도록 한다. 상기 용액은 그 후 원래 용액으로 다시 교환되거나, pH 또는 이온의 세기의 관점에서 화학적 환경이 바뀔 수 있으며, 그 결과 두 번째 차원의 분리가 단백질 복합체의 다른 서브유닛의 분리를 위해 수행될 수 있다. 또한, 다른 화학적 환경 또는 상기 분리 통로를 따라 구배를 갖는 다른 통로가 이러한 두 개 혹은 다수의 분리 단계에서 이용될 수 있다.
도 15는 MALDI-TOF(Matrix-Assisred Laser-Desorption-Ionization-Time-Of-Flight) 질량 분석기와 관련한 칩 구조의 통합 및 사용에 관한 도식적 도면이다. 이러한 구조는 마이크로미터 내지 밀리미터 범위로 크기가 가변적이며, 상기 구조는 상기 칩을 MALDI-TOF 질량분석기 탐지와 통합하는 경우, 평가 프로토콜, 시료의 크기, 시료 농도 및 검출 한계 등에 따라 큰 단일의 장치 또는 복합의 병행 장치로 구성될 수 있다. 도 15A는 단일의 장치를 나타내며, 여기서 막-결합 종(membrane-associated species)은 장치 구조의 상기 지질 이중층 매트릭스의 주입 위치로 한정된다. 예를 들어 전기장, 확산 등을 이용하여 이러한 종을 분리한 후, 상기 분리는 정지되고 다른 수단으로 "동결"되고 상기 구조가 MALDI-TOF에 의해 분석될 수 있다. 도 15B는 복합의 병행 장치를 나타내며, 이는 막-결합 종의 분리가 병행적으로 수행될 수 있는, 동일 또는 상이한 설계의 하나 또는 여러 개의 장치로 구성될 수 있다. 상기 병행 장치는 또한 MALDI-TOF를 이용한 검출에 앞서 낮은 존재비의 막-결합 종의 농축에 사용을 위해 결합될 수 있다. 상기 도식적 이미지는 여러 주입 위치를 설명하고 분리 후 상기 막-결합 종은 검출이 일어날 수 있는 하나의 위치로 농축될 수 있다. 도 15C에 설명되어 있는 보다 단순한 접근은 온전한 베시클 또는 지질 이중층 막의 상기 칩 구조에 대한 흡착을 포함하며, 이는 막 단백질과 같은 막-결합 종에 대한 매트릭스로서 작용한다. 상기 막 단백질은 도 9에 설명된 기술을 이용하여 상기 칩 위에 고정될 수 있다. 상기 지질 매트릭스 위의 용액을 몇몇의 소화 효소 또는 예를 들어 트립신과 같은 효소를 함유하는 용액으로 교환함으로써 상기 지질 이중층 매트릭스 밖으로 돌출된 막 단백질 부분과 상기 막 단백질의 친수성 부분은 펩티드 단편으로 쪼개질 수 있다. 상기 펩티드 단편은 그 후 수집되고 MALDI-TOF에 의해 조사될 수 있다. 이러한 유형의 프로토콜은 또한 미세유체 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 지질 매트릭스 내에서 분리를 수행한 후, 설계된 구조의 다른 부분이 미세유체 채널로부터의 집중된 흐름의 사용에 의해 소화제 용액으로 노출될 수 있고 상기 방출된 펩티드 단편은 각각 MALDI-TOF 질량분석기 검출을 위해 수집될 수 있다.
멤브레노필릭 또는 멤브레노포빅 표면의 기능, 및 상기 장치가 수행하는 적용의 유형에 따라, 상기 장치의 유형 및 외견 또한 달라질 수 있다. 도 16은 실(chamber), 채널 또는 저장소 각각으로 구성된 장치의 예를 나타내지만 이에 제한되지 않는다. MALDI-TOF 적용과 같은 일부 적용을 위해, 상기 장치는 실 내부의 모든 노출된 표면이 멤브레노필릭으로 변형되고, 손상되지 않는 베시클 또는 지지되는 지질 이중층의 형태로 지질을 흡수하는 실로 구성될 수 있다(도 16). 다른 적용에서, 상기 실 내부 표면은 또한 멤브레노포빅 영역에 묻힌 멤브레노필릭 구조로 구조화될 수 있다. 일부 적용에서는 최상부-뚜껑(top-lid) 또는 바닥 기판 둘 중 하나만이 멤브레sh필릭 및 멤브레노포빅 영역 모두로 구조화될 수 있으며, 반면 반대 표면은 멤브레노포빅 또는 멤브레노픽릭 특성 중 하나를 갖는 평범한 표면일 수 있다.
넓은 표면이 필요한 적용에서, 상기 표면-대-부피 비는 몇몇의 수정을 통해 증가될 수 있다. 상기 장치는 상기 표면적을 최적화하기 위해 채널 구조로 이루어질 수 있다(도 17). 이러한 채널 구조는 다양한 물질로 만들어질 수 있고 멤브레노필릭 표면으로 수정된다. 부피 및 표면적 요구에 따라 상기 채널 넓이는 마이크로미터에서 미터 사이에서 다양할 수 있고 상기 높이는 마이크로미터에서 미터까지 다양할 수 있다. 멤브레노필릭 및/또는 멤브레노포빅 특성으로 상기 표면을 수정하기에 앞서 상기 표면에 구조(채널, 기둥, 그로브(grove))를 만들기 위해 상기 채널 구조, 실 또는 저장소 내의 노출된 표면적 또한 미세가공 프로토콜에 의해 구조화될 수 있다. 표면적을 증가시키기 위해 멤브레노필릭 표면으로 수정된 입자들이 또한 상기 실, 저장소 또는 채널 구조에 첨가될 수 있다. 이러한 입자의 크기는 적용에 따라서 나노미터와 미터 사이에서 다양할 수 있다. 다른 적용에서 상기 장치에 첨가된 입자는 멤브레노필릭 표면으로 수정될 수도 있다.
대조군 시료와 함께 병행 또는 복합의 실험을 수행하는 경우에는 동일한 플랫폼 위에서 병행의 실험을 하는 것이 편리하다. 따라서, 실, 채널 구조로 이루어진 몇몇의 병행의 장치 또는 입자로 채워진 다른 장치 유형이 단일의 장치 구조로 통합될 수 있다(도 16 및 도 17).
상기 장치에 대한 적용은 입구 및 출구 채널을 통한 용액의 첨가 및 추출에 의존할 수 있다. 이러한 용액은 지질로 멤브레노필릭 표면을 코팅하기 위한 지질 표본, MALDI-TOF 통합에서와 같은 단백질 적용을 위한 지질/단백질 표본, 잉여 지질/단백질 표본의 제거를 위한 세척 용액, 표본의 단백질 또는 지질을 위한 염색 용액, 또는 단백질이 실, 채널 또는 저장소에서 소화되는 적용을 위한 소화 용액(예를들어 ,트립신, 펩티다아제, 프로테나아제 K와 같은 소화 효소를 함유)을 포함한다. 이러한 용액은 바람직하게는 입구 채널을 통해서 첨가된다(도 16 및 도 17). 이러한 용액 및 단백질이 소화된 펩티드 용액의 추출은 바람직하게 출구 채널을 통해 일어난다. 이러한 형태의 용액 첨가 또는 추출은 상기 실, 채널 구조 또는 저장소의 내부 또는 외부에 단일 또는 복수의 미세유체 채널을 포함하여 보조될 수 있다. 상기 막 단백질의 소화는 도 18에 나타난 바와 같이 두-단계 과정으로 일어날 수 있다. 첫 번째 단계에서, 상기 소화제는 상기 용액 밖으로 돌출된 막 단백질 부분만을 쪼갤 수 있고, 소수성 부분(막 단백질의 막 관통 부분)은 그대로 둔다. 막 단백질의 돌출 부분으로 형성된 상기 펩티트 단편은 나아간 가공 및/또는 검출/동정을 위해 수집된다. 상기 첫 번째 단계는 다른 농도의 소화제, 다른 소화 시간, 소화제의 다른 변형제, 또는 몇몇의 상이한 효소로 순차적으로 여러 번 반복될 수 있다. 두 번째 단계에서, 상기 소화제는 디터젼트(detergent), 유기 용매 또는 막을 분해하는 다른 화학 작용제와 함께 첨가된다. 상기 소화제는 나머지 막 단백질을 펩티드 단편으로 쪼갠다. 상기 지질 및 소수성 펩티드 단편은 첨가된 디터젼트에 의해 안정화된다. 막 단백질로부터 형성된 상기 펩티드 단편은 나아간 가공 및/또는 검출/동정을 위해 수집된다.
실시예 4의 도 19는 칩-위의 트립신 소화로 획득된 적혈구 막 단백질의 펩티드 단편의 질량분석 추적(MALDI-TOF MS)을 나타낸다. 상기 펩티드 단편은 상기 첫 번째 단계 과정에서 오며, 이들이 박혀있던 막 외부로 돌출된 부분에만 기원한다는 것을 나타낸다. 최고 강도의 피크가 선택되고 MALDI-TOF MS/MS 가 수행되어, 표 1에 나타난 펩티드 동정의 결과를 가져왔다.
상기 장치가 병행적으로 여러 실 또는 채널 구조를 가질 수 있기 때문에, 여러 다른 수행을 가능하게 한다. 상기 시료는 모든 실 또는 채널에서 동일할 수있고 시료에 수행되는 상기 처리 및 소화는 모든 병행적인 실 또는 채널에서 동일할 수 있다. 상기 시료는 또한 동일한 처리 및 소화 프로토콜을 유지한 채로 실과 채널 사이에서 상이할 수 있다. 또한, 상기 시료는 모든 실과 채널에서 동일할 수 있지만, 상기 처리와 소화 프로토콜은 상기 실과 채널 사이에서 다를 수 있다. 또한 동일한 장치에서, 상이한 실과 채널에서 다른 시료 및 다른 처리와 소화 프로토콜을 가질 수도 있다.
상기 지질 이중층에서 몇몇 유형의 능동수송이 수행되는 경우의 적용을 위해, 전기장 형성을 위한 전극의 통합이 필요하다. 이러한 전극은 입구/출구 채널을 통해 도입되거나 예를 들어 얇은 금속 필름의 침착을 통해 멤브레노필릭 표면 중 하나로 통합될 수 있다. 상기 전극은 플래티늄과 같은 몇몇의 전도성 금속으로 이루어질 수 있다. 능동수송은 또한 자기장에 의해 수행될 수 있고, 상기 지질 이중층 내의 목표 단백질에 자기 비드가 예컨데 항체 결합 등을 통해 부착되고 자기장 적용에 의해 상기 용액을 통해 끌어진다.
막 단백질의 분석 및 연구를 위한 기술과 프로토콜의 상술한 방법과 함께 장치가 이용되는 경우, 하기의 적용이 가능하다. 먼저, 단백질(바람직하게는 막 단백질)의 동정 및 특성화(characterisation)는 단백질 서열에서 가능한 많은 펩티드, 이에 대응하여 가능한 많은 아미노산 서열을 검출 및 동정하기 위해 최적화된 프로토콜을 포함하는 소위 서열 커버리지(coverage) 연구를 포함한다. 두 번째로, 번역-후 수정의 연구 또한 동일한 맥락에서 적용이 가능하다. 서 번째로, 다른 세포 시료의 막 단백질 매핑(mapping)-막 프로테옴 프로파일링(proteom profiling)이다. 넓은 범위의 존재 수준을 갖는 고도로 복잡한 시료가 소화 및 분석되었다. MS 분석에 앞서 생성된 펩티드가 일 차원(예를 들어, 역 상 HPLC) 또는 이 차원(예를 들어, 이온 교환 HPLC(SCX-강한 양이온 교환)과 후속적인 예컨데 역 상 HPLC)으로 분리된다. 이는 또한 낮은 존재비 단백질의 연구 및 새로운 약의 목표의 발견을 가능하게 한다. 네 번째로, 막 단백질의 기능성 연구-예로는 목표 낚기 및 예컨데 G-단백질 연결 수용체(GPCR) 디오르파니제이션(deorphanization)과 같은 수용체 디오르파니제이션이다. 목표 낚기의 경우, 그 목적은 리간드 결합 연구를 어떤 리간드가 어떤 단백질에 결합하는지 동정하기 위해 이용하는 것이다. 수용체 디오르파니제이션의 경우, 그 목적은 수용체의 기능과 가능한 그들의 리간드를 설명하는 것이다. 기능이 알려지지 않은 많은 수용체가 존재하며, 따라서 그들은 오르판(prphan) 수용체이다. 최종적으로, 질병에 걸린 상태 및/또는 약물 치료하는 동안 단백질 발현 수준의 업(up)-및-다운(down) 조절의 조사, 이른바 발현 프로파일링. 이러한 연구는 상이한 시료들의 비교 및 상기 시료 간의 차이점에 대한 평가를 수반한다.
다른 기술과 비교하여, 상술한 방법, 기술 및 프로토콜과 함께 이용한 상술한 장치로 획득한 향상된 자료 산출은 다양한 화학 작용 및/또는 세척 단계가 칩의 프로토콜의 최적화를 위해 수행될 수 있다는 사실에 기초한다. 이러한 단계는 또한 시료의 희석 없이 수행된다. 또한 막 단백질의 막 외부 및 막 관통 부분은 동일한 시료를 이용하여 다른 단계로 표적되고 수집될 수 있다. 이것은 또한 단일의 시료가 동일한 시료의 다양한 부분의 소화를 위해 순차적으로 및/또는 병행적으로 다른 효소의 대상이 될 수 있음을 의미한다. 순차적 소화 등과 함께 높은 표면-대-부피 비를 갖는 상기 칩의 체제는 최소의 시료 손실을 갖는 고농도의 생산된 펩티드를 유발하여, 높은 민감도를 가능케 한다. 이는 서열 커버리지 연구 및 시료 내 낮은 존재비의 막 단백질의 검출을 촉진한다. 또한, 세포의 다른 세포이하(subcellular) 단편이 칩 위해서 병행적으로 다루어질 수 있다. 최종적으로, 리간드 결합/가교/소화는 잠재적으로 목표 펩티드 결합 위치를 제공할 수 있다. 결합된 리간드가 있는 단백질 및 결합된 리간드가 없는 단백질은 효소적 소화 이후 다른 펩티드 지도를 산출할 것이며, 여기서 상기 리간드는 효소의 분해을 입체적으로 방해하거나 결합하는 동안 구조적인 변화를 준다.
나아가 상술한 방법, 기술 및 프로토콜과 함께 사용된 상기 칩 장치를 이용하는 일반적인 장점은 무엇보다 상기 시료가 표면에 한정되는 것이고, 이는 분석을 하는 동안 고정 매트릭스에 고정되고, 그에 따라 다양한 단계의 표지화(labelling), 화학적 수정, 소화 등이 가능하게 한다. 상기 칩 장치는 MS, 형광, 전기화학, SPR, QCM, 등을 포함하는 검출 기술 온(on)-및-오프(off) 칩의 축적과 관련하여 사용할 수 있는 역량이 있다. 또한, 상기 칩을 현존하는 칩-기초 플랫폼(platform) 및 전통적인 분석 도구와 통합할 수 있는 가능성도 있다. 최종적으로, 상기 시료의 취급은 자동화에 용이하다.
유사한 성과에서, 상술한 방법, 기술 및 프로토콜과 관련하여 사용된 장치 내의 지질 매트릭스의 사용의 장점은 막 단백질과 같은 막 결합 화합물이 그들의 본래의 지질 이중층 환경에 유지되는 것이다. 이것은 막에 결합된 구성분의 구조와 가능이 보존되는 것을 의미한다. 단백질과 같은 막에 결합된 구성분을 함유하는 막 베시클의 제조, 수송, 침착 및 가공은 세제의 사용을 요구하지 않는다. 세제는 단백질 변성(denaturing)과 같은 유해한 효과를 가질 수 있기 때문에 이는 하나의 장점이다.
도 20은 상기 칩 장치의 특징 및 그 기능의 일부에 대한 일반적인 설명을 나타낸다. 상기 칩은 다수의 원료(세포 막, 세포이하 막 단편, 프로테오라이포좀 등)에서 막 물질을 포획하는 방법을 제공한다. 사기 칩 체제는 분석 및 연구될 시료의 가공 및 처리 과정 중 상기 칩으로부터 유체 및 물질을 추가 및 추출하는 방법을 제공한다. 이는 칩 구조 위 어디에나 존재하는 유체 포트를 통해서 수행될 수 있다.
상기 도면은 또한 펩티드가 쪼개질 수 있고 일부 단계에서 칩으로부터 방출되며 그에 따라 다른 프로토콜 및 프로테아제를 순차적으로 이용하여 단백질의 다른 구조를 목표로하는 점에서 상기 칩 장치가 어떻게 작용하는지를 설명한다. 첫 번째 단계는 예를 들어 막외부(수용성) 부분을 목표하고 특히 이 부분의 분석을 위한 펩티드를 만들 수 있다. 후속적인 단계는 그 후 상이한 프로토콜과 상이한 프로테아제를 이용하여 막 관통 부분을 목표할 수 있다. 소화에 의해 생산된 상기 펩티드는 이차 단편으로 수집될 수 있고 분석된다.
이러한 형태의 접근은 일반적으로 예컨데 서열 커버리지 연구 및 막 단백질 분석의 이용에 있어서 유리하다.
상술한 바와 같이 다수의 상이한 프로토콜이 서열 커버리지 연구를 위해 수행될 수 있다. 도 21은 상이한 프로테아제를 이용한 순차적인 소화의 개념을 나타낸다.
도 21에서 그림으로 설명된 바와 같이 단백질의 소화는 하나 또는 여러 다른 프로테아제에 의해 순차적으로 이루어진다. 첫 번째 소화 후, 펩티드는 분석을 위해 수집될 수 있다. 상기 후속적인 소화 단계는 상이한 프로토콜 및 상이한 프로테아제를 이용한 몇몇의 다른 방식으로 이루어질 수 있다. 두 번째 단계는 예를 들어 도 21에 따라 이루어질 수 있으며, 여기서 상기 막은 프로테아제 2, 3, 4, 5 중 어떠한 것을 이용하여 분해 및 소화되거나 또는 손상되지 않은 채로 남겨지고 상기 단백질은 프로테아제 2, 3, 4, 5 중 어떠한 것을 이용하여 소화된다. 어떠한 순서로 프로테아제(1-5)의 어떠한 결합이 목표 단백질의 순차적 소화를 수행하기 위해 수행될 수 있다. 또한, 상기 다른 농도의 동일한 프로테아제가 순차적으로 이용될 수도 있다. 시간 또는 온도 같은 다른 요소를 수정 또는 변경하여 연속적인 소화를 수행하는 것도 가능하다. 소화 전 또는 후의 단백질 또는 펩티드는 화학적 또는 효소적 수정 단계에 노출될 수 있다. 이의 예는 이황화 결합의 환원 및 알킬화, 글리코실화(glicosylation) 위치 올리고당의 효소적 소화/제거, 인산화 위치의 조사 등이며, 여기서 이른바 번역-후 수정(post-translational modification)이 연구된다.
도면의 설명
하기의 참고 사항은 하기를 묘사하는 도면에 대해 만들어졌다.
도 1은 지지 및 부유 이중층 평면 및 고립된 막 형성을 위한 칩-구조의 도식적 도면이다.
a) 구조를 갖지 않는 멤브레노필릭(membranephilico) 표면의 일 실시예이다. 여기서 상기 멤브레노필릭 범위, 및 그 후의 이미지가 래스터된(rastered) 연출로 묘사되었다.
b) 멤브레노필릭 표면에 부착된 베시클(vesicle)(구형 지질막 구조)이 도 1a에 나타난다.
c) 멤브레노필릭 표면을 덮는 평면 지지 막이 도 1a에 나타난다.
d) 단일의 통로가 고립된 두 부분을 연결하는 멤브레노필릭/멤브레노포빅 도메인을 갖는 평면 표면의 일 예이다. 통로 및 고립 부분은 동일하거나 상이한 물질로 구성될 수 있고 상이한 크기일 수 있다.
e) 세 개의 통로가 고립된 두 부분을 연결하는 멤브레노포빅/멤브레노포빅 도메인을 갖는 평면 표면의 일 예이다.
f) 멤브레노필릭 표면을 덮지만 멤브레노포빅 표면은 덮지 않는 평면 지지 막이 도 1d에 도시된다.
g) 멤브레노필릭 표면을 덮지만 멤브레노포빅 표면은 덮지 않는 평면 지지 막이 도 1e에 도시된다.
h) 멤브레노필릭/멤브레노포빅 도메인을 갖고 상기 멤브레노필릭 도메인이 웰(well)에 위치하고 단일의 통로로 연결된 두 개의 오목한 고립 부분으로 구성된 표면 토포그래피(topography)를 갖는 표면의 일 예이다.
i) 멤브레노필릭/멤브레노포빅 도메인을 갖고 상기 멤브레노필릭 도메인이 웰(well)에 위치하고 세 개의 통로로 연결된 두 개의 오목한 고립 부분으로 구성된 표면 토포그래피(topography)를 갖는 표면의 일 예이다.
j) 멤브레노필릭 표면을 덮지만 멤브레노포빅 표면은 덮지 않는 평면 지지 막이 도 1h에 도시된다.
k) 멤브레노필릭 표면을 덮지만 멤브레노포빅 표면은 덮지 않는 평면 지지 막이 도 1i에 도시된다.
l) 멤브레노필릭/멤브레노포빅 도메인을 갖고 상기 멤브레노필릭 도메인이 표면 토포그래피(topography)가 높은 구조의 최상부에 위치하는 표면의 일 예이다.이러한 독특한 예에서 두 개의 높은 원형 기둥이 단일의 통로로 연결된다.
m) 멤브레노필릭/멤브레노포빅 도메인을 갖고 상기 멤브레노필릭 도메인의 표면 토포그래피(topography)가 높은 구조의 최상부에 위치하는 표면의 일 예이다. 이러한 독특한 예에서 두 개의 높은 원형 기둥이 세 개의 통로로 연결된다.
n) 멤브레노필릭 표면을 덮지만 멤브레노포빅 표면은 덮지 않는 평면 지지 막이 도 1l에 도시된다.
o) 멤브레노필릭 표면을 덮지만 멤브레노포빅 표면은 덮지 않는 평면 지지 막이 도 1m에 도시된다. 부유 평면 막이 상기 세 개의 통로 사이에 맞물려있다.
p) 표면의 부유 관(tubular) 막 구조이다. 표면-고정 나노튜브를 갖는 나노 튜브-베시클 네트워크이다.
a. 두 지점이 하나의 통로로 연결된 도식적 외관이다. 상기 멤브레노필릭 표면은 상기 표면의 나머지와 더불어 평면 내에 있다.
b. 베시클-나노튜브 네트워크가 상기 멤브레노필릭 표면에 부착되어 있다. 본 도면은 연결 통로 상의 표면-부착된 나노튜브를 나타낸다.
c. 두 지점이 하나의 통로로 연결된 도식적 외관이다. 상기 멤브레노필릭 표면은 상기 표면의 나머지 평면 아래에 있다.
d. 베시클-나노튜브 네트워크가 상기 멤브레노필릭 표면에 부착되어 있다. 본 도면은 연결 통로 상의 표면-부착된 나노튜브를 나타낸다.
e. 두 지점이 하나의 통로로 연결된 도식적 외관이다. 상기 멤브레노필릭 표면은 상기 표면의 나머지 평면 위에 있다.
f. 베시클-나노튜브 네트워크가 상기 멤브레노필릭 표면에 부착되어 있다. 본 도면은 연결 통로 상의 표면-부착된 나노튜브를 나타낸다.
도 2. 멤브레노포빅 및 멤브레노포빅 영역을 갖는 삼차원적 그레이-스케일(gray scale) 기판을 포함하지만 이에 제한되지 않는 기판의 다른 열 개의 예시이다.
a) 멤브레노포빅 기판 상의 멤브레노필릭 굴곡-가장자리형(meander-border) 패턴이다.
b) 2a의 표면이 이중층 막으로 덮혀있다.
c) 멤브레노포빅 기판 상의 멤브레노필릭 사형(serpentine) 패턴이다.
d) 2c의 표면이 이중층 막으로 덮혀있다.
e) 3차원적 멤브레노포빅 피라미드-형 기판의 상부 표면 상의 멤브레노필릭 패턴이다.
f) 2e의 표면이 이중층 막으로 덮혀있다.
g) 3차원적 멤브레노포빅 계단식-피라미드-형 기판의 상부 표면 상의 멤브레노필릭 패턴이다.
h) 2g의 표면이 이중층 막으로 덮혀있다.
i) 3차원적 멤브레노포빅 사-형 기판의 상부 표면 상의 멤브레노필릭 패턴이다.
j) 2i의 표면이 이중층 막으로 덮혀있다.
k) 멤브레노포빅 기판 상의 멤브레노필릭 나선(circular serpentine) 미로 형 패턴이다.
l) 2k의 표면이 이중층 막으로 덮혀있다.
m)멤브레노포빅 기판 상의 멤브레노필릭 사각 나선(square-shaped serpentine) 미로 형 패턴이다.
n) 2e의 표면이 이중층 막으로 덮혀있다.
도 3. 다른 복합 및 평행 장치
a) 멤브레노포빅 기판 상의 단일의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역으로 이루어진 열여섯 개의 동일한 멤브레노필릭 패턴의 배열을 나타낸다. 여기서 멤브레노필릭 영역은 검정색으로 그려진다.
b) 멤브레노포빅 기판 상의 세 개의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역으로 이루어진 열여섯 개의 동일한 멤브레노필릭 패턴의 배열을 나타낸다.
c) 멤브레노포빅 기판 상의 사형 패턴으로 배열된 단일의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역으로 이루어진 열여섯 개의 동일한 멤브레노필릭 패턴의 배열을 나타낸다.
d) 멤브레노포빅 기판 상의 미로 패턴으로 배열된 단일의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역으로 이루어진 열여섯 개의 동일한 멤브레노필릭 패턴의 배열을 나타낸다.
e) 멤브레노포빅 기판 상의 ⅰ) 사형 패턴으로 배열된 단일의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역 ⅱ) 세 개의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역으로 이루어진 두 개의 상이한 유형의 열여섯 개 멤브레노필릭 패턴의 배열을 나타낸다.
f) 멤브레노포빅 기판 상의 ⅰ) 미로형 패턴으로 배열된 단일의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역 ⅱ) 세 개의 통로로 연결된 두 개의 구형 지역으로 이루어진 두 개의 상이한 유형의 열여섯 개 멤브레노필릭 패턴의 배열을 나타낸다.
도 4. 지질 이중층막 및 추가 구조의 적재를 위한 형태를 갖는 다른 마이크로 칩의 예이다.
a) 구형 미로 패턴으로 배열된 단일의 통로로 연결된 두 지점으로 이루어진 여섯 개의 동일한 멤브레노필릭 영역을 갖는 칩이다. 전기장 적용을 위해 전극이 상기 두 지점에 연결된다.
b) 세 개의 통로로 연결된 두 지점으로 이루어진 여섯 개의 동일한 멤브레노 필릭 영역을 갖는 칩이다. 전기장 적용을 위해 전극이 상기 두 지점에 연결된다.
c) 일곱 개의 통로로 연결된 두 지점으로 이루어진 여섯 개의 동일한 멤브레노필릭 영역을 갖는 칩이다. 전기장 적용을 위해 전극이 상기 두 지점에 연결된다.
d) 두 갈래로 갈라진 네트워크 통로로 연결된 두 지점으로 이루어진 멤브레노필릭 영역을 갖는 하나의 패턴을 가진 칩. 전기장 적용을 위해 전극이 외부에서 상기 두 지점에 연결된다. 작은 검정색 원형 점으로 묘사된 전극은 또한 전기장 적용을 위해 상기 네트워크의 두 갈래로 갈라진 지점에서도 각각 연결된다.
e) 두 갈래로 갈라진 네트워크 통로로 연결된 두 지점으로 이루어진 멤브레노필릭 영역을 갖는 하나의 패턴을 가진 칩. 전기장 적용을 위해 전극이 외부에서 상기 두 지점에 연결된다. 작은 검정색 원형 점으로 묘사된 전극은 또한 전기장 적용을 위해 상기 네트워크의 두 갈래로 갈라진 지점에서도 각각 연결된다.
f) 두 개의 삽입된 전극에 연결된 원형 멤브레노필릭 영역.
g) 두 개의 외부 전극에 인접하여 위치한 원형 멤브레노필릭 영역.
h) 한 개의 중앙 전극 및 여섯 개의 주변 전극을 갖는 원형 멤브레노필릭 영역.
i) 쿼드러폴(quadrapole) 전극 배열로 위치한 원형 멤브레노필릭 영역.
j) 옥타폴(octapole) 전극 배열로 위치한 원형 멤브레노필릭 영역.
k) 네 개의 외부 전극 및 미로의 시작 및 종료 지점 각각에 연결된 두 개의 추가적인 전극을 갖는 멤브레노필릭 미로 패턴.
도 5. 지질 이중층막 및 추가 구조의 적재를 위한 형태를 갖는 다른 마이크 로 칩의 예이다.
a) 세 개의 통로로 연결된 두 지점으로 이루어진 오목한 멤브레노필릭 영역을 가진 칩. 상기 두 개의 바깥쪽 통로, 및 상기 두 지점은 저장소에 차례로 연결된 미세유체 채널로 열결된다. 이 경우 상기 미세 유체 운반은 압력(P)에 의해 조절된다.
도 6. 다른 순수 기판 상 지질의 퍼짐(spreading)
a) 시간에 대한 화학적 및/또는 물리학적 수정 혹은 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진, 플라즈마-처리된 금 표면 상의 대두 기름 퍼짐을 나타내는 플롯이다.
b) 현미경을 통해 보여지는 바와 같이 화학적 및/또는 물리학적 수정 혹은 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진, 플라즈마-처리된 금 표면 상의 대두기름 퍼짐이다. 왼쪽 이미지에 대한 시점은 라이포좀(liposome)의 침착 후 t=0.4s이고 두 번째 이미지는 라이포좀 침착 후 t=5.2s를 나타낸다. 이러한 도면들은 도 6a에 나타난 그래프의 처음 및 마지막 지점에 대응한다.
c) 시간에 대해 플라즈마-처리된 SU-8 표면 상의 대두 기름 퍼짐을 나타내는 플롯이다. 상기 지점의 초기 면적은 327μm2이며, 13분 후 상기 지질 물질은 퍼짐을 보이지 않는다. 상기 지질 면적의 외견상 감소는 광표백(photobleaching) 효과에 기인한다. 상기 지질은 원래 다층라멜라 라이포좀으로 상기 표면에 침착된다.
d) 13분의 시간 간격으로 플라즈마-처리된 SU-8 표면 상의 대두기름 퍼짐의 형광 현미경 이미지를 나타낸다. 이러한 도면은 도 6c의 처음(왼쪽 이미지) 및 마지막(오른쪽 이미지) 지점에 대응한다.
도 7. 상기 장치에 지질을 침착시키기 위한 다른 기술 및 상기 지질 구조가 어떻게 형성되는지를 나타내는 도식.
A) 마이크로 피펫을 이용한 다층라멜라 베시클의 침착
a) 멤브레노필릭 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 칩 구조를 나타내는 도면
b)마이크로매니퓰레이터-조절된 마이크로피펫(micromanipulator-controlled micropipette)을 사용하여 다층라멜라 베시클이 표면으로 옮겨진다. 상기 베시클을 낮은 음(흡입)압을 적용하여 상기 마이크로피펫의 끝으로 잡는다. 마이크로피펫에 작은 양압을 적용하여 상기 베시클이 상기 멤브레노필릭 표면 상으로 배출되고 상기 베시클은 그에 따라 멤브레노필릭 표면에 부착된다.
c) 상기 다층 베시클이 멤브레노필릭 표면 상으로 퍼진다. 상기 설계된 구조의 멤브레노필릭 표면은 최종적으로 지질 이중충 매트릭스에 의해 완전히 덮혀진다.
B) 광학집게(optical tweezer)를 이용한 다층라멜라 베시클의 침착
a) 멤브레노필릭 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 상기 칩 구조를 나타내는 도면이다. 고-강도 광(high-intensity light)의 집중된 빔(beam)에 의해 잡힌 다층라멜라 베시클 또한 나타낸다. 상기 고-강도 집중된 광은 집게의 광학적 쌍(optical pair)으로 작용하고, 주변 용액과 다른 굴절률을 갖는 물질을 가둔다.
b) 집게의 광학적 쌍의 초점은 다층라멜라 베시클을 멤브레노필릭 표면 상에 위치시키기 위해 이동된다. 상기 광이 꺼지고, 다층라멜라 베시클을 방출한다.
c) 상기 다층라멜라 베시클은 멤브레노필릭 표면 상으로 퍼진다. 상기 설계된 구조의 멤브레노필릭 표면은 최종적으로 지질 이중층 매트릭스에 의해 완전히 덮힌다.
C) 표면에 걸쳐 지질 물질로 충전된 피펫의 이동에 의한 피펫-라이팅 기술을 이용한 지질의 침착
a) 멤브레노필릭 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 칩 구조를 나타내는 도면
b) 마이크로매니퓰레이터-조절된 마이크로피펫이 지질 물질로 충전되고 표면으로 이동된다. 상기 지질 물질의 일부는 낮은 양압을 적용하여 피펫의 끝에서 방출된다. 상기 지질 물질의 일부(예를 들어 단층- 또는 다층라멜라 베시클)는 그 후 멤브레노필릭 표면에 부착되게 되며, 그에 따라 상기 마이크로피펫이 제거되고, 지질 물질의 일부를 표면에 남긴다. 상기 마이크로피펫의 끝은 그 후 멤브레노필릭 패턴의 다른 설계된 구조로 옮겨진다.
c) 상기 다층라멜라 베시클은 멤브레노필릭 표면 상으로 퍼진다. 상기 설계된 구조의 멤브레노필릭 표면은 최종적으로 지질 이중층 매트릭스에 의해 완전히 덮혀진다.
D) 작은 베시클의 융합을 이용한 지질의 침착
a) 멤브레노필릭 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 칩 구조를 나타내 는 도면
b) 작은 베시클(단일- 또는 다층라멜라)을 함유하는 용액이 칩의 위에 있는 용액에 위치된다. 상기 작은 베시클은 상기 표면에 안착되고 상기 멤브리노필릭 표면에 부착된다. 지질 농도, 지질 조성물, pH, 이온의 세기, 완충 조성물과 같은 화학적 요소 및 온도와 멤브레노필릭 표면의 조성물 같은 물리학적 요소에 의하여, 상기 베시클은 멤브레노필릭의 표면 상에 그대로 머물거나 자발적으로 연속적인 지질 이중층 구조를 형성할 수 있다. 다른 세척 프로토콜 또한 표면-부착된 베시클을 연속적인 지질 이중층 막으로 변환시키는데 이용될 수 있다.
c) 설계된 구조의 상기 멤브레노필릭 표면은 최종적으로 지질 이중층 매트릭스에 의해 완전히 덮힐 수 있다.
E) 미세유체 채널을 통한 지질 이중층 막의 침착
a)멤브레노필릭 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 칩 구조를 나타내는 도면이다. 상기 칩은 또한 미세유체 채널과 통합될 수 있고, 채널의 흐름이 상기 칩의 일부, 또는 설계된 각각의 멤브레노필릭 구조의 일부로 고도로 집중될 수 있다.
b) 작은 베시클(단일- 또는 다층라멜라)을 포함하는 용액이 미세유체 채널의 사용을 통해 설계된 멤브레노필릭 구조의 일부를 지나 흘려진다. 상기 작은 베시클은 상기 표면에 안착되어 멤브레노포빅 표면에 부착되며 베시클로 남아있거나 도 7Db에서 설명된 바와 같은 연속적인 지질 이중층 막을 형성하기 위해 조작될 수 있다. 상기 미세유체 채널 구조와 관련하여 세척 프로토콜이 이용될 수 있다.
c) 설계된 구조의 멤브레노필릭 표면의 일부가 최종적으로 지질 이중층 매트릭스에 의해 완전히 덮혀진다.
d) 다른 유형의 작은 베시클(단일- 또는 다층라멜라)을 포함하는 다른 용액이 미세유체 채널의 사용을 통해 설계된 멤브레노필릭 구조의 다른 일부를 지나 흘려진다. 상기 작은 베시클은 상기 표면에 안착되어 멤브레노포빅 표면에 부착되며 베시클로 남아있거나 도 7Db에서 설명된 바와 같은 연속적인 지질 이중층 막을 형성하기 위해 조작될 수 있다. 상기 미세유체 채널 구조와 관련하여 세척 프로토콜이 이용될 수 있다.
e) 설계된 구조의 멤브레노필릭 표면의 다른 일부가 최종적으로 지질 이중층 매트릭스에 의해 완전히 덮혀진다. 이는 다른 구조들 또는 단일 구조 내의 상기 설계된 멤브레노필릭 표면 상에 이질성(heterogenous) 지질 매트릭스가 형성되도록 한다.
F) 용해된 지질의 직접 주입에 의한 지질 이중층막의 형성
a)멤브레노필릭 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 칩 구조를 나타내는 도면.
b) 적절한 용매를 이용하여 지질이 상기 용액에 주입된다. 상기 지질은 자발적으로 작은 베시클(단일- 또는 다층라멜라)로 만들어질 수 있다.
c) 상기 작은 베시클은 상기 표면에 안착하고 멤브레노필릭의 표면에 부착하며 베시클로 남거나 도 7D에서 설명된 바와 같이 자발적으로 지질 이중층 막을 형성하도록 조작될 수 있다.
d) 상기 설계된 구조의 멤브레노필릭 표면은 최종적으로 지질 이중층 매트릭스에 의해 완전히 덮힌다.
G) 나노튜브-베시클 네트워크로부터 이중층 장치의 형성
a) 멤브레노필릭 및 주변 멤브레노포빅 영역을 포함하는 칩 구조가 나타난 도면.
b) 막 물질로 충전된 마이크로피펫이 표면 가까이에 배치되고 예를 들어 하나의 점과 같은 작은 일회 분량이 멤브레노필릭 영역 상에 방출된다.
c) 상기 막 물질이 상기 표면 상에 퍼지지만 지질 나노튜브에 의해 마이크로피펫 내의 물질에 여전히 연결된다.
d) 새로운 일회 분량의 막 물질이 멤브레노필릭 위치에 방출된다.
e) 상기 막 물질은 멤브레노필릭 표면 상에 퍼지고 두 막 부분을 연결하는 상기 지질 나노튜브는 기저 멤브레노필릭 통로에 부착된다.
도 8. 멤브레노필릭(화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 멤브레노필릭을 만드는, 플라즈마-처리된 금 또는 플라즈마-처리된 Al2O3 표면) 및 멤브레노포빅 영역(플라즈마-처리된 SU-8 표면)을 포함하는 차별적인 다른 특성을 갖는 다른 크기 및 특징의 미세가공된(microfabricated) 칩 구조의 현미경 사진
a) 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 만든 멤브레노필릭 플라즈마-처리된 금 패턴(도면에서 밝은 회색으로 나타남) 및 플라즈마-처리된 SU-8 멤브레노포빅 영역(도면에서 어두운 회색으로 나타남)을 갖는 칩. 상기 금으로 덮혀진 구형 지점은 직경이 15 마이크로미터이고, 금의 상기 상호접속 통로는 약 1 마이크로미터 두께이며 75 마이크로미터의 길이이다.
b) 도 8a와 동일한 유형의 구조이지만, 2 마이크로미터 넓이의 통로를 갖느다.
c) 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 만든 멤브레노필릭 플라즈마-처리된 금 패턴(도면에서 밝은 회색으로 나타남) 및 플라즈마-처리된 SU-8 멤브레노포빅 영역(도면에서 어두운 회색으로 나타남)을 갖는 칩. 패턴의 다른 예는 직경이 15 마이크로미터인 원형 지점, 통로 사이에 다양한 간격을 갖는 두 개의 통로에 의한 상호접속을 포함한다.
d) c)의 구조 중 하나의 확대도. 상기 통로는 약 1 마이크로미터 넓이이고 서로 2 마이크로미터의 간격으로 분리되어있다.
e) 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 만든 멤브레노필릭 플라즈마-처리된 금 패턴(도면에서 밝은 회색으로 나타남) 및 플라즈마-처리된 SU-8 멤브레노포빅 영역(도면에서 어두운 회색으로 나타남)을 갖는 칩. 90도의 회전을 갖는 굴곡 구조의 예이다. 이 경우 통로의 넓이는 2 마이크로미터이다.
f) e의 구조 중 하나가 확대된 장면을 나타낸다.
g) 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만든 플라즈마-처리된 금 패턴(도면에서 밝은 회색으로 나타남) 및 플라즈마-처리된 SU-8 멤브레노포빅 영역(도면에서 어두운 회색으로 나타남)을 갖는 칩. 2 마이크로미터 넓이의 통로를 갖는 분지 또는 수렴 구조. 이러한 구조는 예를 들어 다른 통로를 따라 이동하는 물질의 농축 또는 희석을 위해 사용될 수 있다. 시료를 농축하는 경우, 상기 시료의 투입은 원형 지점에서 이루어지고 다른 지점에서 이동된 상기 시료는 그 후 각각의 분지에서 합쳐질 수 있다.
h) 미세가공된 구조 중 하나 상의 금 패턴에 한정된 지질의 범위(coverage), 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 만들어진 멤브레노필릭을 설명하는 형광 이미지이다. 상기 지질 막은 퍼짐을 가시화하기 위해 형광 막 염료로 염색되었다.
i) 플라즈마-처리된 금의 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 만들어진 멤브레노필릭 패턴, 및 플라즈마-처리된 SU-8에 의해 한정된 멤브레노포빅 표면을 갖는 칩. 상기 형광 현미경 사진은 완충 용액에 첨가된 형광으로 표지된 대두 기름 리포좀이 플라즈마-처리된 금의 멤브레노필릭 패턴에 현저하게 부착하는 것을 나타내며, 멤브레노필릭은 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 만들어진다.
j) 플라즈마-처리된 금의 멤브레노필릭 패턴을 갖고, 멤브레노필릭은 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 만들어지며, SU-8에 의해 한정된 멤브레노포빅 표면을 갖는 칩. 상기 형광 현미경 사진은 완충 용액에 첨가된 형광으로 표지된 대두 기름 리포좀이 플라즈마-처리된 금의 멤브레노필릭 패턴에 현저하게 부착하는 것을 나타낸다.
k) 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 만든 멤브레노필릭 플라즈 마-처리된 Al2O3 패턴(도면에서 밝은 회색으로 나타남) 및 플라즈마-처리된 SU-8 멤브레노포빅 영역(도면에서 어두운 회색으로 나타남)을 갖는 칩. 상기 Al2O3의 원형 지점은 50 마이크로미터의 직경이고, Al2O3의 상호 접속 통로는 약 2 마이크로미터 두께 및 50 마이크로미터의 길이이다.
l) 미세가공된 구조 중 하나 상의 Al2O3 패턴에 한정된 지질의 범위(coverage), 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 만들어진 멤브레노필릭을 설명하는 형광 이미지가 도 8k에 나타난다. 상기 지질 막은 퍼짐을 가시화하기 위해 형광 막 염료로 염색되었다. 상기 형광은 이미지를 분명하게 하기 위해 전화되었고, 어두운 자주색은 염색된 지질을 나타낸다.
패턴화된 표면의 막-덮힌 부분에 대한 생물학적 또는 합성의 시료를 도입하기 위한 다른 방법. 하기에 주어진 모든 시료에서 출발 지점은 멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 영역으로 이루어진 칩 구조이다. 상기 멤브레노필릭 영역은 지질 이중층으로 덮힌다. 상기 지질 이중층은 평면일 것을 요구하지 않으며 구형, 관형, 또는 관-구형(tubulo-spherical)과 같은 삼-차원적 기하학을 가질 수 있다. 지질 이중층 막 물질에 묻혀있는 막 단백질은 그 후 주입되거나 그렇지 않으며 다양한 기술을 통해 주입 위치에 도입된다.
A) 전기주입(electroinjection)에 의한 막 및 막-구성 요소의 도입
a) 멤브레노필릭(미리 형성된 지질 매트릭스로 덮힌로) 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 칩 구조를 나타내는 도면. 지질 이중층 막에 박혀 있는 막 단백질은 마이크로피펫의 끝에서 상기 칩 상의 주입 위치로 방출된다.
b) 피펫의 끝과 상기 주입 위치의 반대 편 전극 사이의 전기장 적용을 위해, 상기 두 막 저장소가 하나로 병합된다.
c) 이는 상기 막 단백질이 주입 영역으로 이동하게 하고, 그에 따라 연결 통로 상의 분리가 수행될 수 있다.
B) 전기융합(electrofusion)에 의한 막 및 막-구성 요소의 도입
a) 멤브레노필릭(미리 형성된 지질 매트릭스로 덮힌로) 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 칩 구조를 나타내는 도면. 지질 이중층 막 매트릭스 내의 막 단백질은 예들 들어 마이크로피펫에 의해 막 덮힌 표면 옆의 칩 상으로 방출된다.
b) 그 후 막-덮힌 주입 위치를 갖는 막의 부분을 병합하기 위해 두 전극이 사용된다.
c) 상기 막 단백질은 앞에서와 같이 상기 주입 위치로 이동하고 분리가 수행될 수 있다.
C) 광 융합(optical fusion)에 의한 막 및 막-구성 요소의 도입
a) 멤브레노필릭(미리 형성된 지질 매트릭스로 덮힌로) 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 칩 구조를 나타내는 도면. 막 단백질을 포함하는 지질 매트릭스가 예를 들어 마이크로피펫의 사용에 의해 먼저 주입 위치로 방출된다.
b) 고 강도 광은 그 후 두 막 단백질 사이 경계 상에 집중된다(칩 상의 상기 막 단백질 및 산기 박 단백질-덮힌 주입 위치를 포함하는 상기 방출된 부분.
c) 광 융합은 그 후 상기 두 막이 하나로 융합되도록 하여 수행되고, 그에 따라 상기 막 단백질이 주입 위치로 이동한다.
D) 디터젼트 불안정화(detergent destabilization)에 의한 막 및 막-구성 요소의 도입
a) 멤브레노필릭(미리 형성된 지질 매트릭스로 덮힌로) 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 칩 구조를 나타내는 도면. 상기와 같이 막 단백질을 포함하는 지질 매트릭스가 먼저 예를 들어, 마이크로피펫의 사용에 의해 주입 위치에 방출된다.
b) 두 막 부분 사이의 융합(상기 칩 상에 상기 막 단백질 및 상기 막-덮힌 주입 위치를 함유하는 상기 방출된 부분)은 예를 들어 막 융합을 촉진시키는 낮은 농도의 디터젼트를 갖는 용액 또는 다른 화학 작용제에 의해 수행된다.
c) 융합 후, 상기 막 단백질은 주입 위치로 이동할 수 있다.
E) 미리-혼합된 지질 매트릭스의 사용에 의한 막 및 막-구성 요소의 도입
a) 멤브레노필릭 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 칩 구조를 나타내는 도면. 본 방법의 출발점은 노출된, 즉 막 덮개가 없는 멤브레노필릭 표면을 갖는 것이다.
b) 상기 막 단백질(상기 미리혼합된 지질 매트릭스)을 포함하는 상기 막 물질은 그 후 상기 막-덮힌 표면을 형성하기 위한 과정으로 상기 멤브레노필릭 표면을 따라 퍼지게 된다.
c) 상기 막 단백질은 이제 막-덮힌 표면 전체에 걸쳐 위치한다.
F) 미세유체와 관련하여 작은 베시클의 사용에 의한 막 및 막-구성 요소의 도입
a) 멤브레노필릭((미리형성된 지질 매트릭스에 의해 덮히거나 덮히지 않을 수 있는) 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 칩 구조를 나타내는 도면. 상기 칩은 또한 미세유체 채널로 통합될 수 있으며, 여기서 채널의 흐름은 상기 칩의 한 부분, 또는 설계된 각각의 멤브레노필릭 구조의 부분으로 고도로 집중될 수 있다.
b) 작은 베시클(단일- 또는 다층라멜라)을 함유하는 용액이 미세유체 채널의 사요을 통해 상기 설계된 구조의 일부를 지나 흘려진다. 상기 베시클은 소위 전기융합이라 불리는, 전기장의 사용에 의해 또는 상기 지질 이중층 매트릭스에 자발적으로 융합하는 소위 융합성(fusogenic) 베시클이라 불리는 것을 이용하여 미리-형성된 지질 이중층 매트릭스에 융합되도록 만들어질 수 있다.
c) 상기 막 및 막-구성 요소(막 단백질 같은)가 칩 상으로 주입되었다. 이러한 기술을 사용하여, 막 및 막-구성 요소는 설계된 구조 상의 특정한 주입 위치로 주입될 수 있다. 상기 지질 매트릭스는 작업을 위한 이 기술을 위해 미리-형성될 것을 요구하지 않는다. 막 및 막-구성 요소를 포함하는 상기 작은 베시클은 또한 그들 스스로 직접 상기 멤브레노필릭 표면에 부착할 수 있다. 막 및 막-구성-성분은 또한 도 7E에 설명된 바와 유사한 이 기술을 이용하여 다른 구조 또는 동일 구조의 다른 부분으로도 주입될 수 있다.
도 10. 상기 지질 장치 구조를 통한 분리 매카니즘으로서 확산 개념을 설명하는 이미지. 빗-유사 패턴을 갖는 구조가 본 실험을 위해 사용되었고 상기 구조는 지질 이중층 막의 소수성 내부에 융합된 형광 표지(DiO)를 갖는 연속적인 지질 이 중층 막으로 덮혔다. 상기 통로들은 5 마이크로미터의 넓이를 갖고 상기 방사상 통로의 길이는 25 마이크로미터이다. 빗-구조 패턴의 일부는 광표백되고 그 뒤에 광표백 후 형광 회복(FRAP)이 뒤따른다. 상기 이미지는 색-반전(color-inverted)되고 상기 이미지 간의 간격은 4분이다.
a) 광표백 후 최초의 이미지에서, 상기 이미지의 광 표백 지역의 왼쪽 및 오른쪽 가장자리에서 회복이 인지된다.
b) 광표백 후 두 번째 이미지에서, 최초의 이미지 4분 뒤, 형광은 DiO-분자가 최초 빗-구조-통로로 확산하고 그리고 광표백된 지역의 중심부를 향해 계속되는 것을 나타낸다.
c) 광표백 후 세 번째 이미지에서, 두 번째 이미지 4분 뒤, 최초의 이미지 8분 뒤, 상기 DiO-분자가 상기 중심의 빗-구조-통로로 들어간다.
도 11. 지질 이중층 매트릭스 내 막 단백질의 분리/추출을 획득하기 위해 막 단백질에 연결된 자기 비드(bead)의 사용을 나타내는 도식적 이미지이다.
a) A 및 B라고 표시된 두 개의 상이한 막 단백질이 한 장치 구조의 주입 위치에 위치한 초기 상황의 도식적 이미지.
b) 상기 장치 구조에 걸쳐 특정 단백질에 대한 특정 결합 위치와 연결된 자기 비드를 함유하는 용액을 흘려줌에 의해, 상기 자기 비드가 상기 목표 막 단백질에 부착한다.
c) 상기 자기 비드는 막 단백질 A에 부착되었다.
d) 상기 장치 구조에 걸쳐 자기장을 적용함으로써, 상기 막 단백질 A가 자기 장을 따라 이동하고 막 단백질 B로부터 분리된다.
도 12. 2 마이크로미터 넓이의 통로에 의해 상호연결된, 15 마이크로미터 직경을 갖는 두 지점을 포함하는 구조를 나타내는 현미경 사진이다. 상기 통로는 그로부터 방사되는 삼각형 구조를 갖도록 디자인되었다. 이러한 방식으로, 이 차원의 분리 메카니즘을 이용하여, 상기 연결 통로를 따라 일어나는 최초 분리에 수직으로, 통로를 따라 단편들이 수집되고 상기 삼각형의 끝에 집중될 수 있다.
도 13. pH-구배 같은 화학적 구배와 결합한 막-결합 종의 분리를 나타내는 도면이다. pH-구배는 상기 칩-구조 위에 적절한 물질의 구조적 겔(gel)을 도입하거나 또는 상이한 pH를 갖는 몇몇의 용액이 장치 구조를 통해 흐를 수 있는 미세유체와 함께 상기 칩을 사용하여 만들어질 수 있다.
도 14. 비오틴-표지된 지질을 통해 지질 매트릭스에 연결되고 스트렙트아비딘(streptavidin) 표지된 베타-피코에리스린(phycoerythrin)의 형광 이미지이다. 본 이미지에서 상기 장치 구조는 2 마이크로미터 넓이의 단일 통로로 연결된 두 개의 원형 지점(15 마이크로미터 직경)으로 이루어진다. 이는 또한 지질 매트릭스가 형성된 후 첨가될 수 있는 리간드, 항체 및 다른 작용제의 결합을 설명한다. 이는 특히 다양한 막 단백질 목표를 함유하는 지질 매트릭스의 상이한 패치(patch)가 예를 들어 특정 항체와 같은 작용제와 함께 흘려져서 특정 목표 단백질을 찾는 마이크로어레이 프로토콜(microarray protocol)을 이용한 약물 스크리닝(drug screening)과 같은 적용에서 흥미를 끈다.
도 15. MALDI-TOF(Matrix-Assisred Laser-Desorption-Ionization-Time-Of- Flight) 질량 분석기와 관련한 칩의 통합 및 사용에 관한 도식적 도면이다. 상기 구조는 마이크로미터 내지 밀리미터로 크기에서 가변적이며, 따라서 상기 칩을 MALDI-TOF와 통합하는 경우, 평가 프로토콜, 시료의 크기, 시료 농도 및 검출 한계 등에 따라 큰 단일 장치 또는 복합의 병행 장치로 구성될 수 있다.
A) 단일 장치
a) 막-결합 종(membrane-associated species)이 장치 구조의 상기 지질 이중층 매트릭스의 주입 위치로 한정된, 단일 장치.
b) 예를 들어 막 단백질 같은 상기 막-결합 종이 예를 들어 전기장, 확산 등을 이용하여 분리된다.
c) 이러한 종의 분리 후, 상기 분리는 동결되고 상기 구조가 MALDI-TOF에 의해 분석될 수 있다.
B) 복합의 병행 장치
a) 막-결합 종의 분리가 병행적으로 수행될 수 있는, 동일 또는 상이한 설계의 하나 또는 여러 개의 장치로 구성될 수 있는, 복합의 병행 장치를 나타내는 도면이다.
b) 단일의 지점으로 수렴되는 병행의 분리 통로를 나타내는 도면이다. 상기 도식적 이미지는 여러 주입 위치를 설명한다.
c) 상기 막 단백질은 도 9에서 설명된 기술에 의해 주입 위치의 지질 이중층 매트릭스 내로 주입된다.
d) 상기 막 단백질은 전기장 또는 확산 등과 같은 기술을 이용하여 분리된 다. 상기 병행 통로는 MALDI-TOF를 이용한 검출에 앞서 낮은 존재비의 막-결합 종의 농축에 사용될 수 있다.
e) 분리 후, 상기 막-결합 종은 검출이 일어날 수 있는 하나의 위치로 농축될 수 있다.
C) MALDI-TOF-MS(Matrix-Assisred Laser-Desorption-Ionization Mass-Spectrometry) 또는 ESI-MS-MS(Electro-Spray-Ionization Mass-Spectrometry-Mass-Spectrometry) 또는 유사물과의 통합 원리
a) 멤브레노포빅 표면에 둘러쌓인 멤브레노필릭을 포함하는 상기 칩을 나타내는 도면.
b) 상기 칩 위에 위치하는 작은 베시클(막 단백질과 함께 또는 막 단백질 없이)을 함유하는 용액. 베시클이 막 단백질을 함유하지 않는 경우, 상기 막 단백질은 도 10에서 설명한 기술을 이용하여 상기 지질 이중층 매트릭스 내로 주입되어야 한다. 만약 상기 베시클이 막 단백질을 함유하는 경우 상기 통합은 동시에 수행된다. 상기 작은 베시클은 표면에 안착하고 상기 멤브레노포빅 표면에 부착하며 도 7Db에서 설명된 바와 같이 베시클로 머물거나 연속적인 지질 이중층 막을 형성하기 위해 조작될 수 있다.
c) 상기 막 단백질은 상기 표면의 지질 이중층 매트릭스에 부착된다(베시클 그대로 또는 연속적인 지질 이중층 막으로).
d) 막 단백질을 함유하는 상기 지질 매트릭스 위의 용액은 예를 들어 프로테나아제 K 또는 트립신과 같은 소화제를 함유하는 용액으로 교체된다.
e) 상기 소화 용액은 상기 용액에 노출된 막 단백질의 일부를 쪼개고 이는 지질 이중층 매트릭스 위로 튀어나온다.
f) 상기 노출된 부분은 펩티드 단편으로 쪼개지며, 이는 피펫 또는 미세유체 채널에 의해 수집될 수 있다. 상기 용액은 그 후 ESI-MS-MS, 또는 액체 크로마토그래피(LC)나 모세관 전기영동(CE)과 같은 기술에 의한 분리 단계와 함께 또는 이러한 단계 없는 유사 기술로 직접 통합될 수 있다.
g) 상기 펩티드 단편 및 상기 적절한 매트릭스를 함유하는 상기 용액이 MALDI-TOF 플레이트 위에 떨어뜨려진다.
h) 상기 MALDI-TOF 질량 분석 기술은 그 후 상기 펩티드 단편 및 나아가 상기 막 단백질의 동정을 위해 사용된다.
i) 멤브레노필릭 및 주변의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 상기 칩 구조를 나타내는 도면이다. 상기 칩은 또한 채널의 흐름이 상기 칩의 한 부분, 또는 설계된 각 멤브레노포빅의 일부에 고도로 집중될 수 있는 미세 유체 채널과 함께 통합될 수 있다.
j) 상기 막 단백질은 상이한 기술을 이용하여 분리되고 상기 설계된 구조의 특정 부분 상으로 농축되었다. 예를 들어 프로테나아제 K와 같은 다른 소화 효소를 함유하는 흐름은 그 후 설계된 구조의 다른 부분을 목표로 한다. 펩티드 단편은 상기 지질 이중층 매트릭스에서 방출되고 각각 수집된다.
k) 다른 펩티드 단편을 함유하는 상기 수집된 용액은 그 후 MALDI-TOF 플레이트 위에 떨어뜨려지고 도 15H에서 설명한 바와 같이 MALDI-TOF-MS 기술을 이용하 여 분석된다.
도 16. 상기 장치의 구현을 설명하나 이에 제한되지 않는 도식적 도면이다.
a) 병행적으로 이용될 수 있는 비-제한적인 수의 실(chamber), 이 경우에는 9 실을 함유하는 장치의 도식적 윗면(top-view)이다. 각 실은 물질의 첨가, 용액의 교체 및 물질의 추출을 위한 하나의 입구 및 하나의 출구를 갖는다.
b) 상기 실 구조 중 하나의 확대도이다.
c) 상기 표면이 멤브레노필릭 특성을 가질 수 있고 막 단백질을 갖는 연속적인 지질 이중층 막으로 덮혀질 수 있음을 설명하는 실 구조의 벽의 확대도이다.
d) 상기 표면이 멤브레노필릭 특성을 가질 수 있고 지질 이중층 막에 박힌 막 단백질을 갖는 빽빽하게 채워진 베시클의 층으로 덮혀질 수 있음을 설명하는 실 구조의 벽의 확대도이다.
e) 지질 이중층 막에 박힌 막 단백질의 확대도이다.
도 17. 상기 장치의 또 다른 비-제한적인 설계의 도식적 도면.
a) 병행적으로 이용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는 본 예의 경우에는 9 채널을 함유하는 장치의 도식적 윗면(top-view)이다. 각 채널은 물질의 첨가, 용액의 교체 및 물질의 추출을 위한 하나의 입구 및 하나의 출구를 갖는다.
b) 상기 채널 구조 중 하나의 확대도이다.
c) 상기 표면이 멤브레노필릭 특성을 가질 수 있고 막 단백질을 갖는 연속적인 지질 이중층 막으로 덮혀질 수 있음을 설명하는 채널 구조의 벽의 확대도이다.
d) 상기 표면이 멤브레노필릭 특성을 가질 수 있고 지질 이중층 막에 박힌 막 단백질을 갖는 빽빽하게 채워진 베시클의 층으로 덮혀질 수 있음을 설명하는 채널 구조의 벽의 확대도이다.
e) 지질 이중층 막에 박힌 막 단백질의 확대도이다.
도 18. 상기 장치의 예에서 수행되는 가능한 막 단백질 칩-위의 두-단계 소화를 설명하는 도식적 그림
a) 멤브레노필릭 표면에 부착된, 연속적인 지질 이중층 막 또는 베시클 형태의 지질 이중층 매트릭스에 박힌 막 단백질의 확대도이다. 트립신 또는 다른 소화제가 막 외부로 나온 막 단백질 부분이 소회되게 하는 막 위의 상기 용액에 첨가된다.
b) 상기 형성된 펩티드 단편은 나아간 가공 및/또는 검출/동정을 위해 수집된다.
c) 이는 상기 소화제로 쪼개질 수 없는 부분을 갖는 막 단백질을 남겨둔다.
d) 디터젼트(detergent), 유기 용매 또는 다른 화학 작용제가 상기 막의 분쇄를 위해 첨가되고 상기 소화제 또한 더 첨가된다.
e) 상기 막이 분쇄되고 상기 지질은 미셀(miceiie)을 형성하거나 디터젼트에 의해 안정화된다. 상기 소화제는 예를 들어 디터젼트로 안정화된 상기 소수성 부분과 같은 막 단백질의 잔존 부분을 펩티드 단편으로 쪼갠다. 상기 형성된 펩티드 단편은 나아간 가공 및/또는 검출/동정을 위해 수집된다.
도 19. 적혈구 세포의 막 단백질의 칩-위의 트립신 소화로 획득한 펩티드 단편의 질량분석 추적(mass spectrometry trace). 최고 강도의 피크가 선택되고 MS/MS 모드 내의 MALDI-TOF가 수행되었으며, 상기 결과는 표 1에 나타난다.
표 1. MALDI-TOF MS/MS 모드에 의해 유추된 펩티드 서열. 상기 AE1-막 단백질(음이온 교환 단백질)이 동정되었다.
도 20A는 본 발명에 따른 장치를 나타낸다. 활성 표면으로, 상기 멤브레노필릭 표면이 두 고체 지지체를 덮는다. 스페이서(spacer) 및 유체 포트(port)(입구 및 출구 구멍을 수반함)가 유체 세포를 형성한다. 상기 시료 막은 멤브레노픽릭 표면에 부착되고 상기 잉여 물질을 씻어낸다.
도 20B는 상기 막 단백질의 효소 소화를 도식적으로 설명하며, 이 경우에서는 막이 그대로 남겨진다. 상기 막 단백질은 상기 멤브레노필릭 표면에 부착된 상기 지질 이중층 막 매트릭스에 놓여진다. 상기 장치(흐름 셀(flow cell))는 소화제로 충전되고, 이는 막 단백질의 막 외부 부분을 펩티드로 쪼갠다. 상기 펩티드는 이어서 수집되고 예를 들어 질량 분석기 등에 의해 분석된다.
도 20C는 막 단백질의 소화를 도식적으로 설명하며, 이 경우에서는 상기 막의 분쇄를 함께 설명한다. 상기 단계는 전형적으로 상기 막 외부 부분이 쪼개지는 단계 후에 이루어진다. 상기 장치(흐름 셀)은 분쇄제(distruptive agent), 소화제(일부 경우에서는 생략 가능)로 충전되고, 상기 펩티드를 방출한다(그리고 작은 단편으로 가능한 나아간 소화적 분해). 상기 펩티드는 이어서 수집되고 질량분석으로 분석된다.
도 21은 어떠한 수 및 어떠한 소화 사이클의 결합을 이용한 순차적인 소화의 개념을 도식적으로 설명한다. 어떠한 수 및 예를 들어 효소, 화학적 화합물, 어떠 한 파장의 전자기 방사선, 어떠한 진동수의 음 또는 특정 온도 혹은 압력과 같이 상이한 소화제 또는 처리의 어떠한 결합(본 명세서에서 상이한 색의 원으로 설명 및 예시됨). 상기 예는 상이한 분해 패턴의 획득을 위해 순차적으로(또는 병행적으로) 사용될 수 있는 프로테아제의 효소적 소화를 나타낸다. 본 경우에 상기 최초 단계 소화가 프로테아제 1로 수행되고 상기 막이 그대로 남겨진다. 상기 두 번째 단계 소화는 어떠한 다른 4 프로테아제로 수행되고, 상기 막은 그대로 남겨지거나 분쇄된다. 4 개의 다른 분해 패턴은 상기 막이 그대로 남겨져서 발생한다. 새로운 분해 위치가 막 분쇄 동안 노출되기 때문에, 4 분해 패턴의 다른 세트가 상기 막의 분쇄와 함께 수행되는 소화로 발생한다. 나아간 소화 단계가 상기 프로토콜에 추가될 수 있다.
도 22는 서열 커버리지(sequence coverage) 연구 목적을 위한 연속적인 소화의 원리를 나타내는 예를 설명한다. 상단 이미지: 적혈구 막 제조에서의 밴드 3 음이온 교환 단백질의 스네이크플롯(snakeplot)(예측된 막관통, 세포질 및 세포외 부분을 갖는 아미노산 서열의 2차원 도), RBCM. 상기 녹색 점은 트립신 소화로부터 생긴 펩티드를 설명한다. 하단 이미지: 펩신 소화에 후속적으로 연속적인 트립신 소화 결과를 나타내는 스네이크플롯. 상기 추가적인 파란 점은 펩신 소화에서 발생한 펩티드를 설명한다.
1.
멤브레노포빅
및
멤브레노필릭
여역을 갖는 마이크로칩의 가공
재료
130-170μm 두께를 갖는 28mm 직경의 유리 커버슬립(coverslip)을 Menzel-Glaser(Braunschweig, Germany)로부터 구입하였다. 전자 빔 레지스트, 포토레지스트 및 형상액은 AZ Electronic Materials(Somerville, NJ, USA)로부터 프라이머(primer)는 Shipley(Marlborough, MA, USA)로부터 획득하였다. 가공에 사용된 모든 다른 화학물질은 VLSI 등급이고 다른 언급이 없다면 Merck로부터 얻는다. 마스크 가공에서 사용된, 100nm의 크롬으로 코팅된, 100mm의 낮은 반사 블랭크 석영 마스트(reflective blank quartz mask)는 Nanofilm(WestlakeVillage, CA)로부터 획득한다. 증착에 사용된 재료는 Nordic High Vacuum(Kullavik, Sweden)으로부터 구입하였다.
상기 유리 커버슬립은 아세톤에서 20분간 고주파 분해(sonication)되고, 80℃ RCA1 용액(H2O2(25%), NH3(30%) 및 Milli-Q 1:1:5 용액)에서 세척되고, 완충된 옥사이드 에칭 용액(NH4F(30%) 및 HF(49%) 6:1 용액)에 2분간 살짝 담그고, QDR의 Milli-Q 수에서 헹구고 N2 하에서 건조한다.
Au
위
SiO
2
패턴의 가공
상기 기판은 AVAC HVC-600 얇은 막 침착 시스템으로 삽입되고 1.5 nm의 티타늄, 13.5 nm의 금, 1.5 nm의 티타늄, 그리고 마지막으로 60 nm의 실리콘 디옥사이드로 구성된 막이 전자 빔 증착법에 의해 기판상에 증착된다. 상기 기판은 먼저 부 착 촉진제(HMDS)로 스핀코팅(spin coating)되고, 그 후 6000rpm에서 45초간 AZ 5214-E로 이미지 반전, 90 ℃의 열판에서 노출-전 베이크되고 Carl Suss NJB-3 마스크 얼라이너(aligner) 상에서 120 mJ/cm2의 선량으로 365nm 파장에서 패턴화된 다크 필드 크롬 마스크를 통해 노출된다. 상기 기판은 125℃의 열판에서 30초간 노출-후 베이크되고 후속적으로 720 mJ/cm2의 선량으로 유동-노광(flood exposure)된다. 상기 패턴은 AZ351 현상액 및 DI 수 1:5 혼합물에서 60초간 현상되고, QDR엥서 헹구고 N2 하에서 건조한다. 그 결과 분명한 필드 패턴이 나타난다. 상기 노출된 실리콘 디옥사이드는 Plasmatherm RIE m-95 리액티브 이온 에쳐(etcher)(180초, 100W, 25mTorr, 32cm3 CF4/s, 8 cm3 H2/s, 1 cm3 O2/s)에서 에칭된다. 실리콘 디옥사이드가 완전 에칭되었는지 확인하기 위해, 프로파일미터(profilometer) 측정, 두-지점 레지스턴스 측정, 및 습식 에치(wet etch) 테스트가 수행된다. 상기 기판은 Shipley 1165 리무버를 이용하여 잔존 레지스트가 벗겨지고 QDR의 아세톤, 2-프로파놀 및 DI 수에서 헹궈지고 N2 하에서 건조한다. 상기 기판은 TePla 300PC Microwave Plasma 시스템을 이용하여 Microposit 프라이머로부터 유래한 실리콘 디옥사이드 위의 잔존 실록산을 제거하기 위해 최종적으로 제거(desummed)(60 초, 250W, 250 cm3 O2/s)된다.
상기 과정은 AZ-5214E 이미지 반전 레지스트를 위해 최적화될 수 있으나, 기 본적으로 어떠한 Novolac-기초 이미지 반전- 또는 음성 톤 레지스트(negative tone resist)에도 적합할 수 있다.
일부 레지스트에서 상기 에칭은 또한 예를 들어 완충된 옥사이드 에칭 용액(49% 하이드로플루오르 산 및 30% 암모늄 플루오라이드 1:6 혼합물) 같은 습식 에칭 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 표면은 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어질 수 있다.
SU
-8 2002에서
Au
또는
Al
2
O
3
위 패턴의 가공
상기 기판은 AVAC HVC-600 얇은 막 침착 시스템으로 삽입되고 필름(50nm의 Al2O3 또는 1.5nm의 Ti+13.5nm의 Au)이 전자 빔 증착법에 의해 기판상에 증착된다. 상기 기판은 Micro Chem SU-8 2002 음성 톤 포토레지스트로 4000rpm에서 30초간 스핀코팅(spin coating)되고, 95 ℃의 열판에서 노출-전 베이크되고 Carl Suss NJB-3 마스크 얼라이너(aligner) 상에서 120 mJ/cm2의 선량으로 365nm 파장에서 패턴화된 크리어 필드 크롬 마스크를 통해 노출된다. 상기 기판은 95℃의 열판에서 60초간 노출-후 베이크된다. 상기 패턴은 MicroChem's SU-8 현상액에서 60초간 현상되고, 2-프로파놀에서 잠시 헹구고 N2 하에서 건조한다. 그 결과 Au 또는 Al2O3 위에 SU-8 2002의 다크 필드 패턴이 생긴다. 상기 기판은 TePla 300PC Microwave Plasma 시스템을 이용하여 최종적으로 제거(desummed)(60 초, 250W, 250 cm3 O2/s)된다. 상기 표면은 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어질 수 있다.
2.
멤브레노포빅
및
멤브레노필릭
영역을 갖는 마이크로 칩의
멤브레노필릭
영역의
라이포좀으로의
선택적 코팅
재료 및 방법
베시클
제조
베시클은 클로로포름(100mg/mL)에 용해된 대두 레시틴(SBL)으로부터 저장액 (stock solution)으로서 제조되고 DiO(전형적으로 지질 농도에 관해 1 mol%)로 염색된다. 수정과 함께(Karlsson, M. et al. Anal. Chem. 72, 5857-5862(2000)) Criado 및 Keller(Criado M, Keller, B. U. FEBS Lett. 224, 172-176(1987))에 의해 설명된 상기 재수화(rehydration)/재수화 방법이 단일라멜라 라이포좀 제조시에 이용되었다. 요약하면, 5μm 지질 분산(1mg/mL)의 한 방울을 커버슬립 위에 놓고 진공 데시케이터에서 25분간 탈수화된다. 상기 지질 필름이 건조되면, 완충 용액으로 재수화된다(Trizma 베이스 5mM, K3PO4 30mM, KH2PO4 30mM, MgSO4 1 mM, EDTA 0.5 mM, pH 7.8). 수 분 후, 상기 라이포좀이 형성된다. 유리 피펫을 이용하여 지질 서스펜션의 작은 시료가 테스팅 표면에 위치한 완충 용액 방울로 운반된다.
현미경법
및 형광
상기 커버슬립이 Leica PL Fluotar 40× 대물렌즈를 이용하는 도립 현미경(inverted microscope)(Leica DM IRB, Wetzzlar, Germany)의 재물대(stage)에 직접 놓여진다. 형광(epifluorescence) 광원으로 Ar+ 레이저(2025-05, Spectra-Physics) 488-nm 라인이 이용되었다. 간섭성을 깨고 레이저 광을 산란시키기 위해, 투명한 스피닝(spinning) 디스크를 빔 경로에 위치시킨다. 상기 광은 폴리크로익(polychroic) 거울(Leica) 및 상기 형광물질의 여기를 위해 대물렌즈를 통해서 보내진다. 상기 형광은 3-칩 색상 CCD 카메라(Hamamatsu, Kista, Sweden)에 의해 수집되고 디지털 비디오(DVCAM, DSR-11, Sony, Japan)을 이용하여 기록된다. 디지털 이미지는 Adobe Premiere 그래프 소프트웨어 및 Matlab을 이용하여 편집된다.
화학물질 및 재료
Trizma 베이스, 글리세롤, 및 칼륨이 Sigma-Aldrich Sweden AB로부터 획득된다. 대두 레시틴(SBL, 극성 지질 추출물)이 Avanti Polar Lipids, Inc.(700 Industrial Park Drive, Alabaster, AL 35007)로부터 획득된다. 클로로포름, EDTA(titriplex Ⅲ), 마스네슘 술페이트, 칼륨 디하이드로겐 포스페이트, 칼슘 클로라이드, 소듐 클로라이드, 및 마그네슘 클로라이드를 Merck(Darmstadt, Germany)로부터 얻는다. 비이온화(deionize)된 물(Millipore Corp., Bedford, MA)가이 완충제 제조에 사용되었다. DiO(3,39-디옥타데실옥사카보시아닌 퍼클로레이트)가 Molecular Probes(Leiden, The Netherlands)에서 획득되었다. 상기 극성 지질 추출물은 포스파티딜콜린(45.7%), 포스파티딜에탄올아민(22.1%), 포스파티딜이노시 톨(18.4%), 포스파티드 산(6.9%), 및 그 외(6.9%)의 혼합으로 이루어져 있다.
다른 여러 표면이 실험되었다: 플라즈마 처리된 실리콘 디옥사이드, SU-8, 플라즈마 처리된 SU-8, 보로실리케이트 유리, 플라즈마 처리된 금, 플래티늄, 플라즈마처리된 플래티늄, Al2O3, 플라즈마-처리된 Al2O3, 모든 표면은 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어졌다. 상기 실험은 하기와 같은 방법으로 수행되었다. 본 발명자들은 실험될 표면에 먼저 한 방울의 완충제를 이동시키고, 그 후 라이포좀 용액을 방울로 주입한다. 수분 경과 후 라이포좀이 표면에 도달하며, 그에 부착하고 표면 특성에 의존하는 속도로 퍼진다. 상이한 표면을 이용한 상기 실험으로부터 본 발명자들은 멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 특성의 결합을 발견하였다. 상기 금 프라즈마 처리되고, 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진, 표면은 가장 높은 지질 퍼짐을 나타낸다(도 8i). 상기 퍼짐-없는 표면은 플라즈마 처리된 SU-8 표면이었다(도 8j). 본 발명자들은 멤브레노필릭 및 멤브레노포빅 영역을 결합하여 차별적인 지질 커버리지를 갖는 구조를 만들어냈다. 하기의 도면은 SU8이 덮힌 영역과 비교할 때 금으로 덮히고, 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진 표면 부분이 본질적으로 지질 물질에 높은 부착을 제공하는 것을 설명한다. 상기 도면 상의 패턴화된 영역은 금으로 덮힌 영역에 대응한다. 형광 이미지는 라이포좀을 완충 용액에 추가한 20분 뒤에 수집되었다.
3. 분리
메카니즘으로서
막-결합 종의 확산
패턴화된 지질 이중층의 확산 운동의 일 예가 도 10에 나타난다. 상기 지질은 먼저 작은 단일라멜라 베시클(SUVs)이 멤브레노필릭 표면에 융합하여 침착된다. 상기 SUVs는 형광의 가시화를 위해 1 mol% DiO로 염색된 대두 지질로 이루어진다(총 지질 농도: 240 μl 대두 지질, 저장액 100mg/ml 클로로포름이 증착에 의해 약 5시간동안 건조되고 20mM NaCl, 10 mM Trizma, pH 9.5로 이루어진 2ml 완충 용액에서 재수화 되었다). SUVs가 상기 멤브레노필릭 표면에 부착 및 융합한 후(일반적으로 30-60분의 대기 시간), 주변 유체의 상기 잉여 지질 물질은 상기 구조화된 표면 위의 완충 용액을 여러번 교환하여 제거된다. 베시클의 융합은 또한 상기 완충 용액을 칼슘 이온 및 삼투적 불균형을 만들기 위한 높은 이온 세기를 갖는 완충제로(100mM NaCl, 5 mM Trizma, 2 mM CaCl2, pH 8.6)의 교환, 및 짧은 시간 간격으로 상기 장치 흐름 세포에서 완충제를 완전히 배출시킴에 의해 촉진된다. FRAP(광표백 후 형광 회복) 시험이 수행되었으며, 연속적인 지질 이중층의 형성을 확인하기 위해, DiO-표지된 지질 이중층 매트릭스를 함유하는 패턴화된 구조 부분이 고 강도 여기 광을 이용하여 표백되었다. 표백 후, 상기 여기 광의 강도는 필터를 이용하여 감소되고 상기 형광 회복은 여러 시점의 패턴화된 지질 구조의 속사를 통해 기록되었다. 상기 회복은 신속하고 통로의 길이 및 상기 패턴의 복잡한 정도에 따라 다른 설계 패턴 사이에서 다양하다. 상기 예는 단일의 통로에서 나온 네 개의 방사형 팔을 갖는 빗 구조에서의 형광 회복을 보여준다. 상기 패턴에서 통로의 넓이는 5μm, 상기 분리 통로의 길이는 100 μm이고 상기 방사형 팔의 길이는 25 μm이다. 상기 구조의 속사는 30초 간격으로 찍혀졌다. 상기 속사는 상기 지질 이중층 매트릭스 내 DiO-분자의 확산적인 측면 운동을 보여준다.
4. 상기 지질 장치와 질량분석기의 통합
상기 지질 장치 기술과 질량 분석기의 통합은 상기 장치의 지질 매트릭스와 결합한 단백질의 동정을 가능하게 한다. 이를 설명하기 위해, 하기의 실험이 적혈구 세포 막(RBCM) 단백질을 이용하여 수행되었다. 상기 세포는 먼저 포스페이트 완충된 염수(PBS), pH 7.4로 세척되었다. 콜레스테롤이 PBS 내의 β-시클로덱스트린(6mM)로 추출 및 제거되었다. 상기 세포는 용해되고 2 mM EDTA, pH 8.3, 1 mM DTT, 및 프로테아제 억제제로 널리 세척되었다. 상기 RBCM은 가능한 많은 비-막 관통 단백질을 제거하기 위해 그 후 고 염 용액(1M KCl, 1mM DTT, pH 7.8) 및 높은 pH 용액(0.1M Na2CO3, 1mM DTT, pH 11.3)으로 처리되었다. RBCM은 20 mM NaCl, Trima 10mM, pH 8.0에서 0.8 mg/mL로 희석되고 총 15분간(5초 펄스 후속적인 5초 간격) 초음파분해(ultrasonication)하여 상기 막을 베시클로 감소시킨다. 상기 베시클 용액은 초음파분해기의 말단에서 형성된 티타늄 입자를 제거하기 위해 200 nm 입자 크기의 PVDF 막 여과로 통과시킨다. 상기 지질 장치는 바닥이 Al2O3 덮힌 칩(50 nm 두께층, 얇은 필름 침착 시스템(AVAC HVC-600)에 어의 증착을 통해 증착됨)으로 만들어지고, 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진다. 세포(100-500μm) 및 Al2O3로 덮힌 최상부-뚜껑(top-lid)의 바라 는 높이를 제공하기 위한 테플론 스페이서(spacer)는, 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진다. 상기 장치는 RBCM 베시클 서스펜션으로 충전되고, 베시클은 그 후 최소 2 mL의 세척 완충제(20 mM NaCl, Tris 10 mM, pH 8.0)를 이용하여 세척된다. 상기 실은 그 후 최소 2 mL의 칼슘 버퍼(2 mM CaCl2, 20 mM NaCl, 10 mM tris, pH 8.0)로 세척되어 상기 표면에 대한 베시클의 부착력을 향상시킨다. 상기 과정은 상기 장치 내에, 화학적 및/또는 물리학적 수정 및 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진 모든 Al2O3 표면에 부착된 촘촘한 베시클 층의 결과를 가져온다. 상기 실은 트립신(20 nM NaCl, Tris 10 mM, pH 8.0 내 0.02 mg/ml)을 함유하는 용액으로 채워지고 37℃에서 일정 시간(3 내지 5 시간) 동안 인큐베이션된다. 상기 획득된 펩티드 용액은 상기 장치로부터 총 부피 200-400μL로 수집되었다. 상기 소화 용액 내의 펩티드는 농축되고, 탈염되고 MALDI-플레이트 위에서 하기와 같이 용해되었다: 소화물의 분취량이 C18-수정된 실리콘 비드를 함유하는 막을 통해 통과되었다. 3 막이 사용되었고, 각각은 75μL의 소화물을 수용하였다. 상기 결합 펩티드는 0.1% TFA(막 당 50μL)로 세척되었다. 상기 펩티드는 70% ACN(막 당 2μL)로 용리되었고, MALDI-플레이트의 단일 지점으로 고였다. 상기 지점의 펩티드는 Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time Of Flight(MALDI-TOF) 질량 분석기로 분석되었다. 이러한 실험으로부터의 질량분석이 도 19에 나타난다. 열한 개의 독특한 펩티드가 MS/MS 모드에서 MALDI TOF를 이용하여 동정되었다. 이들은 표 1에 나열되어 있다. 이러한 펩티드의 서열을 SWISSPROT 와 같은 단백질 데이타베이스에 포함된 것과 비교해 보면, 상기 펩티드의 기원은 막관통 단백질 AE1(음이온 교환자 1, 획득 번호 P02730)인 것으로 밝혀진다.
5. 적혈구(
erythrocyte
막 표본)의 프로파일링
적혈구 막 표본이 프로파일링 연구와 관련한 평가 및 결과를 얻기 위해 사용되었다. 요약하면, RBCM으로 표시되는, 상술한 바와 유사한 표본이 상기 실험에서 사용되었다. LC-MS/MS 분석이 필터로부터의 폴리머 오염에 민감한 것으로 밝혀졌기 때문에 필터링의 최종 단계에서 상기 베시클 서스펜션이 제거되었다(이 경우 나노 스프레이 공급원이 장착된 7-Tesla(Linear Trap Quadrupole-Fourier Transform)LTQ-FT 질량 분석기(Thermo Electron)). 또한, 다른 완충제가 사용되며, 이 경우 높은 이온 세기가 막 물질의 상기 표면에 흡수를 증가시는 것으로 나타나므로 10 mM Trizma, 300mM NaCl, pH 8이 사용되었다.
이 경우 상기 칩 장치는 두 개의 유리 기판(68×109mm 면적, 0.6-0.8 mm 두께 Menzel Glaser)으로 이루어지며, 이들은 모두 3,5 nm 크롬, 7.5 mM 금으로 수정되고, 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 통해 멤브레노필릭으로 만들어진다. 상기 두 기판은 약 70 μm 두께의 양면 테잎(1524 medical transfer adhesive, 3M)으로 결합되며, 이는 상기 두 기판 사이의 거리를 설정한다. 상기 유리 기판 중 하나에, 두 개의 구멍(하나는 입구이고 하나는 출구)이 기판을 통해 뚫어졌다. 나노포트(nanoport)(Upchurch Scientific)가 상기 구멍의 상부에 추가되어 액체의 입구/출구 접촉 능력을 부여한다. 이 경우 어댑터를 가진 시린지가 상기 나 노포트에 연결되고 액체가 상기 칩 장치를 통해 강제될 수 있다.
하기에서는 하나의 효소로 여러 단계에서 이루어지는 전형적인 소화 실험을 설명하며, 이것이 연속적인 소화 프로토콜이다.
요약하면, 상기 칩(부피 약 500 μm)은 베시클 서스펜션(RBC, tipsonicated)으로 충전되고 약 1시간 동안 놔둔다. 상기 베시클 표본은 여과되지 않았다. 상기 팁초음파 분해(tipsonication) 과정 중 상기 시료로 방출되었을 가능성이 있는 티타늄 및 유리 입자를 제거하기 위해, 상기 베시클 서스펜션이 에펜도르프(eppendorf) 튜브에서 2 ml 분취량으로 나누어지고 10000rpm에서 10분간 원심분리된다.
잉여 베시클은 약 2ml의 완충제(10 mM Trizma, 20 mM NaCl, pH 8)로 세척된다. 상기 부착된 베시클은 약 2ml(상기 2mM CaCl2와 같이)의 칼슘 함유 완충제에 넣어져서 상기 표면에 적절하게 결합되도록 한다. 최종적으로, 15분 후, 일반 완충제(칼슘 없음)가 상기 칩에 약 1.5 ml 첨가된다. 용액은 사용 전에 여과되지 않는다. 모든 완충 튜브및 피펫의 말단은 MQ로 사용 전에 헹궈진다.
트립신이 상기 칩(상기와 같이 완충제 내 0.005mg/ml, 약 500μm)에 첨가되고 상기 칩은 30 분간 37℃에서 인큐베이션된다. 상기 용액은 인큐베이션 전에 재-순환(약 200μl)된다.
이 단계에서 생성된 상기 펩티드는 그 후 완충제를 하나의 포트에 첨가하고 상기 용액을 상기 다른 포트를 통해 연속적으로 추출하여 칩에서 용리된다(상기 칩 부피와 일치하는 약 500μl가 추출되었다). 상기 추출된 펩티드 용액으 그 후 다시 37 ℃에서 하룻 밤(18 시간) 인큐베이션하여 트립신에 의한 완전한 소화를 확보한다. 상기 시료는 최종적으로 직접 동결된다.
트립신이 다시 상기 칩(동일한 완충제 내 0.005mg/ml)에 첨가되고 상기 칩은 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션된다.
이 단계에서 생성된 상기 펩티드는 그 후 완충제를 하나의 포트에 첨가하고 상기 용액을 상기 다른 포트를 통해 연속적으로 추출하여 칩에서 용리된다(상기 칩 부피와 일치하는 약 500μl가 추출되었다). 상기 추출된 펩티드 용액으 그 후 다시 37 ℃에서 하룻 밤(16 시간) 인큐베이션하여 트립신에 의한 완전한 소화를 확보한다. 상기 시료는 최종적으로 직접 동결된다.
트립신이 다시 상기 칩(동일한 완충제 내 0.005mg/ml)에 첨가되고 상기 칩은 하룻 밤(16 시간) 동안 37℃에서 인큐베이션된다.
상기 생성된 펩티드는 그 후 나노흐름 LC-MS/MS 시스템을 이용하여 분석되었다.
특히, 액체크로마토그래피를 위해 Agilent 1100 이원(binary) 펌프가, 내부가 3 μm 입자 Reprosil-Pur C18-AQ(Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany)로 채워진 역(reversed) 상 컬럼 200 × 0.055nm와 함께 이용되었다 상기 컬럼을 통한 흐름은 약 100nl/min의 흘림(spilt)에 의해 감소된다. 40분의 0.2% HCOOH 내의 10-50% CH3CN 구배(gradient)가 상기 펩티드의 분리를 위해 이용되었다. 상기 나노흐름 LC- MS/MS가 내부가 수정된 나노스프레이 공급원을 장착한 7-Tesla(Linear Trap Quadyupole-Fourier Transform) LTQ-FT 질량 분석기(Thermo Electron)상에서 이루어졌다. 상기 분광계는 자동으로 MS/MS 모드로 바뀌는, 데이타-의존 모드에서 작동한다. MS-스펙트럼이 FTICR에서 획득된 반면, MS/MS-스펙트럼은 LTQ-트랩에서 획득되었다. 각각의 FTICR 스캔을 위해, 두 배 혹은 세 배로 대전된 가장 강한 상기 여섯 개의 이온이 직선 트랩에서 충돌유발분해(collision-induced dissociation)에의해 연속적으로 분해된다. 모든 일련의 질량 스펙트럼은 MASCOT(Matrix Science, London)에 의해 HUMAN 데이타베이스에 대해 조사되었다.
다수의 다양한 프로토콜이 상기 막 표본에 존재하는 막 단백질의 동정과 관련하여 상기 데이타의 최적화 및 보완을 위해 적용되었다.
지금까지, 상기 데이타를 종합하는 경우 상기의 모든 칩에서 310 단백질이 검출 및 동정되었고 적혈구 막 표본에 대한 분석이 시행되었다. 이 동정은 MS/MS 데이타 서치를 하는 동안 발견된 1496의 독특한 단백질 서열에 기초한다. 2 개 이상의 펩티드가 동정을 위해 요구되는 경우, 104의 단백질이 상기 표본에 할당될 수 있다. 단일의 펩티드(예상 값(expected value)< 0.05)에 의해 검출되고 동정되는 단백질이 상기 목록에 추가되는 경우, 여분의 147 단백질이 할당될 수 있다. 최종적으로, 0.05 보다 높은 예상 값으로 1 펩티드에 의해 동정된 단백질이 포함되는 경우 추가적인 59 단백질이 상기 목록에 추가될 수 있다. 보다 자세한 견지로 상기결과를 문헌적 데이타와 비교하면 상기 문헌에 설명된 약 70%의 막 단백질이 본 연구에서 동정되었다.
6. 음이온 교환 단백질의 서열
커버리지
연구,
RBCM
표본(
erythrocyte
)의 밴드 3
서열 커버리지 연구의 목적은 특정 단백질 내의 아미노산을 가능한 많이 검출하는 것이다. 높은 서열 커버리지는 펩티드가 단백질 대부분에서 만들어지는 것을 의미한다. 높은 서열 커버리지는 목표 단백질을 많은 위치에서 쪼개서 LC-MS/MS 분석에 적합한 다수의 펩티드를 생산하기 위해 병행적으로 또는 순차적으로 다양한 프로테아제를 이용하여 획득될 수 있다.
서열 커버리지 연구를 위한 프로토콜의 설립에는 여러 대체적인 방법이 있다. 예를 들어, 이른바 제한된 프로테오라이시스(limited proteolysis)가 경쟁 없이 시료를 소화시키기 위해 비특이적 효소가 이용되는 경우에 적용될 수 있다. 비특이적 효소는 분해을 위한 많은 잠재적인 위치를 갖고 소화가 완성에 접근하면, 비교적 짧은 단편이 생산될 것이다. 반면 제한된 소화는 낮은 효소 농도 및/또는 짧은 소화 시간을 이용하여 상기 시료를 보다 큰 펩티드 단편으로 유도한다. 이러한 큰 펩티드 단편은 서열에 있어서 중첩될 수 있으며 그에 따라 높은 서열 커버리지를 촉진할 수 있다. 또 다른 방법은 더욱 특정한 효소를 사용하고 이들을 병행적 또는 순차적으로 사용하는 것이다. 이를 통해, 비특이적 프로테아제와 동일한 방식으로, 상기 단백질은 일부 경우 중첩 서열이 생산될 수 있는 상이한 방식으로 절단된다. 이러한 견지에서 특이적 및 비특이적 프로테아제의 조합 또한 가능하다.
하기의 문단은 서열 커버리지를 위한 목적을 갖는 프로토콜을 설명한다. 요 약하면, 이는 상이한 프로토콜과 프로테아제를 이용한 순차적인 소화이다.
다시, 이 경우에서 상기 칩 장치는 3, 5 nm 크롬 및 7.5 nm 금으로 수정되고, 화학적 및/물리학적 수정 또는 조작에 의해 멤브레노필릭으로 만들어진다. 상기 두 기판은 양면 테잎(1524 medical transfer adhesive, 3M, 약 70 μm 두께)으로 결합되며, 이는 상기 두 기판 사이의 거리를 설정한다. 상기 유리 기판 중 하나에, 두 개의 구멍(하나는 입구이고 하나는 출구)이 뚫어졌다. 나노포트(nanoport)(Upchurch Scientific)가 상기 구멍의 상부에 추가되어 액체의 입구/출구 접촉 능력을 부여한다. 이 경우 어댑터를 가진 시린지가 상기 나노포트에 연결되고 액체가 상기 칩 장치를 통해 강제될 수 있다.
요약하면, 상기 칩(부피 약 500 μm)은 베시클 서스펜션(RBC, tipsonicated)으로 충전되고 약 1시간 동안 놔둔다. 상기 베시클 표본은 여과되지 않았다. 상기 팁초음파 분해(tipsonication) 과정 중 생산되었을 가능성이 있는 티타늄 및 유리 입자를 제거하기 위해, 상기 베시클 서스펜션이 에펜도르프(eppendorf) 튜브에서 2 ml 분취량으로 나누어지고 10000rpm에서 10분간 원심분리된다.
잉여 베시클은 약 2ml의 완충제(10 mM Trizma, 20 mM NaCl, pH 8)로 세척된다. 상기 부착된 베시클은 약 2ml(상기 2mM CaCl2와 같이)의 칼슘 함유 완충제에 넣어져서 상기 표면에 적절하게 결합되도록 한다. 최종적으로, 15분 후, 일반 완충제(칼슘 없음)가 상기 칩에 약 1.5 ml 첨가된다. 주의: 용액은 사용 전에 여과되지 않는다. 모든 완충 튜브 및 피펫의 말단은 MQ로 사용 전에 헹궈진다.
트립신이 상기 칩(상기와 같이 Trizma 완충제 내 0.005mg/ml, 약 500μm)에 첨가되고 상기 칩은 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션된다. 상기 용액은 인큐베이션 전에 재-순환(약 200μl)된다.
이 단계에서 생성된 상기 펩티드는 그 후 완충제를 하나의 포트에 첨가하고 상기 용액을 상기 다른 포트를 통해 연속적으로 추출하여 칩에서 용리된다(약 500μl가 추출되었다). 상기 추출된 펩티드 용액은 그 후 다시 37 ℃에서 하룻 밤(20 시간) 인큐베이션하여 트립신에 의한 완전한 소화를 확보한다. 상기 시료는 최종적으로 산성화 없이 직접 동결된다.
두 번째 소화 단계를 수행하기 위해 펩신 프로토콜이 후속되었다. 요약하면, 펩신(0.001 mg/ml)를 MQ수에 10% 포름산과 함께 용해하고, 5% 아세토니트릴(실험 직전)을 상기 칩에 첨가하고(약 500 μl 첨가) 상기 칩을 통해 상기 용액을 첨가 및 추출하여 37℃에서 하룻밤 인큐베이션 하기 전에 잠시 재순환한다. 상기 펩티드는 상기 칩에서 흡입에 의해 추출되었다. 동결 전, 300 μl 아세토니트릴을 약 300 μl의 시료에 첨가하여 상기 펩신을 불활성화한다.
요약하면, 상기 분석의 결과는 첫 번째 트립신 단계가 30%의 밴드 3 음이온 교환 단백질의 서열 커버리지의 결과를 갖는 것을 보여준다. 후속적인 펩신 소화 단계는 67%의 서열 커버리지 결과를 갖는다. 이와 함께, 상기 서열 커버리지는 약 69%에 이르는 것으로 계산되었다. 이 것은 상기 트립신 단편과 비교할 때 상기 펩신 단계에서 발견된 펩티드 서열의 중첩을 명백히 나타낸다. 그러나, 상기 펩신 소화 단계는 펩신 소화 단계 전 트립신의 첫 번째 소화 단계를 가짐으로써 촉진되는 것으로 나타난다.
하기의 도면은 밴드 3 음이온 교환 단백질의 서열 커버리지 연구의 추가 결과를 보여준다. 첫 번째 패널은 트립신 소화에 의해 획득한 단편을 나타낸다. 두 번째 패널은 펩신 소화에 의해 발견된 단편을 추가하는 경우의 총 결과를 보여준다.
Claims (141)
- 적어도 하나의 멤브레노필릭 영역을 포함하는 적어도 하나의 지지 고체면;적어도 부분적으로 상기 멤브레노필릭 영역에 고정되며, (ⅰ)계면활성 막, (ⅱ)지질 유사 폴리머, (ⅲ)계면활성 또는 에멀젼 시스템, (ⅳ)액정, 또는 이들의 조합으로 구성된 덮개층(covering layer); 및상기 덮개층에 포함되거나 묶인, 또는 연결되거나 결합된 물질을 포함하는 장치.
- 제1항에 있어서, 수용액 내 고체 입자로 구성된 멤브레노필릭 영역을 더 포함하며, 상기 고체 입자는 멤브레노필릭 특성을 갖고 (a)막, (b)지질 유사 폴리머 또는 (c)계면활성 혹은 에멀젼 시스템, (d)액정, 또는 이들의 조합으로 덮여있고 고정된 고체 입자인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 지지 고체면과 상기 덮개층 사이에 갇힌 수용성 층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덮개층을 덮는 액체 또는 수성 용액을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 겔 또는 폴리머 구조로 형성된 층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지 고체면 상에 금속 필름을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지 고체면은 적어도 하나의 멤브레노필릭 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 멤브레노필릭 영역은 실리콘 디옥사이드, 유리, 운모(Mica) 또는 폴리머, 또는 이들의 어떠한 조합으로 만들어지는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제8항에 있어서, 상기 표면은 플라즈마 처리되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 멤브레노필릭 영역은 금속 옥사이드 및 금속, 또는 이들의 어떠한 조합으로 만들어진 표면인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제10항에 있어서, 상기 표면은 플라즈마 처리되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 표면을 형성하는 물질은 알루미늄 옥사이드 및 금, 또는 이들의 어떠한 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덮개층은 계면활성 막으로 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제13항에 있어서, 상기 계면활성 막은 지질 이중층막, 세포막, 지질 베시클, 프로테오베시클, 지질 나노튜브, 지질 단일층, 세포 단편, 세포 소기관 및 이들의 어떠한 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제14항에 있어서, 상기 계면활성 막은 지질, 당 및/또는 단백질을 통해 상기 멤브레노필릭 영역에 적어도 부분적으로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제15항에 있어서, 상기 막은 적어도 하나의 지질막 저장소에 연결된 적어도 하나의 지질 나노튜브의 네트워크로서 형성되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 멤브레노필릭 영역은 다른 지질 또는 지질/지질 혼합물로 덮혀질 수 있으며, 여기서 멤브레노필릭 영역 특정 부분의 상기 지질 또는 상기 지질/지질 혼합물은 한 가지 유형의 지질 또는 지 질/지질 혼합물일 수 있는 반면, 멤브레노필릭 영역 특정한 다른 부분의 상기 지질 또는 상기 지질/지질 혼합물은 다른 유형의 지질이거나 지질/지질 혼합물일 수 있는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제17항에 있어서, 상기 지질/지질 혼합물은 다른 유형의 지질 또는 동일 표면 상에 공존하는 다른 상(phase) 상태의 지질을 함유할 수 있는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막은 마이크로피펫 또는 광합집게(optical tweezer)를 이용하여 단일- 또는 다층라멜라 베시클의 침착에 의해 멤브레노필릭 표면으로 도입된 지질 이중층막인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막은 표면에 걸쳐 지질 물질로 충전된 피펫의 번역에 의한 피펫-라이팅(writing) 기술을 이용하여 지질의 침착에 의해 멤브레노필릭 표면으로 도입된 지질 이중층 막인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막은 작은 베시클의 융합을 이용한 지질의 침착에 의해 멤브레노필릭 표면으로 도입된 지질 이중층 막인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막은 유체 채널 및 흐름 세포(flow cell)를 통한 지질 이중층 막의 침착에 의해 멤브레노필릭 표면으로 도입된 지질 이중층 막인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막은 용해된 지질의 직접 주입에 의한 지질 이중층 막 형성에 의해 멤브레노필릭 표면으로 도입된 지질 이중층 막인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 이중층 막의 지지 고체면으로의 흡착은 상기 지지 고체면의 부착 잠재력(adhesion potential)에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제24항에 있어서, 상기 부착 잠재력은 정적이고 하기의 어떠한 상호작용에 의해 조절될 수 있는 것을 특징으로 하는 장치: 반데르발스, 소수성, 정전기력, pi-pi 상호작용, 수소 결합 및 공유 결합성 상호작용.
- 제24항에 있어서, 상기 부착 잠재력은 동적이고 하기의 어떠한 상호작용에 의해 조절될 수 있는 것을 특징으로 하는 장치: 전기 습윤(electrowetting), 전기력 및 자기력.
- 제13항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덮개층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 상기 물질이, 덮개층 내 또는 덮개층 위 지질 부(moiety)에 묶이거나, 연결되거나 결합되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덮개층의 상기 지지 고체면에 대한 고정을 향상시키기 위해 2가 양이온을 이용하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제28항에 있어서, 상기 2가 양이온은 칼슘 이온인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덮개층은 손상되지 않은 세포로 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덮개층은 지질 유사 폴리머로 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제31항에 있어서, 상기 지질 유사 폴리머는 다이(di)-블록-폴리머인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덮개층은 계면활성 또는 에멀젼 시스템에 의해 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제33항에 있어서, 상기 계면활성 또는 에멀젼 시스템은 미셀 형성 시스템, 오일, 스펀지-상 및 이액성(lyotropic) 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 상기 물질은 외재성 및 관통 막 단백질, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-고정 단백질, 포스포리피드, 스핑고리피드, 약물, 양쪽성제(amphiphilic agent), 친지질성제, 스테롤, 당, 올리고뉴클레오티드 및 폴리머로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 상기 물질은 비-공유성 상호작용에 의해 상기 덮개층에 연결될 수 있는 분자인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 상기 물질은 비드(bead)에도 연결되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제37항에 있어서, 상기 비드는 자기 비드인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제37항에 있어서, 상기 비드는 대전된 비드인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 덮개층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 상기 물질은 운반 표지(transport marker)에도 연결되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 상기 물질은 상기 덮개층 내로 도입되거나 또는 상기 물질은 전기주입, 전기융합, 광융합, 열에 의해 도입된 융합, 전자기 방사에 의해 도입된 융합, 화학적 작용제에 의해 도입된 융합 및 디터젼트 불안정화(detergent destabilization)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기술에 의해 상기 덮개층을 형성하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 덮개층이 형성되는 동안 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 상기 물질이 상기 덮개층을 형성하는 상기 물질 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덮개 층 위의 전기장 적용을 위해 적어도 하나의 전극을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덮개 층 위의 자기장 적용을 위해 적어도 하나의 자석을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제4항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덮개 층을 덮는 액체 또는 수용액의 흐름 형성을 위한 적어도 하나의 입구 및 적어도 하나의 출구 연결부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덮개 층 주변의 추가적인 막, 단백질-지질 혼합물, 세척액, 염색액, 소화액 및 다른 용액 혹은 서스펜션의 교환을 위한 적어도 하나의 입구 및 적어도 하나의 출구 연결부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 시료의 농축 및 분리를 수행하기 위해 분획된 샘플 또는 특수화된 도메인의 수집을 위한 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치로 그리고 상기 장치 로부터 물질을 운반하기 위한 적어도 하나의 유체 채널을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 상기 물질의 분리, 단리 및/또는 농축을 위한 것을 특징으로 하는 장치.
- 제49항에 있어서, 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 상기 물질은 화학적 또는 물리학적 수정 또는 조작을 가능하게 하는 특유한 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지 고체면에 상기 덮개층을 고정하기 위한 분자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제51항에 있어서, 고정을 위한 상기 분자는 테터(tether)인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지 고체면은 평면이고 상기 멤브레노필릭 표면은 특정한 이차원 기하학 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지 고체면은 삼차원 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제54항에 있어서, 상기 삼차원 구조는 기둥(pollar)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제54 또는 제55항에 있어서, 상기 멤브레노필릭 영역은 오목한 구조 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제54 또는 제55항에 있어서, 상기 멤브레노필릭 영역은 높은 구조의 최상부에 위치하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제7항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 멤브레노필릭 영역은 포토레지스트 물질, 플라스틱, 폴리머 또는 지질 막으로 형성되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제7항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지 고체면은 하나의 멤브레노필릭과 하나의 멤브레노포빅의 두 가지 상이한 표면 영역으로 패턴화되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제7항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 복합적이거나 평행한 패턴으로 배열된, 하나 이상의 멤브레노필릭 영역 및 하나 이상의 멤브레노포빅 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제60항에 있어서, 상기 패턴은 동일한 멤브레노필릭 또는 멤브레노포빅 표면 영역의 기하학적 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제60항에 있어서, 상기 패턴은 상이한 멤브레노필릭 또는 멤브레노포빅 표면 영역의 기하학적 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제3항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용성 층은 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- (ⅰ)제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 장치를 상기 물질 일부의 조절된 분해를 수행하는 적어도 하나의 소화제(digestive agent) 또는 분해제(cleavage agent)와 접촉하여, 그 후 상기 물질이 실질적으로 이동성 부분 및 여전히 상기 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 고정부분으로 구성되는 제 1단계, 및 (ⅱ) 실질적으로 이동성 부분이 탐지 또는 분석되는 제 2단계를 포함하는 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 장치의 덮개층에 포함되거 나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 분리 또는 동정 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 소화제는 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제65항에 있어서, 상기 소화제는 트립신인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제64항 또는 제65항에 있어서, 상이한 소화제 또는 분해제의 혼합물이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 상이한 소화제 또는 분해제가 순차적으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 상이한 소화제 또는 분해제가 병행적으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제69항에 있어서, 상기 상이한 소화제 또는 분해제가 상이한 통로(lane) 또는 장치에서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 (ⅲ) 상기 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 잔존 고정 부분을 적재하는 덮개 층의 구조를 분쇄하는 최소 하나의 분쇄제(disruptive agent)와 상기 장치가 접촉하여, 그 후 실질적으로 이동성인 기초 성분으로 구성되는 제 3단계; 및 (ⅳ) 덮개 층으로부터 방출된 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 잔존 부분을 탐지 또는 분석하는 제 4단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제71항에 있어서, 상기 분쇄제는 디터전트(detergent) 또는 유기 용매인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 장치는 분쇄제와 함께 동시에 소화제 또는 분해제와 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 장치는 분쇄제와 접촉한 후, 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질을 이후 단계에서 탐지 및 분석이 가능한 작은 부분으로 더 분해하기 위해 사용되는 소화제 또는 분해제(cleavage agent)와 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 물질의 작은 부분은 단백질 단편 또는 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제64항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 두 단계의 탐지 또는 분석(ⅱ 및/또는 ⅳ)은 분리 단계가 선행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제76항에 있어서, 상기 분리는 모세관 전기영동(CE), 액체 크로마토그래피(LC), 겔-크로마토그래피 및 겔-전기영동으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석은 질량분석기에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제78항에 있어서, 사용된 상기 질량분석기는 MALDI MS 및 또는 Electrospray Ionization(ESI MS-MS)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제79항에 있어서, 사용된 상기 MALDI MS는 MALDI-TOF 및 MALDI-TOF-TOF로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석은 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석은 석영 결정 미량저울(quartz crystal microbalance)(QCM) 에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석은 형광-기초 기술에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (ⅰ)제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 장치를 용해성 물질을 함유하는 수용액과 접촉하는 제 1단계, (ⅱ)상기 장치를 수용액 내 용해성 물질의 분해를 수행하는 적어도 하나의 소화제 또는 분해제(cleavage agent)와 접촉하는 제 2단계; 및 (ⅲ) 상기 용해성 물질의 분할이 탐지 또는 분석되는 제 3단계를 포함하는 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 장치로 수용액 내 용해성 물질을 분리 및 동정하는 방법.
- 제84항에 있어서, 상기 덮개층의 존재가 기판에 용해성 물질이 부착되지 않도록 보장하여 시료의 손실을 막는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항 또는 제85항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석(ⅲ) 단계에 앞서 분리 단계가 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제86항에 있어서, 상기 분리는 모세관 전기영동(CE), 액체 크로마토그래피(LC), 겔-크로마토그래피 및 겔-전기영동으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석은 질량분석기에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제88항에 있어서, 사용된 상기 질량분석기는 MALDI MS 및 또는 Electrospray Ionization(ESI MS-MS)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제89항에 있어서, 사용된 상기 MALDI MS는 MALDI-TOF 및 MALDI-TOF-TOF로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석은 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석은 석영 결정 미량저울(quartz crystal microbalance)(QCM) 에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석은 형광-기초 기술에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 물리학적 수정 또는 조작의 상이한 단계 또는 탐지 또는 분석의 상이한 단계가 동일한 시료 상에 병행적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 물리학적 수정 또는 조작의 상이한 단계 또는 탐지 또는 분석의 상이한 단계가 상이한 시료 상에 병행적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치 내의 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 분리를 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 64-83항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치 내의 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 수집을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 64-83항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치 내의 덮개 층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 물질의 동정을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 64-83항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 액체 또는 수용액 내 용해성 물질의 분리를 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제84-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 액체 또는 수용액 내 용해성 물질의 수집을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제84-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 액체 또는 수용액 내 용해성 물질의 동정을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제84-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 제96 내지 101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질은 외재성 및 관통 막 단백질, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-고정 단백질, 포스포리피드, 스핑고리피드, 약물, 양쪽성제(amphiphilic agent), 친지질성제, 스테롤, 당, 올리고뉴클레오티드, DNA 및 폴리머로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 분리 컬럼으로의 통합을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 제103항에 있어서, 상기 분리 컬럼은 모세관 전기영동(CE) 컬럼, 액체 크로마토그래피(LC) 컬럼, 겔-크로마토그래피 컬럼 또는 겔-전기영동 컬럼인 것을 특징으로 하는 용도.
- 검출 또는 분석 시스템으로의 통합을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 제105항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석 시스템은 질량분석기인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제106항에 있어서, 상기 질량분석기는 MALDI MS 또는 Electrospray Ionization(ESI MS-MS)인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제107항에 있어서, 상기 MALDI MS는 MALDI-TOF 및 MALDI-TOF-TOF로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제105항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석 시스템은 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 시스템인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제105항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석 시스템은 석영 결정 미량저울(quartz crystal microbalance)(QCM) 시스템인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제105항에 있어서, 상기 탐지 또는 분석 시스템은 형광-기초 시스템인 것을 특징으로 하는 용도.
- 탈염 및 농축 컬럼과 결합을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 결합 상호작용의 연구를 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 단백질-약물 상호작용의 연구를 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제107항에 따른 용도.
- 리간드 결합의 연구를 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 가교결합(cross-linking) 프로토콜을 이용한 리간드 결합 상호작용의 연구를 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 제116항에 있어서, 상기 가교결합은 소화 또는 분해가 후속적인 것을 특징으로 하는 방법.
- 확산 연구를 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 화학적 상호작용의 연구를 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 화학 컴퓨터 제작을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 이식형 장치의 제작을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 마랑고니(Marangoni)-흐름 및 다른 막 특성과 결합한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 멤브레노필릭 영역 상에서 살아있는 세포의 배양을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 항체와 결합한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 제124항에 있어서, 상기 항체는 제1-62항 중 어느 한 항의 장치의 상기 멤브레노필릭 영역(들)에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 마크로분자의 집중 혹은 농축 또는 마크로분자적인 군체 형성을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 서열 커버리지 연구를 통한 막 결합 물질의 분석을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 번역-후 수정(post-translational modification)의 연구를 통한 막 결합 물질의 분석을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 막 프로테옴 프로파일링(membrane proteome profilling)을 통한 막 결합 물질의 분석을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 낮은 존재비 단백질의 연구를 통한 막 결합 물질의 분석을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 약물 발견 목표의 연구를 통한 막 결합 물질의 분석을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 목표 낚기(fishing) 연구를 통한 막 결합 물질의 분석을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 수용체 디오르파니제이션(deorphanization)을 통한 막 결합 물질의 분석을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 표현 프로파일링 및 업(up)-및-다운(down) 조절을 통한 막 결합 물질의 분석을 위한 제1-63항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도 또는 제64-95항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 제127 내지 134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막 결합 물질은 막 단백질인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제127 내지 134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막 결합 물질은 올리고사카라이드(oligosaccharide)인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 덮개층에 포함되거나 묶인, 연결되거나 결합된 상기 물질에 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작을 하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제137항에 있어서, 상기 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작은 이황화 결합의 환원 및 알킬화인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제137항에 있어서, 상기 화학적 및/또는 물리학적 수정 또는 조작은 효소적 소화 또는 글리코실화 위치에서 올리고사카라이드의 제거인 것을 특징으로 하는 용도.
- 번역-후 수정의 연구에서의 제137 내지 139항 중 어느 한 항의 용도.
- 인산화 위치 연구에서의 제137 내지 139항 중 어느 한 항의 용도.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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