DE19951509A1

DE19951509A1 - Substratgestützte Lipiddoppelschichten

Info

Publication number: DE19951509A1
Application number: DE1999151509
Authority: DE
Inventors: Joachim Raedler
Original assignee: Biotul AG I K
Current assignee: Biotul AG I K
Priority date: 1999-10-26
Filing date: 1999-10-26
Publication date: 2001-10-31

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft schnelle und kostengünstige Verfahren zur Herstellung von Lipiddoppelschichten auf Substratoberflächen sowie die behandelten Substratoberflächen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Beschichtung von Substratober flächen mit einer homogenen Lipiddoppelschicht und nach diesen Verfahren hergestellte Gegenstände.

Für viele Anwendungen in der Biosensorik und in der angewandten Forschung ist es wesentlich, Phospholipidmembranen auf Festkörperoberflächen aufzutragen [E. Sackmann; Science 271, 43-48 (1996)]. Beispiele sind Bindungsstudien von Proteinen bzw. Hormonen an Lipiddoppelschichten, die eine wesentliche Rolle bei der Signaltransduktion von Zellen spielen oder Biosensoren, die auf Leitfähigkeits messungen an Ionenkanälen auf funktionalisierten Festkörperelektroden basieren.

Weiterhin werden substratgestützte Lipiddoppelschichten zur Untersuchung der Zell adhäsion angewandt.

Substratgestützte Lipiddoppelschichten können nach bisherigen Vorstellungen am besten durch Langmuir-Blodgett Technik, d. h. durch sukzessive Übertragung jeweils einer monomolekularen Lipidschicht von der Wasser-Luft-Grenzfläche hergestellt werden, wobei die erste Schicht vorzugsweise chemisch an die Festkörper oberfläche gebunden ist [E. Kalb, S. Frey, L. K. Tamm; Biochimica et Biophysica Acta 1103, 307-316 (1992)]. Alternativ kann eine Doppelschicht mittels einer Suspension beschallter Vesikel durch Fusion und Aufplatzen der Vesikel an der Oberfläche erhalten werden [H. M. McConnell, T. H. Watts, R. M. Weis, A. A. Brian; Biochim. Biophys. Acta 864, 95-106 (1986)]. Kommerzielle Chips mit welchen Bindungsstudien an Lipidmembranen möglich sind, werden. mit Hilfe der Vesikelfusion hergestellt [Biosensor, 1995, BIAtechnolgy Note 106; BIA Journal 5(2), 17 (1998)]. Weiterhin können polymergestützte Lipiddoppelschichten erzeugt werden, die große Transmembranproteine aufnehmen können [E. Sackmann; Science 271, 43-48 (1996)].

Weiterhin beschreiben US-A-5,401,378 und B. Raguse et al. [Langmuir 14, 648- 659 (1998)] die Herstellung von Lipiddoppelschichten. In diesem Fall werden zunächst Thiolipide chemisch an eine Goldoberfläche gebunden und anschließend miti einer weiteren Monoschicht versehen. Es entsteht eine Polymer-verankerte Doppelschicht ("tethered membrane"), bei der keine Diffusion mit langer Reichweite von amphiphilen Molekülen auf der dem Substrat zugewandten Seite möglich ist.

Substratgestützte Lipiddoppelschichten, die für analytische Zwecke eingesetzt werden, müssen einfach hergestellt werden können und eine defektfreie Beschichtung aufweisen. Insbesondere die Anwendung im High-Throughput- Screening Verfahren verlangt sehr homogene Beschichtungen.

Die bekannten Verfahren haben verschiedene Nachteile. Prinzipiell sind die Verfahren, die lediglich eine Lipidmonoschicht auf ein mit einer Monoschicht hydrophobisiertes Substrat auftragen, nicht geeignet Transmembranproteine zu verankern, da die dem Substrat zugewandte Seite der Doppelschicht zu dicht am Substrat anliegt. Die Verwendung von Thiolipiden zur Herstellung verankerter Membranen ist auf die Beschichtung von Goldoberflächen beschränkt. Werden Lipidschichten über Vesikelfusion hergestellt, so ist eine homogene Beschichtung nicht gesichert. Weiterhin sind Verfahren wie die Langmuir-Blodgett Technik mit einem hohen verfahrenstechnischen Aufwand verbunden. Der Hauptnachteil aller bekannter Verfahren folgt aber aus der Tatsache, daß substratgestützte Lipiddoppel schichten nur in wässrigen Medien haltbar sind. Vorgefertigte Oberflächen müßten demnach feucht gehalten werden, womit sich gravierende verkaufstechnische Beschränkungen z. B. bei der Sterilität, Haltbarkeit und Verpackung ergeben.

Aus den aufgeführten Nachteilen stellt sich die Aufgabe, ein. Verfahren zur Verfügung zu stellen, nach welchem der Anwender eine homogene substratgestützte Lipiddoppelschicht von hoher Qualität auf einfache Weise und in kurzer Zeit zuverlässig herstellen kann. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, mit Lipid vorbehandelte Substratoberflächen zur Verfügung zu stellen, die vom Anwender schnell und einfach zu Lipiddoppelschichten aktiviert werden können. Weiterhin sollen Lipiddoppelschichten mit einer hohen Homogenität zur Verfügung gestellt werden, die zum Einsatz in der High-Throughput-Technik eingesetzt werden können.

Diese Aufgaben werden gelöst durch ein Verfahren zum Auftragen einer Lipiddoppelschicht auf einer Substratoberfläche, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Substratoberfläche;
b) in Kontakt bringen der Substratoberfläche mit einer Lösung, umfassend mindestens ein Lipid, mindestens ein mit Wasser mischbares, organisches Lösungsmittel LM1 und ggf. Wasser, wobei die Konzentration von Wasser c(H₂O) in der Lipidlösung kleiner als die kritische Benetzungskonzentration c_B(H₂O) des Lipids/der Lipide ist;
c) Erhöhung der Konzentration von Wasser c(H₂O) in der Lipidlösung, bis die Konzentration von Wasser mindestens die kritische Benetzungskonzentration c_B(H₂O) entspricht aber kleiner als die kritische Vesikelbildungskonzentration c_V(H₂O) ist.

Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren zum Auftragen einer Lipiddoppelschicht auf einer Substratoberfläche zur Verfügung, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Substratoberfläche;
b) in Kontakt bringen der Substratoberfläche mit einer Lösung, umfassend mindestens ein Lipid und mindestens ein organisches Lösungsmittel LM2;
c) Entfernen des Lösungsmittels aus dem Lipidgemisch auf der Substratober fläche;
d) in Kontakt bringen der Substratoberfläche mit einem Gemisch, umfassend mindestens ein mit Wasser mischbares, organisches Lösungsmittel LM1 und Wasser, wobei die Konzentration von Wasser c(H₂O) in dem Gemisch mindestens die kritische Benetzungskonzentration c_B(H₂O) des Lipids/der Lipide entspricht aber kleiner als die kritische Vesikelbildungskonzentration c_V(H₂O) des Lipids/der Lipide ist.

Außerdem betrifft die Erfindung Gegenstände, umfassend eine Substratoberfläche, auf die eine Lipiddoppelschicht gemäß einem der vorstehenden Verfahren aufgetragen ist.

In einer weiteren Ausführungsform wird ein Gegenstand, umfassend eine Substrat oberfläche beschrieben, der zur Herstellung einer Lipiddoppelschicht geeignet ist, der nach dem Verfahren, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Substratoberfläche;
b) in Kontakt bringen der Substratoberfläche mit einem Gemisch, umfassend mindestens ein Lipid und mindestens ein organisches Lösungsmittel LM2;
c) Entfernen des Lösungsmittels LM2 aus dem Lipidgemisch auf der Substrat oberfläche;

hergestellt ist.

Verwendete Abkürzungen:
DMPC: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin
DMPS: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin
DMTAP: 1,2-Dimyristoyi-sn-glycero-3-trimethylammoniumpropan
DOPC: 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin
DOPS: 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin
DOTAP: 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-trimethylammoniumpropan
EW31: Poly(4-vinylpyridin), quarternisiert mit 1-Brombutan
HEPES: 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure
NBD: Nitrobenzoxadiazol
NBD-DPPE: 1,2-Dipalmitoly-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (Nitrobenzoxadiazol)
PEI: Polyethylenimin, verzweigt (erhältlich von Aldrich)
PSPA: Poly(3-sulfopropylacrylat) (Monomer erhältlich von Raschig)
SOPC: Stearoyloleylglycerophosphocholin

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt eine Darstellung der Benetzung einer Festkörperoberfläche und der Vesikelbildung durch Lipide als Funktion der Wasserkonzentration in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel:

a) in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischem Lösungsmittel liegen die Lipide bei niedriger Wasserkonzentration nicht assoziert vor (c(H₂O) < c_B(H₂O));
b) bei Erhöhung der Wasserkonzentration bilden die Lipide spontan eine Lipid doppelschicht auf der Festkörperoberfläche (c_B(H₂O) ≦ c(H₂O) < c_V(H₂O));
c) bei einer weiteren Erhöhung der Wasserkonzentration setzt schließlich die Vesikelbildung im Volumen ein (c(H₂O) ≦ c_V(H₂O)).

In Fig. 2 ist eine schematische Darstellung des Verlaufs des Belegungsgrades des Substrats und der Vesikelkonzentration im Volumen in Abhängigkeit von der Wasserkonzentration in einer Lösung bestehend aus Lipid, Wasser und mit Wasser mischbarem organischem Lösungsmittel angegeben. Die gestrichelte Kurve stellt den Belegungsgrad des Substrats mit einer Lipidmembran dar (0 = kein Lipid, 1 = vollständige Belegung). Die durchgezogene Kurve stellt den Grad der Vesikelbildung dar (0 = keine Vesikel, 1 = vollständige Vesikelbildung).

Die Fig. 3 zeigt konfokale fluoreszenzmikroskopische Schnitte senkrecht zum Boden einer Messkammer. Für das System bestehend aus DOPC : DOPS (9 : 1) in einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser wird bei einer Lipidkonzentration von 1 mg/ml die Bildung der Lipiddoppelschicht an einer Glasoberfläche beobachtet, die zuvor jeweils mit PEI, PSPA und dem Polykation 1 beschichtet wurde.

Der dunkle Bereich liegt unterhalb der Deckglasoberfläche, während der mittelgraue Bereich das Lösungsmittel darstellt. Die Lipiddoppelschicht ist als heller Streifen zu erkennen.

Fig. 4 zeigt die Strukturformel von Polykation 1.

Eine schematische Darstellung der Vorgehensweise in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist in Fig. 5 angegeben.

a) Eine organische Lipidlösung wird auf die Substratoberfläche einer schematisch dargestellten Meßkammer gegeben und eingetrocknet. Es entstehen ungeordnete Multischichten.
b) Durch Spülen mit einem Lösungsmittelgemisch mit einer Wasserkonzentration im Bereich von c_B(H₂O) ≦ c(H₂O) < c_V(H₂O) werden die Lipidschichten bis auf die letzte wandnahe Lipiddoppelschicht entfernt.

Die Struktur von EW31 ist in Fig. 6 gezeigt (n ist von 20 bis 5000).

Mit den erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Lipiddoppelschichten auf Substrate auftragen. Die so hergestellten Oberflächen eigenen sich z. B. in Biochips als Sensoroberflächen zur Modellierung und Untersuchung von Membranvorgängen bei biologischen Prozessen. Die Sensoren können u. a. in der optischen Spektro skopie und bei Interferenzverfahren, besonders in der Oberflächenplasmonen resonanz, ferner bei Schwingquarzsensoren eingesetzt werden.

Die Lipiddoppelschicht ist substratgestützt. Die Wahl der chemischen Zusammen setzung der Substratoberfläche ist nicht besonders beschränkt. Als Substrate kommen sowohl leitende, nichtleitende als auch halbleitende Oberflächen in Betracht. Beispielhaft können Metalle, bevorzugt der Gruppen IV A bis VIII und I B bis III A, Halbleiter wie Si, Ga, Ge, As, In, sowie Gläser genannt werden. Daneben ist es ebenfalls möglich Polymere, wie Polycarbonat, Polyethylen, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polymethylmethacrylat und Polymere, in die cyclische Olefine einpolymerisiert sind, wie TOPAS® (Thermoplastisches Olefinpolymer amorpher Struktur), als Substrat zu verwenden. Die Lipiddoppelschichten bilden sich besonders gut an allen geladenen und/oder hydrophilen Oberflächen. Bevorzugte Oberflächen sind polyelektrolytbeschichtetes Glas oder Quarz und Edelmetalle, insbesondere Gold.

Die Lipiddoppelschichten werden bevorzugt zur Untersuchung von biologischen Membranprozessen eingesetzt. Hierbei ist es von besonderer Bedeutung den zu untersuchenden Substanzen und Lipiden eine Oberfläche anzubieten, die den natürlichen Bedingungen möglichst ähnelt. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es möglich die Substratoberfläche vorzubehandeln. Eine Möglichkeit ist die Aufbringung einer oder mehrerer Schichten aus Polyelektrolyt. Polyelektrolyte weisen z. T. ein Wassergehalt auf, die dem Wassergehalt einer natürlichen Oberfläche ähnelt. Geeignete Polyelektrolyte sind Polyelektrolyte, die keine großen hydrophoben Gruppen aufweisen. Bevorzugte Polyelektrolyte sind Polyethylenimin, oder mit kurzen (1 bis 4 Kohlenstoffatomen) quaternisierte Poly-(4-vinylpyridine) oder Poly-(3- N,N-dimethylamino)propyl)methacrylamide). Es können auch Gemische geeigneter Polyelektrolyte eingesetzt werden.

Weiterhin kann die Substratoberfläche durch chemische und physikalische Verfahren vorbehandelt werden. Durch die Einwirkung von Basen (z. B. 20 min 1 M KOH oder LiOH) auf das Substrat wird das Anbinden kationischer Lipide (z. B. DOTAP) und neutraler Lipide (z. B. DOPC, DMPC, SOPC) verbessert. Erwärmen oder/und Pressen kann bei einigen Substraten (z. B. PC, PE, PS, PVC und cyclische Olefine) die Oberfläche glätten, und so die Bildung einer homogenen Schicht erleichtern. Durch das Reinigen mit basischen Reinigungsmitteln unter Verwendung von Ultraschall kann ebenfalls die Oberflächengüte von Membranbeschichtungen verbessert werden.

Ein Vorteil der Erfindung ist, daß die substratgestützten Lipiddoppelschichten je nach Bedarf entweder nach einem trockenen Verfahren oder nassen Verfahren hergestellt werden können. Bei dem trockenen Verfahren wird eine Lipidlösung auf die Substratoberfläche eingetrocknet, wobei ungerichtete Lipidmultischichten entstehen. In dieser Form ist das Substrat, z. B. ein Sensorchip, lagerfähig und kann ohne besondere Vorkehrungen an Anwender versandt werden. Um die gewünschte Lipiddoppelschicht zu erzeugen, muß der Anwender lediglich das Substrat für kurze Zeit mit einem geeignetem Gemisch aus organischem Lösungsmittel und Wasser in Kontakt bringen. Bei dem nassen Verfahren kann der Anwender selbst schnell und einfach, ohne besondere technische Vorrichtungen die gewünschte Lipiddoppel schicht erzeugen. Die Substratoberfläche wird zunächst mit einer Lipidlösung in Kontakt gebracht. Durch Erhöhen der Konzentration von Wasser in der Lipidlösung bildet sich spontan eine Lipiddoppelschicht an der Substratoberfläche. Im folgenden sollen die beiden Verfahren näher erläutert werden.

Die vorliegenden Erfinder haben festgestellt, daß die Vorteile der erfindungs gemäßen Verfahren nur erzielt werden, wenn bei dem Schritt, in dem die Lipid doppelschicht gebildet wird, ein Gemisch aus Wasser und mindestens einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel LM1 verwendet wird. Die Konzentration des Wassers in diesem Gemisch ist von entscheidender Bedeutung. Nur wenn die Konzentration des Wassers in dem kritischen Benetzungsbereich liegt, werden homogene, defektfreie Schichten erhalten. Ist die Wasserkonzentration zu niedrig, bildet sich keine Lipiddoppelschicht an der Substratoberfläche. Ist die Konzentration des Wassers dagegen zu hoch, bilden sich in der Lösung Vesikel, die je nach Beschaffenheit des Substrats mit diesem nicht mehr fusionieren. Eine defektfreie, homogene Beschichtung kann auf beliebigen Substraten erreicht werden, wenn der kritische Bereich bekannt ist. In den Beispielen werden Verfahren zur Bestimmung der kritischen Benetzungskonzentration und der kritische Vesikel bildungskonzentration angegeben.

Zur Erläuterung seien die Grundlagen der Lipiddoppelschichtbildung kurz beschrieben: Lipide bestehen aus einem hydrophilen Kopf und mindestens einer hydrophoben Kette. In wässriger Lösung lagern sich Lipide auf Grund des sogenannten hydrophoben Effekts zu Lipiddoppelschichten an. Die hydrophobe Wechselwirkung bewirkt, daß sich die hydrophoben Lipidketten in einer Weise zusammenfügen, daß sie dem Wasser abgewandt sind. Dadurch entstehen Lipiddoppelschichten, die in wässriger Lösung geschlossene Schalen (Vesikel) bilden. In organischen Lösungsmitteln dagegen liegen Lipide gelöst, d. h. als isolierte Einzelmoleküle vor. In Gemischen von Wasser und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln LM1, kann die Stärke der hydrophoben Wechselwirkung genau eingestellt werden. In einem bestimmten, engen Konzentrationsbereich, der zwischen den beiden oben diskutierten Konzentrationsbereichen liegt, bildet sich spontan eine homogene, defektfreie Lipiddoppelschicht an einer angebotenen Substratoberfläche.

In Fig. 1 ist die Bildung einer substratgestützten Lipiddoppelschicht schematisch dargestellt. In Bild i liegen die Lipide im organischen Lösungsmittel LM1 und ggf. Wasser gelöst vor. Wird nun Wasser zugegeben, erhöht sich die Neigung der Lipide, Doppelschichten zu bilden und es entsteht ab der kritischen Benetzungs konzentration, c_B(H₂O), spontan eine Lipiddoppelschicht auf dem Substrat (Bild ii). Da die Lipide an der Wand energetisch bevorzugt sind, entsteht die Lipiddoppel schicht bei einer Konzentration von Wasser, die keine Vesikelbildung im Flüssig keitsvolumen erlaubt. Erst ab der kritischen Vesikelbildungskonzentration c_V(H₂O) bilden sich Vesikel in der Lösung (Bild iii). Die Vesikel können leicht z. B. durch Spülen entfernt werden, und man erhält eine einzelne substratgestütze Lipiddoppel schicht. Entscheidend für die beiden hier beschriebenen Verfahren ist, daß es zwei kritische Punkte der Wasserkonzentration gibt:

1. die kritische Benetzungskonzentration, c_B(H₂O), ab der sich spontan eine Lipiddoppelschicht auf dem Substrat bildet; und
2. die kritische Vesikelbildungskonzentration, c_V(H₂O), ab der die Vesikelbildung im Flüssigkeitsvolumen einsetzt.

Dies ist in Fig. 2 noch einmal verdeutlicht. Die gestrichelte Kurve stellt den Belegungsgrad des Substrats mit einer Lipiddoppelschicht dar (0 = keine Lipid, 1 = vollständige Belegung). Die durchgezogene Kurve stellt den Grad der Vesikelbildung dar (0 = keine Vesikel, 1 = vollständige Vesikelbildung). In Fig. 3 sind konfokale fluoreszenzmikroskopische Schnitte senkrecht zum Boden einer Messkammer gezeigt. Im Konzentrationsbereich i (Bild (a) und (b)) liegt das Lipid im gelöstem Zustand vor. In dem kritischen Konzentrationsbereich (Bild (c)) c_B(H₂O) ≦ c(H₂O) < c_V(H₂O) bildet sich spontan eine Lipiddoppelschicht auf der Substratoberfläche, die auch bei einer weiteren Erhöhung der Wasserkonzentration über c_V(H₂O) hinaus bestehen bleibt (Bild (d)). Die Lipiddoppelschicht ist als heller Streifen zu erkennen.

Die kritische Benetzungskonzentration c_B(H₂O) und die kritische Vesikelbildungs konzentration c_V(H₂O) müssen für das jeweilige System bestehend aus Lipid, Substrat und organischem Lösungsmittel experimentell ermittelt werden. Im Allgemeinen liegt die kritische Benetzungskonzentration im Bereich einem Wasser gehalt von 20 bis 90 Vol.-% Wasser bezogen auf das Gesamtvolumen der Lösung, besonders im Bereich von 30 bis 50 Vol.-%. Die kritische Vesikelbildungs konzentration liegt üblicherweise nur 0,1 bis 10 Vol.-% über der kritischen Benetzungskonzentration, meistens im Bereich von 1 bis 2 Vol.-% über der Benetzungskonzentration.

Als organische Lösungsmittel LM1 eignen sich alle mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, in die sich das eingesetzte Lipid in der verwendeten Konzentration bei Raumtemperatur vollständig löst. Im Rahmen der Erfindung werden Lösungsmittel als mit Wasser mischbar bezeichnet, wenn sie sich im Konzentrationsbereich c(H₂O) < c_V(H₂O) vollständig mit Wasser mischen, d. h. nur eine Phase visuell erkennbar ist. Beispiele sind polare, protische Lösungsmittel wie C_1-8-Alkohole, oder polare aprotische Lösungsmittel wie Formamid, N,N-Dimethyl formamid, Dimethylsulfoxid oder Aceton. Bevorzugt sind Alkohole, besonders bevorzugt sind Ethanol, Isopropanol und Octanol. Die Eignung eines Lösungsmittels, in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt zu werden, kann mit den Tests zur Bestimmung der kritischen Benetzungskonzentration und der kritischen Vesikel bildungskonzentration ermittelt werden. Wenn ein Lösungsmittel in dem verwendeten Lösungsmittel/Lipid-System beide Punkte besitzt, kann es in dem erfindungs gemäßen Verfahren eingesetzt werden. Selbstverständlich können auch Lösungs mittelgemische eingesetzt werden.

Weiterhin kann das Gemisch Salze wie NaCl, KCl, CaCl₂, MgCl₂, HEPES, Ethylen diamintetraacetat, AgCl und Acetat in einer Konzentration von 1 µM bis 500 mM enthalten.

Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich zum Auftragen von Lipiddoppel schichten aller gängigen Lipide. Beispiele geeigneter Lipidklassen sind Lecithine, Glykolipide und Phospholipide. Besonders bevorzugt sind Lecithine und Glykolipide, vorallem DOPC, DOPS, DOTAP, DMPC, DMPS und DMTAP. Durch die Verwendung von Lipidgemischen können mit den erfindungsgemäßen Verfahren gemischte Doppelschichten aus mehreren Lipiden hergestellt werden. Die Konzentration von Wasser im Lösungsmittelgemisch wird in diesem Falle so eingestellt, daß die Bedingung c_B(H₂O) ≦ c(H₂O) < c_V(H₂O) für alle verwendeten Lipide erfüllt ist.

Um eine verbesserte Haftung der Membran auf geladenen Oberflächen zu erzielen, werden vorteilhafterweise mindestens 0,1 mol-%, bevorzugt zwischen 10 und 100 mol-%, bezogen auf die Gesamtmolzahl der Lipide geladene Lipide eingesetzt. Eine weitere Verbesserung wird erzielt, wenn die Substratoberfläche vor dem Aufbringen der Lipiddoppelschicht im Vergleich zu den verwendeten, geladenen Lipiden entgegengesetzt geladen ist. So kann bei anionischem Lipid die Substratoberfläche durch entsprechende Vorbehandlung mit Molekülen mit endständigen Aminogruppen funktionalisiert sein. Bei einer Goldoberfläche ist beispielsweise eine Behandlung der Oberfläche mit α-Aminoalkan-ω-thiolverbindungen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen zur Funktionalisierung der Oberfläche besonders geeignet.

Die Erfindung soll nun anhand von zwei bevorzugten Ausführungsformen näher erläutert werden.

Bei dem trocknen Verfahren wird ein Gemisch des Lipids/der Lipide in einem organischen Lösungsmittel LM2 auf die Substratoberfläche aufgebracht. Dieses organische Lösungsmittel LM2 kann jedes geeignete organische Lösungsmittel sein, in dem das Lipid in der verwendeten Konzentration bei Raumtemperatur gelöst werden kann. Die Auswahl des organischen Lösungsmittels LM2 ist nicht auf die obenerwähnten organischen Lösungsmittel LM1 beschränkt, die in dem Doppel schichtbildungsschritt verwendet werden. Es ist selbstverständlich, daß auch Gemische der organischen Lösungsmittel LM2 geeignet sind und daß bei mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln auch Wasser im Gemisch vorhanden sein kann. Die Konzentration des Lipids und die Menge des Gemisches werden vorzugsweise so gewählt, daß 0,5 bis 250 µg Lipid/cm² Substratoberfläche nach dem Trocknen verbleiben. Üblicherweise wird auf eine Substratoberfläche mit einer Fläche von 1 cm² etwa 50 µl eines Lipidgemisches aufgebracht. Die Konzentration des Lipids im organischen Lösungsmittel LM2 liegt meistens im Bereich von 10 bis 5000 µg/ml, bevorzugt bei etwa 1000 µg/ml. Die Art der Auftragung ist nicht entscheidend. In der Regel wird eine Pipette verwendet.

Nach dem Auftragung des Lipidgemisches wird das Lösungsmittel z. B. durch Anlegen von Unterdruck, durch Erwärmen oder durch Abblasen mit einem Inertgas wie Stickstoff entfernt. Es ist selbstverständlich, daß die Bedingungen so gewählt werden, daß weder das Substrat noch die Lipide beeinträchtigt werden. Beispiels weise kann das Lösungsmittel durch 30minütiges Erwärmen bei 37°C oder Stehenlassen bei Raumtemperatur entfernt werden.

Der so erhaltene Gegenstand kann in dieser Form in den Handel gebracht werden. Derzeit übliche Lipiddoppelschichten, die z. B. nach dem Langmuir-Blodgett Verfahren hergestellt werden, müssen jeweils vom Anwender nach einem aufwendigen Verfahren hergestellt werden und sind selbst unter Wasser nur begrenzt haltbar. Dagegen sind die Gegenstände mit den getrockneten Lipidmulti schichten lagerfähig und können ohne besondere Vorkehrungen vom Hersteller an die Anwender versandt werden. Der Anwender muß lediglich die vorbehandelte Substratoberfläche mit dem hierin beschrieben Lösungsmittel/Wasser-Gemisch in Kontakt bringen, um die gewünschte substratgestützte Lipiddoppelschicht zu erhalten.

Die vorbehandelte Substratoberfläche kann auf verschiedene Weisen mit dem Lösungsmittel/Wasser-Gemisch in Kontakt gebracht werden. Das vorbehandelte Substrat kann in einem Behälter mit dem geeigneten Lösungsmittel/Wasser- Gemisch gelegt werden und anschließend mit Wasser gespült werden, um überschüssiges Lipid zu entfernen. Bevorzugt ist die vorbehandelte Substrat oberfläche wie in Fig. 5 gezeigt in einer Durchflußzelle untergebracht. Die Durchflußzelle kann in dieser Ausführungsform nicht nur zum Erzeugen der Lipiddoppelschicht, sondern auch für die Zufuhr von weiteren Substanzen während den nachfolgenden Experimenten mit der Lipiddoppelschicht verwendet werden.

Das Ablösen der oberen Schichten der Lipidmultischichten dauert in der Regel etwa 10 Minuten. Während des Spülvorgangs kann die Winkelverschiebung simultan mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) beobachtet werden, wenn die Durch flußzelle auch als Meßzelle für die SPR ausgestaltet ist. Wenn die ermittelte Winkelverschiebung bei etwa 0,5° liegt, ist nur noch die gewünschte Lipiddoppel schicht an der Substratoberfläche vorhanden und der Gegenstand ist einsatzbereit.

Bei der zweiten bevorzugten Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßer Gegenstand nach dem nassen Verfahren hergestellt. Zunächst wird die Substratoberfläche mit der Lösung eines oder mehrerer Lipide in Kontakt gebracht. Als Lösungsmittel werden ein oder mehrere der vorstehend beschriebenen mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel LM1 und ggf. Wasser verwendet. Die Konzentration von Wasser in diesem Gemisch ist kleiner als die kritische Benetzungskonzentration c_B(H₂O). Die Lipidkonzentration liegt üblicherweise im Bereich von 10 µg/ml bis 2500 µg/ml, bevorzugt von 50 µg/ml bis 500 µg/ml.

Anschließend wird die Wasserkonzentration in der Lösung erhöht, so daß sie die Bedingung c_B(H₂O) ≦ c(H₂O) < c_V(H₂O) erfüllt. Sobald die kritische Benetzungs konzentration überschritten wird, bildet sich spontan eine Lipiddoppelschicht an der Oberfläche des Substrats. Zur Erzielung besonders homogener Schichten sollte die Konzentration von Wasser in der Lösung langsam erhöht werden. Einerseits wird so Turbulenz vermieden und andererseits wird vermieden, daß sich lokal in der Bulkphase Bereiche vorhanden sind, in denen zeitweise die Konzentration von Wasser größer als c_V(H₂O) ist. Es sollte auch nicht schlagartig die Konzentration von Wasser von c(H₂O) < c_B(H₂O) auf c(H₂O) < c_V(H₂O) erhöht werden, da ansonsten die Lipide Vesikel bilden und somit nicht mehr zum Benetzen des Substrats zur Verfügung stehen. Außerdem wird die Beschichtung inhomogen und weist Lipidschläuche auf, die mit der substratgestützten Membran verbunden sind. Bevorzugt wird die Konzentration des Wassers mit gleichmäßiger Rate innerhalb einer Zeitspanne von 5 Sekunden bis 1 Stunde, bevorzugt 1 Minute bis 30 Minuten, erhöht.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es wesentlich bei einer Konzentration von Wasser kleiner als c_B(H₂O) anzufangen und anschließend die Konzentration von Wasser zu erhöhen. Wenn man umgekehrt mit einer Konzentration von Wasser größer als c_V(H₂O) beginnt und Lösungsmittel zugibt werden Lipiddoppelschichten minderer Qualität erhalten. Bei diesen Schichten sind dann bei fluoreszenzmikro skopischen Studien Inhomogenitäten erkennbar.

Nach der Bildung der Lipiddoppelschicht kann die behandelte Substratoberfläche mit Wasser oder Pufferlösung gespült werden, um überschüssiges, in der Lösung vorhandenes, Lipid zu entfernen.

Die Bildung der Lipiddoppelschicht kann, wie in der ersten Ausführungsform beschrieben, in einem abgeschlossenen Gefäß oder einer Durchflußzelle erfolgen. Auf Grund der Automatisierbarkeit und der einfachen Handhabung ist auch in der zweiten Ausführungsform der Einsatz einer Durchflußzelle bevorzugt. Die Einstellung der Wasserkonzentration kann z. B. im Gegenstromverfahren oder durch Diffusion erfolgen.

Das nasse Verfahren bietet den großen Vorteil, daß funktionelle Moleküle, wie Glykolipide, Lipopolysaccharide oder funktionalisierte Lipide, wie biotinylierte Lipide auf einfache Weise in die Lipiddoppelschicht eingebracht werden können. Die funktionellen Moleküle werden zusammen mit den Lipiden in dem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel LM1 und ggf. Wasser gelöst. Bei der Bildung der Lipiddoppelschicht werden die funktionellen Moleküle mit eingebaut. Ein weiterer Vorteil des nassen Verfahrens ist, daß der Endanwender die Lipidzusammensetzung der Membran frei wählen kann.

Das trockene Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß die Beschichtung kurzfristig auf einfache Weise vor der Anwendung aktiviert werden kann. Lagerung und Transport der Vorstufe mit eingetrockneter Lipidmultischicht sind unproblematisch möglich.

Die erzeugten substratgestützten Lipiddoppelschichten sind sehr homogen und zeichnen sich durch hohe Selbstdiffussionskonstanten der Lipide aus, die in der Größenordnung der entsprechenden freien Lipiddoppelschichten liegen.

Ein weiterer Vorteil ist, daß nur geringe Lipidmengen bei den erfindungsgemäßen Verfahren benötigt werden. In der Regel werden bei dem nassen Verfahren etwa 50 µg/cm² Lipid, bei dem trocknen Verfahren etwa 50 µg Lipid zum Herstellen einer 1 cm² großen Lipiddoppelschicht benötigt. Bei der im Stand der Technik üblichen Vesikelfusion werden 5000 µg/ml benötigt.

BEISPIELE Bestimmung der kritischen Benetzungskonzentration c_B(H₂O)

Zur Bestimmung der kritischen Benetzungskonzentration wird eine Verdünnungs reihe von Lösungen angesetzt, die das gewählte Lipid, einen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff, Wasser und das gewählte organische Lösungsmittel LM1 enthalten. Als Fluoreszenzfarbstoff eignet sich beispielsweise NBD der Firma Avanti Polar Lipids in einer Konzentration von 0,1-2 Gew.-% bezogen auf das Gewicht der Lösung. Zunächst werden Lösungen z. B. mit einem Verhältnis von Wasser zu organischem Lösungsmittel LM1 von 10 : 90, 20 : 80, 30 : 70, . . ., 90 : 10 mit der gewählten Substratoberfläche in Kontakt gebracht und untersucht, um die ungefähre Lage von c_B(H₂O) zu bestimmen. Anschließend werden im ermittelten Bereich Zwischenverdünnungen hergestellt und untersucht, um den exakten Wert zu bestimmen. Die kritische Benetzungskonzentration wird mit Hilfe eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops (Axiovert der Firma Zeiss) bestimmt. Hierbei werden dreidimensionale Bilder der Fluoreszenzverteilung aufgenommen, die die Bildung einer Lipiddoppelschicht an der Substratoberfläche nachweisen (siehe Fig. 3).

Die kritische Benetzungskonzentration kann auch mit Hilfe der abgeschwächten Totalreflektion-Fourier Transform Infrarotspektroskopie (ATR-FTIR; Nicolet 60 SXR) bestimmt werden. Es wird wie bei der Bestimmung von c_B(H₂O) mittels konfokale Fluoreszenzmikroskopie eine Verdünnungsreihe von Lösungen, die Wasser und das gewählte organische Lösungsmittel enthalten, hergestellt. Ein Teil jeder Lösung wird jeweils mit dem gewählten Lipid in der gewünschten Konzentration versetzt, der zweite Teil wird als Referenzlösung verwendet.

Die hergestellten Lipid- und Referenzlösungen werden mit dem gewählten Substrat in Kontakt gebracht und die Konzentration der Lipide bzw. der CH₂-Gruppen in unmittelbare Nähe (d. h. bis zu 750 nm) des Substrates wird mittels ATR-FTIR bestimmt. Die Referenz wird benötigt, um den Untergrund, der durch die CH₃- Schwingungsbanden des Lösungsmittels hervorgerufen wird, abzuziehen. Es wird ein sigmoidaler Verlauf der Konzentration der oberflächennahen Lipide beobachtet, wobei der Wendepunkt die kritische Benetzungskonzentration entspricht (siehe Fig. 2).

In einer dritten Möglichkeit zur Bestimmung der kritische Benetzungskonzentration kann auf die Verwendung von Referenzlösungen bei der ATR-FTIR verzichtet werden. Stattdessen werden deuterierte Lipide verwendet, da sich die Schwingungs banden der deuterierten CD₂-Gruppen der Lipide (etwa 2200 cm^-1) normalerweise ausreichend von den Schwingungsbanden der CH₃-Gruppen des Lösungsmittels (bei Isopropanol etwa 2970 cm^-1) unterscheiden.

Bestimmung der kritischen Vesikelbildungskonzentration c_V(H₂O)

Wie bei der Bestimmung der kritische Benetzungskonzentration wird eine Verdünnungsreihe von Lösungen, die Wasser, das gewählte organische Lösungsmittel und das gewählte Lipid enthalten, hergestellt. Mit Hilfe von Lichtstreuung (Eigenbau) kann die mittlere Teilchengröße in der Lösung bestimmt werden. Es wird wieder ein sigmoidaler Verlauf beobachtet, wobei der Wendepunkt die kritische Vesikelbildungskonzentration entspricht (siehe Fig. 2).

Beispiel 1 Herstellung anionischer Lipiddoppelschichten auf einer Goldoberfläche nach dem trockenen Verfahren

Ein Goldsubstrat wird zunächst 12 Stunden in eine 2 × 10^-2 molare wässrige Cysteamin-Lösung gefegt, um eine cysteamin-beschichtete Goldoberfläche zu erzeugen. Anschließend werden alternierend je drei Schichten PSPA Polyanion und EW31 Polykation als Polyelektrolytschichten aufgebracht. Hierzu wird das vorbehandelte Substrat im Wechsel jeweils in eine PSPA-Lösung (1 × 10^-3 mol/l) und in eine EW31-Lösung (2 × 10^-2 mol/l) gelegt und anschließend mit Wasser gespült. Beide Lösungen sind jeweils wäßrige Lösungen und haben einen pH-Wert von 2. Die Inkubationszeit beträgt für jede Polyelektrolytschicht 20 Minuten.

Für die Herstellung der Lipiddoppelschicht auf der Cysteamin-Polyelektrolytschicht wird ein Lipidgemisch aus DOPC : DOPS (9 : 1, mol : mol) in 100% Isopropanol eingesetzt in einer Konzentration von 1 mg/ml. Ein Tropfen der Lipidlösung wird durch Auftropfen auf der Oberfläche eingetrocknet. Die vorbehandelte Oberfläche kann in diesem Zustand gelagert werden. Zur Aktivierung wird die Oberfläche mit einem Isopropanol : Wasser-Gemisch (Verhältnis: 20 : 80 v : v) gespült. Überzählige Lipidschichten werden so abgetragen und es verbleibt eine Lipiddoppelschicht auf der Oberfläche.

Beispiel 2 Herstellung anionischer Lipiddoppelschichten auf einer Glasoberfläche nach dem nassen Verfahren

Ein Glassubstrat wird zunächst mit drei unterschiedlichen Polyelektrolytschichten beschichtet. Das Substrat wird nacheinander mit einer wäßrigen Polyethylenimin- Lösung (2 × 10^-2 mol/l), PSPA-Lösung (1 × 10^-3 mol/l) und EW31-Lösung (2 × 10^-2 mol/l), jeweils mit einem pH-Wert von 2, in Kontakt gebracht. Die Inkubationszeit beträgt für jede Polyelektrolytschicht 20 Minuten. Für die Herstellung der Lipid doppelschicht auf der Polyelektrolytschicht wird ein Lipidgemisch aus DOPC : DOPS (9 : 1, mol : mol) eingesetzt. Dem Lipidgemisch wird der Farbstoff NBD-DPPE in einer Konzentration von 1 mol pro 100 mol Gesamtlipid zugesetzt, um fluoreszenz mikroskopische Untersuchungen an der festkörpergestützten Lipiddoppelschicht durchzuführen (siehe Fig. 3). 50 µl Lipid werden in 490 µl Isopropanol und 110 µl Wasser gelöst. Anschließend wird langsam mit Wasser verdünnt, bis sich bei einem Isopropanol : Wasser-Verhältnis von 72 : 28 v : v eine Lipiddoppelschicht an der Glasoberfläche bildet. Überschüssiges Lipid wird mit Wasser weggespült.

Beispiel 3 Herstellung kationischer Lipiddoppelschichten auf einer Glasoberfläche nach dem nassen Verfahren

Als Substrat dient Glas, das mit 1 M KOH vorbehandelt wird. Für die Herstellung der Lipiddoppelschicht auf der Polyelektrolytschicht (EW31) wird ein Lipidgemisch aus DOPC : DOTAP (9 : 1, mol : mol) eingesetzt. Die Lipidmischung ist in einem Isopropanol : Wasser Gemisch mit dem Verhältnis 3 : 1 v : v gelöst. Die Lipidkonzentration beträgt 1 mg/ml. Anschließend wird langsam mit Wasser verdünnt, bis sich bei einem Isopropanol : Wasser Verhältnis von 60 : 40 v : v eine Lipiddoppelschicht an der Glasoberfläche bildet. Überschüssiges Lipid wird mit Wasser weggespült.

Claims

1. Verfahren zum Auftragen einer Lipiddoppelschicht auf einer Substratoberfläche, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Substratoberfläche;
b) in Kontakt bringen der Substratoberfläche mit einer Lipidlösung, umfassend mindestens ein Lipid, mindestens ein mit Wasser mischbares, organisches Lösungsmittel LM1 und ggf. Wasser, wobei die Konzentration von Wasser c(H₂O) in der Lipidlösung kleiner als die kritische Benetzungskonzentration c_B(H₂O) des Lipids/der Lipide ist;
c) Erhöhung der Konzentration von Wasser c(H₂O) in der Lipidlösung bis die Konzentration von Wasser mindestens der kritischen Benetzungs konzentration c_B(H₂O) entspricht aber kleiner als die kritische Vesikelbildungskonzentration c_V(H₂O) ist.

2. Verfahren zum Auftragen einer einer Lipiddoppelschicht auf einer Substratoberfläche, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Substratoberfläche;
b) in Kontakt bringen der Substratoberfläche mit einer Lipidlösung, umfassend mindestens ein Lipid und mindestens ein organisches Lösungsmittel LM2;
c) Entfernen des Lösungsmittels aus dem Lipidgemisch auf der Substrat oberfläche;
d) in Kontakt bringen der Substratoberfläche mit einem Gemisch, umfassend mindestens ein mit Wasser mischbares, organisches Lösungsmitte) LM1 und Wasser, wobei die Konzentration von Wasser c(H₂O) in dem Gemisch mindestens der kritischen Benetzungskonzentration c_B(H₂O) des Lipids/ der Lipide entspricht aber kleiner als die kritische Vesikelbildungs konzentration c_V(H₂O) des Lipids/der Lipide ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei mindestens 0,1% des Lipids/der Lipide geladen sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens 0,1% des Lipids/der Lipide anionisch sind.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine Lipid aus Lecithine und Glykolipide ausgewählt ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Substratoberfläche im Vergleich zu dem geladenem Lipid/den geladenen Lipiden entgegengesetzt geladen ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Substratoberfläche endständige Aminogruppen (-NH₃ ⁺) aufweist.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Substratober fläche eine oder mehrere Schichten Polyelektrolyt aufweist.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das organisches Lösungsmittel LM1 ein Alkanol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist.

10. Gegenstand, umfassend eine Substratoberfläche, auf die eine Lipiddoppel schicht gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 aufgetragen worden ist.

11. Gegenstand, umfassend eine Substratoberfläche, die gemäß dem Verfahren, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Substratoberfläche;
b) in Kontakt bringen der Substratoberfläche mit einem Gemisch umfassend mindestens ein Lipid und mindestens ein organisches Lösungsmittel LM2;
c) Entfernen des Lösungsmittels LM2 aus dem Lipidgemisch auf der Substratoberfläche;

hergestellt ist.