DE10108545A1 - Verfahren zur Aufbringung multilamellarer Doppelschichten amphiphiler Moleküle mit Belackungsschleuder - Google Patents

Verfahren zur Aufbringung multilamellarer Doppelschichten amphiphiler Moleküle mit Belackungsschleuder

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Abstract

Ein Verfahren, mit dem ein Schichtsystem amphiphiler Moleküle, bestehend aus N Doppelschichten, in einer multilamellaren Phase auf einem Festkörper aufgetragen werden kann, und das es erlaubt, die Zahl N zu kontrollieren. DOLLAR A Das Verfahren besteht aus einer Erweiterung des für Polymerbeschichtungen verbreiteten Lackschleuder-Verfahrens (engl. spincoating) auf amphiphile Moleküle, die multilamellare Phasen bilden können. Dazu werden die amphiphilen Moleküle in organischen Lösungsmitteln gelöst und auf zuvor modifizierte Substrate pipettiert. Durch Rotation mit einer Belackungsschleuder wird die Lösung gleichmäßig verteilt und getrocknet. Auf der Oberfläche bleiben die amphiphilen Moleküle in Form von orientierten, multilamellaren Doppelschichten zurück, welche sich durch Selbstorganisation bilden. Durch Variation der Konzentration der amphiphilen Moleküle im Lösungsmittel kann die Anzahl der Schichten kontrolliert werden. DOLLAR A Das Verfahren eignet sich zur Probenherstellung für biophysikalische Strukturuntersuchungen.

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung fällt in das Gebiet der Entwicklung neuer Methoden zur Biofunktionalisierung von Festkörperoberflächen durch dünne, makromolekulare Filme. Solche Filme kommen in verschiedenen Bereichen der Biotechnologie zur Anwendung. Dazu zählen Biosensorik und - analytik, insbesondere sogenannte DNA-Chips; Medizintechnik von Implantaten; pharmazeutische Wirkstoff-Verabreichung (drug delivery); Untersuchung von Struktur und Dynamik biologischer Makromoleküle; Zell-Halbleiter-Kopplung in der Neurologie und Neurotechnologie; sowie allgemein in Form von biochemischen Funktionsschichten. Dabei bezeichne der Begriff Funktionsschicht oder funktionalisierte Schicht einen dünnen, makromolekularen Film mit definierten biochemischen Bindungs-, Transport-, oder Permeabilitätseigenschaften sowie optischen oder elektrischen Eigenschaften, wobei der Filmaufbau aus einer gezielten Manipulation hervorgegangen ist. Beispiele für Funktionen sind katalytische Spaltung von Molekülen, Rezeptorwirkung, optisch oder elektrisch getriebener Stofftransport über den Film, Beteiligung an Adhäsionsprozessen, Wirkstofffreisetzung aus dem Film.
Stand der Technik
Funktionen im obigen Sinne werden in den meisten Fällen durch die Einbettung aktiver (d. h. funktionaler) biologischer Makromoleküle in den betreffenden Filmen realisiert (Heyse et al., WO 96/38726), insbesondere durch Peptide, Proteine oder Nukleinsäuren. Diese für die Funktion verantwortlichen Makromoleküle seien im Folgenden als funktionstragende oder aktive Moleküle bezeichnet. Die aktiven Moleküle des Films können dann mit weiteren in der flüssigen Phase gelösten organischen oder anorganischen Molekülen (auch Ionen) in Wechselwirkung treten.
Die Funktionen der aktiven Makromoleküle (enzymatische Reaktionen, spezifische Durchlässigkeit oder Bindung von organischen Molekülen, optische Eigenschaften, immunologische Eigenschaften durch spezifische Bindungen) können aber nur dann technisch genutzt werden, wenn diese in der richtigen Faltung oder Konformation vorliegen. In vielen Fällen handelt es sich bei den funktionstragenden Molekülen um Membran-aktive Moleküle, insbesondere um Membranproteine. Das heißt, für die korrekte Konformation ist die Bindung an oder Einbettung in eine Lipiddoppelschicht erforderlich. Hieraus ergibt sich die Notwendigkeit für die Präparation von Lipiddoppelschichten auf Festkörperoberflächen (im Folgenden als Basispräparation bezeichnet), bei gleichzeitiger oder nachträglicher Dotierung von Membran­ aktiven Molekülen. Verschiedene Verfahren zur Basispräparation bilden den allgemeinen Stand der Technik und sind in der Patentliteratur (WO 96/38726, EP 0 355 847 A3, WO 96/10178) oder der in wissenschaftlichen Fachzeitschriften beschrieben. Membrane können dabei einzeln oder in Form von multilamellaren Stapeln mit einer gewissen Zahl N von Doppelschichten aufgebracht werden. Der letzte Fall bietet den Vorteil einer Signal- bzw. Funktionsvervielfachung durch das größere Aufnahmevermögen multilamellarer Systeme für die funktionstragenden Moleküle. Zudem kann die Stabilität der eingebetteten, aktiven Moleküle erhöht werden, d. h. die Moleküle sind in multilamellaren Systemen besser gegen Umwelteinflüsse geschützt. Wünschenswert ist hier also die Präparation einer kontrollierten Anzahl von Doppelschichten, die jeweils den spezifischen Anforderungen der Anwendung entspricht.
Aus der Literatur bekannte Verfahren, mit denen allerdings in der Regel nur eine Membran (N = 1) aufgebracht werden kann, sind: (a) Langmuir-Blodgett Transfer, bei dem die zunächst auf einer Wasseroberfläche gespreiteten Lipidmoleküle auf eine Festkörperoberfläche übertragen werden, und (b) die Vesikelfusion (Sackmann 96, McConnell 86, Beyer 96, Salafsky 96, Kalb 92, Groves 97, Rädler 98, Nissen 98). Methode (a) läßt sich in Form einer Variante (Langmuir-Schäfer Technik) auf den Fall N < 1 verallgemeinern, allerdings nimmt der Flächenanteil der übertragenen Lipide rasch mit N ab, das heißt es gelingt nur eine sehr unvollkommener Schichtaufbau (vgl. Abb. 1A). Um homogene Doppelschichten zu realisieren, gibt es weiterhin die von Seul und Sammon beschriebene Methode (Seul & Sammon 89), bei der die Lipide zunächst im organischen Lösungsmittel in Form eines Benetzungsfilmes auf ein Substrat aufgebracht werden, und sich bei Verdunstung und nachfolgender Hydratisation aus der Gasphase orientierte Stapel bilden. Die Methode ist in Hinblick auf Morphologie, Verteilung von N, thermische Stabilität, Defekte usw. vebessert und eingehend untersucht worden (Salditt 99, Münster 00, Vogel 00). Der entscheidende Nachteil besteht darin, daß (a) N über das Substrat hinweg einer breiten Verteilungsfunktion unterworfen ist und (b) sich geringe Zahlen N (z. B. N kleiner als 50) nicht präparieren lassen (vgl. Abb. 1B). Weiterhin kommt es in den relativ dicken Filmen zum Auftreten topologischer Defekte.
Die dem Stand der Technik entsprechenden Verfahren liefern also entweder nur im Fall von N = 1 bzw. N = 2 mäßig homogene Filme mit hohem Bedeckungsgrad, oder aber im Fall von N größer 50 einen zwar hohen Bedeckungsgrad, jedoch einen in der Zahl N undefinierte Stapel, d. h. N variiert lateral und es kommt zu einer unerwünschten Domänenbildung.
Das Aufbringen von dünnen Filmen mit Belackungsschleuder (engl. spin-coating) ist ein bekanntes Verfahren zur Aufbringung von Polymerfilmen auf Festkörperoberflächen. Geräte für diese Anwendung werden industriell gefertigt und kommerziell vertrieben, sind bisher jedoch nicht zum Aufbringen von amphiphilen Doppelschichten, insbesondere Lipiddoppelschichten, eingesetzt worden.
Zugrundeliegendes Problem
Das zu Grunde liegende Problem besteht also darin, eine kontrollierte Zahl N von möglichst homogenen (defektfreien) Lipidmembranen auf Festkörperoberflächen aufzubringen. Dabei soll die Ebene der Membrane perfekt durch die Festkörperoberfläche definiert sein. Die dem Stand der Technik entsprechenden Verfahren hierzu liefern entweder nur im Fall von N = 1 bzw. N = 2 mäßig homogene Filme, oder aber im Fall von N größer 50 homogene, aber in ihrer Zahl undefinierte Stapel, d. h. N variiert lateral und es kommt zu einer unerwünschten Domänenbildung (siehe Abschnitt 2).
Erfindung
Die erfindungsgemäße Anwendung des Lackschleuder-Verfahrens (engl. spin-coating) auf amphiphile, multilamellare Phasen bildende Moleküle erlaubt es, Schichtelemente mit einer definierten Anzahl N von homogenen Membranschichten mit einer Mosaizität unter 0.05° auf einem Festkörper, z. B. Silizium oder Glas, herzustellen (vgl. Abb. 1).
Die Erfindung betrifft auf einem Träger angebrachte Schichtelemente bestehend aus
  • a) einem modifizierten Träger wobei die Modifizierung die Hydrophilisierung oder die Hydrophobisierung der Oberfläche bedeutet, und
  • b) einer oder mehreren Doppelschichten aus organischen, amphiphilen Molekülen in einer lamellaren Phase, wobei die amphiphilen Moleküle der ersten Monoschicht derart ausgerichtet sind, dass die Seite mit der gleichen hydrophilen oder hydrophoben Eigenschaft wie die der modifizierten Tägeroberfläche zu dieser zeigt. Auf der Basis dieser ersten Monoschicht liegen die folgenden Schichten derart, dass immer zwei Monoschichten, deren hydrophobe Seiten zueinander zeigen eine Doppelschicht bilden. Zwischen je zwei Doppelschichten befindet sich eine Schicht polares Lösungsmittel. Im Fall einer hydrophilen Tägeroberfläche befindet sich eine Schicht polares Lösungsmittel auch zwischen der Trägeroberfläche und der ersten Monoschicht (vgl. Abb. 2).
Ferner sind die Schichtelemente dadurch gekennzeichnet, dass
  • a) die Verteilung der amphiphilen Moleküle auf dem Träger mit einer Belackungsschleuder durchgeführt wird,
  • b) sich die multilamellaren Schichten der amphiphilen Moleküle nach der Nukleation an der modifizierten Trägeroberfläche durch Selbstorganisation aus der homogenen Lösung heraus bilden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Aufbringung hochorientierter multilamellarer Schichtsysteme amphiphiler Moleküle auf Festkörperoberflächen, gekennzeichnet dadurch,
  • a) dass man einen Träger derart modifiziert, dass seine Oberfläche flächenweit hydrophil, bzw. hydrophob ist,
  • b) dass man die amphiphilen Moleküle in einem geeigneten, die Oberfläche benetzenden, Lösungsmittel löst und mittels einer Belackungsschleuder auf dem Träger verteilt,
  • c) dass sich die multilamellaren Schichten der amphiphilen Moleküle nach der Nukleation an der modifizierten Trägeroberfläche durch Selbstorganisation aus der homogenen Lösung heraus bilden,
  • d) dass man die Anzahl der aufgetragenen Doppelschichten durch Variation der Konzentration der amphiphilen Moleküle im Lösungsmittel kontrollieren kann.
Dazu werden die amphiphilen Moleküle (z. B. Phospholipide) in organischen Lösungsmitteln (z. B. Isopropanol oder Trifluoroethanol) gelöst und auf flache, gereinigte Substrate mit modifizierter Oberfläche (z. B. durch Ätzen) pipettiert. Durch Rotation mit einer Belackungsschleuder wird die Lösung auf der gesamten Oberfläche gleichmäßig verteilt und getrocknet. Auf der Oberfläche bleiben die amphiphilen Moleküle in Form von Doppelschichten, die durch Selbstorganisation mit Wasser aus der umgebenden Luft entstehen, zurück. Dabei nukleieren die Doppelschichten an der Wand, in einer Weise, dass es (i) zu einer perfekten Orientierung zum Substrat und (ii) zu einer besonders hohen Homogenität kommt, siehe Abbildung? Weiterhin ist hervorzuheben, dass die Anzahl der Membran-Doppelschichten durch Variation der Konzentration der amphiphilen Moleküle im Lösungsmittel kontrolliert werden kann (vgl. Abb. 3).
Gewerbliche Anwendbarkeit
Das Verfahren könnte in Lizenz bei allen Herstellungsprozessen von Festkörper-gestützten Membranen (Basispräparation) gewerblich zum Einsatz kommen. Als Anwendungsfelder für die makromolekularen Filme kommen die oben genannten Gebiete in Betracht. Dazu zählen Biosensorik und -analytik, insbesondere sogenannte DNA-Chips; Medizintechnik von Implantaten; pharmazeutische Wirkstoff-Verabreichung (drug delivery); Untersuchung von Struktur und Dynamik biologischer Makromoleküle; Zell-Halbleiter-Kopplung in der Neurologie und Neurotechnologie; sowie allgemein in Form von biochemischen Funktionsschichten.
Vorteilhafte Wirkungen der Erfindungen bezüglich des Stands der Technik
Die Methode des Belackungsschleuderns von amphiphilen Doppelschichten ist sehr unkompliziert und zuverlässig. Sie ermöglicht es weitgehend defektfreie, sehr glatte, homogene Schichten von Membranen in definierter und kontrollierter Anzahl auf ein Substrat aufzubringen
Beispiel Beschichtung eines hydrophiliserten Siliziumsubstrates mit 1,2-Dimyristoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DMPC) Doppelschichten Modifizierung der zu beschichtenden Oberfläche
Damit sich die Amphiphilen Moleküle in geordneter Weise an die Substratoberfläche anlagern können ist es wichtig, dass diese Oberfläche hydrophilisert (zur Anlagerung der hydrophilen Kopfgruppen) bzw. hydrophobisiert wird (zur direkten Anlagerung der hydrophoben Kohlenwasserstoffketten).
Dazu werden die Substratoberflächen gründlich gereinigt und geätzt. Die Reinigung und Ätzung der Substrate ist Materialabhängig. Handelsübliche Siliziumwafer und Glassubstrate werden 10 min in einem Methanol Ultraschallbad gereinigt, anschließend ein zweites mal mit Methanol und zweimal mit H2O (Reinstwasser MilliQ, Firma Millipore, Eschborn) gespült.
Danach folgt das Ätzen der Oberfläche um eine hydrophile Oberfläche zu erhalten. Dies erfolgt im Fall von Silizium Substraten durch ein einminütiges Ätzbad in einer gesättigten Lösung von KOH in Ethanol und anschließendem zweifachen Spülen in H2O (Reinstwasser) und anschließender Trocknung in einem Stickstoffgebläse.
Andere Möglichkeiten sind eine 30 Minuten dauernde Bestrahlung der Substrate mit ozonerzeugendem UV-Licht, oder durch eine 30 Sekunden dauernde Plasmaätzung in einem PlasmaCleaner (z. B. Fa. Harrick Scientific, New York).
Glassubstrate können ebenfalls durch Plasmaätzung wie bei Siliziumsubstraten geätzt werden oder durch ein einminütiges Ätzbad in einer 5 molaren Lösung von KOH in H2O und anschließendem zweifachem Spülen in H2O (Reinstwasser) und abschließendem Trocknen durch Stickstoffgebläse.
Vorbereitung der Lipidlösung
Das Lipid wird in einer bestimmten Konzentration in einem organischen Lösungsmittel, das die modifizierte Oberfläche benetzt gelöst. (z. B. 1,2-Dimyristoyl- sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC) in Isopropanol 10 mg DMPC/ml Isopropanol für Beschichtung von Si oder Glas nach oben beschriebener Modifizierung)
Der Vorgang des Belackungsschleuderns selbst läuft wie folgt ab. Je nach Substratgröße wird eine bestimmte Menge (100 µl für Substrate 15 × 25 mm und 500 µl für 2''-wafer) der Lösung auf das Substrat pipettiert. Die Oberfläche und das Lösungsmittel sollten so beschaffen sein, dass die Lösung das gesamte Substrat sofort benetzt. Sobald die Lösung die gesamte Oberfläche benetzt hat wird das Substrat mit einer Belackungsschleuder in Rotation gebracht. Die Rotationsphase des Substrates erfolgt in zwei Stufen wobei die jeweiligen Geschwindigkeiten von der Substratgröße abhängen. In der ersten Stufe wird das Substrat innerhalb einer Sekunde auf eine Rotationsgeschwindigkeit von (500 U/min für 15 mm × 25 mm Substrate und 1000 U/min für runde 2'' Wafer) beschleunigt und für die Dauer von einer Sekunde in diesem Rotationszustand gehalten. Diese Stufe dient zur Homogenisierung der Benetzung und zum Abschleudern überschüssiger Lösung. In der zweiten Stufe wird das Substrat innerhalb von einer Sekunde auf eine höhere, zweite Rotationsgeschwindigkeit (3000 U/min) weiter beschleunigt wobei die Trocknung einsetzt. Nach einer Rotationsdauer von 15 bis 30 Sekunden bei dieser höheren Geschwindigkeit ist das Substrat trocken und kann von der Belackungsschleuder abgenommen werden. Zur restlosen Entfernung des Lösungsmittels werden die Substrate noch für 12 Stunden in einem Exsikkator getrocknet.
Die Anzahl der Membranschichten auf dem Substrat lässt sich mit Hilfe der Konzentration der verwendeten Lipidlösung kontrollieren. Die Gesamtschichtdicke verhält sich im Bereich von 1 mg Lipid/1 ml Lösungsmittel bis 20 mg Lipid/1 ml Lösungsmittel näherungsweise linear mit der Konzentration.
Beispielsweise erreicht man mit diesem Verfahren für Konzentrationen zwischen 1 mg DMPC/1 ml Isopropanol und 20 mgDMPC/1 ml Isopropanol auf 15 mm × 25 mm große, flache Glas bzw. Siliziumsubstrate in den oben genannten Bedingungen Membranzahlen von 1 bis 22 Membranen. Die Anzahl der Membranen für DMPC gelöst in Isopropanol und eine Substratgröße von 15 mm × 25 mm ergibt sich also mit einem Fehler von ca. 10% nach der Formel:
n = u.konz ± 1
n = Anzahl der Membrane u = Proportionalitätskonstante hier 1 konz = Konzentration Lipid in Lösungsmittel in mg/ml (vgl. Abb. 5).
Literatur (Nicht-Patentliteratur)
Rädler, J., Strey, H. and Sackmann, E. 1995. On the Phenomenology and Kinetics of Lipid Bilayer Spreading on Hydrophilic Surfaces. Langmuir. 11: 4539-4548
Rädler, J., and E. Sackmann. 1997. Functionalization of solids by ultrathin soft polymer-lipid film composites: Modeling of cell surface and cell recognition processes. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 2: 330-336
Nissen, J., Gritsch, S., Wiegand, G. and Rädler, J. O. 1998. Wetting of Phospholipid Membranes on Hydrophilic Surfaces - Concepts Towards Self-Healing Membranes Eur. Phys.. J. B. submitted
C. Münster, Dissertation (2000)
M. Vogel, Dissertation (2000)
M. Vogel, C. Münster, W. Fenzl, and T. Salditt Thermal unbinding of highly oriented phospholipid membranes Physical Review Letters 84, 390-393 (2000)
T. Salditt, C. Münster, Y. Lu,, M. Vogel, W. Fenzl, and A. Souvorov Specular and diffuse scattering of highly aligned phospholipid membranes Physical Review E 60, 7285 (1999)
E. Sackmann, Science 271, 43 (1996)
H. M. McConnell, T. H. Watts, R. M. Weis, and A. A. Brian, Biochim. Biophys. Acta 864,95 (1986)
D. Beyer, G. Elender, W. Knoll, M. Kühner, S. Maus, H. Ringsdorf, and E. Sackmann, Angew. Chemie-internatl. engl. edit. 35, 1682 (1996)
J. Salafsky, J. T. Groves, and S. G. Boxer, Biochemistry 35, 14773 (1996)
E. Kalb, S. Frey, and L. K. Tamm, Biochimica et Biophysica Acta 1103, 307 (1992)
J. T. Groves, N. Ulman, and S. G. Boxer, Science 275, 651 (1997)

Claims (13)

1. Auf einem Träger angebrachtes Schichtelement, bestehend aus
  • a) einem modifizierten Träger, wobei mit Modifizierung die Hydrophilisierung oder die Hydrophobisierung der Oberfläche bezeichnet wird, und
  • b) einer oder mehreren Doppelschichten aus organischen, amhiphilen Molekülen in einer lamellaren Phase, wobei immer zwei Monoschichten, deren hydrophobe Seiten zueinander zeigen, eine Doppelschicht bilden, und zwischen je zwei Doppelschichten sich eine Schicht polares Lösungsmittel befindet, dadurch gekennzeichnet, dass
  • c) die amphiphilen Moleküle mit einer Belackungsschleuder auf dem Träger verteilt worden sind,
  • d) und sich die orientierten, multilamellaren Schichten der amphiphilen Moleküle durch Selbstorganisation aus der homogenen Lösung heraus bilden.
2. Ein Schichtelement nach Patentanspuch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Selbstorganisation der Moleküle durch Nukleation an der modifizierten Trägeroberfläche geschieht.
3. Verfahren zur Aufbringung hochorientierter monolamellarer oder multilamellarer Schichtsysteme amphiphiler Moleküle auf Festkörperoberflächen nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass
  • a) man einen Träger derart modifiziert, so dass seine Oberfläche flächenweit hydrophil, bzw. hydrophob ist,
  • b) man die amphiphilen Moleküle in einem geeigneten, die Oberfläche benetzenden, Lösungsmittel löst und mittels einer Belackungsschleuder auf dem Träger verteilt,
  • c) sich die multilamellaren Schichten der amphiphilen Moleküle durch Selbstorganisation aus der homogenen Lösung heraus bilden.
4. Ein Verfahren nach Patentanspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der aufgetragenen Doppelschichten durch Variation der verwendeten Molekülkonzentration im Lösungsmittel kontrolliert wird.
5. Ein Schichtsystem nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Trägermaterial um Silizium handelt.
6. Ein Schichtsystem nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Trägermaterial um Glas handelt.
7. Ein Verfahren nach Patentanspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass die Trägeroberfläche mittels einer Ätzlösung modifiziert wird, wobei
  • a) im Fall von Silizium als Trägermaterial diese Ätzlösung beispielsweise aus einer gesättigten Lösung von KOH in Ethanol,
  • b) und im Fall von Glas als Trägermaterial diese Ätzlösung beispielsweise aus einer 5molaren Lösung von KOH in H2O besteht.
8. Ein Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche mittels Bestrahlung mit einer Ozonlampe modifiziert wird.
9. Ein Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche mittels Plasmaätzung modifiziert wird.
10. Ein Schichtsystem nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das polare Lösungsmittel H2O ist.
11. Ein Schichtsystem nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den amphiphilen Molekülen um Lipide, insbesondere um Phospholipide handelt.
12. Ein Schichtsystem nach Patentanspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass die Lipiddoppelschichten als Träger für funktionale Membran-aktive Moleküle dienen.
13. Ein Schichtsystem nach Patentanspruch 12 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den funktionalen Membranaktiven Molekülen um antibiotische Peptide oder Membranproteine handelt.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP2221071A3 (de) * 2009-02-19 2012-08-15 Biomet Manufacturing Corp. Medizinische Implantate mit arzneimittelfreisetzender Beschichtung
US11110204B2 (en) * 2016-09-30 2021-09-07 Gc Corporation Method of producing bioabsorbable membrane

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