DE4217353B4 - Verfahren zur säulenchromatographischen Trennung von Proteinen mittels Lipidbilayer-beschichteter Silicagele - Google Patents
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Abstract
Verfahren
zur säulenchromatographischen
Trennung von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Proteingemisch
mit einem Chromatographiematerial in Kontakt gebracht wird, welches
aus Silica besteht, dessen Dimensionen im Bereich Nanometer bis
Mikrometer liegen und das mit einer nicht kovalent angebundenen Lipiddoppelschicht
aus amphiphilen Lipiden umgeben ist, wobei die Lipiddoppelschicht
aus einer Mischung von Lipiden besteht und wobei mindestens ein
Lipid bei neutralem pH-Wert elektrisch neutral und mindestens ein
Lipid bei neutralem pH-Wert geladen ist.
Description
- 1. Stand der Technik
- Die Säulenchromatographie ist ein grundlegendes Verfahren der Biochemie zur Trennung von Proteinen und Peptiden entsprechend ihrer Größe bzw. ihres Molekulargewichts (sogenannte Gelfiltration) oder entsprechend ihres elektrischen Ladungszustandes (sogenannte Ionenaustausch-Chromatographie).
- Bei der Gelfiltration wird eine Chromatographiesäule mit einem in Wasser quellenden Polymer oder mit einem Silicagel (Kugeln aus Siliziumdioxid mit Poren auf der Kugeloberfläche) gefüllt und das zu trennende Proteingemisch wird (in Puffer gelöst) von oben auf die Säule gegeben. Danach wird der Säule von oben kontinuierlich Pufferlösung zugeführt und das Proteingemisch wird langsam durch die Säule zum Säulenausgang gespült. Auf dem Weg durch die Säule werden kleinere Proteine verlangsamt, da sie stärker (d.h. länger) mit dem Chromatographiematerial Wechselwirken. Auf diese Weise kann man am Säulenausgang mit einem Fraktionensammler die einzelnen Proteinfraktionen, entsprechend ihrer Größe geordnet, sammeln (sh. z.B. Cooper, T.G. "Biochemische Arbeitsmethoden" Kapitel 5 pp 157.Verlag de Gruyter, Berlin, New York, 1981).
- Die Ionenaustausch-Chromatographie ist im grundsätzlichen Aufbau der Gelfiltration ähnlich. Im Unterschied verwendet sie jedoch Chromatographiegele mit kovalent gebundenen, elektrisch geladenen Gruppen. Diese Gele binden Proteine mit der entsprechenden Gegenladung und lassen andere Proteine (Proteine mit gleicher Ladung wie das Gel oder elektrisch neutrale Proteine) ungehindert oder sogar beschleunigt (infolge elektrostatischer Abstoßung) die Säule passieren. Nachdem die nichtgebundenen Proteine aus der Säule gespült worden sind, gibt man eine Pufferlösung über die Säule, die eine hohe Konzentration von zum Gel entgegen gesetzt geladenen Ionen enthält. Diese verdrängen die Proteine von ihren Bindungsstellen im Gel und ermöglichen damit ein Sammeln dieser Proteine am Säulenausgang. In bestimmten Fällen werden zum Abtrennen der Proteine auch Detergenzlösungen verwendet. Das Resultat des Verfahrens sind entsprechend ihrer Ladung getrennte Proteinfraktionen (sh. z.B. Cooper, T.G. "Biochemische Arbeitsmethoden" Kapitel 4 pp 126.Verlag de Gruyter, Berlin, New York, 1981).
- Ein Problem bei beiden Arten von Chromatographie kann die Denaturierung empfindlicher Proteine während des Chromatographielaufes sein. Derartige Prozesse geschehen u.a. bei Kontakt zwischen den Proteinen und anorganischen Substanzen. Dies kann insbesondere bei Silicagelen zu einem beträchtlichen Verlust an Proteinaktivität führen. Um dies zu verhindern, werden Silicagele mit verschiedenen organischen (z.B. polymeren) Beschichtungen (Coatings) angeboten. Ziel ist hierbei, eine Oberfläche durch das Coating so zu gestalten, daß das mit ihr wechselwirkende Protein sie als natürliche Umgebung "empfindet" (biokompatible Oberfläche). Beispiele hierfür ist die Bindung von Dextranmolekülen auf der Oberfläche von Latexgelen oder die kovalente Bindung einer Monoschicht von Phospholipiden (dem Hauptbestandteil biologischer Membranen) auf der Oberfläche von Silicagelen (immobilisierte Membran). Diese Verfahren sind technisch aufwendig und somit sind derartige Chromatographiegele relativ teuer.
- Eine weitere Möglichkeit zur Trennung von Proteinen und Peptiden ist die sogenannte Affinitätschromatographie. Hierbei werden Proteine aufgrund einer spezifischen Wechselwirkung mit einem anderen Molekül isoliert. Eine solche Wechselwirkung kann beispielsweise eine Antikörper-Antigen-Wechselwirkung sein. Einer der beiden Wechselwirkungspartner wird hierfür auf einem Trägermaterial immobilisiert. Unter Verwendung dieses Materials wird die säulenchromatographische Isolierung des anderen Wechselwirkungspartners durchgeführt. Die
DE 37 33 303 beschreibt beispielsweise ein Trägermaterial mit immobilisierten, biologisch aktiven Makromolekülen, welches für eine Affinitätschromatographie geeignet ist. Hierbei sind die Makromoleküle innerhalb einer Lipidmonoschicht eingebettet. Diese Schicht ist auf einer mit hydrophoben Resten derivatisierten Oberfläche fixiert. - Bei der Ionenaustausch-Chromatographie kommt noch ein Problem hinzu: Das Abtrennen der durch Ladungswechselwirkung an das Chromatographiegel gebundenen Proteine durch eine Pufferlösung hoher Ionenstärke oder Detergenzien kann zu einem Ausfällen der Proteine (und damit zur Denaturierung) führen. Das vorgeschlagene neue Verfahren reduziert den technischen Aufwand zur Biokompatibilisierung von Silicagelen beträchtlich und soll darüber hinaus neue Möglichkeiten zum Abtrennen der Proteine vom Gel ohne Gefahr ihrer Denaturierung eröffnen.
- 2. Beschreibung des Verfahrens
- Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur säulenchromatographischen Trennung von Proteinen gemäß Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen definiert. Das neue Verfahren baut auf dem bereits vorhandenen Kenntnisstand der Säulenchromatographie (Gelfiltration, Ionen-Austausch-Chromatographie) auf. Als Chromatographiematerial für das neue Verfahren werden Silicagele (d. h. poröse Kugeln aus Silica) oder Silicakugeln mit glatter Oberfläche verwendet, deren Dimensionen im Bereich nm-μm liegen.
- Der wesentliche Unterschied zu allen bisherigen Verfahren besteht darin, daß jede dieser Kugeln an ihrer Oberfläche vollständig mit einer ca. 50-60 Å dicken Doppelschicht aus Lipiden (die sogenannte Lipiddoppelschicht oder Lipidbilayer) beschichtet ist. Zwischen der Lipiddoppelschicht und der Kugeloberfläche existiert außerdem noch eine 10-20 Å dicke Wasserschicht. Die
1 zeigt schematisch die Darstellung einer Silicakugel mit glatter Oberfläche, welche mit einer Doppelschicht aus Lipiden beschichtet wurde. Die Lipide selbst können je nach den Anforderungen des Chromatographie-Experimentes entweder natürliche, aus Gewebe extrahierte Lipidspezies sein oder auf synthetischem Weg erzeugt worden sein. Die Präparationsmethode zur Erzeugung derartig beschichteter Kugeln wurde von einem der Anmelder dieses Patentes entwickelt und ist veröffentlicht worden (T. M. Bayerl & M. Bloom, 1990, „Physical properties of single phospholipid bilayers adsorbed to micro glass beads", Biophysical Journal 58: 357-362 Rockefeller Press, New York. Der Anmelder konnte in derselben Veröffentlichung zeigen, daß ein derartig präpariertes Kugelsystem mit einem adsorbierten Lipidbilayer über einen Zeitraum von Wochen stabil ist und die Lipiddoppelschicht auch durch hydrodynamische Kräfte und mechanische Einwirkung (wie sie z. B. beim Waschen einer solchen Probe im strömenden Medium oder bei Zentrifugation im wäßrigen Medium entstehen) nicht von den Kugeln abgelöst wird. - Die Vorteile der Verwendung solcher mit einem Lipidbilayer beschichteter Silicagele für säulenchromatographische Zwecke sind wie folgt:
- 1) Durch die vollständige Abschirmung der Silicaoberfläche durch den Lipidbilayer wird ein Kontakt der zu trennenden Proteine mit dem Silica unterbunden. Damit wird die möglicherweise bei einem solchen Kontakt stattfindende Denaturierung eines Teiles der Proteine vermieden, denn die Proteine können nun nur mit der hydrophilen Lipidoberfläche in Wechselwirkung treten. Da Lipide biologische, amphiphile Moleküle sind (wie sie auch in jeder Zellmembran zu finden sind) und ein Lipidbilayer weiterhin ein extrem weiches Material („soft surface") darstellt, findet an solchen Oberflächen praktisch keine Proteindenaturierung statt. Durch den Lipidbilayer ist die Kugel mit einer sogenannten „biokompatiblen Oberfläche" versehen. Damit läßt sich die Ausbeute eines Chromatographielaufes bezüglich Proteinaktivität beträchtlich steigern und die Trennung von sehr empfindlichen, bisher als schwer trennbar erachteten Proteinen, erscheint möglich (sh. Beispiel 1).
- 2) Ein weiterer Vorteil des Verfahrens ist die gezielte Ausnutzung elektrostatischer Oberflächenladungseffekte zur ladungsselektiven Trennung von Proteinen. Obwohl das in eukariotischen Zellen am häufigsten vorkommende Phospholipid, das Lezithin (Phosphatidylcholin), über einen weiten pH Bereich nach außen elektrisch neutral ist, existieren eine Vielzahl anderer Lipide, die bei neutralem pH Wert eine negative Überschußladung aufweisen (z. B. Phosphatidylserine, Phosphatidylglycerole, Cardiolipin). Durch gezielte Beimischung solcher Lipide zur Beschichtung der Silicagele läßt sich somit eine definierte negative Oberflächenladung auf dem die Kugel umgebenden Lipidbilayer erzeugen. Dadurch werden Proteine mit positiver Überschußladung auf ihrem Weg durch die Säule infolge anziehender Coulomb Wechselwirkung mit dem Lipidbilayer verzögert bzw. gebunden (ohne dabei zu denaturieren, sh.1), negativ geladene Proteine hingegen werden beschleunigt. Durch Einsatz von Amphiphilen mit positiver Überschußladung kann auch eine positive Oberflächenladung des Lipidbilayers erzeugt werden, falls das zu trennende Gemisch dies erfordert. Damit gestattet das neue Chromatographieverfahren die Durchführung von Ionen-Austausch-Chromatographie (sh. Beispiel 2).
- 3) Ein wesentlicher Vorteil liegt in der Verwendung eines Lipidbilayers (anstelle der bisher verwendeten immobilisierten Membran = Lipidmonoschicht) zur Beschichtung der Kugeln begründet. Die vom Antragsteller entwickelte Präparationsmethode (wird im Beispiel unten erläutert) erlaubt eine Beschichtung der Kugeln in der Chromatographiesäule unmittelbar vor dem Aufbringen der zu trennenden Proteinmischung. Dieses Verfahren ist damit äußerst vielseitig und kostengünstig, da nur Kugeln der gewünschten Größe (die problemlos über Jahre gelagert werden können) in die Säule gepackt werden und dann erst die Beschichtung mit dem Lipidbilayer vorgenommen wird. Auch können Veränderungen in der Lipidzusammensetzung der Kugeloberflächen (und damit Veränderungen der Oberflächenladung der die Kugeln umgebenden Lipidbilayer) ohne Entfernen der Kugeln aus der Säule vorgenommen werden (sh. Beispiel). Damit ist das vorgeschlagene Verfahren gegenüber der immobilisierten Membran (kovalent an die Geloberfläche gebundene Lipidmonoschicht) weit überlegen, da letztere nur mit hohen technischen Aufwand und keinesfalls in der Säule selbst erzeugt werden kann.
- 4) Schließlich kann ein solches Lipidbilayer – beschichtetes Silicagel zur ladungsempfindlichen Trennung von Proteinen unter Ausnutzung des Mischungsverhaltens binärer Lipidgemische angewandt werden. Reine synthetische Lipide (i.a. Lipide mit gesättigten Fettsäureketten) weisen einen scharfen, reversiblen Phasenübergang 1. Ordnung zwischen kristalliner und flüssig – kristalliner Struktur des Lipidbilayers auf (sh z.B. Sackmann, E."Polymorphism of Lipid/water systems" in "Biophysics" (Hoppe, W., Lohmann, W., Markl, H., Ziegler, H., eds) pp. 425. Springer Verlag Berlin, Heidelberg 1983). Durch Mischung von 2 Lipiden (eines davon elektrisch neutral, das andere negativ geladen), von denen mindestens eines gesättigt ist und über eine Phasenübergangstemperatur (PÜT) verfügt, die in einem für die zu eluierenden Proteine verträglichen Bereich liegt (z.B. zwischen 0-8°C), können nun durch Veränderung der Temperatur Ladungsmuster auf der Oberfläche des die Kugeln umgebenden Lipidbilayer erzeugt werden (sh z.B. Sackmann, E."Chargeinduced changes in the microstructure of membranes" in "Biophysics" (Hoppe, W., Lohmann, W., Markl, H., Ziegler, H., eds) pp. 438-444. Springer Verlag Berlin, Heidelberg 1983). In der kristallinen Phase (Temperatur < PÜT) kann unter geeigneten Bedingungen eine quasi-zweidimensionale Domänenbildung im Lipidbilayer (Domänengröße im nm bis μm Bereich) stattfinden, die durch unterschiedlich hohe Anteile an negativ geladenen Lipid gekennzeichnet ist. Kristalline Bereiche mit hoher negativer Oberflächenladung können dann in eine fluide Matrix mit geringer negativer Oberflächenladung eingebettet sein. Positiv geladene Proteine werden unter diesen Bedingungen mit hoher Bindungskraft (Coulomb Wechselwirkung) an die kristallinen Bereiche gebunden. Wird nun die Temperatur erhöht (Temperatur der Säule > PÜT) wird die Domänenstruktur aufgelöst (durch Schmelzen der kristallinen Bereiche) und die negativ geladene Lipidkomponente verteilt sich gleichmäßig (durch laterale Diffusion) über den gesamten Lipidbilayer. Damit sinkt die Bindungskraft zwischen Protein und Oberfläche drastisch und das zuvor gebundene Protein kann sich vom Lipidbilayer lösen (sh. Anwendungsbeispiel 3).
- Im folgenden sollen die Vorteile des Verfahrens in drei Beispielen dargestellt werden.
- 3. Beispiele
- 3.1. Anwendungsbeispiel 1:
- Gelfiltration von Proteinen mit unterschiedlichem Molekulargewicht
- Eine Chromatographiesäule wird mit kommerziell erhältlichen Silicagel (Kugeln aus Siliziumdioxid (Durchmesser 3 μm), die mit Poren auf der Oberfläche (Porendurchmesser 100 nm) versehen sind) gepackt und Puffermedium (der pH Wert kann zwischen pH3-9, je nach den Elutionsbedingungen, frei gewählt werden) wird aufgefüllt.
- 3.1.1 Beschichtung des Silicagels mit einem Lipidbilayer
- Als Lipid zur Beschichtung wird ein natürlich vorkommendes Phosphatidylcholin, das sogenannte Lecithin, verwendet. Das lyophilisierte Lipidpulver wird in 10 ml Puffermedium gelöst und (bei Zimmertemperatur) 15 min. unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wird die Lösung in einem Ultraschall-Disintegrator für 10-15 min. bei hoher Leistung beschallt, bis die zuvor milchige Lipidlösung klar geworden ist. Die Lipidmenge ist so berechnet, daß die von den Lipiden in einer Doppelschichtanordnung zu bedeckende Fläche etwa der doppelten Oberfläche der Silicakugeln (einschließlich Porenoberfläche) entspricht (Oberflächenbedarf eines Lezithinmoleküls ca. 80 Å2). Die durch Ultrabeschallung erzeugten kleinen unilamellaren Lezithinvesikel (Durchmesser 40-100nm) werden nun auf die Säule gegeben und langsam eluiert. Dabei fusionieren die Vesikel auf der Oberfläche der Silicakugeln (und in den Poren) und bilden einen abgeschlossenen, stabilen Lipidbilayer auf der Oberläche aus. Überschüssige Vesikel, die keine freien Plätze zur Fusion auf der Kugeloberfläche finden, werden eluiert. Nach Spülen der Säule mit Puffer ist diese für die Filtration bereit.
- Alternativ kann die Beschichtung der Kugeln auch außerhalb der Säule (vor dem Packen) durchgeführt werden. Hierzu wird die Lezithinvesikellösung mit den Kugeln (Silicagel) im Puffermedium unter leichten Schütteln für ca. 1 min. gemischt. Mittels einer Tischzentrifuge wird das Säulenmaterial dann ca. 5 mal gewaschen (d.h. Dispersion der beschichteten Kugeln in einem größeren Volumen von Puffer, Zentrifugation der Dispersion und Absaugen des, die überschüssigen Vesikel enthaltenden, Überstandes) und kann dann in der Säule gepackt werden.
- 3.1.2 Gelfiltration
- Das zu trennende Gemisch von Proteinen wird (im Elutionspuffer gelöst) auf die Säule gegeben. Auf dem Weg durch die Säule werden nun die kleinen Proteine des Gemisches (durch Wechselwirkung mit den Poren) verzögert. Die Lezithinbilayerschicht verhindert dabei eine mögliche Denaturierung der Proteine. Die einzelnen Fraktionen unterschiedlicher Größe (Molekurargewicht) werden am Ausgang der Säule mit einem Fraktionssammler getrennt aufgefangen.
- 3.2 Anwendungsbeispiel 2:
- Ionen-Austausch-Chromatographie eines Proteingemisches mit unterschiedlicher elektrischer Ladung der Einzelkomponenten
- 3.2.1 Vorbereitung der Säule
- Präparation der Säule wie in Beispiel 1 beschrieben, allerdings wird statt reinem Lezithin nun ein binäres Lipidgemisch von Lezithin und Phosphatidylserin (molares Mischungsverhältnis 4:1) verwendet. Da Phosphatidylserin bei neutralem pH Wert eine negative Überschußladung trägt, wird die gesamte, das Kugelmaterial bedeckende Lipiddoppelschicht nun mit einer negativen Oberflächenladung versehen. Da Phosphatidylserin insbesondere stark gekrümmte Lipiddoppelschichtbereiche bevorzugt, wird es sich in den Poren der Kugel anreichern und dort ein besonders starkes elektrisch negatives Oberflächenpotential bewirken.
- Eine weitere Methode der Säulenpräparation ist möglich, falls eine mit reinen Lezithindoppelschichten präparierte Säule bereits vorhanden ist und nicht neu gepackt werden soll. In diesem Fall werden durch Beschallung mit Ultraschall (sh. Beispiel 1) unilamellare Vesikel aus Phosphatidylserin hergestellt und auf die Säule gegeben und langsam eluiert. Auf dem Weg durch die Säule tauschen die negativ geladenen Phosphatidylserin-Vesikel Lipide mit dem aus dem Kugelmaterial adsorbierten Lipidbilayer (Lezithin) aus. Dadurch erhält der Lipidbilayer auf dem Kugelmaterial eine negative Oberflächenladung. Nach Spülung der Säule zur Entfernung der Austauschvesikel ist diese für die Chromatographie bereit.
- 3.2.2 Chromatographie
- Das zu trennende Proteingemisch wird auf die Säule gegeben und unter neutralen pH Bedingungen (und relativ niedriger Ionenstärke) eluiert. Auf dem Weg durch die Säule werden elektrisch positiv geladene Proteine durch Coulomb Wechselwirkung in den Poren oder auf der Kugeloberfläche gebunden, negativ oder neutral geladene Proteine passieren die Säule beschleunigt (repulsive Coulomb Wechselwirkung) oder unbeeinflußt. Der Lipidbilayer verhindert eine Denaturierung der gebundenen Proteine. Nachdem die negativ oder neutral geladenen Bestandteile des Gemisches die Säule verlassen haben, wird diese mit einem Puffer hoher Ionenstärke (z.B. 200 mM NaCl) gespült. Alternativ können Detergenzlösungen niedriger Konzentration verwendet werden. Die Ionen verdrängen hierbei die elektrostatisch gebundenen Proteine von den Oberflächen und die Proteine können im Fraktionssammler am Säulenausgang aufgefangen werden. Damit wurden positiv geladene Proteine aus dem Gemisch ohne Gefahr einer Denaturierung (und damit höchstmöglicher Proteinaktivität) abgetrennt.
- 3.3 Anwendungsbeispiel 3:
- Ladungsselektive Elution von Proteinen durch temperaturinduzierte Veränderung der Bindungseigenschaften der Chromatographiesäule
- 3.3.1 Präparation der Säule
- Es werden Kugeln aus Siliziumdioxid mit glatter Oberfläche (ohne Poren) zum Packen der Säule verwendet. Der Lipidbilayer wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf der Oberfläche der Kugeln adsorbiert. Als Lipidmischung wird ein binäres Gemisch aus 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-3-glycero-phosphocholine (POPC) mit 20 mol% 1,2-dimyristoyl-sn-3-glycero-phosphatidylglycerol (DMPG) verwendet. Diese Mischung hat einen Phasenübergang bei einer Temperatur (PÜT) von ca. 4°C.
- 3.3.1 Chromatographie
- Das zu eluierende Proteingemisch (mit Proteinen gegensätzlicher elektrischer Überschußladung) wird bei einer Säulentemperatur von 1°C auf die Säule gegeben. Bei dieser Temperatur sind kristalline Domänen mit einem hohen Anteil von negativ geladenen DMPG im Lipidbilayer vorhanden. Während der Elution werden positiv geladenen Proteine (und von diesen bevorzugt jene mit der höchsten Überschußladung) an den Lipidbilayer gebunden. Nachdem negativ geladene und elektrisch neutrale Proteine die Säule verlassen haben, wird die Säulentemperatur auf 8°C erhöht, die gebundenen Proteine lösen sich von der Oberfläche (infolge der Auflösung der kristallinen Domänen) und können eluiert werden.
Claims (8)
- Verfahren zur säulenchromatographischen Trennung von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Proteingemisch mit einem Chromatographiematerial in Kontakt gebracht wird, welches aus Silica besteht, dessen Dimensionen im Bereich Nanometer bis Mikrometer liegen und das mit einer nicht kovalent angebundenen Lipiddoppelschicht aus amphiphilen Lipiden umgeben ist, wobei die Lipiddoppelschicht aus einer Mischung von Lipiden besteht und wobei mindestens ein Lipid bei neutralem pH-Wert elektrisch neutral und mindestens ein Lipid bei neutralem pH-Wert geladen ist.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipiddoppelschicht aus einer Mischung von Lipiden besteht, die insgesamt eine negative Oberflächenladung bei neutralem pH-Wert bewirken.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipiddoppelschicht aus einer Mischung von Lipiden besteht, die insgesamt eine positive Oberflächenladung bei neutralem pH-Wert bewirken.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Lipid einen scharfen Phasenübergang zwischen kristallin und flüssig aufweist.
- Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Phasenübergang bei einer Phasenübergangstemperatur zwischen 0 und 8°C erfolgt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipiddoppelschicht durch spontane Adsorption und Fusion sehr kleiner unilamellarer Vesikel gebildet wird.
- Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipiddoppelschicht Lipide aus der Klasse der Phospholipide, insbesondere Phosphatidylcholin, aufweist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipiddoppelschicht Lipide mit negativer elektrischer Ladung der Kopfgruppe aufweist.
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