DE102004038873A1

DE102004038873A1 - Bestimmung von Bindungsparametern

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Publication number: DE102004038873A1
Application number: DE102004038873A
Authority: DE
Inventors: Johannes Dr. Schmitt; Joachim Dr. Nöller; Thomas Müller
Original assignee: Nimbus Biotechnologie GmbH
Current assignee: Nimbus Biotechnologie GmbH
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2004-08-05
Publication date: 2006-02-23
Also published as: US20080003590A1; EP1782045A1; WO2006015736A1

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Bestimmung von Bindungsparametern zwischen mindestens einer Substanz und mindestens einem Bindungspartner unter Verwendung mindestens einer lumineszierenden Sonde sowie ein geeigneter Kit dazu bereitgestellt. Zur Durchführung des Verfahrens wird ein Festkörper eingesetzt, der zumindest teilweise mit mindestens einem Bindungspartner beladen ist und der mit der zu untersuchenden Substanz inkubiert wird. Nach Separation von Festkörper und nicht gebundener Substanz erfolgt die Konzentrationsbestimmung der zu untersuchenden Substanz durch Messung einer Modulation bzw. Abschwächung von Lumineszenzsignalen der mindestens einen Sonde durch die nicht gebundene Substanz im Überstand.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Bindungsparametern sowie einen Kit, der zur Durchführung dieses Verfahrens geeignet ist.

Die Bestimmung von Bindungsparametern zwischen einer Substanz und einem Bindungspartner ist von erheblicher Bedeutung für beispielsweise Pharmakologie, Medizin, Biotechnologie und Biochemie. Sie ermöglicht Einsichten, wie Moleküle (beispielsweise biologische Moleküle wie z. B. Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, insbesondere biologisch aktive Substanzen oder Wirkstoffe) mit biologischen Membranen in Wechselwirkung treten, wie sie innerhalb von Zellen transportiert werden und Signalwirkung entfalten können. Die Kenntnis von Bindungsparametern ist daher besonders vorteilhaft für die Entwicklung therapeutischer Wirkstoffe und anderer, neuartiger Medikamente [Böhm, H. J., Klebe, G., Kubinyi, H., „Wirkstoffdesign, Spektrum", Akademischer Verlag, 1. Auflage, Heidelberg (1996)].

Zur Ermittlung von Bindungsparametern ist es gegenwärtig in der Regel notwendig, nach dem Bindungsprozeß gebundenen und freien Anteil der zu untersuchenden Substanz voneinander zu trennen. Dieser Separationsschritt kann beispielsweise durch Verwendung einer semipermeablen Membran (Dialyse), durch Ultrafiltration oder Ultrazentrifugation erfolgen. Anschließend kann die Konzentration der Substanz im freien Anteil oder im gebundenen Anteil bestimmt werden. So können Rückschlüsse auf die Bindungsaffinität der Substanz zum Bindungspartner gezogen werden. Nachteilig hierbei ist, daß nach der Separation zumeist weitere Transferschritte der Phasen mit gebundenem oder ungebundenem Anteil erforderlich sind. Dies wird den Anforderungen eines Hochdurchsatzscreening-Verfahrens (HTS-Verfahren), das die Untersuchung von hunderten bis tausenden von Substanzen täglich ermöglichen soll, nicht gerecht. Zur Vereinfachung der Trennung von freiem und gebundenem Anteil einer Substanz kann ein Bindungspartner (beispielsweise ein Protein oder eine Lipidmembran) auf einen Festkörper immobilisiert werden. Die Abtrennung kann in diesem Fall durch Sedimentation, Filtration oder durch eine einfache niedertourige Zentrifugation erfolgen. Allerdings ist auch hier mindestens ein weiterer Transferschritt von Flüssigkeiten zur Konzentrationsbestimmung der Substanz erforderlich.

Um den aufwendigen Transfer von freiem und gebundenem Teil der zu untersuchenden Substanz nach einer Separation zu vermeiden, wurden bereits verschiedene Ansätze verfolgt, eine Bestimmung von Bindungsparametern ohne Separation von Substanz und Bindungspartner unter Verwendung sogenannter Markersubstanzen durchzuführen. Beispielsweise erlaubt die Verwendung von fluoreszenten oder radioaktiven Markersubstanzen, die in spezifischen Regionen des zu untersuchenden Bindungspartners binden, die Quantifizierung der Bindung der zu untersuchenden Substanzen über eine Verdrängung des fluoreszenten [D. E. Epps, T. J. Raub, F. J. Kezdy „A General, Wide-Range Spectrofluorometric Method for Measuring the Site-Specific Affinities of Drugs toward Human Serum Albumin", Analytical Biochemistry 227, 342-350 (1995)] oder radioaktiven Markers [N. Bosworth, and P. Towers „Scintillation proximity assay" Nature 341, 167-168 (1989)]. Ohne Verwendung von Markersubstanzen kann die Bestimmung von Bindungsparametern meist nur in Spezialfällen realisiert werden. Dazu gehört die Untersuchung von Proteinbindungen, bei denen sich intrinsische, detektierbare Eigenschaften des Proteins nach der Bindung verändern. Ein Beispiel dafür ist die Bindung von Substanzen an Human Serum Albumin [D. E. Epps, T. J. Raub, V. Caiolfa, A. Chlari, M. Zamal „Determination of the Affinity of Drugs toward Serum Albumin by Measurement of the Quenching of the Intrinsic Tryptophan Fluorescence of the protein" J. Pharm. Pharmacol. 57, 41-48 (1999)]. Dies ist allerdings nur im Falle von sehr stark bindenden Substanzen möglich und führt in vielen Fällen aufgrund der UV-Aktivität der zu untersuchenden Substanzen zu fehlerbehafteten Ergebnissen. Ein derartiger Ansatz ist in der Literatur auch zur Bestimmung der Bindungsparameter zum α1-aciden Glykoprotein und auch zu membranständigen Proteinen beschrieben [A.-K. Johansen, N.-P. Willasen, G. Sager „Fluorescence studies of β-adrenergic ligand binding to α1-acid glycoprotein with 1-anilino-8-naphtalene sulfonate, isoprenaline, adrenaline and propanolol" Biochemical Pharmacology" 43(4), 725-729, (1992); R. Liu, A. Siemiarcuk, F. J. Sharom „Intrinsic fluorescence of the P-glycoprotein multidrug transporter: sensitivity of tryptophan residues to binding of drugs and nucleotides" Biochemistry 39(48): 14927-14938 (2000)]. Auch hier handelt es sich um Spezialfälle, die nicht verallgemeinert werden können. Weitere Möglichkeiten bestehen in der Modifizierung des Bindungspartners selbst [J. P. Vilardaga, M. Bünemann, C. Krasel, M. Castro, M. J. Lohse „Measurement of the millisecond activation switch og G protein-coupled receptors in living cells" Nat. Biotechnol. 21(7), 807-812 (2003)], mit einer oder mehreren Fluoreszenzsonden, bevorzugt in der Nähe der Bindungstaschen, bei denen die Bindung eine Änderung des Fluoreszenzsignals bewirkt. Ein weiterer Ansatz benutzt die sogenannte Oberflächenplasmonenresonanz (SPR surface plasmon resonance) [zum Beispiel: P. Mistrik, F. Moreau, J. M. Allen „BlaCore analysis of leptin-leptin receptor interaction: evidence for 1:1 stoichiometry" Anal. Biochem. 327(2), 271-277 (2004)], um die Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern zu quantifizieren. Allerdings erlauben die gegenwärtig erhältlichen Geräte ebenfalls keinen hohen Probendurchsatz. Weitere Methoden zur Bestimmung von Bindunsparametern nutzen die nukleare Kernresonanzspektroskopie (NMR), paramagnetische Elektronenresonanzspektroskopie (EPR) [E. de-Paula, S. Schreier „Molecular and physicochemical aspects of local anasthetic-membrane interaction" Brazilian Journal of Medical and Biological Research 29, 877-894 (1996)] und Differentialkalorimetrie (DSC) [V. Plotnikov, A. Rochalski, M. Brandts, J. F. Brandts, S. Williston, V. Frasca, L. N. Lin „An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions" Assay Drug Dev Technol. 1, 83-90 (2002)]. Diese sind zwar sehr genau und liefern über die einfache Bindung hinaus weitere Informationen, erlauben aber nur die Bestimmung weniger Substanzen am Tag.

Die bisherigen Verfahren zur Bestimmung von Bindungsparametern erfordern also entweder aufwendige Separations- und/oder Transferschritte, um eine Trennung von gebundenem und nicht gebundenem Anteil der zu untersuchenden Substanz zu realisieren, oder sind nur auf bestimmte Fälle anwendbar. Sie werden daher einem allgemein einsetzbaren HTS-Verfahren nicht oder nur ungenügend gerecht. Weiterhin sind herkömmliche Verfahren im allgemeinen wenig anwenderfreundlich und verhindern eine einfache Automatisierbarkeit.

Die Erfindung stellt sich somit die Aufgabe, ein Verfahren und einen entsprechenden Kit bereitzustellen, bei welchen die geschilderten Nachteile vermieden werden. Insbesondere soll mit dem Verfahren eine allgemein anwendbare Bestimmung von Bindungsparametern ermöglicht werden, welche nicht auf Spezialfälle beschränkt ist. Das Verfahren soll ohne großen Aufwand durchführbar sein und für einen hohen Probendurchsatz geeignet sein.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, wie es in Anspruch 1 beschrieben ist. Die abhängigen Ansprüche 2 bis 16 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens. Der Anspruch 17 befaßt sich mit einem Kit zur Bestimmung von Bindungsparametern. Bevorzugte Ausführungen dieses Kits sind in den abhängigen Ansprüchen 18 bis 26 genannt. Durch Bezugnahme wird hiermit der Wortlaut sämtlicher Ansprüche zum Inhalt der Beschreibung gemacht.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Bindungsparametern zwischen mindestens einer Substanz und mindestens einem Bindungspartner verwendet mindestens eine lumineszierende Sonde. Dabei wird Lumineszenz als Oberbegriff insbesondere für Fluoreszenz und Phosphoreszenz, aber auch beispielsweise für Elektro-, Thermo- und Chemolumineszenz verwendet. Es wird zunächst mindestens ein Festkörper bereitgestellt, der zumindest teilweise mit mindestens einem Bindungspartner beladen ist. Die zu untersuchende Substanz oder die Substanzen werden mit diesem Festkörper zusammengebracht, so daß sich Wechselwirkungen zwischen Substanz und Bindungspartner, insbesondere Bindungen, ausbilden können. Dieser Inkubation des Festkörpers mit der mindestens einen Substanz folgt eine Separation des Festkörpers, welcher nun die gebundene Substanz tragen kann, und nicht gebundener Substanz in einem Reaktionsgefäß in Sediment und Überstand. Zur Ermittlung der Substanzkonzentration im Überstand wird eine Modulation bzw. Abschwächung von Lumineszenzsignalen der mindestens einen Sonde durch nicht gebundene Substanz im Überstand gemessen. Dies setzt die Überlappung der Absorptionsspektren der mindestens einen Substanz mit Anregungs- und/oder Emissionsspektren der mindestens einen Sonde voraus.

Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt damit den sogenannten inneren Filtereffekt aus, bei welchem die Lichtabsorption von Substanzen auf indirektem Wege über eine Abschwächung von Lumineszenzintensitäten geeigneter Sonden bestimmbar ist. Dieses Phänomen beruht darauf, daß die Intensität von Lichtstrahlen, die auf dem Weg zu einer geeigneten Sonde bzw. auf dem Weg von der Sonde zu einem Detektor von anderen gelösten Substanzen absorbiert werden, das heißt also abgeschwächt werden. Die Überlappung von Anregungs- beziehungsweise Emissionswellenlängen mit der Absorptionsbande der zu untersuchenden Substanz führt bei der Messung bei geeigneten Wellenlängen (das heißt im Bereich der Absorptionsbande der Substanz) zu einer Modulation bzw. Abschwächung der Lumineszenzintensität, die proportional der Konzentration der zu untersuchenden Substanzen im Überstand ist. Dieser Effekt eignet sich damit in besonders vorteilhafter Weise zur Konzentrationsbestimmung der zu untersuchenden Substanz im Überstand gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Der innere Filtereffekt wurde bereits für verschiedene analytische Methoden ausgenutzt. Beispielsweise beschreibt die WO 94/17388 die Nutzung des inneren Filtereffekts für die Bestimmung von Ionen in Flüssigkeiten mit Hilfe einer Sensormembran. Die US 4,822,746 befaßt sich allgemein mit der Nutzung des inneren Filtereffekts zur Bestimmung einer Ligandenbindung, wobei hier unter Liganden Ionen, Stoffe oder Ähnliches zu verstehen sind. Der nachzuweisende Ligand wird hier durch eine geeignete (Farb-)Reaktion einer Analyse zugänglich gemacht. Weiterhin beschreibt die US 4,654,300 die Nutzung eines derartigen Quencheffektes in Immunoassays. In jedem dieser genannten Fälle wird der innere Filtereffekt zu analytischen Zwecken genutzt. Dieser Effekt wird jedoch in keinem Fall direkt oder ausschließlich durch die zu untersuchende Substanz hervorgerufen, wie es im Verfahren gemäß der Erfindung vorgesehen ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren setzt neben dem inneren Filtereffekt eine räumliche Trennung von gebundener und freier Substanz innerhalb eines Reaktionsgefäßes voraus, wobei für diese Trennung eine Separation in Sediment und Überstand erfolgt. Das Sediment umfaßt den Festkörper mit Bindungspartner und gegebenenfalls mit gebundener Substanz. Im Überstand ist die nicht gebundene Substanz enthalten. Hierdurch wird eine Kompartimentierung in eine überwiegend flüssige Phase und eine weitgehend feste Phase erzielt. Diese Trennung von gebundenem und nicht gebundenem Anteil der zu untersuchenden Substanz innerhalb eines Gefäßes erfordert keine weiteren Transferschritte zur Trennung von Sediment und Überstand. Vielmehr kann mit Hilfe des inneren Filtereffekts direkt in dem Reaktionsgefäß die Konzentration der zu untersuchenden Substanz im Überstand bestimmt werden.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind prinzipiell zwei Alternativen möglich, die gegebenenfalls miteinander kombiniert werden können. In der ersten Alternative befindet sich die lumineszierende Sonde während der Messung im Sediment. In der zweiten Alternative befindet sich die lumineszierende Sonde während der Messung im Überstand.

Gemäß der ersten Alternative ist die lumineszierende Sonde an dem Festkörper aufgebracht, der mit Bindungspartner beladen sein kann. Bevorzugterweise wird hierfür der Festkörper vor einer Immobilisierung des Bindungspartners mit geeigneten Sonden versehen. Weiterhin kann es auch bevorzugt sein, daß der Festkörper selbst Lumineszenzeigenschaften aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, insbesondere gemäß dieser Alternative, wird für das erfindungsgemäße Verfahren zum einen Festkörper weitestgehend ohne spezifische und/oder weitestgehend ohne unspezifische Bindungsaffinität zur zu untersuchenden Substanz als sogenannter bindungspassiver Festkörper und/oder weiterer Festkörper mit spezifischer Bindungsaffinität zur Substanz als sogenannter bindungsaktiver Festkörper bereitgestellt. Der Festkörper mit spezifischer Bindungsaffinität ist hierbei im allgemeinen mit dem mindestens einen Bindungspartner beladen bzw. trägt den Bindungspartner in immobilisierter Form. Die bindungspassiven Festkörper sind gegenüber unspezifischer Bindung der Substanzmoleküle weitestgehend inert bzw. inertisiert, wobei die Inertisierung über eine kovalente und/oder nicht kovalente Absättigung reaktiver Gruppen erfolgen kann. Sie werden in der Regel zur Bestimmung der Ausgangskonzentration, also zur Substanzkonzentration vor der Bindung an den Bindungspartner, verwendet. Die bindungsaktiven Festkörper mit dem immobilisierten Bindungspartner werden zur Bestimmung der Substanzkonzentration nach der Bindung verwendet. Zur Verdeutlichung dieses Verfahrens wird auf die 1 verwiesen.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens werden sondenmarkierte Substanzen beziehungsweise Festkörper zu den bindungsaktiven und bindungspassiven Festkörpern gegeben, die damit nicht mehr notwendigerweise sondenmarkiert sein müssen. Die zugegebenen sondenmarkierten Substanzen beziehungsweise Festkörper ermöglichen dann eine Bestimmung der Substanzkonzentration mittels des inneren Filtereffekts. Dieses Verfahren erfordert ein weitgehend gleiches Sedimentationsverhalten von sondenmarkierten Substanzen beziehungsweise Festkörpern und den bindungsaktiven und bindungspassiven Festkörpern.

Gemäß der zweiten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens befindet sich die Sonde während der Messung im Überstand. Hierbei erfolgt die Detektion der Substanzkonzentration mittels des inneren Filtereffekts in der weitgehend flüssigen Phase, also dem Überstand, wobei sich im Überstand lumineszierende Sonden als Partikel befinden, die nicht sedimentieren. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, daß die lumineszierenden Partikel eine Dichte vergleichbar mit der wäßrigen Phase, also beispielsweise mit Wasser oder Puffer, aufweisen. Vorzugsweise sind diese Partikel weiterhin ausreichend groß, um ultraviolettes und sichtbares Licht zu streuen. Sie weisen also vorzugsweise optisch streuende Eigenschaften auf. Durch diese lichtstreuenden Eigenschaften der Partikel bzw. der Sonden erreicht das Lumineszenzsignal, insbesondere das anregende Licht, nicht den sedimentierten Festkörper, und es stellt sich eine gleichmäßige optische Weglänge ein. Zur Verdeutlichung dieses Verfahrens wird auf die 2 verwiesen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Alternative des Verfahrens erfolgt die Zugabe der lumineszierenden Sonden, insbesondere der Partikel, nach der Bindung und räumlichen Trennung beziehungsweise Separation des Festkörpers. Andererseits ist es auch möglich, die lumineszierenden Partikel beziehungsweise Sonden zusammen mit dem Festkörper und den Kontrollen in den Reaktionsgefäßen vorzulegen, und die zu untersuchende Substanz am Ende zuzugeben. Diese Ausführungsform erfordert, daß während der Sedimentation des Festkörpers die streuenden und lumineszierenden Partikel in Suspension verbleiben.

Die beiden beschriebenen grundsätzlichen Alternativen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unterscheiden sich vor allem dadurch, daß die lumineszierenden Partikel beziehungsweise Sonden bei der zweiten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens im Überstand verbleiben und sich nicht im Sediment bzw. der Festkörperphase nach der Separation befinden. Weiterhin ist bei der zweiten Alternative die Verwendung bindungspassiver Festkörper nicht notwendig, aber möglich. Die räumliche Trennung von gebundener und freier Substanzfraktion innerhalb des Reaktionsraumes beziehungsweise des Reak tionsgefäßes ist jedoch bei beiden Alternativen die grundlegende Voraussetzung für die Durchführung des Verfahrens.

Die gemessenen Lumineszenzsignale stellen vorzugsweise konzentrationsproportionale Größen dar, mit deren Hilfe die Quantifizierung der Bindung erfolgt. Vorzugsweise werden hierfür die Lumineszenzintensitäten des bindungspassiven Festkörpers mit und ohne Substanz im Überstand gemessen. Die Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe ergibt sich aus dem Lambent-Beer-Gesetz: c' = c'vor der Bindung = log l'0/l' = ε·c·d

Dabei ist l'₀ die Lumineszenzintensität im Reaktionsgefäß mit Pufferlösung und l' die Lumineszenzintensität im Reaktionsgefäß mit Substanzlösung. Zur Bestimmung der Bindung wird der Festkörper mit dem Bindungspartner belegt, und der bindungsaktive Festkörper wird von der freien Substanzfraktion durch zum Beispiel Sedimentation oder Zentrifugation getrennt. Es erfolgt vorzugsweise wiederum die Messung einer Referenz ohne Substanz und die konzentrationsproportionale Größe der Substanz im Überstand wird gemäß dem Lambert-Beer-Gesetz c* = c*nach Bindung = log l*0/l* = ε·c·dermittelt. Durch Vergleich der Konzentrationen vor und nach der Bindung kann die Bindung quantifiziert werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die mindestens eine lumineszierende Sonde fluoreszierende und/oder phosphoreszierende Eigenschaften auf. Hierbei erfolgt die Anregung der jeweiligen Fluoreszenz oder Phosphoreszenz entweder mit einer oder mehreren definierten Wellenlängen, oder es werden Anregungsspektren aufgenommen. Weiterhin kann als Sonde auch eine lumineszierende Sonde eingesetzt werden, welche ein Signal ohne vorherige Lichtanregung abstrahlt. Beispielsweise kann hierfür eine Sonde mit Elektro-, Thermo- und/oder Chemolumineszenz verwendet werden. Die Verwendung von Sonden mit Fluoreszenz und Phosphoreszenz ist jedoch besonders be vorzugt, da es sich hierbei um in der Laborpraxis etablierte Vorgehensweisen handelt, die sehr gut handhabbar sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Einzelsonde bzw. eine einzelne Sondenart eingesetzt. Andererseits kann es auch bevorzugt sein, daß eine Kombination verschiedener Sonden verwendet wird. Eine solche Kombination von Sonden kann vorzugsweise über den sogenannten Förster-Energietransfer miteinander gekoppelt sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht der oder die Festkörper aus einem Glas-, Keramik-, Silikat-, Metall- und/oder Polymermaterial oder aus Kombinationen dieser Materialien. Ganz besonders bevorzugt sind Festkörper in Form von Kügelchen, sogenannten Beads, wobei es sich hierbei vorzugsweise um poröse Kügelchen handelt. Ganz besonders bevorzugt sind derartige Kügelchen, vorzugsweise poröse Kügelchen, aus Silikatmaterial.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem Bindungspartner um mindestens eine Lipidmembran. Hierbei kann es sich um eine einfache Lipidschicht, einen sogenannten Monolayer, oder um eine doppelte Lipidschicht, einen sogenannten Bilayer, handeln. Die Zusammensetzung derartiger Lipidschichten kann je nach gewünschter Anwendung frei gewählt werden. Beispielsweise können derartige Lipidschichten weitgehend homogen aufgebaut sein, oder es können beispielsweise verschiedene Lipide als Bestandteile der Membranschichten eingesetzt werden, wodurch zum Beispiel die Gegebenheiten einer nativen Membran nachgestellt werden können. Weiterhin kann es auch bevorzugt sein, daß es sich bei der Lipidmembran um eine sogenannte Biomembran handelt, die insbesondere aus natürlichen Membranen hergestellt ist. Die Zusammensetzung einer solchen Biomembran kann naturgemäß variieren. Derartige Lipid membranen oder Biomembranen werden gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren auf einem Festkörper immobilisiert. Hierbei können diese Membranen (Monolayer oder Bilayer) kovalent fixiert sein. Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn diese Lipidschichten nicht kovalent fixiert sind, so daß sie native Bedingungen einer Lipidmembran besonders gut widerspiegeln. Mit Hilfe solcher immobilisierten Lipidschichten können mit besonderem Vorteil die Bindungsparameter einer zu untersuchenden Substanz mit Lipidschichten analysiert werden, wie es für viele Aspekte bei der Untersuchung von potentiellen Wirkstoffen oder Ähnlichem von Interesse ist.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können erfindungsgemäß als Bindungspartner Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, Tenside, Steroide, Polymere, Nukleotide, Oligonukleotide, DNA und/oder RNA eingesetzt werden. In besonders bevorzugter Weise werden als Bindungspartner immobilisierte Proteine eingesetzt, insbesondere Serumproteine, zum Beispiel humanes Serumalbumin, Enzyme oder Antikörper. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren können hiermit die Bindungsparameter einer zu untersuchenden Substanz mit einer oder mehreren dieser Bindungspartner untersucht werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann der mit Bindungspartner beladene Festkörper noch weitere Komponenten aufweisen. Beispielsweise kann auf oder innerhalb einer Lipidmembran, die auf dem Festkörper immobilisiert ist, ein weiteres Protein oder mehrere Proteine fixiert sein. Insbesondere kann es sich um in der Lipidmembran rekonstituierte Proteine handeln. Weiterhin können auch Kohlenhydrate, Tenside, Steroide, Polymere, Nukleotide, Oligonukleotide, DNA und/oder RNA oder auch Peptide als weitere Komponenten auf dem Festkörper immobilisiert sein. Besonders bevorzugt geschieht dies in Verbindung mit einer Lipidmembran, insbesondere einer Lipiddoppelschicht. Es kann sich beispielsweise um einen rekonstituierten Liganden handeln, beispielsweise ein Protein. Durch Integration eines oder mehrerer Proteine, Kohlenhydrate oder anderer weiterer Komponenten innerhalb einer Lipidmembran, insbesondere einer Lipiddoppelschicht, können mit besonderem Vorteil native Bedingungen einer Lipidmembran nachgestellt werden, so daß mit Hilfe solcher relativ komplexen Bindungspartner auf der Grundlage einer Lipidmembran ein weitgehend natürliches Bindungsverhalten der zu untersuchenden Substanz nachgestellt werden kann. Andererseits können auch andere Kombinationen, beispielsweise Proteine und Kohlenhydrate, als Bindungspartner auf dem Festkörper immobilisiert sein.

Als zu untersuchende Substanzen kommen im Prinzip alle Stoffklassen in Frage. Insbesondere können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens potentielle Wirkstoffe, insbesondere potentielle pharmazeutische und/oder biologische Wirkstoffe, untersucht werden, die für Therapie und/oder Diagnostik verschiedener Krankheiten einsetzbar sind. Es kann sich hierbei beispielsweise um Peptide oder Proteine handeln. Insbesondere können auch niedermolekulare Stoffe, wie häufig bei potentiellen pharmazeutischen Wirkstoffen vorkommend, untersucht werden. Weiterhin können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Beispiel potentielle Umweltgifte untersucht werden, die verschiedene Zusammensetzungen haben können bzw. unterschiedlichen Substanzklassen zuzuordnen sein können.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß die Separation in Sediment und Überstand ohne besonderen Aufwand erfolgt. Durch die Separation werden gebundene und freie Fraktion der zu untersuchenden Substanz räumlich voneinander getrennt, so daß die Bestimmung der Konzentration im Überstand innerhalb des Reaktionsgefäßes unter Ausnutzung des inneren Filtereffekts durchgeführt werden kann. Besonders bevorzugt ist es, daß die Separation durch Sedimentation und/oder Zentrifugation vorgenommen wird, insbesondere durch niedertourige Zentrifugation. Vor allem eine einfache Sedimentation hat den Vorteil, daß hierfür keinerlei apparativer Aufwand erforderlich ist und daß die Trennung in Sediment und Überstand ohne weiteres Zutun erfolgt. Die Durchführung der Separation mit Hilfe einer Zentrifugation, insbesondere einer niedertourigen Zentrifugation, hat den Vorteil, daß hierdurch der Separationsprozeß beschleunigt und gegebenenfalls verstärkt werden kann, was je nach gewünschter Anwendung vorteilhaft sein kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann innerhalb üblicher Reaktionsgefäße durchgeführt werden. Besonders bevorzugt ist hierbei der Einsatz von Mikrotiterplatten, also insbesondere der Einsatz der Kavitäten einer Mikrotiterplatte als Reaktionsgefäß. Hierbei sind Mikrotiterplatten üblicher Abmessungen geeignet, wobei beispielsweise Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen (Kavitäten) eingesetzt werden können, welche zum einen ein ausreichendes Volumen innerhalb der einzelnen Kavität bereitstellen und zum anderen einen hohen Probendurchsatz ermöglichen. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren selbstverständlich auch in anderen geeigneten Aufbauten durchgeführt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Messung der Lumineszenzsignale bei einer oder mehreren diskreten Wellenlängen, insbesondere Anregungs- und Emissionswellenlängen. Andererseits können jedoch auch gesamte Spektren gemessen werden und hieraus Rückschlüsse auf die Modulation der jeweiligen Signale bestimmter Wellenlängen gezogen werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Anregung der Sonden bei einer bestimmten Wellenlänge durch Bestrahlung „von oben", wobei also die Anregung auf der Seite des Überstandes erfolgt. Dies muß selbstverständlich nicht unbedingt die obere Seite des Ansatzes sein. Bei entsprechender Ausrichtung des gesamten Reaktionsansatzes, bei spielsweise in einer Zentrifuge, kann dies zum Beispiel auch eine Bestrahlung von der Seite her bedeuten. Diese anregende Wellenlänge durchläuft den Überstand und wird hierbei durch Lichtabsorption der nicht gebundenen Substanzen im Überstand abgeschwächt. Dies bewirkt, daß nur noch ein verminderter Anteil des eingestrahlten Signals auf die Sonde im Sediment oder auch im Überstand, je nach Alternative des Verfahrens, trifft, und damit das von der Sonde abgestrahlte Lumineszenzsignal im Vergleich mit entsprechenden Kontrollen vermindert ist. Bei der Verwendung von lumineszierenden Sonden, die ein Signal ohne vorherige Anregung abstrahlen, wird in der Regel das abgestrahlte Signal auf der Seite des Überstands aufgenommen werden, da hierbei dieses Phänomen des inneren Filtereffektes in entsprechender Weise ausgenutzt werden kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Messung des ausgestrahlten Signals, also der emittierten Strahlung der Sonde, auf der Seite des Sediments, also ohne Durchlaufen des Überstandes. Auch die Anregung mit einer geeigneten Anregungswellenlänge erfolgt vorzugsweise auf dieser Seite (Messung „von unten"). Dadurch wird erreicht, daß eine veränderte Lumineszenzintensität nach Bindung der zu untersuchenden Substanz an den Bindungspartner im Sediment berücksichtigt werden kann. Diese Art der Messung dient also vor allem einer Normierung der Meßergebnisse. Dies kann vorzugsweise zu einer Normierung der Lumineszenzintensität der Messung „von oben" eingesetzt werden, so daß die Lumineszenzmodulation durch die am Festkörper gebundene Substanz korrigiert werden kann. Bevorzugterweise erfolgt insbesondere bei der ersten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Messung sowohl „von oben" als auch „von unten". Andererseits kann es auch bevorzugt sein, daß die Messung ausschließlich durch eine Messung der emittierten Strahlung und vorzugsweise auch einer Anregung der Sonden „von unten" erfolgt, beispielsweise wenn es um die Bestimmung verhältnismäßig hoher Konzentrationen geht. Auch bei der beschriebenen zweiten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Anregung und/oder Messung der emittierten Strahlung vorzugsweise „von oben". Hierfür können wiederum entweder die Anregungs- oder Emissionsspektren bestimmt werden, beziehungsweise es können die Lumineszenzsignale bei einer oder mehreren diskreten Anregungs- und Emissionswellenlängen ermittelt werden. Selbstverständlich sind auch Kombinationen der verschiedenen Möglichkeiten möglich.

In bevorzugter Weise erfolgt die Ermittlung der Substanzkonzentration im Überstand durch Bestimmung von konzentrationsproportionalen Größen, wie es bereits beschrieben wurde. Als Alternative hierzu oder in Kombination dazu kann es bevorzugt sein, daß die Substanzkonzentration anhand von Kalibriergeraden ermittelt wird. Hierfür werden vorteilhafterweise vor und/oder nach der Bindung Kalibriergeraden aufgenommen, bei denen in Gegenwart der lumineszierenden Sonden, beispielsweise der Partikel gemäß der zweiten Alternative des Verfahrens, die Konzentration der Substanz variiert wird und gemäß dem Lambert-Beer-Gesetz c'' = log l''0/l'' = ε·c·d = α·cdie Proportionalitätskonstante α bestimmt wird. Dabei sind l''₀ die Lumineszenzintensität, insbesondere die Fluoreszenz- und/oder Phosphoreszenzintensität, der Pufferlösung und l'' die Lumineszenzintensität, insbesondere die Fluoreszenz- und/oder Phosphoreszenzintensität, der Substanzlösung. Zum anderen können daneben oder als Alternative dazu die konzentrationsproportionalen Größen c''_{vor Bindung} Und C''_nach
Bindung bestimmt und durch Vergleich beider Parameter die Bindung quantifiziert werden.

Die Erfindung umfaßt ferner einen Kit zur Bestimmung von Bindungsparametern, welcher mindestens einen Festkörper und mindestens eine lumineszierende Sonde umfaßt. Die Sonde besitzt vorzugsweise fluores zierende und/oder phosphoreszierende Eigenschaften und befindet sich während der Messung gemäß dem beschriebenen Verfahren im Sediment oder im Überstand. Es können auch Sonden mit Lumineszenzeigenschaften ohne Lichtanregung, insbesondere Elektro-, Thermo- und/oder Chemolumineszenzeigenschaften, bevorzugt sein.

Bevorzugterweise ist der Festkörper zumindest teilweise mit mindestens einem Bindungspartner beladen. Andererseits kann es auch bevorzugt sein, daß der Festkörper im erfindungsgemäßen Kit ohne weitere Beladung bereitgestellt wird, so daß der Anwender die Möglichkeit erhält, eine Beladung mit geeigneten Bindungspartnern selbst vorzunehmen. Hierdurch wird eine größere Flexibilität der Einsatzmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Kits erreicht, so daß der Anwender die Komponenten des erfindungsgemäßen Kits den jeweiligen Fragestellungen des durchzuführenden Experiments ohne weiteres anpassen kann. Vor allem in dem Fall, daß der Festkörper ohne Beladung mit einem Bindungspartner im Kit bereitgestellt wird, können weitere Komponenten im Kit enthalten sein, die für eine Beladung beziehungsweise Immobilisierung mit Bindungspartnern vom Anwender eingesetzt werden können, beispielsweise geeignete Puffer, Linkermoleküle oder Ähnliches.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Kits ist der Festkörper mit einer Lipidschicht, vorzugsweise mit einer Lipiddoppelschicht beladen. Eine Beladung mit einer Lipidmonoschicht kann ebenfalls bevorzugt sein. Die Immobilisierung erfolgt zum Beispiel über kovalente Kräfte. Besonders bevorzugt ist jedoch eine Immobilisierung über nicht kovalente Kräfte, beispielsweise über lipophile Wechselwirkungen, insbesondere Van-der-Waals-Wechselwirkungen, und/oder elektrostatische Wechselwirkungen. Dies hat den Vorteil, daß hierdurch native Bedingungen einer Membran besonders gut imitiert werden können. Bezüglich einer geeigneten Immobilisierung von Lipidschichten wird auf die WO 99/51984 verwiesen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits wird der mit Bindungspartner beladene Festkörper durch einen Festkörper mit immobilisierten Proteinen bereitgestellt. Besonders bevorzugt sind hierbei auf dem Festkörper immobilisierte Serumproteine, zum Beispiel humanes Serumalbumin, Enzyme oder Antikörper. Die festkörperimmobilisierten Proteine können beispielsweise direkt oder über geeignete Linkermoleküle auf dem Festkörper immobilisiert sein.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Bindungspartner von einer Lipidschicht gebildet, welche rekonstituierte Proteine innerhalb der Schicht aufweist. Hierdurch können beispielsweise Bindungsaffinitäten zwischen Substanz und Bindungspartner analysiert werden, wobei der Bindungspartner im engeren Sinne das Protein ist, welches in seiner natürlichen Umgebung, nämlich der Lipidschicht beziehungsweise einer Lipiddoppelschicht, der Substanz zur Bindung angeboten wird. Hiermit können in besonders vorteilhafter Weise die natürlichen Bedingungen von Bindungsreaktionen nachgestellt werden. Bei den Proteinen als Bindungspartner, welche entweder an und/oder innerhalb einer Lipidschicht auf dem Festkörper immobilisiert sind, handelt es sich vorzugsweise um membranständige und/oder transmembrane Proteine, insbesondere um Serumproteine, vorzugsweise humanes Serumalbumin.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist der Festkörper mit der mindestens einen lumineszierenden Sonde versehen. Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist vor allem zur Durchführung des Verfahrens gemäß der oben beschriebenen ersten Alternative geeignet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits weist die Sonde optisch streuende Eigenschaften auf und ist nicht mit dem Festkörper gekoppelt. Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist vor allem zur Durch führung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß der oben beschriebenen zweiten Alternative geeignet.

Besonders vorteilhaft ist eine Bereitstellung des zumindest teilweise mit mindestens einem Bindungspartner beladenen Festkörpers in vorpipettierten Mikrotiterplatten mit beispielsweise 96, 384 und 1536 well (Kavitäten) Format, bei denen der festkörperimmobilisierte Bindungspartner, gegebenenfalls die Sonde, und der Puffer bereits enthalten sind, so daß der Anwender nur noch die Substanz und gegebenenfalls die Sonde hinzugeben muß.

Bezüglich weiterer Merkmale der verschiedenen Komponenten des erfindungsgemäßen Kits wird auf die obige Beschreibung verwiesen.

Die Verwendung lumineszenzmarkierter Festkörper und/oder streuender und lumineszierender Partikel gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren stellt im Zusammenhang mit der festkörperunterstützten Bindung zwischen einem immobilisierten Bindungspartner und einer zu untersuchenden Substanz ein allgemein anwendbares Verfahren zur Bestimmung von Bindungsparametern dar. Die Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größen kann vorteilhafterweise direkt nach Trennung in Sediment und Überstand durch eine einfache Sedimentation oder Ähnliches erfolgen. Hierbei dient die zu untersuchende Substanz sozusagen selbst als Marker. Dadurch wird eine Konzentrationsänderung nach der Bindung direkt und ausschließlich durch die zu untersuchende Substanz erfaßt und durch eine Modulation des lumineszierenden Signals zugänglich. Das erfindungsgemäße Verfahren wird daher den Ansprüchen eines automatisierten und anwenderfreundlichen Hochdurchsatzscreening-Verfahrens, wie es vorzugsweise in der pharmazeutischen Industrie angewendet wird, in besonders vorteilhafter Weise gerecht.

Die beschriebenen Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung erschließen sich aus der folgenden Beschreibung von Beispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen und den Figuren. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.

In den Figuren zeigt

1: schematische Darstellung des Meßprinzips gemäß der ersten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens;

2: schematische Darstellung des Meßprinzips gemäß der zweiten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens;

3: Konzentrationsabhängigkeit der konzentrationsproportionalen Größe log F₀(λ)/F(λ) = ε(λ)·c·d für Warfarin;

4: Korrelation der erfindungsgemäß gemessenen Membranaffinitäten logMA mit den Werten aus herkömmlichen Membranaffinitätsmessungen unter Verwendung von Filterassays;

5: Korrelation der erfindungsgemäß gemessenen K_d-Werte (Dissoziationskonstante) der HSA-Bindung mit Werten aus herkömmlich ermittelten Dissoziationskonstanten unter Verwendung von Filterassays;

6: Konzentrationsabhängigkeit der konzentrationsproportionalen Größe log F₀(λ)/F(λ) = ε(λ)·c·d in stark streuenden Medien für Warfarin.

Die 1 zeigt in schematischer Darstellung das Meßprinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Form der ersten Alternative des Verfahrens in bevorzugter Ausführungsform. Hierbei liefert die Messung der Fluoreszenz der passivierten Festkörper die Intensitäten l₀' (passivierter Festkörper plus Puffer), und l' (passivierter Festkörper plus Puffer plus Substanz) liefert die konzentrationsproportionale Größe c'_vor
Bindung. Die Messung der Fluoreszenz der bindungsaktiven Festkörper liefert die Intensitäten l₀* (bindungsaktiver Festkörper plus Puffer), und l* (bindungsaktiver Festkörper plus Puffer plus Substanz) liefert die konzentrationsproportionale Größe c*_nach
Bindung. Die 2 zeigt in vergleichbarer Weise das Meßprinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß der zweiten Alternative in einer bevorzugten Ausführungsform. Hierbei ist l₀ die Fluoreszenzintensität der Pufferlösung, l_{vor Bindung}'' die Fluoreszenzintensität der Substanzlösung und l_{nach Bindung}'' die Fluoreszenzintensität nach dem Bindungsereignis und Kompartimentierung in Sediment und Überstand.

Im weiteren wird die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand der Affinitätsbestimmung von Warfarin an eine Lipidmembran, der Bestimmung der Albuminbindung von Carbamazepin sowie anhand der Albuminbindung von Warfarin in stark streuenden Medien beschrieben.

1. Herstellung von Aminoträgern
2 g eines porösen Silikatmaterials (Nucleoprep 300-12, Macherey-Nagel, Düren) werden in eine Silanlösung, bestehend aus 9,2 ml N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilan und 243 μl konzentrierter Essigsäure in 450 ml entionisiertem Wasser, gegeben und drei Stunden lang sam rotiert, danach wird das Silikatmaterial sedimentiert, dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen und bei 80°C getrocknet.
2. Herstellung von fluoreszenzaktiven Trägern
1 mg 3-Indolylessigsäure wird in 0,5 ml Dimethylformamid gelöst, und zu dieser Lösung werden 10 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 12 mg 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid, ebenfalls in 0,5 ml Dimethylformamid gelöst, gegeben. Diese Lösung wird mindestens 2 Stunden gerührt, und anschließend werden 200 mg des in 1. hergestellten Aminoträgers zugegeben. Diese Suspension wird über Nacht rotiert und dreimal mit PBS (phosphate buffered saline, 10 mM Natriumphosphat, 0,9 % Natriumchlorid, pH 7.4) gewaschen und in Carbonatpuffer überführt.
Zu 100 mg des Trägers in 900 μl Carbonatpuffer (pH 9,5) werden 100 μl einer Lösung von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) in einem Carbonatpuffer (1,33 mg/ml) hinzugegeben und über Nacht rotiert. Zur Entfernung von nicht umgesetzten FITC wird zunächst zweimal mit Carbonatpuffer und anschließend dreimal mit PBS gewaschen.
3. Herstellung von fluoreszenzaktiven und bindungspassiven Trägern (FI-Ref)
Zur 100 mg des fluoreszenzaktiven Trägers aus 2. wird 1 ml einer Lösung von Polyethylenglykolbisglycidylether (Mn ungefähr 526) in PBS (3 (w/v)) gegeben und über Nacht auf dem Überkopfrotierer gedreht. Abschließend wird dreimal mit PBS gewaschen.
4. Rekonstitution von Lipidmembranen auf fluoreszenzaktiven Trägern (FI-EiPC)
Zur Rekonstitution von Lipidmembranen wird zunächst 1 g eines gemäß 2. hergestellten Trägers mit einer Lösung von 25 mg Polystyrolsulfonat, Natriumsalz in 25 ml Wasser im Überkopfrotierer behandelt und anschließend je dreimal mit Wasser und PBS gewaschen.
Zu diesem Träger werden 60 ml einer Vesikellösung von 5 mg/ml EiPC (Lipidextrakt aus Eigelb) in PBS (Herstellung durch Homogenisierung im Homogenisator EmulsiFlex-C5 der Firma AVESTIN) gegeben und über Nacht inkubiert. Zur Entfernung überschüssigen Lipids wird dreimal mit PBS gewaschen und der Träger anschließend in PBS aufbewahrt. Die Bestimmung der Lipidkonzentration erfolgt über Trocknen definierter Suspensionsvolumina, Ablösen des Lipids vom Festkörper mittels eines organischen Lösemittels und anschließender HPLC-Analytik.
5. Immobilisierung von Human Serum Albumin (HSA) auf fluoreszenzaktiven Trägern (FI-HSA)
Zur Immobilisierung von HSA werden zu 1 g eines gemäß 2. hergestellten Trägers 100 mg HSA, gelöst in 10 ml Phosphatpuffer (20 mM, pH 7,4), gegeben und mindestens vier Stunden über Kopf rotiert. Zur Entfernung von freiem Protein wird mit Phosphatpuffer, 1 M NaCl in Phosphatpuffer und abschließend mit PBS gewaschen. Die Quantifizierung der Proteinimmobilisierung erfolgt durch Überstandsanalyse. Die Suspension wird in einer gewünschten Proteinkonzentration in PBS eingestellt und aufbewahrt.
6. Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe von Warfarin
200 mg des gemäß 3. hergestellten bindungspassivierten und fluoreszenzaktiven Trägers werden mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gebracht. Von dieser Suspension werden jeweils 30 μl in verschiedene Kavitäten einer 96 well Mikrotiterplatte (Greiner UV-Star) gefüllt. Durch Zugabe definierter Volumina von Warfarin und PBS werden in einem Gesamtvolumen von 300 μl zehn verschiedene Warfarinkonzentrationen zwischen 0 und 2 E-4 mol/l hergestellt. Nach Mischen der Kavitäten durch Resuspension wird der Festkörper durch Sedimentation vom Überstand getrennt. In einem Plattenleser (TECAN Safire) werden die Anregungsspektren im „top-read"-Modus in allen zehn Kavitäten zwischen 250 und 480 nm bei einer Emissionswellenlänge von 530 nm gemessen und gemäß des Lambert-Beer-Gesetzes log F₀(λ)/F(λ) = ε(λ)·c·d miteinander verrechnet, wobei das Anregungsspektrum der Pufferlösung F₀(λ) entspricht. Eine Auftragung der konzentrationsabhängigen Größe log F₀/F am Maximum der Warfarinabsorption von 310 nm als Funktion der Konzentration (3) zeigt einen linearen Verlauf.
7. Bestimmung der Membranaffinität von Warfarin im 96 well Format
Zur Bestimmung der Membranaffinität werden 200 mg des in 4. hergestellten FI-EiPC Trägers mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gebracht, ebenso wurden 200 mg eines gemäß 3. hergestellten FI-Ref mit PBS auf 1 ml eingestellt.
Zur Bestimmung der konzentrationsabhängigen Größen wurden folgende Volumina in die Kavitäten einer 96 well UV-Platte (Greiner UV-Star) gegeben:
Vor Bindung
Kavität Referenz 1: 100 μl FI-Ref Suspension + 200 μl PBS;
Kavität Substanz 1: 100 μl FI-Ref Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Warfarinlösung;
Nach Bindung
Kavität Referenz 1': 100 μl FI-EiPC Suspension + 200 μl PBS;
Kavität Substanz 1': 100 μl FI-EiPC Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Warfarinlösung;
wobei die Endkonzentration an Warfarin in den Kavitäten 70 μM ist. Nach Mischen der Kavitäten durch Resuspension wird der Festkörper durch Sedimentation von Überstand getrennt. Zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe c_{vor Bindung} werden im „top-read"-Modus Anregungsspektren zwischen 250 und 480 nm bei einer Emissionswellenlänge von 530 nm von den Kavitäten Referenz 1 und Substanz 1 aufgenommen und gemäß c_{vor Bindung} = log F_0v(λ)/Fv(λ) verrechnet, wobei F_0v(λ) und F_v(λ) die Anregungsspektren der Kavitäten Referenz 1 und Substanz 1 sind. Zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe c_{nach Bindung} werden entsprechend obiger Vorgehensweise Anregungsspektren der Kavitäten Referenz 1' und Substanz 1' aufgenommen und gemäß c_{nach Bindung} = log F_0n(λ)/F_n(λ) berechnet. Hier sind F_0n(λ) und F_n(λ) durch die Anregungsspektren der Kavitäten Referenz 1' und Substanz 1' gegeben. Mit den Lipidvolumina V_lipid und einem Gesamtvolumen V_gesamt in den Kavitäten Referenz 1' und Substanz 1' wird die Membranaffinität von Warfarin gemäß
erhalten. Aus einer Dreifachbestimmung wurde ein Wert von 1.7 ± 0.3 erhalten, der in guter Übereinstimmung mit Werten aus konventionellen Bindungsassays ist.
8. Bestimmung der Membranaffinität im 96 well Format
Zur Bestimmung der Membranaffinität wurden 200 mg des in 4. hergestellten FI-EiPC Trägers mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gebracht, ebenso wurden 200 mg eines gemäß 3. hergestellten FI-Ref mit PBS auf 1 ml eingestellt.
Zur Bestimmung der konzentrationsabhängigen Größen wurden folgende Volumina in die Kavitäten einer 96 well UV-Platte (Greiner UV-Star) pipettiert:
Vor Bindung
Kavität Referenz 1: 100 μl FI-Ref Suspension + 200 μl PBS;
Kavität Substanz 1: 100 μl FI-Ref Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Warfarinlösung;
Kavität Substanz 2: 100 μl FI-Ref Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Benzocainsäure;
Kavität Substanz 3: 100 μl FI-Ref Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Propranolollösung;
Kavität Substanz 4: 100 μl FI-Ref Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Imipraminlösung;
Kavität Substanz 5: 100 μl FI-Ref Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Indomethacinlösung;
Kavität Substanz 6: 100 μl FI-Ref Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Metoprolollösung;
Nach Bindung
Kavität Referenz 1': 100 μl FI-EiPC Suspension + 200 μl PBS;
Kavität Substanz 1': 100 μl FI-EiPC Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Warfarinlösung;
Kavität Substanz 2': 100 μl FI-EiPC Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Benzocainsäure;
Kavität Substanz 3': 100 μl FI-EiPC Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Propranolollösung;
Kavität Substanz 4': 100 μl FI-EiPC Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Imipraminlösung;
Kavität Substanz 5': 100 μl FI-EiPC Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Indomethacinlösung;
Kavität Substanz 6': 100 μl FI-EiPC Suspension + 170 μl PBS + 30 μl Metoprolollösung;
wobei die Substanzkonzentration in den Kavitäten 70 μM ist. Nach Mischen der Kavitäten durch Resuspension wird der Festkörper durch Sedimentation vom Überstand getrennt. Zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe c_{vor Bindung,i} werden sowohl im „top-read"-Modus als auch im „bottom-read"-Modus Anregungsspektren zwischen 250 und 480 nm bei einer Emissionswellenlänge von 530 nm von den Kavitäten Referenz 1 und Substanz i aufgenommen und die „von oben" aufgenommenen Spektren durch Division durch die entsprechend „von unten" aufgenommenen Spektren normiert und gemäß c_{vor Bindung,i} = log F_0v(λ)/F_vi(λ) verrechnet, wobei F_0v(λ) und F_vi(λ) die normierten Anregungsspektren (l_oben/l_unten) der Kavitäten Referenz 1 und Substanz i sind. Zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe C_{nach Bindung,i} werden entsprechend obiger Vorgehensweise Anregungsspektren der Kavitäten 1' und Substanz i' aufgenommen und gemäß c_{nach Bindung,i} = log F_0n(λ)/F_ni(λ) berechnet. Hier sind F_0n(λ) und F_ni(λ) durch die normierten Anregungsspektren (l_oben/l_unten) der Kavitäten Referenz' und Substanz i' gegeben. Mit dem Lipidvolumina V_lipid und einem Gesamtvolumen V_gesamt in den Kavitäten Referenz 1' und Substanz i' erhält man die Membranaffinität logMA_i der Substanz i gemäß
Die gute Übereinstimmung der logMA-Werte mit den aus einem heterogenen Filterassay gewonnenen Vergleichswerten zeigt 4.
9. Bestimmung der Albuminbindung von Carbamazepin im 384 well Format
Zur Bestimmung der Albuminbindung wurden 200 mg des in 5. hergestellten FI-HSA Trägers mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gebracht, ebenso wurden 200 mg eines gemäß 3. hergestellten FI-Ref mit PBS auf 1 ml eingestellt.
Zur Bestimmung der konzentrationsabhängigen Größen wurden folgende Volumina in die Kavitäten einer 384 well UV-Platte (Greiner UV-Platte) pipettiert:
Vor Bindung
Kavität Referenz 1: 35 μl FI-Ref Suspension + 65 μl PBS;
Kavität Substanz 1: 35 μl FI-Ref Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Carbamazepinlösung;
Nach Bindung
Kavität Referenz 1': 35 μl FI-HSA Suspension + 65 μl PBS;
Kavität Substanz 1': 35 μl FI-HSA Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Carbamazepinlösung;
wobei die Endkonzentration an Carbamazepin in den Kavitäten 70 μM ist. Nach Mischen der Kavitäten durch Resuspension wird der Festkörper durch Sedimentation vom Überstand getrennt. Zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe c_{vor Bindung} werden im „top-read"-Modus Anregungsspektren zwischen 250 und 480 nm bei einer Emissionswellenlänge von 530 nm von den Kavitäten Referenz 1 und Substanz 1 aufgenommen und gemäß c_{vor Bindung} = log F_0v(λ)/F_v(λ) verrechnet, wobei F_0v(λ) und F_v(λ) die Anregungsspektren der Kavitäten Referenz 1 und Substanz 1 sind. Zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe c_{nach Bindung} werden entsprechend obiger Vorgehensweise Anregungsspektren der Kavitäten Referenz 1' und Substanz 1' aufgenommen und gemäß c_{vor Bindung} = log F_0n(λ)/F_n(λ) berechnet. Hier sind F_0n(λ) und F_n(λ) durch die Anregungsspektren der Kavitäten Referenz 1' und Substanz 1' gegeben. Mit der Konzentration an HSA in den Kavitäten Referenz 1' und die Substanz 1' c_HSA berechnet sich unter Vernachlässigung von Sättigungseffekten die Dissoziationskonstante K_d für Carbamazepin gemäß
Der erhaltene K_d-Wert von 1,7 E-4 [mol/l] stimmt gut mit den Werten aus konventionellen Bindungsassays überein.
10. Bestimmung der Albuminbindung im 384 well Format
Zur Bestimmung der Albuminbindung werden 200 mg des in 5. hergestellten FI-HSA Trägers mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 1 ml ge bracht, ebenso wurden 200 mg eines gemäß 3. hergestellten FI-Ref mit PBS auf 1 ml eingestellt.
Zur Bestimmung der konzentrationsabhängigen Größen wurden folgende Volumina in die Kavitäten einer 384 well UV-Platte (Greiner UV-Platte) pipettiert:
Vor Bindung
Kavität Referenz 1: 35 μl FI-Ref Suspension + 65 μl PBS;
Kavität Substanz 1: 35 μl FI-Ref Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Phenylbutazonlösung;
Kavität Substanz 2: 35 μl FI-Ref Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Carbamapezinlösung;
Kavität Substanz 3: 35 μl FI-Ref Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Diclofenaclösung;
Kavität Substanz 4: 35 μl FI-Ref Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Ketoprofenlösung;
Kavität Substanz 5: 35 μ FI-Ref Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Furosemidlösung;
Kavität Substanz 6: 35 μl FI-Ref Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Warfarinlösung;
Nach Bindung
Kavität Referenz 1': 35 μl FI-HSA Suspension + 55 μl PBS;
Kavität Substanz 1': 35 μl FI-HSA Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Phenylbutazonlösung;
Kavität Substanz 2': 35 μl FI-HSA Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Carbamazepinlösung;
Kavität Substanz 3': 35 μl FI-HSA Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Diclofenaclösung;
Kavität Substanz 4': 35 μl FI-HSA Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Ketoprofenlösung;
Kavität Substanz 5': 35 μl FI-HSA Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Furosemidlösung;
Kavität Substanz 6': 35 μl FI-HSA Suspension + 55 μl PBS + 10 μl Warfarinlösung;
wobei die Substanzkonzentration in den Kavitäten 70 μm ist. Nach Mischen der Kavitäten durch Resuspension wird der Festkörper durch Sedimentation vom Überstand getrennt. Zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe c_{vor Bindung,i} werden sowohl im „top-read"-Modus als auch im „bottom-read"-Modus Anregungsspektren zwischen 250 und 480 nm bei einer Emissionswellenlänge von 530 nm von den Kavitäten Referenz 1 und Substanz i aufgenommen und die „von oben" aufgenommenen Spektren durch Division durch die entsprechend „von unten" aufgenommenen Spektren normiert und gemäß c_{vor Bindung} = log F_0v(λ)/F_vi(λ) verrechnet, wobei F_0v(λ) und F_vi(λ) die normierten Anregungsspektren (l_oben/l_unten) der Kavitäten Referenz 1 und Substanz i sind. Zur Bestimmung der konzentrationsproportionalen Große c_{nach Bindung,i} werden entsprechend obiger Vorgehensweise Anregungsspektren der Kavitäten Referenz 1' und Substanz i' aufgenommen und gemäß c_nach _Bindung = log F_0n(λ)/F_ni(λ) berechnet. Hier sind F_0n(λ) und F_ni(λ) durch die normierten Anregungsspektren (l_oben/l_unten) der Kavitäten Referenz 1' und Substanz i' gegeben. Mit der Konzentration an HSA in den Kavitäten Referenz 1' und Substanz i' c_HSA erhält man unter Vernachlässigung von Sättigungseffekten die Dissoziationskonstante K_d,i der Substanz i gemäß
Die gute Übereinstimmung der K_d-Werte mit den aus einem heterogenen Filterassay gewonnenen Vergleichswerten zeigt 5.
11. Bestimmung der konzentrationsproportionalen Größe in streuenden Medien
In eine 384 well Mikrotiterplatte werden in fünf verschiedene Kavitäten jeweils 10 μl einer Suspension von Europium-markierten Polystyrol-Mikropartikeln (Durchmesser 1 μm, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) gegeben. Durch Zugabe definierter Volumina von Warfarin und PBS werden in einem Gesamtvolumen von 100 μl fünf verschiedene Warfarinkonzentrationen zwischen 0 und 7E-5 mol/l hergestellt. Die Endkonzentration an Polystyrolpartikeln beträgt 0,05 %. In einem Plattenleser (TECAN Safire) werden die Anregungsspektren im „top-read"-Modus in allen fünf Kavitäten zwischen 230 und 580 nm bei einer Emissionswellenlänge von 620 nm gemessen (lag time 100 μs, integration time 400 μs) und gemäß des Lambert-Beer-Gesetzes log F₀(λ)/F(λ) = ε(λ)·c·d miteinander verrechnet, wobei das Anregungsspektrum der Pufferlösung F₀(λ) entspricht. Eine Auftragung der konzentrationsabhängigen Größe log F₀/F am Maximum der Warfarinabsorption von 310 nm als Funktion der Konzentration (6) zeigt einen linearen Verlauf.
12. Bestimmung der Albuminbindung von Warfarin in stark streuenden Medien
Zur Bestimmung der Albuminbindung in stark streuenden Medien werden drei Kavitäten einer 384 well Mikrotiterplatte mit kommerziell erhältlichem TRANSIL^®-HSA (NIMBUS Biotechnologie GmbH Leipzig) wie folgt befüllt
Kavität Puffer 1: 90 μl PBS;
Kavität Referenz 1: 80 μl PBS + 10 μl Warfarinlösung;
Kavität Substanz 1: 35 μl TRANSIL^®-HSA Suspension + 45 μl PBS + 10 μl Warfarinlösung;
wobei die Warfarinkonzentration in den Kavitäten Referenz 1 und Substanz 1 70 μM ist. Nach Durchmischen und Sedimentation des Festkörpers werden 10 μl einer Suspension von Europium-markierten Polystyrol-Mikropartikeln (Durchmesser 1 μm, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) zugegeben. In einem Plattenleser (TECAN Safire) werden die Anregungsspektren im „top-read"-Modus in allen drei Kavitäten zwischen 230 und 580 nm gemessen bei einer Emissionswellenlänge von 620 nm (lag time 100 μs, integration time 400 μs) und gemäß des Lambent-Beer-Gesetzes log F₀(λ)/F(λ) = ε(λ)·c·d miteinander verrechnet, wobei das Anregungsspektrum der Pufferlösung F₀(λ) entspricht. Mit Hilfe der in 11. aufgenommenen Kalibriergeraden werden die Konzentrationen in der Substanz- und Referenzkavität bestimmt und die K_d gemäß
zu Kd = 1,7E-5 [mol/l] bestimmt, was in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen konventioneller Methoden ist.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von Bindungsparametern zwischen mindestens einer Substanz und mindestens einem Bindungspartner unter Verwendung mindestens einer lumineszierenden Sonde, umfassend die Verfahrensschritte: – Bereitstellung mindestens eines Festkörpers, der zumindest teilweise mit mindestens einem Bindungspartner beladen ist, – Inkubation des Festkörpers mit der mindestens einen Substanz, – Separation von Festkörper und nicht gebundener Substanz in einem Reaktionsgefäß in Sediment und Überstand und – Messung einer Modulation von Lumineszenzsignalen der mindestens einen Sonde durch nicht gebundene Substanz im Überstand zur Ermittlung der Substanzkonzentration im Überstand, wobei Absorptionsspektren der mindestens einen Substanz mit Anregungs- und/oder Emissionsspektren der mindestens einen Sonde überlappen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Sonde während der Messung im Sediment befindet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde an mit Bindungspartner beladenem Festkörper und/oder an unbeladenem Festkörper aufgebracht ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Festkörper selbst Lumineszenzeigenschaften aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Sonde während der Messung im Überstand befindet, wobei vorzugsweise die Sonde optisch streuende Eigenschaften aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Festkörper im wesentlichen ohne spezifische und/oder im wesentlichen ohne unspezifische Bindungsaffinität zur Substanz als bindungspassive Festkörper und/oder Festkörper mit spezifischer Bindungsaffinität zur Substanz als bindungsaktive Festkörper bereitgestellt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die lumineszierende Sonde fluoreszierende und/oder phosphoreszierende Eigenschaften aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine einzelne Sonde oder eine Kombination von Sonden verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Festkörper ein Glas-, Keramik-, Silikat-, Metall- und/oder Polymermaterial ist, insbesondere in Form von Kügelchen, vorzugsweise porösen Kügelchen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspartner mindestens eine Lipidmembran, Biomembran, Peptid, Protein, Enzym, Kohlenhydrat, Tensid, Steroid, Polymer, Nukleotid, Oligonukleotid, DNA und/oder RNA ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Separation durch Sedimentation und/oder Zentrifugation, insbesondere niedertourige Zentrifugation, erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß die Kavität einer Mikrotiterplatte ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lumineszenzsignale bei einer oder mehreren diskreten Wellenlängen und/oder als Spektrum gemessen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Messung die Lumineszenzsignale nach Durchlaufen des Überstandes aufgenommen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Messung, insbesondere zur Normierung der Messung, die Lumineszenzsignale ohne Durchlaufen des Überstandes aufgenommen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ermittlung der Substanzkonzentration im Überstand durch Bestimmung von konzentrationsproportionalen Größen und/oder mit Hilfe von Kalibriergeraden erfolgt.
Kit zur Bestimmung von Bindungsparametern nach einem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, mindestens umfassend folgende Komponenten: – mindestens einen Festkörper und – mindestens eine lumineszierende Sonde.
Kit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Festkörper zumindest teilweise mit mindestens einem Bindungspartner beladen ist.
Kit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der mit Bindungspartner beladene Festkörper ein Festkörper mit immobilisierter Lipidschicht, vorzugsweise Lipiddoppelschicht, ist, insbesondere mit nicht kovalent immobilisierter Lipidschicht.
Kit nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der mit Bindungspartner beladene Festkörper ein Festkörper mit immobilisierten Proteinen ist.
Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der mit Bindungspartner beladene Festkörper ein Festkörper mit in einer Lipidschicht rekonstituierten Proteinen ist.
Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine mindestens ein Serumprotein, insbesondere humanes Serumalbumin, sind.
Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Festkörper mit der Sonde versehen ist.
Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde optisch streuende Eigenschaften aufweist.
Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß Festkörper, insbesondere Festkörper mit immobilisiertem Bindungspartner, und vorzugsweise Puffer in vorpipettierten Mikrotiterplatten, insbesondere in einem 96, 384 und/oder 1536 well (Kavitäten) Format, enthalten ist.
Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten des Kits mindestens eines der Merkmale gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 aufweisen.