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Die Erfindung bezieht sich auf die Gebiete der Biowissenschaften, Biotechnologie und der Elektrotechnik/Elektronik und betrifft ein Verfahren zur Herstellung von großen Vesikeln aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen, wie sie beispielsweise als Lipidvesikel als Modellsystem in biophysikalischen und biomedizinischen Forschungen zur Untersuchung von z. B. Lipid-Protein-Interaktionen dienen.
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Große Vesikel aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen mit nur einer umhüllenden Membran (giant unilamellar vesicles – GUV), wie sie auch im Rahmen dieser Erfindung definiert sein sollen, werden bisher bereits durch verschiedene Verfahren hergestellt. Zur Anwendung als Modellsystem ist es erforderlich, dass die Vesikel größer sind als die Beugungsgrenze des Lichtes (ca. 200 nm), da sie Untersuchungen mit lichtoptischen Methoden ermöglichen. Für die meisten Modellsysteme werden Lipidvesikel benötigt.
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Ein übliches Verfahren zur Vesikelherstellung ist die Elektroformation (Angelova, M. I u. a.: Faraday Discussions 303 (1986)). Dazu werden Lipide entweder aus organischen Lösungsmitteln oder in Form von sehr kleinen Vesikeln aus wässrigen Lösungen auf Elektroden eingetrocknet. Zwischen diesen Elektroden wird in wässrigen Lösungen eine Wechselspannung von ca. 10 Hz und 2,5 V angelegt. Im Laufe von 1–3 h entstehen GUVs mit 10 bis 200 μm Durchmesser.
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Dieses Verfahren ist wegen der Leitfähigkeit auf Lösungen mit einer maximalen Konzentration von Ionen von ca. 10 mmol/l beschränkt. Dies ist weit von den physiologischen Konzentrationen von ca. 150 mmol/l NaCl entfernt. Außerdem ist die relativ lange Herstellungsdauer kritisch, wenn z. B. Kinetiken von Reaktionen im Lumen der Vesikel beobachtet werden sollen.
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Dieses Elektroformations-Verfahren wurde vielfältig modifiziert, wobei allerdings nur durch Pott, T. u. a.: Chem. Phys. Lipids (2008) ein wesentlicher Fortschritt erzielt werden konnte. Dabei wurde eine 500 Hz-Wechselspannung eingesetzt und die GUVs in physiologischer Salzlösung hergestellt. Ebenso ist eine Lipidauftragung in Form von vorher hergestellten kleinen Vesikeln erforderlich. Diese modifizierte Elektroformation selbst besteht aus mehreren Schritten und dauert 2–3 h.
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Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von sehr großen GUVs (mit ca. 200 μm Durchmesser) ist das mikrofluidische Jetting (Stachowiak J. C., u. a.: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4697–4702 (2008)). Dazu wird zunächst eine planare Lipiddoppelschicht zwischen 2 Wassertropfen in einem organischen Lösungsmittel hergestellt (Funakoshi K., u. a.: Anal. Chem. 78, 8169–8174 (2006)). Dann wird analog zur Herstellung von Seifenblasen mit Hilfe einer Glaskapillare ein Puls der zu verpackenden Lösung gegen die Lipiddoppelschicht geschossen, so dass sich ein GUV formt. Durch dieses Verfahren können sehr gleichmäßig große GUVs hergestellt werden, allerdings ist sie methodisch sehr aufwändig und wenig robust. Weiterhin ist von Nachteil, dass das Verfahren nur mit vergleichsweise fluiden, dass heißt niedrigviskosen, Lipidmischungen realisierbar ist. Da die Größe der Vesikel von der Größe der Kapillaren abhängt, steigen die Anforderungen an die Reinheit der Lösungen und die Mechanik der Apparatur bei physiologisch relevanten GUVs mit einem Durchmesser von unter einigen hundert um enorm an.
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Mit sehr geringer Ausbeute können GUVs auch durch spontane Hydrierung von eingetrockneten Lipiden hergestellt werden. Dabei ist mit einem hohen Anteil an multilamellaren Vesikeln zu rechnen, die meistens schwer von unilamellaren Vesikeln zu unterscheiden sind. Durch den Zusatz von künstlich mit langen Polyethylenglycol-Ketten versehenen Lipiden kann die Effizienz erhöht werden, so dass z. B. in-vitro-Translation in diesen Vesikeln beobachtet werden kann (Wei Yu, u. a. J. of Biosci. Bioeng. 92, No. 6, 590–593, (2001)). Zur Untersuchung von Protein-Membran- oder Lipid-Interaktionen sind diese Vesikel allerdings wegen der bedeckten Oberfläche nicht mehr geeignet.
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Weiterhin ist ein Verfahren zur Herstellung von Vesikeln aus doppelten Emulsionen bekannt (Ho Cheung Shum, u. a.: Langmuir 2008, 24, 7651–7653). Hierbei wird ein Tropfen mit wässriger Lösung in einen Tropfen eines später zu entfernenden organischen Lösungsmittels eingebracht, der wiederum von einer wässrigen Lösung umschlossen ist. Die Herstellung erfolgt auch durch Glaskapillaren. Auch dieses Verfahren erfordert einen hohen apparativen Aufwand und ist empfindlich gegenüber Störungen. Nachteilig ist auch, dass die hergestellten Vesikel in den Lipiddoppelschichten Lösungsmittelreste enthalten, die die Eigenschaften der Schichten verändern, was für die weiteren Untersuchungen nachteilig ist.
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Ein Verfahren zur Herstellung von Vesikeln ist aus der
DE 10 2005 053 011 A1 bekannt. Hierbei wird eine Tetraorganosilicium-Verbindung in einem Lösungsmittel, einem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch gelöst, die Lösung in eine wässrige Phase oder organische Phase oder Mischphase eingebracht und das Lösungsmittel entfernt.
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Aus der
DE 695 35 689 T2 ist ein Verfahren zum Untersuchen eines Kalziumkanalblockers bekannt, bei dem eine Doppelschicht- oder Mehrschichtmembran zur Verfügung gestellt wird, die einen Kanal zwischen einer ersten Seite und einer zweiten Seite der Membran aufweist. Eine derartige Doppelschicht- oder Mehrschichtmembran wird durch das Mischen eines Phospholipidis mit einer Mischung aus einem anorganischen Polyphosphat und einem Polyhydroxybutyrat in einem organischen Lösungsmittel unter Ultraschallbehandlung sowie dem Bilden einer Membran zwischen zwei wässrigen Phasen hergestellt, wobei das Polyhydroxybutyrat und das anorganische Polyphosphat einen Kanal durch eine aus dem Phospholipid gebildete Schicht bilden und ein Kalziumkanalblocker und ein Kalziumion auf einer der beiden Seiten der Membran und ein Transportmittel für das Kalziumion durch den Kanal bereitgestellt werden.
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Weiterhin sind aus der
DE 10 2004 016 020 A1 serumstabile amphotere liposomale Formulierungen bekannt, die neutrale Lipide, Cholesterol und als ladungstragende Lipide amphotere Lipide oder Mischungen von kationischen und anionischen Lipiden umfassen und einen Oligonukleotid als Wirkstoff.
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Hergestellt werden derartige Liposome indem ein Gemisch aus Lipiden in Chloroform gelöst und vollständig getrocknet wird. Danach wird eine Suspension aus Lösungsmittel und der Lipidfilm im Wasserbad hydratisiert und dort mit Ultraschall behandelt. Die Lösung wird eingefroren, aufgetaut und durch eine Membran mit 400 nm Porenweite extrudiert.
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Auch ist aus der
US 4,133,874 A eine synthetische Zelle für den Sauerstoff- und Kohlendioxidtransport als Ersatz für Erythrocyten bekannt, die eine synthetische Zellmembran aus einem Lipidmaterial aufweist, durch die Hämoglobin eingekapselt ist. Dabei werden die Lipidmaterialien mit einem Lösungsmittel in einer Flasche gemischt und unter Vakuum als dünne Schicht auf der Flaschenwandung abgeschieden. Das Hämoglobin wird dann in die Flasche gegeben und die Flasche in ein Wasserbad getaucht und mit Ultraschall behandelt. Es entstehen Vesikel mit Hämoglobin im Inneren, die einen Durchmesser von 0,1–10 μm aufweisen.
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Die Aufgabe der vorliegenden Lösung besteht in der Angabe eines Verfahrens zur Herstellung von großen Vesikeln aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen, das schnell und effektiv arbeitet und mit dem insbesondere große einschichtige Vesikel aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen hergestellt werden.
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Die Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen angegebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von großen Vesikeln mit Abmessungen zwischen 3 und 300 μm Durchmesser aus im Wesentlichen selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen wird auf ein Substrat, das ein piezoelektrischer Einkristall oder piezoelektrisch funktionalisiert ist und in dem akustische Wellen in Form von Oberflächenwellen und/oder Volumenwellen und/oder Plattenwellen anregbar sind, mindestens eine Lage aus einer Doppelschicht aus im Wesentlichen selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen aufgebracht und eingetrocknet, nachfolgend wird die Einschlussflüssigkeit zumindest über die mindestens eine Lage positioniert, danach wird das Substrat zur Entstehung deformierender akustischer Wellen angeregt, bis sich mindestens große Vesikel aus einer Doppelschicht aus im Wesentlichen selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen mit der darin eingeschlossenen Einschlussflüssigkeit von der Substratoberfläche ablösen.
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Vorteilhafterweise wird die Anregung des Substrates über einen Zeitraum von 10 s bis 15 min durchgeführt.
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Vorteilhaft ist es auch, wenn eine Vielzahl an Lagen auf das Substrat über- und nebeneinander aufgebracht wird, wobei jeweils eine Lage aus einer Doppelschicht aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen besteht.
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Und auch vorteilhaft ist es, wenn die Lagen auf das Substrat strukturiert aufgebracht werden.
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Ebenfalls vorteilhaft ist es, wenn als Einschlussflüssigkeit eine wässrige Lösung oder eine nichtwässrige Lösung oder eine Dispersion aufgebracht wird, wobei noch vorteilhafterweise als Einschlussflüssigkeit eine physiologische Flüssigkeit oder eine physiologische Flüssigkeit mit DNA, RNA, Peptiden, Proteinen oder medizinischen Wirkstoffen oder eine chemisch synthetisierte magnetische Flüssigkeit verwendet wird.
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Weiterhin vorteilhaft ist es, wenn die Vesikel aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen bestehen, die transmembrane Ionenkanäle und/oder angelagerte Proteine, Peptide oder medizinische Wirkstoffe aufweisen.
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Von Vorteil ist es auch, wenn Lagen auf das Substrat aufgebracht werden, die aus einzelnen Lipiden oder Blockcopolymeren oder aus einer Mischung von Lipiden und/oder Blockcopolymeren und/oder Proteinen bestehen, wobei noch vorteilhafterweise alle Verfahrensschritte oberhalb der Schmelztemperatur der eingesetzten Lipide durchgeführt werden und/oder Lagen aus Lipid-Doppelschichten auf das Substrat aufgebracht werden, wobei in den Lipid-Doppelschichten nichttransmembrane Proteine und/oder peptidische und/oder nichtpeptidische transmembrane Moleküle und Ionen eingelagert sind.
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Und weiterhin von Vorteil ist es, wenn Lagen auf das Substrat aufgebracht werden, die aus Calixarenen oder Cyclodextrinen oder amphiphilen Fullerenen oder aus einer Mischung von Calixarenen und/oder Cyklodextrinen und/oder amphiphilen Fullerenen bestehen.
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Mit der erfindungsgemäßen Lösung wird es möglich, insbesondere große Vesikel aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen, vorzugsweise Lipidvesikel, die größer sind als die Beugungsgrenze des Lichtes schnell und effektiv herzustellen. Dazu wird ein grundlegend neues Prinzip der Herstellung derartiger Vesikel aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen eingesetzt, welches viele methodische und Material-Limitierungen der bisher bekannten Verfahren umgeht.
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Dabei ist das erfindungsgemäße Verfahren verglichen mit den bekannten Verfahren einfach in der Handhabung, was seine Anwendung auch für fachfremde Benutzer ermöglicht, und der Arbeitsaufwand ist in den meisten Fällen geringer.
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Weiterhin sind kurze Herstellungszyklen und gleichzeitig eine große Anzahl an hergestellten Vesikeln aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen realisierbar. Diese kurzen Herstellungsdauern können zudem z. B. die Untersuchungen von Reaktionskinetiken im Inneren der Vesikel aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen ermöglichen. Ebenso wird im Falle von Lipidvesikeln die Oxidation von Lipiden vermieden, die bekanntermaßen zu Eigenschaftsänderungen führt. Derartige Oxidationen treten bei der Elektroformation typischerweise an den Elektroden auf.
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Die erfindungsgemäße Lösung ist darüber hinaus sehr flexibel einsetzbar hinsichtlich einer großen Breite an selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen und der Einschlussflüssigkeit, worunter im folgenden sowohl reine Flüssigkeiten, als auch Stoffgemische mit flüssigen Eigenschaften, wie z. B. Lösungen und Dispersionen zu verstehen sind, da insbesondere deren elektrischen und dielektrischen Eigenschaften bei der Auswahl nicht mehr berücksichtigt werden müssen. Durch Änderung der Anregungsbedingungen des Substrates kann das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin an verschiedene Eigenschaften der eingesetzten selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen oder der Einschlussflüssigkeit angepasst werden.
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Mit der erfindungsgemäßen Lösung können aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen große Vesikel hergestellt werden. Derartige selbstorganisierende, membranbildende Moleküle sind beispielsweise Lipide oder Blockcopolymere oder andere amphiphile organische Substanzen oder Mischungen von Lipiden und/oder Blockcopolymeren und/oder Proteinen und/oder anderen amphiphilen organischen Substanzen.
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Als erfindungsgemäße Einschlussflüssigkeit können vorteilhafterweise physiologische Flüssigkeiten eingesetzt werden, aber auch andere wässrige und nichtwässrige Lösungen.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch Bestandteil eines komplexeren Systems sein und insbesondere in mikrofluidische Systemen zur Anwendung kommen.
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Die auf dem Substrat aufgebrachten Lagen an Doppelschichten aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen werden über die gesamte Oberfläche des Substrates oder auf bestimmte Bereiche des Substrates positioniert. Dabei ist es erfindungsgemäß weder erforderlich noch praktisch einfach realisierbar, dass die Lagen gleichmäßig und vollständig über die gesamte Oberfläche aufgebracht sind. Auch ist eine unterschiedliche Anzahl an Lagen übereinander auf einem Substrat in bestimmten Bereichen der Oberfläche möglich. Die Position und Anzahl der Lagen kann auch durch eine Strukturierung in gewissen Grenzen gesteuert werden. Die Strukturierung kann beispielsweise durch eine Aufbringung mit einer Maske erreicht werden.
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Nachfolgend erfolgt die Trocknung der Lagen, vorteilhafterweise bei Raumtemperatur, aber auch bei höheren Temperaturen, aber immer oberhalb der Schmelztemperatur der eingesetzten Moleküle.
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Nach der Trocknung wird die Oberfläche der Lagen mit der Einschlussflüssigkeit bedeckt. Praktischerweise wird die gesamte mit Lagen bedeckte Oberfläche des Substrates mit einem Flüssigkeitsfilm oder mit mehreren Tropfen bedeckt. Dieser Vorgang kann gegebenenfalls mehrfach wiederholt werden.
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Danach erfolgt die Anregung der deformierenden akustischen Wellen mittels eines hochfrequenten Stromes. Beispielsweise werden durch die Schwingungen eines mit dem Substrat verbundenen Interdigitalwandlers deformierende akustische Oberflächenwellen ausgelöst, die einerseits die Lagen auf der Oberfläche des Substrates einer Deformation aussetzen und gleichzeitig in der Einschlussflüssigkeit eine Strömung (acoustic streaming) auslösen können.
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Die deformierenden akustischen Wellen können als Oberflächenwelle, als Volumenwelle aber auch als Plattenwelle realisiert werden. Ausschlaggebend ist, dass in jedem Falle eine Deformation auf die Lage oder den Lagenstapel auf der Oberfläche aufgeprägt wird. Es wird vermutet, dass diese Deformation der Lagen oder Lagenstapel dazu führt, dass dort leichter die Einschlussflüssigkeit eindringen kann. Damit werden die einzelnen Lagen mehr oder weniger voneinander gelöst und ein Vesikel kann sich bilden.
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Besonders vorteilhaft zur Ausbildung einer akustischen Strömung ist es, wenn die Anregung des Substrates mittels hochfrequenten Stromes zu einer akustischen Welle mit wenigstens anteilig sagittaler Polarisation der Schwingungsamplitude durchgeführt wird.
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Nachfolgend wird die Aufgabe an mehreren Ausführungsbeispielen näher erläutert.
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Beispiel 1
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Ein einkristallines Substrat aus LiNbO3 (128° gedrehter y-Schnitt mit x-Ausbreitungsrichtung) mit den Abmessungen 10 mm × 20 mm × 0,5 mm mit einer polierten Oberfläche weist eine Interdigitalrichtwandlerstruktur auf, die akustische Oberflächenwellen mit einer Wellenlänge von 30 μm bei einer Frequenz von 130 MHz entlang der kristallografischen X-Achse anregt. Akustische Verluste und die entstehende Verlustwärme werden dadurch minimiert.
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Auf die Substratoberfläche außerhalb der Interdigitalrichtwandlerstruktur werden 10 Tropfen von je 1 μl einer Lipidlösung mit einer dünnen Pipettenspitze aufgetragen. Die Lipidlösung in Chloroform besteht aus 10 mg/ml polaren Lipiden, extrahiert aus Sojabohnen, mit Zusatz von 0,1% Dil-C18, eines Fluoreszenzfarbstoffes. Die Tropfen werden zuerst 10 Minuten bei Umgebungsdruck und danach 15 min im Vakuum bei 5000 Pa getrocknet. Es liegen dann in einem Bereich der Substratoberfläche von 5 mm × 5 mm Inseln mit einer Vielzahl von übereinander angeordneten Lagen vor, wobei jede Lage aus einer Lipid-Doppelschicht besteht. Es liegt keine gleichmäßige Beschichtung der gesamten Substratoberfläche mit der gleichen Anzahl an Lagen vor. Danach wird die mit den Lagen beschichtete Substratoberfläche mit einem Tropfen von 150 μl einer physiologischen Kochsalzlösung als Einschlussflüssigkeit, welche 150 mmol/l NaCl und 20 mmol/l eines Phosphatpuffers mit pH 7 enthält, bedeckt. Danach wird das Interdigitalwandlersystem für 10 min mit einer Leistung von 10 mW angeregt. Während dieser Anregung werden in dem Tropfen die GUVs gebildet.
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Beispiel 2
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Ein einkristallines Substrat aus LiNbO3 (y-Schnitt) mit den Abmessungen 10 mm × 20 mm × 0,5 mm mit einer polierten Oberseite und einer polierten Unterseite weist auf seiner Unterseite eine entlang der z-Achse ausgerichtete Interdigitalwandlerstruktur mit einer Periodizität von 30 μm auf, die bei einer Frequenz von 285 MHz auf die Substratoberfläche gerichtete akustische Volumenwellen mit vorwiegend longitudinaler Polarisation innerhalb der kristallografischen yz-Ebene anregt. Die Kontakte der Interdigitalwandlerstruktur werden kurzgeschlossen, um bei den folgenden Präparationsschritten durch Temperaturänderung bedingte Funkenbildung zu vermeiden. Auf die Substratoberseite werden am Auftreffort der akustischen Volumenwellen 10 Tropfen von je 1 μl einer Lipidvesikelsuspension mit einer dünnen Pipettenspitze bei 65°C, bei der die Lipidmembranen in einer homogenen flüssigen Phase vorliegen, aufgetragen. Die Lipidvesikelsuspension in einer physiologischen Kochsalzlösung als Einschlussflüssigkeit, welche 150 mmol/l NaCl und 20 mmol/l Tris(hydroxymethyl)-aminomethanpuffers mit pH 7,5 enthält, besteht aus kleinen Lipidvesikeln mit einem Durchmesser von 15–50 nm und einer Lipidkonzentration von 10 mg/ml, welche sich zusammensetzt aus Cholesterol extrahiert aus Wolle, Sphingomyelin extrahiert aus Schweinehirn und synthetischem 1,2-Dioleoyl-glycero-3-phosphocholin (DOPC) im Verhältnis 1:2:2 mit Zusatz von 0,1% 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Lissamine Rhodamine B Sulfonyl] (Rhodamine-DOPE), eines fluoreszenzsmarkierten Lipids. Diese kleinen Lipidvesikel wurden zuvor durch Ultraschallbehandlung in einem Ultraschallbad hergestellt. Die Tropfen werden zuerst 5 Minuten bei Umgebungsdruck unter Stickstoffstrom und danach 2 h bei Raumtemperatur im Vakuum bei 4000 Pa getrocknet. Es liegen dann in einem Bereich der Substratoberfläche von 5 mm × 5 mm Inseln mit einer Vielzahl von übereinander angeordneten Lagen vor, wobei jede Lage aus einer Lipid-Doppelschicht besteht. Es liegt keine gleichmäßige Beschichtung der gesamten Substratoberfläche mit der gleichen Anzahl an Lagen vor. Danach wird das Substrat mit den Lagen wieder auf 65°C erwärmt und die mit den Lagen beschichtete Substratoberseite mit einem Tropfen von 150 μl einer vorgewärmten physiologischen Kochsalzlösung als Einschlussflüssigkeit, welche 150 mmol/l NaCl und 20 mmol/l eines Phosphatpuffers mit pH 7 und enthält, bedeckt. Der Kurzschluss der Interdigitalwandlerkontakte wird entfernt und HF-Leistung für 15 min in den Interdigitalwandler eingespeist.
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Nach Herstellung der großen Vesikel werden die Kontakte der Interdigitalrichtwandlerstruktur wieder kurzgeschlossen. Danach wird das Substrat mit den Lagen auf Raumtemperatur abgekühlt, wobei eine Phasenübergangstemperatur der entstandenen Vesikel unterschritten wird. Daraufhin entmischen sich die Lipidmembranen und koexistierende Bereiche der flüssig-ungeordneten und flüssig-geordneten Phase in lichtmikroskopisch auflösbarer Größe entstehen, wobei das fluoreszenzmarkierte Lipid sich bevorzugt in der flüssig-ungeordneten Phase aufhält.