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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine stabile Doppelschicht- oder
Mehrschichtmembran mit Kanälen
durch die Membran, die ein Phospholipid und eine Mischung aus einem
Polyhydroxybutyrat (PHB) und einem Polyphosphat enthält. Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transportieren
eines Ions oder Moleküls
durch den Kanal in der Membran. Weiterhin betrifft die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zum Untersuchen von Verbindungen, die den
Kanal blockieren. Schließlich betrifft
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Aufnehmen der Kanäle in Membrane.
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R-poly-3-hydroxybutyrate
und anorganische Polyphosphate (PolyPi) sind alte und ubiquitäre Homopolymere,
deren biologische Funktionen nicht gut verstanden sind. PHB, ein
Kopf-Schwanz-Polymer von
R-3-Hydroxybutyrat ist am besten bekannt als ein Polymer mit hohem
Molekulargewicht (60.000 bis 1.000.000), das in Einschlusskörpern in
vielen Prokaryoten abgelagert ist. PolyPi sind lineare Ketten von Orthophosphaten,
die durch Phosphoranhydridbindungen verbunden sind, die eine freie
Energie der Hydrolyse vergleichbar der des ATP aufweisen. Reusch
et al. (R. N. Reusch und H. L. Sadoff., J. Bakteriol. 156, 778–788 (1983);
R. N. Reusch, et al., J. Bakteriol. 168, 553–562 (1986); und R. N. Reusch., Soc.
Exp. Biol. und Med. 19, 377–381
(1989)) isolierten PHB mit einem niederen Molekulargewicht (< 12.000) aus bakteriellen
Plasmamembranen und aus Membranen und Organellen von Pflanzen, und schlussfolgerten,
dass Membran-PHB in Escherichia coli, Azotobacter vinelandii und
Bacillus subtilis mit Ca(PolyPi) komplexiert war. Die Anwesenheit
dieser Komplexe in bakteriellen Membranen wird erkannt durch Beobachten
der thermotropen Fluoreszenz der Membransonde N-Phenyl-1-naphthylamin;
eine Dissoziation der Komplexe führt
zu einem Anstieg der Fluoreszenz mit einem Peak bei ca. 56°C. Die Konzentration
an PHB/PolyPi ist niedrig während
des Log-Phasen Wachstums, steigt jedoch 50- bis 100-fach oder mehr
an, wenn die Zellen durch physiologische oder physikochemische Mittel
genetisch kompetent gemacht werden. Bei hohen Konzentrationen verursachen
die Komplexe Änderungen
der Plasmamembranstruktur, die durch Gefrierbruchelektronenmikroskopie
beobachtbar sind (R. Reusch, et al., Can. J. Microbiol. 33, 435–444 (1987)).
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Poly-β-hydroxybutyrat(PHB)-
und Kalziumpolyphosphat-Komplex-Membrane wurden als biologische
Komplexe aus bakteriellen Membranen extrahiert (Reusch, R. und Sadoff,
H., Proc. National Acad. Science 85, 4176–4180 (1988)). Versuche, die Komplexmembrane
aus Kalziumpolyphosphat und PHB in Liposomen zu rekonstituieren,
führte
zu begrenztem Erfolg, da diese signifikant getrennt waren, wie aus 1 dieser Referenz gesehen werden kann.
Die mutmaßlichen
Funktionen dieser biologischen Komplexe sind weiterhin diskutiert
in FEMS Microbiology Rev. 103, 119–130 (1992).
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Reusch
und Sadoff schlugen eine Struktur für das PHB/Ca(PolyPi) in E.
coli vor, die auf molekularer Modellierung und Computermodellierung
hinsichtlich der physikalischen Eigenschaften der Polymere, der
Koordinationsgeometrie des Kalziums und der Membranumgebung beruhte.
Es wird angenommen, dass das amphophile PHB eine schraubenförmige Pore
bildet – mit
einer lipophilen Außenseite aus
Methyl- und Methylengruppen und einer hydrophilen Auskleidung mit
Estercarbonylsauerstoffen – die
durchquert wird mit einem starreren PolyPi-Anion. Ein Kanal ist
gebildet in dem Raum zwischen den zwei Polymeren, der solavatisierende
Carbonylsauerstoffsäulen
gleichmäßig verteilt
entlang dessen äußerer Wand
und negativ geladene Bindungsstellen in regelmäßigen Intervallen entlang dessen
innerer Wand aufweist. Der Kanal ist unterteilt in mehrere angrenzende
parallele Wege, durch die Kationen, eines hinter dem anderen, sich
in der Richtung von Konzentrations- oder von Spannungsgradienten
bewegen können.
Da alle Kationenbindungsstellen identisch sind, sind die Potentialenergieminima
auch identisch. Dieses Model eines Mehrzentren-, „Eines-nach-dem-anderen"-Kanals (multiple-site,
single-file channel) ist in Übereinstimmung
mit den gegenwärtigen
Ansichten über
Protein-Ca2+-Kanalstrukturen, wie von Hess
und Tien und Almers und McCleskey ausgedrückt (Hess, P. und R. W. Tsien, Nature.
309, 453 (1984); und Almers, W. und McCleskey, E. W., J. Physiol.
353, 585 (1984)). Dieses Model wird als Grundlage benutzt, um zu
erklären, wie
die Erfinder glauben, dass die vorliegende Erfindung funktioniert;
diese möchten
jedoch nicht an irgendeine besondere Theorie gebunden sein.
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WO93/13423 offenbart Verfahren
zum Untersuchen eines Kalziumkanalblockers unter Verwendung von
entwicklungsfähigen
Zellen.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, ein Untersuchungsverfahren zum
Bestimmen, ob die Kanäle
von Kanalkomplexen in Lipiddoppelschichten oder Mehrschichten durch
bestimmte Ionen oder Moleküle
blockiert sind, bereitzustellen.
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Die
Aufgabe wird gelöst
durch ein Verfahren zum Untersuchen eines Kalziumkanalblockers,
das umfasst:
- (a) das zur Verfügung stellen
einer stabilen Doppelschicht- oder Mehrschichtmembran, die einen Kanal
zwischen einer ersten Seite und einer zweiten Seite der Membran
aufweist, die umfasst:
(a1) eine Lipiddoppelschicht, die zwei
wässrige Bereiche
auf jeder der Seiten der Membran trennt,
(a2) eine im Wesentlichen
reine Mischung aus (1) einem Polyhydroxybutyrat (PHB) mit einem
Molekulargewicht zwischen 1.000 und 30.000 und (2) einem Polyphosphat,
wobei das PHB und das Polyphosphat Molekulargewichte aufweisen,
die einen Kanal durch die Membran bereitstellen;
wobei die
Doppelschicht- oder Mehrschichtmembran erhältlich ist durch
(i) Mischen
eines Phospholipids mit einer Mischung aus einem anorganischen Polyphosphat und
einem Polyhydroxybutyrat (PHB) mit einem Molekulargewicht zwischen
1.000 und 30.000 in einem organischen Lösungsmittel unter Ultraschallbehandlung,
um eine membranbildende Lösung
bereitzustellen, und
(ii) Bilden einer Membran zwischen zwei
wässrigen
Phasen, wobei das PHB und das anorganische Polyphosphat einen Kanal
durch eine aus dem Phospholipid gebildete Schicht bilden,
- (b) das Bereitstellen eines Kalziumkanalblockers und eines Kalziumions
auf einer oder beiden Seiten der Membran; und
- (c) das Bereitstellen von Transportmitteln für das Kalziumion durch den
Kanal, wobei der Kalziumkanalblocker den Kanal durch die Membran
blockiert.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
sind in den Unteransprüchen
dargelegt.
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Das
PHB kann ökonomisch
aus Prokaryoten extrahiert, mit Ultraschall behandelt und gereinigt werden,
um ein Molekulargewicht zwischen 1.000 und 30.000, vorzugsweise
11.000 bis 16.000 zu ergeben. PHB tritt auch in höheren Organismen
auf; eine Extraktion ist jedoch schwieriger. Das PHB kann auch chemisch
durch Polymerisation unter Verwendung von bekannten Verfahren synthetisiert
werden.
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Salze
des Polyphosphats außer
Kalzium können
verwendet werden, wie Strontium, Barium, Mangan, Magnesium, Lithium,
Natrium, Kalium, Rubidium oder Cäsium.
Solche Metalle sind in der Gruppe IA und IIA des Periodensystems.
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Die
Phospholipide sind vorzugsweise:
- (1) 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (Avanti
Polar Lipids, Birmingham, AL);
- (2) E. coli Phospholipide, die hauptsächlich Phosphatidylethanolamin
und Phosphatidylglycerol (4:1 Mischung) mit gemischten Fettacylketten, hauptsächlich 16:0,
16:1, 18:1 (Avanti Polar Lipids) sind. Viele andere synthetische
und natürliche
Phospholipide können
verwendet werden und andere Lipide, wie Triglyceride, Cholesterol
und ähnliche
können
zugegeben werden. Diese sind im Phospholipidhandbuch, Marcel Dekker,
Inc., New York 1–22
und 603–637
(1993) beschrieben.
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Die
PHB- und Polyphosphatmischung kann durch irgendein Mittel getrocknet
werden, das das PHB nicht zersetzt. Ein Vakuumofen kann zum Beispiel
verwendet werden. Ein Mikrowellenofen kann verwendet werden. PHB
und PolyPi können
in einem Mörser
und Pistill gemischt werden, auf den Schmelzpunkt des PHB (ca. 175°C) erwärmt und langsam
abgekühlt
werden. Das bevorzugte Verhältnis
von PHB zu CaPolyPi ist zwischen etwa 1:1 und 10:1 und stärker bevorzugt
2:1 PHB zu CaPolyPi in etwa 1% Phospholipid. Das Verhältnis von
Phospholipid zu der Mischung ist zwischen etwa 1.000:1 und 100.000:1.
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Die
Membran kann in jedem Lösungsmittel gebildet
werden, indem das Phospholipid, Polyphosphat und PHB gelöst werden
können.
Chloroform und Dichlormethan wurden erfolgreich verwendet.
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Vorzugsweise
wird eine Lösung
von PHB in Chloroform zu trocknem pulverisiertem Ca(PPi) zugegeben,
das Chloroform verdampft und die Mischung im Mikrowellenherd bis
zur Trockne erhitzt (4 Minuten). Chloroform (trocken) wird zugegeben
und die Mischung wird mit Ultraschall behandelt. Die Chloroformlösung wird
zu dem Phospholipid in Dekan zugegeben und das Chloroform wird verdampft, um
eine Doppelschicht herzustellen. Falls Liposomen hergestellt werden,
wird Phospholipid zu der Chloroformlösung zugegeben. Das Chloroform wird verdampft,
ein wässriger
Salzpuffer zu dem trocknen Film zugegeben und die Mischung mit Ultraschall
behandelt.
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Das
wässrige
Lösungsbad
für die
Membran kann symmetrisch (gleiche Lösung auf beiden Seiten der
Membran) oder unsymmetrisch sein. Puffer werden verwendet, um den
pH einzuhalten, vorzugsweise zwischen etwa 5 und 9. Die Lösungen haben
vorzugsweise eine hohe Ionenstärke
und enthalten eine Menge an Magnesiumsalzen.
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Die
vorliegende Erfindung ist nützlich
zum Untersuchen von Kalzium- oder anderen Metall-Blockern. Anorganische Blocker sind
zum Beispiel Lanthan, Aluminium, Nickel, Kadmium, Kobalt und Mangan.
Organische Ca2+-Blocker sind zum Beispiel
Nifedipin, Verapamil und Diltiazem.
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Die
Transportmittel können
ein Ionenkonzentrations- oder Spannungs-Unterschied sein. Vorzugsweise
hat die Apertur für
die Experimente mit der Spannungsklemme (voltage clamp) eine Querschnittsfläche zwischen
50 und 1.000 μm2. Die Doppelschichtmembran hat eine Dicke
zwischen etwa 40 und 120 Angström.
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Gewöhnlich wird
eine Doppelschichtmembran gebildet. Es wird verstanden werden, dass
mehrere Schichten gebildet werden können.
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Die
folgenden sind nicht-beschränkende
Beispiele der vorliegenden Erfindung.
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel zeigt die Extraktion und Reinigung von PHB (etwa 11.000
bis 13.000 durchschnittliches MW) aus Escherichia coli und die Bildung
eines Doppelschichtmembrankomplexes aus PHB und Kalziumpolyphosphat
mit den Kanälen.
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Die
Zellen von E. coli wurden durch die Verfahren von Hanahan (Hanahan,
D., J. Mol. Biol. 166, 557–580
(1983)) und Reusch (Reusch, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.
85, S. 4176–4180,
(1988)) kompetent gemacht. PHB wurde aus dem E. coli unter Verwendung
von heißem
Chloroform (zwischen etwa 50°C
und Rückfluss)
extrahiert, gekühlt
und anschließend
gefiltert, um unlösliche
Bestandteile zu entfernen. Das PHB wird mit fünf (5) Volumina Methanol ausgefällt. Das
PHB wurde suspendiert in 10 mM Tris-Puffer (Tris(hydroxymethylaminomethan)), EDTA
pH 8,0 und mit Proteinase K (200 μg/ml)
bei 37°C
für 2 Stunden
behandelt, um Proteine zu entfernen. Das PHB wurde anschließend durch
Zentrifugieren gesammelt und nacheinander mit destilliertem Wasser
(3×),
Methanol (2×)
und Aceton (2×)
gewaschen. Das PHB wurde in Chloroform gelöst und durch Zugabe von 5 × Methanol
(2×) ausgefällt. Das gereinigte
PHB hatte ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 11.000
bis 13.000.
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Kalziumpolyphosphat
(Ca(PolyPi)) wurde durch Zugeben eines molaren Überschusses von 1 M CaCl2 zu einer wässrigen Lösung Natriumphosphatglas 45
(Sigma Chemical, St. Louis Missouri) hergestellt. Der Niederschlag
wurde durch Zentrifugieren gesammelt, zweimal mit einer wässrigen
CaCl2-Lösung
gewaschen und durch Gefriertrocknen und Erhitzen in der Mikrowelle
getrocknet. Die Probe wurde pulverisiert und anschließend wieder
in der Mikrowelle erhitzt.
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Eine
Chloroformlösung
des gereinigten PHB (in einem Bereich von 1 und 10 μg/ml) wurde
zu einer kleinen Menge eines Überschusses
an pulverisiertem Ca(PolyPi) (< 1
mg) zugegeben. Das Chloroform wurde mit einem trocknen Stickstoffstrom
entfernt und die zurückbleibende
Mischung wurde in einem Mikrowellenofen bei voller Leistung zwei
Zeitspannen von zwei (2) Minuten erhitzt. Trocknes Chloroform wurde
zugegeben und die Mischung bei mittlerer (30% der vollen Leistung)
Leistung (30% Impulszeit) für
zwei (2) Minuten unter Verwendung von einem VIBRA CELL ULTRASONICATOR
(Sonics and Materials, Danbury Conn.) mit Ultraschall behandelt. Ein
Teil des gefilterten Überstandes
wurde zu der Lösung
aus (1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (POPC)) als das Phospholipid
(PL) in Dekan zugegeben. Bevorzugt waren 10 ng PHB für 40 μg PL (40.000
ng), was 0,025% ist. Ein Prozentbereich von 0,1% bis 0,001% kann
verwendet werden. Das Chloroform wurde anschließend verdampft.
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Die
Mischung des Membrankomplexes wurde verwendet, um eine Doppelschicht über eine
250 μMeter
Apertur in einer Nylon(DELRIN, Dupont, Wilmington, DE)-Küvette zu
bilden, die zwei wässrige Lösungsbäder separiert,
die symmetrische Lösungen von
250 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 in
10 mM Tris(Tris(hydroxymethylaminomethan)) HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinsulfonsäure) bei einem
pH von 7,3 bei Raumtemperatur (20°C–24°C) enthalten.
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Die
gebildete Membran wurde in einer Zelle unter Verwendung der Spannungsklemmentechnik getestet.
Eine Spannung wurde an einer Seite (cis) angelegt. Die Trans-Seite
wurde als Erde genommen. Die angelegte Spannung war zwischen 60
mV und 120 mV. Die Spannung wurde konstant gehalten und der Strom
wurde gemessen. Das System maß den Strom,
der erforderlich war, um die Spannung aufrecht zu erhalten. Die
Ergebnisse waren, dass es eine Einzelkanalaktivität gab, die
spannungsabhängig
war. Ein Kalziumion bewegte sich zu der Trans-Seite der Zelle. Die
Zelle kann folglich verwendet werden, um die Wirksamkeit von Kalziumkanalblockern
zu testen.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel zeigt Kalziumkanäle,
die aus gereinigtem PHB hergestellt wurden, das aus E. Coli isoliert
wurde und in einer chromatographischen Säule abgetrennt wurde, um ein
durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 8.000 und 15.000 zu
erhalten und anschließend
mit synthetischem Kalziumpolyphosphat gemischt wurde.
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E.
Coli DH5α wurden
kompetent gemacht und die Zellpellets wie in Beispiel 1 beschrieben
gewaschen. Das PHB wurde anschließend mit heißem Chloroform
extrahiert. Das PHB wurde mit dem fünffachen Volumen an Methanol
ausgefällt,
in Tris, EDTA-Puffer, pH 7,5 suspendiert und über Nacht mit Proteinase K
(200 μg/ml)
bei 37°C
inkubiert. Das PHB wurde durch Zentrifugieren gesammelt und nacheinander
mit destilliertem Wasser (2×),
Methanol (2×)
und Aceton (2×)
gewaschen. Das gereinigte Polymer wurde anschließend in Chloroform aufgelöst und aus
einer Lösung
mit fünffachem
Volumen Methanol ausgefällt.
Das Polymer wurde in Chloroform wieder in Lösung gebracht, filtriert und
anschließend an
einer nicht-wässrigen
Größenausschlusssäule (SHODEX
K-803, Waters, Milford, MA) chromatographiert, und das PHB wurde
durch UV-Absorption bei 245 nm detektiert. Die Absorption detektierte
die Veränderung
des Refraktionsindexes, der durch das Polymer als eine Funktion
des Molekulargewichts bewirkt wird.
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Kalziumpolyphosphat
wurde durch Auflösen von
Natriumpolyphosphatglas (durchschnittliche Kettenlänge 45;
Sigma Chemical Col., St. Louis, Missouri) in destilliertem Wasser
und Zugeben eines Überschusses
an Kalziumchlorid hergestellt. Der Kalziumpolyphosphatniederschlag
wurde durch Zentrifugieren gesammelt, getrocknet und pulverisiert.
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Wie
in Beispiel 1 wurde eine Lösung
des PHB in Chloroform (10 μg/ml)
und Phospholipid in Chloroform zu einem Überschuss (ca. 1 mg) Kalziumpolyphosphat
zugegeben. Das Chloroform wurde mit einem Strom von Stickstoffgas
verdunstet und die Polymermischung wurde durch Erhitzen bei voller Leistung
in einem Mikrowellenofen (2 × 2
Minuten) getrocknet. Trocknes Chloroform wurde zugegeben und die
Mischung wurde bei geringer Leistung (30%) für 2 Minuten mit Ultraschall
behandelt, währenddessen
sie bei geringer Temperatur (von 4°C bis 15°C) gehalten wurde. Der Überstand
wurde filtriert und zu den Phospholipiden wie in Beispiel 1 zugegeben.
Die Ergebnisse unter Verwendung der Spannungsklemmentechnik waren
Einzelkanalströme.
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Beispiel 3
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Dieses
Beispiel zeigt Kalziumkanäle,
die aus PHBs mit gemischtem Molekulargewicht aus Einschlusskörpern in
Bakterien und synthetischem Kalziumpolyphosphat hergestellt wurden.
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PHB
aus Alcaligenes species wurde aus Sigma-Vertriebswegen bezogen.
Das Polymer wurde gereinigt und mit Ultraschall behandelt und an
einer nicht-wässrigen
Größenausschlusssäule, wie
in Beispiel 2 beschrieben, chromatographiert. Die Fraktion, die
im selben Zeitintervall wie E. Coli PHB eluierte, wurde gesammelt
und für
die Herstellung von Kalziumkanälen,
wie in Beispiel 2 beschrieben, verwendet. Die Ergebnisse in der
Spannungsklemmenzelle waren dieselben wie in Beispiel 2.
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Beispiel 4
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Wie
in Reusch, et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 4176–4180 (1988)
beschrieben, wurden die Kanalkomplexe aus den Bakterien isoliert
und verwendet, um die Doppelschicht zu bilden. Das Problem mit dieser
Herangehensweise war, dass andere biologische Materialien wie Proteine
und Lipopolysaccharide anwesend sind, die die Kanalcharakteristika
modifizieren.
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Escherichia
coli wurden genetisch kompetent gemacht im wesentlichen nach dem
Verfahren von Hanahan (J. Mol. Biol. 166, 557–580 (1983)), wie früher beschrieben
(Reusch, et al., J. Bacteriol. 168, 553–562 (1986)). Um die Membrane
zu extrahieren, wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt, nacheinander
mit Methanol, Methanol:Aceton (1:1) und anschließend Aceton gewaschen, und
anschließend über Nacht
mit Chloroform (ca. 0,5 ml Chloroform pro 100 ml Zellen) extrahiert.
Alle Lösungsmittel waren
trocken und alle Verfahren wurden bei 4°C in einer trocknen Umgebung
durchgeführt.
Ein Teil der Chloroformlösung
(zwischen 10 μl
bis 200 μl)
wurde zu einer Lösung
von 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (POPC) in Dekan (20 μl von 40
mg/ml) zugegeben. Das Chloroform wurde mit einem Strom von trocknem
Stickstoffgas entfernt und die Lipidmischung wurde verwendet, um
eine Doppelschicht über
eine 250 μm
Apertur in einer (DELRIN)-Küvette zu
malen, die zwei wässrige
Lösungsbäder trennte, die
symmetrische Lösungen
von 250 mM CaCl2, 1 mM MgCl2,
in 10 mM Tris HEPES, pH 7.3 wie in Beispiel 1 enthielt. Diese Doppelschicht
war wirksam für Bewertungszwecke.
Die Ergebnisse unter Verwendung der Spannungsklemmentechnik waren
Kanäle, die
bei Spannungen zwischen 60 mV und 100 mV beobachtet wurden. Diese
waren spannungsaktiviert (voltage-gated) und spannungsabhängig, obwohl dies
zu diesem Zeitpunkt nicht bekannt war.
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Beispiel 5
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Dieses
Beispiel zeigt die Herstellung von gereinigten Kalziumkanälen aus
E. Coli unter Verwendung einer chromatographischen Säule. Es
war unerwartet, dass der Kanal unter Verwendung dieses Reinigungsverfahrens
konserviert werden könnte.
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E.
Coli DH5α wurden
im wesentlichen nach dem Verfahren von Hanahan, wie früher von
Reusch, et al. (1986) beschrieben, kompetent gemacht. Die Zellen
wurden durch Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit (1.500
Upm) bei 4°C
für 15
Minuten gesammelt. Das Zell-Pellet wurde nacheinander mit Methanol
(2×),
Methanol:Aceton (1:1) (2×)
und Aceton (2×)
gewaschen, getrocknet und anschließend über Nacht mit Chloroform extrahiert.
Alle Lösungsmittel
waren trocken und kalt. Alle Verfahren wurden bei geringer Temperatur
in einer trocknen Atmosphäre
durchgeführt.
Der Extrakt wurde mit einem Spritzenfilter (0,20 μm) TEFLON
(Dupont, Wilmington, Delaware) gefiltert und an einer nicht-wässrigen
Größenausschlusssäule (Shodex
K-803, (8 mm × 25
cm) Waters, Milford, MA) unter Verwendung von Chloroform als Eluent
chromatographiert. Es zeigte sich, dass die Fraktion, die in einem
Molekulargewichtsbereich von 17.000 ± 4.000 eluierte, eine Einzelkanal-Kalziumkanalaktivität aufwies,
wenn sie in eine planare Lipiddoppelschicht, aus 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin
(POPC) wie in Beispiel 1 zusammengesetzt, aufgenommen wurde. Der
Komplex wurde mittels der Spannungsklemmentechniken des Beispiels
1 untersucht. Eine Analyse dieser Fraktion zeigte, dass sie PHB,
PolyPi und Kalzium, jedoch kein Protein enthielt. Dieser gereinigte
Kanalextrakt wurde auch in Liposome aufgenommen, die aus dem obigen
Lipid zusammengesetzt waren, und in die planare Lipiddoppelschicht
wie in Beispiel 1 transferiert. Die Ergebnisse unter Verwendung
der Spannungsklemmentechnik waren Einzelkanalströme, die spannungsabhängig waren.
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Beispiel 6
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Dieses
Beispiel zeigt die Aufnahme von gereinigten extrahierten Komplexen
in Liposome unter Verwendung einer Ultraschallbehandlung.
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PHB/PolyPi-Komplexe
wurden aus E. Coli wie in Beispiel 5 extrahiert und gereinigt. Ein
Teil des Chloroformextrakts (verdünnt zwischen 1 zu 100 μl) wurde
zu einer Lösung
von Phospholipid in Chloroform zugegeben. Die Phospholipide waren
1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin
(POPC) oder eine 1:1 Mischung aus Rinderhirn-Phosphatidylethanolamin (PE) und Rinderhirn-Phosphatidylserin
(PS) (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL) oder eine 2:1 Mischung
aus POPE und POPG (PG = Phosphatidylglycerol). Das Chloroform wurde
mit einem Strom aus Stickstoff unter Bildung eines dünnen Films
der Lipidmischung verdunstet. Ein Puffer (z. B. 10 mM KHepes, pH
6,4, enthaltend 10 mM CaCl2, 45 mM MgCl2, 100 mM KCl) wurde zugegeben und die Probe wurde
in ein Ultraschallbad für
30 Minuten bei 4°C gestellt
und in einer inerten Atmosphäre
(Stickstoff oder Argon) gehalten. Die Phospholipid-Dispersion wurde
bei 80.000 g für
30 Minuten bei 4°C
zentrifugiert und der Überstand
wurde auf eine 1 × 15
cm Sepharose 4B (Pharmacia, Piscataway, NJ) aufgetragen. Fraktionen
wurden gesammelt und auf die Anwesenheit eines Komplexes durch Zugeben
der hydrophoben Sonde N-Phenyl-1-Naphthylamin und Beobachten der
thermotropen Fluoreszenz getestet. Der Komplex führt zu einem Fluoreszenz-Peak bei ca. 56°C. Den Komplex
enthaltende Fraktionen wurden zu dem wässrigen Lösungsbad (cis-Seite) des planaren
Doppelschichtsystems mit Spannungsklemme, wie in Beispiel 1 beschrieben,
zugegeben und die Kanalaktivität
wurde beobachtet, was anzeigte, dass der Komplex aus den Liposomen
in die Doppelschicht aufgenommen worden war.
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Viele
verschiedene Verfahren können
zum Bilden von Liposomen verwendet werden und die Liposomen können unilamellar
oder multilamellar, klein oder groß sein. Sie können aus
vielen verschiedenen Phospholipiden und Mischungen derselben gebildet sein
und können
auch andere Lipide wie Cholesterol und Triglyceride einschließen. Die
Techniken sind gut etabliert (siehe RRC New. Liposomes a Practical Aproach,
IRL Press, Seiten 1 bis 104 (1990)). Die aus gereinigtem PHB und
Ca(PolyPi) (oder einen anderen PolyPi-Salz) dargestellten Komplexe
können
in jegliche dieser Liposome durch einfaches Zugeben eines Teils
der Chloroformlösung
der Komplexe zu einer Chloroformlösung der Lipide, Verdunsten
des Lösungsmittels
und Bilden der Liposome aus dem zurückgebliebenen Lipidfilm aufgenommen
werden. Das wässrige
Medium, in dem die Liposome „aufgelöst" sind, sollte vorzugsweise
von hoher Ionenstärke mit
einem pH zwischen 6 und 8 sein. Es sollte vorzugsweise (ein) Salz(e)
von einem oder mehreren der folgenden enthalten: Ca2+,
Sr2+, Ba2+, Mn2+, Mg2+, Li+, Na+, K+, Rb+ oder Cs+.
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Beispiel 7
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Die äußeren Membrane
eines Frosches sind Oozyten und sind überzogen mit dem Komplex, der in
Liposomen aufgenommen ist. Der Kanal bildet sich selbst. Dies stellt
einen Kanal in den Oozyten zum Testen verschiedenartiger Chemikalien
bereit.
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Vergleichsbeispiel 8
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Das
Verfahren nach Reusch et al., Proc. National Acad. Science 85, 4176–4180 (1988)
wurde mit PHB mit Ca Poly(P), wie auf Seite 4178 dieser Referenz
beschrieben, wiederholt in einem Versuch, ein Liposom herzustellen.
In diesem Fall waren die Komplexe instabil. Die Probleme beim Bilden
von Liposomen mit stabilen Komplexen waren folglich in dieser Referenz
nicht gelöst.
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Beispiel 9
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E.
Coli wurde als eine Quelle von PHB/PolyPi-Komplexen verwendet, da
diese keine cytoplasmischen PHBs mit hohem Molekulargewicht synthetisieren,
die mit extrahiert werden und schwer zu trennen sind von den kleineren
Membran-PHBs. E. Coli DH5α wurden
durch eine Änderung
des Verfahrens nach Hanahan, wie früher in Beispiel 1 beschrieben, kompetent
gemacht und der Komplex wurde aus dem von Lipiden befreiten (delipidated),
getrockneten Zellrückstand
in Chloroform extrahiert und chromatographisch wie in Beispiel 5
gereinigt. Da der Komplex sehr labil und empfindlich gegenüber Feuchtigkeit
ist, wurden alle Schritte des Isolationsverfahrens bei 4°C in einer
trocknen Stickstoffatmosphäre
durchgeführt. Wie
in Beispiel 1 wurde der gereinigte Extrakt zu einer Lösung eines
synthetischen 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin
(Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL) in Dekan (20 mg/ml) zugegeben
und das Chloroform mit einem trocknen Stickstoffstrom entfernt.
Die zurückbleibende
Dekanlösung
wurde verwendet, um eine Doppelschicht über eine 150–250 μm Apertur
zwischen zwei wässrigen
Lösungsbädern zu
bilden.
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Es
wird angenommen, dass der Komplex zwischen den zwei linearen Homopolymeren
von PHB und PolyPi symmetrisch ist, wobei das anionische PolyPi
senkrecht zu der Membran orientiert ist. Die cis-Seite der Doppelschicht,
die willkürlich
als die Innenseite definiert ist, hatte ein variables Potential, wohingegen
die trans-Seite oder Außenseite
als faktische Erde gehalten wurde. Spannungen werden in der üblichen
Konvention als „Innen
minus Außen" berichtet.
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Wenn
Haltepotentiale größer als
+60 mV für mehrere
Minuten über
eine Doppelschicht enthaltend PHB/PolyPi zwischen symmetrischen
Lösungen
aufrecht erhalten wurden, die aus 10 mM HEPES, pH 7,5 und 250 mM
von entweder CaCl2, SrCl2 oder BaCl2 bei Raumtemperatur zusammengesetzt waren,
wurden sprungartige Stromschwankungen beobachtet. Ausbrüche enthaltend
wohldefinierte Stromschritte dauerten von wenigen Sekunden bis einige Minuten
und wechselten sich ab mit Perioden der Inaktivität von 10
Sekunden bis einige Minuten, die für 15 bis 60 Minuten fortdauerten.
Ein bestimmter Zellextrakt, bei 4°C
trocken gelagert, konnte verwendet werden, um Kanalaktivität für zwei Wochen
zu ergeben, aber die Aktivität
wurde in wenigen Minuten verloren, wenn der den Komplex enthaltende
Extrakt Raumluft ausgesetzt wurde. Die Stromschwankungen bei +100
mV waren ca. 1 pA mit Ca2+ und Sr2+, und Ba2+. Mg2+ war durchdringend in der Abwesenheit von
Ca2+, aber Ca2+ selektiert
nachhaltig gegenüber
Mg2+, wobei jedoch geringe Konzentrationen
an Mg2+ den Kanal stabilisierten. Die Fähigkeit
von Sr2+ und Ba2+,
Ca2+ zu ersetzen und die Selektivität gegenüber der
Nicht-Durchlässigkeit
(impermeance) von Mg2+ sind charakteristisch
für Ca2+-Kanäle (Tsien, et
al., Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16, 265 (1987)).
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Einzelkanal-Strom-Spannungsbeziehungen für die durchdringenden
Kationen in symmetrischen Lösungen
waren linear von 40 mV bis 120 mV. Unter 40 mV waren die Einzelkanalströme zu klein
und kurz, um gemessen zu werden, und bei Potentialen über +100
mV erhöhte
sich das Arbeitsstromrauschen (open current noise) zusehends. Die
Einzelkanalleitfähigkeiten
waren ca. 10 pS für
Ca2+, Sr2+ und Ba2+. Diese Leitfähigkeiten änderten sich nicht signifikant,
wenn die Konzentrationen der Trägerkationen auf
100 mM reduziert wurden, was anzeigte, dass die Trägerstellen
in dem Kanal im Hinblick auf das Trägerkation gesättigt waren
und dass die relativen Leitfähigkeiten
die relativen Raten des Kationentransports widerspiegeln. Die Kanalöffnungszeiten
wurden beeinflusst sowohl durch die Spannung als auch die Natur
des Kations, das den Strom trug. Wenn sich die Spannung dem Umkehrpotential
näherte
(0 für die
symmetrischen Lösungen),
nahmen die Öffnungszeiten
für jedes
der durchdingenden Kationen substanziell ab. In Abwesenheit von
Ca2+ waren monovalente Kationen durchdringend.
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Der
Kanal war selektiv für
divalente Kationen gegenüber
monovalenten Kationen. Die Selektivität des Kanals ist gezeigt, wenn
eine 250 mM SrCl2-Lösung auf der trans-Seite durch
eine isotonische Lösung
aus 8 mM SrCl2 und 270 mM KCl ersetzt wurde. Das
Umkehrpotential von –37
mV war im Wesentlichen das Gleiche wie das Gleichgewichtspotential, das aus
der Nernst-Gleichung berechnet wurde, wohingegen das für Cl– +9
mV und das für
K+ nominell unendlich war.
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In
vielen Zelltypen sind die Ca2+-Ströme durch
eine Vielfalt von Übergangsmetallen
blockiert, mutmaßlich
da sie mit Ca2+ um Bindungsstellen in dem
Kanal konkurrieren. Für
Lanthan, Kobalt und Kadmium wurde herausgefunden, dass sie den Kanalkomplex
nicht durchdringen. Beide reduzierten den Einzelkanalstrom in einer
konzentrationsabhängigen
Weise, wobei die Reihenfolge der Wirksamkeit La3+ > Co > Cd ist.
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Der
Kanalextrakt wurde weiterhin an einer nicht-wässrigen Größenausschlusssäule (Shodex K803)
chromatographiert und die eluierten Fraktionen auf ihre Einzelkanalstromaktivität in nicht-symmetrischen
Lösungen
geprüft,
wobei cis 20 mM BaCl2 in 10 mM Hepes, pH
7,3, 60 mM RbCl war und trans 5 mM MgCl2,
60 mM RbCl, 10 mM Hepes, pH 7,3 bei –1.009 mV war. Die Fraktion
mit Kanalaktivität
eluierte in einem relativ scharfen Peak in einem Molekulargewichtsbereich,
der als 17.000 ± 4.000
nach den Standards von Polyisoprenen (Polysciences, Warrington,
PA) und synthetischen PHB (Seebach, ETH, Zürich) definiert war. Die Fraktion
mit Kanalaktivität enthielt
PHB und PolyPi, jedoch weder Protein noch Nukleotide. Die Einzelkanalkonduktanz
des gereinigten Komplexes war unverändert, wobei sie jedoch unbeständiger war,
was nahelegt, dass (eine) stabilisierende Substanz(en) durch die
Chromatographie entfernt wurde(n).
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Beispiel 10
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Die
Kanalzusammensetzung wurde bestätigt durch
in vitro Herstellung von PHB/Ca(PolyPi) aus gereinigtem PHB, das
aus kompetenten E. Coli DH5α isoliert
wurde, und Ca(PolyPi), das aus CaCl2 und
Natriumphosphatglas wie in Beispiel 1 hergestellt wurde. Trocknes
pulverisiertes Ca(PolyPi) (100 μg)
wurde zu einer Lösung
von PHB in Chloroform (10 μg/ml)
zugegeben und die Mischung wurde mit Ultraschall behandelt. Die
gefilterte Lösung
wurde zu Lipiden zugegeben und eine Doppelschicht wurde gebildet
wie in Beispiel 9 beschrieben. Es wird erwartet, dass dieser Kanal
die gleichen Charakteristika aufweisen wird wie die aus E. Coli
extrahierten Kanäle.
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Unter
Bezugnahme auf die Beispiele können die
wässrigen
Lösungsbäder für die Membrane
symmetrisch (gleiche Zusammensetzung auf beiden Seiten der Membran)
oder unsymmetrisch (verschiedene Zusammensetzungen) sein. Die Lösung(en)
kann (können)
Salze von Kalzium, Strontium, Barium, Mangan, Magnesium, Lithium,
Natrium, Kalium, Rubidium und Cäsium
(Periodensystem, Gruppen IA und IIA) enthalten. Vorzugsweise kann
Magnesium in der Lösung
bereitgestellt werden und kann durch den Kanal passieren. Die Lösung(en)
kann (können)
Puffer enthalten, um den pH konstant zu halten, vorzugsweise zwischen
5 und 9, um die Membran instand zu halten. Die Lösungen weisen gewöhnlich eine
hohe Ionenstärke
(hohe Konzentration an Ionen) auf.
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Der
PHB/PolyPi-Kanalkomplex kann als ein einzelnes Molekül eines
Ionen-leitenden Polymerelektrolyten angesehen werden, der quer durch
die Membran positioniert ist (MacCallum, J. R. und Vincent, C. A.,
Polymer Electrolyte Reviews, Elsevier Applied Science, N. Y., S.
23–37
(1987)). PHB teilt die molekularen Charakteristika, die Salz-solvatisierende
Polymere gemein haben. Dessen Estercarbonylsauerstoffe haben eine
ausreichende Elektronendonorkraft, um schwache koordinative Bindungen
mit Kationen zu bilden und die zwischen- und innerkettige Entfernung zwischen
Carbonylsauerstoffen in der vorgeschlagenen Struktur erlaubt vielfache
Bindungen zwischen der Polymerkette und dem Kation. Zusätzlich ist
das Polymer oberhalb seiner Glastemperatur (ca. 0°C) unter
physiologischen Bedingungen, so dass eine Bindungsrotation und segmentweise Bewegungen
der Polymerkette bei der Überführung von
Kationen von Stelle zu Stelle helfen können. Die Rückgratstruktur von PHB ist
identisch zu der des Polyesters, Poly-β-propiolakton, die von Watanabe, et
al. (Wanatabe, et al., Macromolecules 17, 2908–2912 (1984)) berichtet wurde,
um ionenleitende Komplexe mit Lithiumperchlorat und Eisenchlorid zu
bilden. Die von dieser Klasse von Polymeren solvatisierten Salze
sind allgemein zusammengesetzt aus Kationen mit hohen Solvatationsenergien
und großen
Anionen mit diffuser Ladung. Ca2+ und PolyPi teilen
diese Charakteristika – die
Hydratationsenergie von Kalzium ist –397 kcal/mol und jede PolyPi-Monomereinheit teilt
seine einzelne negative Ladung, die zwischen zwei Sauerstoffen verteilt
ist.
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Selektivität wird erzielt
durch Ausnutzung der individuellen und kombinierten molekularen
Eigenschaften von zwei Polymeren, um zwischen Kationen nach Ionengröße, Bindungsenergie,
Hydratationsenergie und Koordinationsgeometrie zu unterscheiden. Die
negativ geladenen Phosphorylreste von PolyPi ziehen Kationen zur Öffnung des
Kanals und die Flexibilität
der PolyPi-Kette und der Abstand zwischen benachbarten negativen
Ladungen begünstigt
die Bindung (sequestration) von divalenten Kationen in Gegenwart
großer
Konzentrationen von monovalenten Kationen (Corbridge, D. E. C.,
Stud. Inorg. Chem. 6: 170–178
(1985)). PHB stellt einen zweiten Selektivitätsfilter bereit durch ein bevorzugtes
Solvati sieren von Kationen mit Koordinationsgeometrien, die mit der
räumlichen
Anordnung von Estercarbonylsauerstoffen übereinstimmen. Gemeinsam definieren
die Sauerstoffliganden von PHB und PolyPi eine Gleichgewichtskavität, die die
optimale Kationengröße bestimmen
wird.
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Der
vorstehende Mechanismus der Ionenpermeation ist in Übereinstimmung
mit der Selektivitätsanordnung
und der Einzelkanalkonduktanz des Kanals. Falls angenommen wird,
dass die Ligandengeometrie optimal für Ca2+ ist,
dann würden
Sr2+ und Ba2+, die ähnliche
Koordinationsgeometrien aufweisen, auch durchdringen; wir würden jedoch
erwarten, dass ein signifikantes Ansteigen des Kationendurchmessers
die Gleichgewichtskavität
deformieren würde
und die Bindung schwächen
würde.
Dies ist vereinbar mit der experimentellen Selektivitätsanordnung
Ca2+ = Sr2+ > Ba2+ und
der Konduktanzanordnung Ba2+ > Sr2+ =
Ca2+. Ein Ausschluss von Mg2+ wird
infolge dessen kleiner Größe, der
unterschiedlichen Koordinationsgeometrie und der langsamen Wasseraustauschrate
erwartet (Martin, R. B., Bioinorganic chemistry of magnesium. In „Metal
Ions in Biological Systems",
Sigel, H. und Sigel, A., Herausgeber 26: 1–13 (1990)). Ionen, die fest
an PolyPi auf der Kanalstirnfläche
binden, jedoch infolge ihrer Größe, wie
La3+, oder infolge der Koordinationsgeometrie, wie
Cd2+ oder Co2+,
am Eindringen gehindert werden, blockieren den Eintritt von durchdringenden
Kationen. Durchdringende Blocker wie Mn2+ binden
fester als Ca2+ und bewegen sich langsamer
durch den Kanal, wobei sie den Ca2+-Strom
inhibieren.
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Trotz
der Einfachheit seiner Zusammensetzung und Struktur, zeigt der Komplex
viele der Charakteristika von eukariotischen Ca2+-Kanälen und dient
folglich als Modell, um die strukturellen Merkmale und molekularen
Mechanismen aufzuklären, die
dem Ionentransport in diesen komplizierteren Systemen zugrunde liegen.
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Beispiel 11
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Dieses
Beispiel zeigt Kalziumkanäle,
die aus gereinigtem PHB hergestellt wurden, das aus E. Coli isoliert
wurde, und in eine Doppelschicht aus Phospholipid und synthetischem
Kalziumpolyphosphat aufgenommen wurden, das zu der wässrigen
Lösung zugegeben
wurde, die die Doppelschicht umgibt.
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E.
Coli DH5α wurden
kompetent gemacht und das Zellpellet gewaschen und mit Proteinase
K wie in Beispiel 2 behandelt. Das PHB in Chloroform wurde zu 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin
in Dekan (10 ng PHB zu 40 μg
Lipid) zugegeben. Das Chloroform wurde verdampft und eine Doppelschicht wurde
gebildet mit der PHB-Lipidlösung
zwischen zwei wässrigen
Lösungsbädern aus
100 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 in
10 mM Tris HEPES, pH 7,4. Kalziumpolyphosphat wurde wie in Beispiel
1 beschrieben hergestellt und zu dem wässrigen Lösungsbad zugegeben. Eine Spannung
von 60 mV wurde an der Innenseite angelegt. Das Ergebnis war eine
Einzelkanalaktivität,
die spannungsabhängig
war. Das PHB alleine hatte bei dieser Konzentration in der wässrigen
Lösung
keine Kanäle
unter diesen Bedingungen. Nach der Anlegung der Spannung an die
Lösung
mit CaCl2 wurden die Kanäle gebildet.