JPH09507166A

JPH09507166A - チャンネル付きポリヒドロキシブチレート及びポリホスフェート膜

Info

Publication number: JPH09507166A
Application number: JP8511952A
Authority: JP
Inventors: エヌ．レウスク，ロセッタ
Original assignee: ミシガンステイトユニバーシティー
Priority date: 1994-10-03
Filing date: 1995-09-26
Publication date: 1997-07-22
Anticipated expiration: 2015-09-26
Also published as: DE69535689T2; WO1996010454A1; EP0731727B1; US6602398B1; EP0731727A4; US5585249A; AU683203B2; AU3725395A; DE69535689D1; ATE384262T1; CA2176361A1; US5650330A; EP0731727A1; CA2176361C; JP3021663B2

Abstract

(57)【要約】ポリ−３−ヒドロキシブチレート／ポリホスフェートのイオンチャンネルを含む脂質二重層。このイオンチャンネルは、生物から抽出された又は、サイズ選択された個々の成分から製造された精製ポリヒドロキシブチレート／ポリホスフェート複合体であることが好ましい。この二重層はインビボの結果に相関する、このチャンネルへの種々な分子及びイオンの影響を試験するために有用である。二重層は細胞又は他の二重層中にチャンネルを移動させるために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】チャンネル付きポリヒドロキシブチレート及びポリホスフェート膜発明の背景 (1) 発明の分野本発明は、膜を通してのチャンネルを有し、リン脂質及び、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）とポリホスフェートとの混合物を含む、安定な二重層膜又は多重層膜に関する。特に、本発明は膜中のチャンネルを通してイオン又は分子を輸送する方法に関する。さらに、本発明はチャンネルをブロックする化合物を分析する方法に関する。最後に、本発明は膜にチャンネルを組み込む方法に関する。 (2) 関連技術の説明Ｒ−ポリ−３−ヒドロキシブチレートと無機ポリホスフェート（ＰｏｌｙＰｉ）とは古くから、いたるところにあるホモポリマーであるが、それらの生物学的役割はあまりよく知られていない。ＰＨＢ、Ｒ−３−ヒドロキシブチレートの頭−尾結合ポリマーは多くの原核生物中の封入体内に沈積した高分子量（６０，０００〜１，０００，０００）ポリマーとして最も良く知られている。ＰｏｌｙＰｉはＡＴＰに匹敵する、加水分解の自由エネルギーを有する、ホスホ−アンヒドリド(phospho-anhydride)結合によって結合した直鎖オルトホスフェートである。Ｒｅｕｓｃｈ等［Ｒ．Ｎ．ＲｅｕｓｃｈとＨ．Ｌ．Ｓａｄｏｆｆ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５６，７７８〜７８８（１９８３）；Ｒ．Ｎ．Ｒｅｕｓｃｈ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８，５５３〜５６２（１９８６）；及びＲ．Ｎ．Ｒｅｕｓｃｈ，ＳｏｃＥｘｐ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄＭｅｄ．１９，３７７〜３８１（１９８９）］は、細菌の形質膜から及び植物の膜と細胞小器官とから低分子量（＜１２，０００）を有するＰＨＢを単離し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、及びＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ中の膜ＰＨＢがＣａ（ｐｏｌｙＰｉ）によって複合体化されると結論した。細菌膜中のこれらの複合体の存在は、膜プローブ、Ｎ−フェニル −１−ナフチルアミンのサーモトロピック蛍光(thermotropic fluorescence)を観察することによって検出され；これらの複合体の解離は蛍光を増加させ、約５６℃においてピークを示す。ＰＨＢ／ｐｏｌｙＰｉの濃度は対数増殖期中は低いが、生理学的手段によって又は生理化学的手段によってのいずれにせよ、細胞を遺伝学的にコンピテント(competent)にした場合には、５０倍〜１００倍以上に上昇する。高濃度において、これらの複合体は凍結割断電子顕微鏡検査によって観察可能な、形質膜構造の変化を惹起する［Ｒ．Ｒｅｕｓｃｈ等，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３，４３５〜４４４（１９８７）］。ポリ−β−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）とポリリン酸カルシウムとの複合体膜は生物学的複合体として、細菌膜から抽出されている［Ｒｅｕｓｃｈ，Ｒ．とＳａｄｏｆｆ，Ｈ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ８５，４１７６〜４１８０（１９８８）］。これらの複合体膜をリポソームにおいてポリリン酸カルシウムとＰＨＢとから再構成しようとする試みは、この参考文献の図１に見ることができるように、これらの錯体膜が有意に解離したので、限られた成功を経験したにすぎない。これらの生物学的複合体の推定される機能はＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖ．１０３，１１９〜１３０（１９９２）においてさらに考察されている。ＲｅｕｓｃｈとＳａｄｏｆｆは、ポリマーの物理的性質と、カルシウムの配位ジオメトリー(coordination geometry)と、膜環境とに関する分子のコンピューターモデル化に基づいて、大腸菌におけるＰＨＢ／Ｃａ（ｐｏｌｙＰｉ）の構造を提案している。これは、両親媒性(amphophilic)ＰＨＢがヘリカル孔（メチル基及びメチレン基の親油性外部と、エステルカルボニル酸素の親水性ライニングとを有する）を形成し、この孔をより硬質なｐｏｌｙＰｉアニオンが通り抜ける (traversed)ことを仮定している。これらの２種ポリマーの間のスペースに、その外壁に沿って均一な間隔をおいた溶媒和カルボニル酸素カラムを有し、その内壁に沿って規則的な間隔をおいて、負に帯電した結合部位を有するチャンネルが形成される。このチャンネルは幾つかの隣接平行レーンに再分割され(subdivide d)、これらのレーンを通ってカチオンが一列縦隊で(in single-file)、濃度勾配若しくは電圧勾配の方向に移動することができる。全てのカチオン結合部位は同じであり、最小ポテンシャルエネルギー(potential ene rgy minima)も同じである。多重部位の一列縦隊チャンネルのこのモデルは、Ｈｅｓｓ、Ｔｉｅｎ、Ａｌｍｅｒｓ及びＭｃＣｌｅｓｋｅｙが表現している、タンパク質Ｃａ²⁺チャンネル構造に関する現在の見解と一致する［Ｈｅｓｓ，Ｐ．とＴｓｉｅｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ．３０９，４５３（１９８４）；及びＡｌｍｅｒｓ，Ｗ．とＭｃＣｌｅｓｋｅｙ，Ｅ．Ｗ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５３，５８５（１９８４）］。本発明者が考えている、本発明がどのように機能するかを説明するための根拠として、このモデルを用いるが、本発明者は何らかの特定の理論に縛られることを望む訳ではない。目的それ故、脂質二重層又は多重層としてイオンチャンネル複合体を提供することが、本発明の目的である。簡単でかつ経済的である、二重層状イオンチャンネル複合体の形成方法を提供することが、本発明の他の目的である。さらにまた、チャンネルが特定のイオン又は分子によってブロックされるか否かを判定するための分析方法を提供することが本発明の目的である。これらの目的及び他の目的は下記説明を参照することによってますます明らかになると思われる。好ましい実施態様の説明本発明は、膜の第１面と第２面との間にチャンネルを有する、安定な二重層膜又は多重層膜であって、膜の各側で２つの水性領域を分離する二重層（又は複数個の二重層）と、（１）ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）と（２）ポリホスフェートとの実質的に純粋な混合物（ＰＨＢとポリホスフェートとは膜を横切るチャンネルを形成する分子量を有する）とを含む前記膜に関する。さらに、本発明はチャンネルを通してカチオンを輸送する方法であって、膜の第１面と第２面との間にチャンネルを有する、安定な二重層膜又は多重層膜であり、膜の各側で２つの水性領域を分離する脂質二重層と、（１）ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）と（２）ポリホスフェートとの実質的に純粋な混合物（ＰＨＢとポリホスフェートとは膜を横切るチャンネルを形成する分子量を有する）とを含む前記膜を形成する工程と；このチャンネルを通してのカチオンの輸送手段を用意する工程とを含む前記方法に関する。さらにまた、本発明はカルシウムチャンネルブロッキング化合物の分析方法であって、膜の第１面と第２面との間にチャンネルを有する、安定な二重層膜又は多重層膜であり、膜の各側で２つの水性領域を分離する脂質二重層と；（１）実質的に純粋なポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）と（２）ポリホスフェートとの混合物（ＰＨＢとポリホスフェートとは膜を横切るチャンネルを形成する分子量を有する）とを含む前記膜を形成する工程と；膜の片面若しくは両面にカルシウムチャンネルブロッカー化合物とカルシウムイオンとを供給する工程と；このチャンネルを通してのカチオンの輸送手段を用意する工程とを含み、カルシウムチャンネルブロッキング化合物が膜を通るチャンネルをブロックする前記方法に関する。最後に、本発明は膜の第１面と第２面との間にチャンネルを有する二重層膜又は多重層膜の形成方法であって、有機溶媒中でリン脂質を無機ポリホスフェートとポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）との混合物と混合して、膜形成用溶液を形成する工程と；ＰＨＢと無機ポリホスフェートとがリン脂質によって形成される二重層を通るチャンネルを形成している、２水性相の間の膜を形成する工程とを含む前記方法に関する。ＰＨＢを原核生物から経済的に抽出して、音波処理し、精製して、１，０００〜３０，０００、好ましくは１１，０００〜１６，０００の分子量にすることができる。ＰＨＢは高等生物においても生ずるが、抽出は一層困難である。ＰＨＢはまた、周知のプロセスを用いる重合によって化学的に合成することもできる。例えば、ストロンチウム、バリウム、マンガン、マグネシウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム又はセシウムのような、カルシウム以外のポリリン酸塩も使用可能である。このような金属は周期律表の第ＩＡ族と第ＩＩＡ族に含まれる。リン脂質は好ましくは、 (1) １−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ，アラバマ州，バーミンガム）；及び (2) 主として１６：０、１６：１、１８：１の混合脂肪アシル鎖を有する、主としてホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルグリセロール（４：１混合物）である大腸菌リン脂質（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ）である。他の多くの合成及び天然リン脂質が使用可能であり、例えばトリグリセリド、コレステロール等のような、他の脂質を加えることができる。これらはＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄＨａｎｄｂｏｏｋ（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ社，ニューヨーク）１−２２及び６０３〜６３７（１９９３）に記載されている。ＰＨＢを分解しない任意の手段によって、ＰＨＢとポリホスフェートとの混合物を乾燥させることができる。例えば、真空炉を用いることができる。マイクロ波炉を用いることもできる。ＰＨＢとｐｏｌｙＰｉとを乳鉢と乳棒とによって混合し、ＰＨＢの融点（約１７５℃）まで加熱して、徐々に冷却することができる。ＰＨＢ対ＣａＰｏｌｙＰｉの好ましい比は約１：１から１０：１までの範囲内であり、最も好ましくは、約１％のリン脂質中で２：１（ＰＨＢ：ＣａＰｏｌｙＰｉ）である。リン脂質対混合物の比は約１０００：１から１００，０００：１までの範囲内である。リン脂質、ポリホスフェート及びＰＨＢが溶解することができる任意の溶媒中で、膜を形成することができる。クロロホルム及びジクロロメタンが上首尾に用いられている。音波処理以外の混合方法を用いることができる。音波処理が好ましい。クロロホルム中のＰＨＢの溶液を乾燥した微粉砕Ｃａ（ＰＰｉ）に加え、クロロホルムを蒸発させ、混合物を乾燥するまで（４分間）マイクロ波処理することが好ましい。クロロホルム（乾燥）を加え、混合物を音波処理する。クロロホルム溶液をデカン中のリン脂質に加え、クロロホルムを蒸発させて、二重層を形成する。リポソームを形成する場合には、クロロホルム溶液にリン脂質を加える。クロロホルムを蒸発させ、水性塩緩衝液を乾燥フィルムに加えて、混合物を音波処理する。膜のための浸漬(bathing)水溶液は対称的（膜の両側で同じ溶液）でも非対称的(asymmetric)でもよい。緩衝液を用いて、ｐＨを好ましくは約５から９までの範囲に維持する。溶液は好ましくは高いイオン強度を有し、或る量のマグネシウム塩を含む。本発明はカルシウム又はその他の金属のブロッキング化合物を分析するために有用である。無機ブロッカー(blocker)化合物は、例えば、ランタン、アルミニウム、ニッケル、カドミウム、コバルト及びマンガンである。有機Ｃａ²⁺ブロッカーは、例えば、ニフェジピン、ベラパミル及びジルチアゼムである。輸送手段はイオン濃度又は電圧の差でよい。電圧クランプによる実験のアパーチャー(aperture)は５０〜１０００μｍ²の横断面積を有する。二重層膜は約４０〜１２０Åの厚さを有する。通常、二重層膜が形成される。多重層膜も形成されうることは理解されるであろう。下記は本発明の非限定的な実施例である。実施例１この実施例は大腸菌からのＰＨＢ（平均分子量約１１，０００〜１３，０００）の抽出及び精製と、チャンネルを有する、ＰＨＢとポリリン酸カルシウムとの二重層膜複合体の形成とを示す。大腸菌の細胞を、Ｈａｎａｈａｎの方法［Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７〜５８０（１９８３）］及びＲｅｕｓｃｈの方法［Ｒｅｕｓｃｈ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５，４１７６〜４１８０（１９８８）］によってコンピテントにした。ＰＨＢを大腸菌から熱クロロホルム（約５０℃から還流するまで）を用いて抽出し、冷却し、次に濾過して、不溶物を除去した。ＰＨＢを５倍量のメタノールによって沈殿させた。このＰＨＢを１０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン））、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中に懸濁させ、３７℃のプロテイナーゼＫ（２００μ ｇ／ｍｌ）によって２時間処理して、タンパク質を除去した。次に、ＰＨＢを遠心分離によって回収し、蒸留水（３ｘ）、メタノール（２ｘ）及びアセトン（２ｘ）によって連続的に洗浄した。ＰＨＢをクロロホルムに溶解し、５倍量のメタノールによって沈殿させた（２ｘ）。精製ＰＨＢは約１１，０００〜１３，０００の平均分子量を有した。リン酸ナトリウムガラス４５（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ，ミズリー州，セントルイス）の水溶液に１モル過剰な１ＭＣａＣｌ₂を加えることによって、ポリリン酸カルシウム（Ｃａ（ｐｏｌｙＰｉ））を製造した。沈殿物を遠心分離によって回収し、ＣａＣｌ₂水溶液によって２回洗浄し、凍結乾燥によって乾燥させ、マイクロ波処理した。サンプルを微粉砕し、再びマイクロ波処理した。精製ＰＨＢのクロロホルム溶液（１〜１０μｇ／ｍｌの範囲）を過剰な微粉砕Ｃａ（ｐｏｌｙＰｉ）の少量（＜１ｍｇ）に加えた。乾燥窒素流によってクロロホルムを除去し、残留混合物を完全出力のマイクロ波炉において２分間ずつの２期間にわたって加熱した。乾燥クロロホルムを加えて、混合物を中出力（完全出力の３０％）（３０％パルス時間）において２分間、ＶＩＢＲＡＣＥＬＬＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣＡＴＯＲ（ＳｏｎｉｃｓａｎｄＭａｔｅｒｉａｌｓ，コネチカット州，ダンバリー）を用いて音波処理した。濾過した上清の一部をデカン中のリン脂質（ＰＬ）としての（１−パルミトイル−２，オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ））の溶液に加えた。０．０２５％であるＰＬ４０μ ｇ（４０，０００ｎｇ）に対してＰＨＢ１０ｎｇが好ましかった。０．１％〜０．００１％の％範囲が使用可能である。次に、クロロホルムを蒸発させた。膜複合体の混合物を用いて、室温（２０〜２４℃）においてｐＨ７．３の１０ｍＭＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン））ＨＥＰＥＳ（４−（２ −ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンスルホン酸）中の２５０ｍＭＣａＣｌ₂ 、１ｍＭＭｇＣｌ₂の対称溶液を含む浸漬水溶液を分離する、ナイロン（ＤＥＬＲＩＮ，ＤｕＰｏｎｔ，デラウェア州，ウィルミントン）キュベット中の２５０μｍアパーチャーを横切る二重層を形成した。形成された膜を電圧クランプ方法を用いて、セル(cell)中で試験した。片側（シス）に電圧を印加した。トランス側はアース(ground)として用いた。印加した電圧は６０ｍＶ〜１２０ｍＶであった。電圧を一定に維持し、電流を測定した。この系は電圧を維持するために必要な電流を測定した。結果は、電位依存性であるシングルチャンネル活性が存在することであった。カルシウムイオンはセルのトランス側に移動した。セルをこのように用いてカルシウムチャンネルブロッカーの効果を試験することができる。実施例２この実施例は、大腸菌から単離し、８，０００〜１５，０００の平均分子量を得るようにクロマトグラフィーカラム中で分離した後に、合成ポリリン酸カルシウムと混合した、精製ＰＨＢからのカルシウムチャンネルの製造を示す。大腸菌ＤＨ５αをコンピテントにして、細胞ペレットを実施例１に述べたように洗浄した。次に、ＰＨＢを熱クロロホルムによって抽出した。ＰＨＢを５倍量のメタノールによって沈殿させ、Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁させ、３７℃においてプロテイナーゼＫ（２００μｇ／ｍｌ）と共に一晩インキュベートした。ＰＨＢを遠心分離によって回収し、蒸留水（２ｘ）、メタノール（２ｘ）及びアセトン（２ｘ）によって連続的に洗浄した。精製したポリマーをクロロホルム中に溶解し、５倍量のメタノールによって溶液から沈殿させた。ポリマーをクロロホルム中に再溶解し、濾過し、次に非水性サイズ排除カラム（ＳＨＯＤＥＸＫ−８０３，Ｗａｔｅｒｓ，マサチュセッツ州，ミルフォード）上でクロマトグラフィーし、ＰＨＢを２４５ｎｍにおけるＵＶ吸収によって検出した。この吸収は、ポリマーによって生じる、分子量の関数としての屈折率の変化を検出した。ポリリン酸ナトリウムガラス（平均鎖長さ４５；ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ，ミズリー州，セントルイス）を蒸留水に溶解し、過剰な塩化カルシウムを加えることによって、ポリリン酸カルシウムを製造した。ポリリン酸カルシウム沈殿物を遠心分離によって回収し、乾燥させ、微粉砕した。実施例１におけるように、クロロホルム中のＰＨＢ（１０μｇ／ｍｌ）とクロロホルム中のリン脂質との溶液を過剰なポリリン酸カルシウム（約１ｍｇ）に加えた。窒素ガス流によってクロロホルムを蒸発し、ポリマー混合物をマイクロ波炉において完全出力で加熱する（２ｘ２分間）ことによって乾燥させた。乾燥クロロホルムを加えて、低温（４℃〜１５℃）を維持しながら、混合物を低出力（３０％）において２分間、音波処理した。上清を濾過し、実施例１におけるようにリン脂質に加えた。電圧クランプ方法を用いた結果はシングルチャンネル電流であった。実施例３この実施例は細菌中の封入体からの混合分子量ＰＨＢと合成ポリリン酸カルシウムとからのカルシウムチャンネル製造を示す。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ種からのＰＨＢはＳｉｇｍａｃｈａｎｎｅｌｓから購入した。ポリマーを精製し、音波処理し、非水性サイズ排除カラム上で実施例２に述べたようにクロマトグラフィーした。大腸菌ＰＨＢと同じ時間間隔に溶出する画分を回収し、実施例２に述べたようにカルシウムチャンネルの製造に用いた。電圧クランプセルにおける結果は実施例２と同じであった。実施例４Ｒｅｕｓｃh等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５，４１７６〜４１８０（１９８８）に記載されるように、チャンネル複合体を細菌から単離し、二重層の形成に用いた。このアプローチに関する問題は、チャンネル特徴を修飾する、例えばタンパク質及びリポ多糖のような、他の生物学的物質が存在することであった。既述されたように［Ｒｅｕｓｃｈ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８，５５３〜５６２（１９８６）］、本質的に、Ｈａｎａｈａｎの方法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７〜５８０（１９８３）］によって、大腸菌を遺伝的にコンピテントにした。膜を抽出するために、細胞を遠心分離によって回収し、メタノール、メタノール：アセトン（１：１）、次にアセトンによって連続的に洗浄し、次にクロロホルム（細胞１００ｍｌにつき約０．５ｍｌ）によって一晩抽出した。全ての溶剤は乾燥しており、全ての操作は乾燥環境下で４℃において実施した。クロロホルム溶液の一部（１０μｌ〜２００μｌ）を、デカン中の１−パルミトイル、２−オレオイル、ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）の溶液（４０ｍｇ／ｍｌを２０μｌ）に加えた。クロロホルムを乾燥窒素ガス流によって除去し、脂質混合物を用いて、実施例１におけるように１０ｍＭＴｒｉｓＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）中の２５０ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＭｇＣｌ₂の対称溶液を含む、２つの浸漬水溶液を分離する、二重層を（ＤＥＬＲＩＮ）キュベット中の２５０μｍアパーチャーを横切って塗布した。この二重層は評価の目的のために有効であった。電圧クランプ方法を用いた結果は６０ｍＶ〜１００ｍＶの電圧においてチャンネルが観察されたことであった。これらは電位−ゲート制御され (voltage-gated)、電位依存性であったが、このことはこの当時は知られていなかった。実施例５この実施例は、クロマトグラフィーカラムを用いた、大腸菌からの精製カルシウムチャンネルの製造を示す。この精製方法を用いて、チャンネルを保存することができたことは意外であった。大腸菌ＤＨ５αを本質的にＲｅｕｓｃｈ等（１９８６）によって既述されたように、Ｈａｎａｈａｎの方法によってコンピテントにした。細胞を４℃において低速度（１５００ｒｐｍ）での遠心分離によって１５分間回収した。細胞ペレットをメタノール（２ｘ）、メタノール：アセトン（１：１）（２ｘ）、次にアセトン（２ｘ）によって連続的に洗浄し、乾燥させ、次にクロロホルムによって一晩抽出した。全ての溶剤は乾燥しており、かつ低温であった。全ての操作は乾燥環境下で低温において実施した。抽出物をＴＥＦＬＯＮ（ＤｕＰｏｎｔ，デラウェア州，ウイルミントン）シリンジフィルター（０．２０μｍ）によって濾過して、非水性サイズ排除カラム（ＳｈｏｄｅｘＫ−８０３，（８ｍｍｘ２５ｃｍ），Ｗａｔｅｒｓ，マサチュセッツ州，ミルフォード）上で溶離剤としてクロロホルムを用いてクロマトグラフィーした。１７，０００±４，０００の分子量範囲で溶出した画分が、実施例１におけるように、１−パルミトイル、２−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）から成る平面状脂質二重層に組み入れたときに、シングルチャンネルのカルシウムチャンネル活性を有することが判明した。この複合体を実施例１の電圧クランプ方法によって試験した。この画分の分析は、この画分がＰＨＢ、ｐｏｌｙＰｉ及びカルシウムを含むが、タンパク質を含まないことを示した。この精製チャンネル抽出物を上記脂質から成るリポソームにも組み入れ、実施例１におけるように、平面状脂質二重層中に移し入れた。電圧クランプ方法を用いた結果は、電位依存性であるシングルチャンネル電流であった。実施例６この実施例は、音波処理を用いた、精製抽出複合体のリポソーム中への組み入れを示す。ＰＨＢ／ｐｏｌｙＰｉ複合体を、実施例５におけるように、大腸菌から抽出し、精製した。クロロホルム抽出物の一部（１〜１００μｌを希釈）をクロロホルム中のリン脂質の溶液に加えた。リン脂質は１−パルミトイル、２−オレオイル− ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、又はウシ脳ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とウシ脳ホスファチジルセリン（ＰＳ）との１：１混合物（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ，アラバマ州，バーミンガム）、又はＰＯＰＥとＰＯＰＧ（ＰＧ＝ホスファチジルグリセロール）との２：１混合物であった。窒素流によってクロロホルムを蒸発させて、脂質混合物の薄フィルムを形成した。緩衝液（例えば、１０ｍＭＣａＣｌ₂、４５ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＫＣｌを含む１０ｍＭＫＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．４）を加えて、サンプルを音波処理浴(sonication bath)に４℃において３０分間入れ、不活性雰囲気（窒素又はアルゴン）中に保持した。リン脂質分散液を８０，０００ｇにおいて３０分間、４℃で遠心分離し、上清を１ｘ１５ｃｍＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ニュージャージー州，ピスカタウェイ）に加えた。画分を回収し、疎水性プローブ、Ｎ−フェニル−１−ナフチルアミンを加え、サーモトロピック蛍光を観察することによって複合体の存在に関して試験した。この複合体は約５６℃において蛍光ピークを生じる。複合体を含む画分を実施例１に述べた電圧クランプ平面状二重層系の浸漬水溶液（シス側）に加えたところ、チャンネル活性が観察され、このことはリポソームからの複合体が二重層に組み入れられていることを実証した。リポソームを形成するには、多様な方法が使用可能であり、リポソームは単層状又は多層状、小さい又は大きいのいずれにでもなりうる。これらは多様なリン脂質及びそれらの混合物から形成することができ、例えばコレステロール及びトリグセリドのような他の脂質を含むこともできる。これらの技術は充分に確立されている［ＲＲＣＮｅｗＬｉｐｏｓｏｍｅｓａＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１〜１０４頁（１９９０）を参照のこと］。精製ＰＨＢとＣａ（ｐｏｌｙＰｉ）（又は他のｐｏｌｙＰｉ塩）とから構成される複合体は、単に、これらの複合体のクロロホルム溶液の一部を脂質のクロロホルム溶液に加え、溶媒を蒸発させ、残留脂質フィルムからリポソームを形成することによって、これらのリポソームのいずれかに組み入れることができる。リポソームが“溶解する”水性媒質は好ましくは、６〜８のｐＨを有する高イオン強度のものであるべきである。この水性媒質は好ましくは下記イオン：Ｃａ²⁺ ，Ｓｒ²⁺、Ｂａ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｌｉ⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｒｂ⁺又はＣｓ⁺の１種以上の塩を含むべきである。実施例７カエルの外側膜は卵母細胞であり、これらをリポソーム中に組み入れた複合体によって被覆する。チャンネルは自然に(by itself)形成される。これは種々な化学薬品を試験するための、卵母細胞中へのチャンネルを提供する。比較例８リポソームの製造を試みて、Ｒｅｕｓｃｈ等の方法（Ｐｒｏｃ．ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ８５，４１７６〜４１８０（１９８８））を、この参考文献の４１７８頁に記載されるように、ＰＨＢとＣａｐｏｌｙ（Ｐ）とを用いて繰り返した。この場合に、複合体は不安定であった。したがって、安定な複合体によってリポソームを形成するという問題はこの参考文献においては解決されなかった。実施例９大腸菌は小さい膜ＰＨＢと同時抽出され(coextract)、小さい膜ＰＨＢから分離することが困難である高分子量の細胞質ＰＨＢを合成しないので、大腸菌をＰＨＢ／ｐｏｌｙＰｉ複合体の供給源として用いた。実施例１に既述したようなＨａｎａｈａｎ方法の変形によって大腸菌ＤＨ５αをコンピテントにし、複合体を脱脂質した乾燥細胞残渣から複合体をクロロホルム中に抽出し、実施例５におけるように、クロマトグラフィーによって精製した。この複合体は非常に不安定であり、水分に敏感であり、単離操作の全ての工程を乾燥窒素雰囲気下で４℃において実施した。実施例１におけるように、精製した抽出物をデカン中の合成１− パルミトイル、２−オレオイルホスファチジルコリン（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ，アラバマ州，バーミンガム）（２０ｍｇ／ｍｌ）の溶液に加え、クロロホルムを乾燥窒素流によって除去した。残留デカン溶液を用いて、２つの浸漬水溶液の間の１５０〜２５０μｍアパーチャーを横切る二重層を形成した。ＰＨＢとｐｏｌｙＰｉとの２種類の線状ホモポリマーの複合体は対称的であり、アニオンｐｏｌｙＰｉが膜に対して垂直に配向する。二重層のシス側（任意に、内側と定義される）は可変な電位であり、トランス側（又は外側）は実際のアースに維持した。電圧は内側マイナス外側の通常の慣例で報告する。１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）と、ＣａＣｌ₂、ＳｒＣｌ₂又はＢａＣｌ₂ のいずれかの２５０ｍＭとから成る対称的溶液の間のＰＨＢ／ｐｏｌｙＰｉ含有二重層を横切って、＋６０ｍＶより大きい維持電位(holding potential)を室温において数分間維持するときに、段階的な電流変動が観察された。１０秒間〜数分間の不活性期間と交互に数秒間〜数分間持続する明確な（well-defined）電流段階を含むバースト(burst)が１５〜６０分間、継続した。４℃において乾燥状態に保持された、一定細胞抽出物を用いて、２週間のチャンネル活性を生じることができたが、複合体含有抽出物を室の空気に暴露させた場合には、活性は数分間で失われた。Ｃａ²⁺、Ｓｒ²⁺及びＢａ²⁺によると、＋１００ｍＶにおける電流変動は約１ｐＡであった。Ｍｇ²⁺はＣａ²⁺の不存在下では浸透したが、Ｃａ²⁺ はＭｇ²⁺に対して強度に選択されるが、低濃度のＭｇ²⁺はチャンネルを安定化した。Ｓｒ²⁺及びＢａ²⁺がＣａ²⁺に置換しうることと、Ｍｇ²⁺の不浸透に対する選択性とがＣａ²⁺チャンネルの特徴である［Ｔｓｉｅｎ等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１６，２６５（１９８７）］。対称的溶液中の浸透カチオンに関するシングルチャンネル電流−電圧関係は４０ｍＶから１２０ｍＶまで直線的であった。４０ｍＶ未満では、シングルチャンネル電流はあまりに小さくかつ短くて、測定できず、＋１００ｍＶを越える電位では、開放チャンネルの電流ノイズがかなり増加した。シングルチャンネルコンダクタンスはＣａ²⁺、Ｓｒ²⁺及びＢａ²⁺では約１０ｐＳであった。これらのコンダクタンスは、キャリヤーカチオンの濃度が１００ｍＭに低下したときに有意に変化せず、このことはチャンネル内のキャリヤー部位がキャリヤーカチオンに関して飽和されていること及び相対的コンダクタンスがカチオン輸送の相対的速度を反映することを実証する。チャンネル開放時間は電流を運搬するカチオンの電圧と性質の両方によって影響された。電圧が逆電位(reversal potential)（対称的溶液に関しては零）に近づくと、各浸透カチオンに関して開放時間は実質的に減少した。Ｃａ²⁺の不存在下では、一価カチオンが浸透性であった。チャンネルは一価カチオンに比べて二価カチオンに対して選択的であった。トランス側で２５０ｍＭＳｒＣｌ₂溶液を８ｍＭＳｒＣｌ₂と２７０ｍＭＫＣｌとの等張性溶液によって置換した場合に、チャンネルの選択性が判明する。− ３７ｍＶの逆電位はＮｅｒｎｓｔ式から算出される平衡電位と本質的に同じであるが、Ｃｌ^-に関する逆電位は＋９ｍＶであり、Ｋ⁺に関する逆電位は公称的に無限であった。多くの種類の細胞において、Ｃａ²⁺電流は種々な遷移金属によってブロックされるが、この理由はこれらの遷移金属がチャンネル内の結合部位をＣａ²⁺と共に満たす（complete with Ca²⁺）からであると推定される。ランタン、コバルト及びカドミウムはチャンネル複合体において不浸透であることが判明した。Ｌａ³⁺ ＞Ｃｏ＞Ｃｄの効率(effectiveness)の順序で、両方がシングルチャンネル電流を濃度依存的に減少させた。チャンネル抽出物をさらに非水性サイズ排除カラム（ＳｈｏｄｅｘＫ８０３）上でクロマトグラフィーして、溶離画分を非対称的溶液中でシングルチャンネル電流活性に関して試験した、シスは１０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）中の２０ｍＭＢａＣｌ₂、６０ｍＭＲｂＣｌであり、トランスは−１００９ｍＶにおいて５ｍＭＭｇＣｌ₂、６０ｍＭＲｂＣｌ、１０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）であった。チャンネル活性を有する画分は、ポリイソプレン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，ペンシルヴェニア州，ワーリントン）と合成ＰＨＢ（Ｓｅｅｂａｃｈ，ＥＴＨ，チューリッヒ）との標準によって１７，０００±４，０００と定義された分子量範囲内において相対的にシャープなピークで溶出した。チャンネル活性を有する画分はＰＨＢとｐｏｌｙＰｉとを含有したが、タンパク質もヌクレオチドも含有しなかった。精製複合体のシングルチャンネルのコンダクタンスは無変化であったが、比較的不安定であり、このことは安定化物質(stabi lizing substance)がクロマトグラフィーによって除去されたことを示唆する。実施例１０コンピテント大腸菌ＤＨ５αから単離した精製ＰＨＢと、実施例１におけるようにＣａＣｌ₂とリン酸ナトリウムガラスとから製造したＣａ（ｐｏｌｙＰｉ）とから、インビトロでＰＨＢ／Ｃａ（ｐｏｌｙＰｉ）を製造することによって、チャンネル組成物を確立した。乾燥した微粉砕Ｃａ（ｐｏｌｙＰｉ）（１００μ ｇ）をクロロホルム中のＰＨＢ溶液（１０μｇ／ｍｌ）に加え、混合物を超音波処理した。濾過した溶液を脂質に加え、実施例９に述べたように、二重層を形成した。このチャンネルが大腸菌から抽出したチャンネルと同じ特徴を有することが予想される。実施例に関して、膜の浸漬水溶液は対称的（膜の両側において同じ組成）又は非対称的（異なる組成）のいずれでもよい。溶液はカルシウム、ストロンチウム、バリウム、マンガン、マグネシウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム及びセシウム（周期律表第ＩＡ族と第ＩＩＡ族）の塩を含むことができる。好ましくは、マグネシウムを溶液中に供給して、チャンネルを通過させることができる。溶液はｐＨを好ましくは５〜９に維持して、膜を保持するために緩衝剤を含むことができる。溶液は通常、高イオン強度（高いイオン濃度）を有する。ＰＨＢ／ＰｏｌｙＰｉチャンネル複合体は膜全体に配置されるイオン伝導性ポリマー電解質の単分子として見なすことができる［ＭａｃＣａｌｌｕｍ，Ｊ．Ｒ．とＶｉｎｃｅｎｔ，Ｃ．Ａ．，ＰｏｌｙｍｅｒＥｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅＲｅｖｉｅｗｓ，ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク，２３〜３７頁（１９８７）］。ＰＨＢは塩溶媒和ポリマーに共通した分子特徴を共有する。そのエステルカルボニル酸素はカチオンと弱い配位結合を形成するために充分な電子ドナー力を有し、提案された構造におけるカルボニル酸素間の鎖間(interchain)及び鎖内(intrachain)距離はポリマー鎖とカチオンとの間の多重結合を可能にする。さらに、ポリマーは生理的条件下でそのガラス温度（約０℃）を越えているので、ポリマー鎖の回転運動とセグメント運動(segmental motion)の両方がカチオンの部位から部位への移動を助成する。ＰＨＢのバックボーン構造は、Ｗａｔａｎａｂｅ等［Ｗａｔａｎａｂｅ等，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１７，２９０８〜２９１２（１９８４）］によって、過塩素酸リチウム及び塩化鉄と共にイオン伝導性複合体を形成すると報告されているポリエステル、ポリ−β−プロピオラクトンのバックボーン構造と同じである。この種のポリマーによって溶媒和される塩は一般に、高い溶媒和エネルギーを有するカチオンと、拡散電荷(diffuse charge)を有する大きいアニオンとから一般に構成される。Ｃａ²⁺とｐｏｌｙＰｉとはこれらの特徴を共有し（カルシウムの水和エネルギーは−３９７ｋｃａｌ／ｍｏｌである）、各ｐｏｌｙＰｉモノマー単位は２個の酸素の間に分配されたその単一負電荷を共有する。２種類のポリマーの個々の及び組合せた分子性質を利用して、イオンの大きさ、結合エネルギー、水和エネルギー及び配位ジオメトリーによってカチオンを識別することによって、選択性が得られる。ｐｏｌｙＰｉの負に荷電したホスホリル残基はカチオンをチャンネルの口(mouth)に引き付け、ｐｏｌｙＰｉ鎖のフレキシビリティと、隣接負電荷の間の距離とが、大きい濃度の一価カチオンの存在下での二価カチオンの封鎖(sequestration)を容易にする［Ｃｏｒｂｒｉｄｇｅ，Ｄ．Ｅ．Ｃ．，Ｓｔｕｄ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６：１７０〜１７８（１９８５）］。ＰＨＢはエステルカルボニル酸素の空間配置に適合する配位ジオメトリーを有するカチオンを優先的に溶媒和することによって、第２選択性フィルターを形成する。ＰＨＢとｐｏｌｙＰｉとの酸素リガンドは、共同で、最適カチオンサイズを決定する平衡キャビティ(equilibrium cavity)を画定する。上記イオン浸透メカニズムはチャンネルの選択性順序及びシングルチャンネルコンダクタンスと矛盾しない。リガンドジオメトリーがＣａ²⁺に最適であると推定されるならば、同じ配位ジオメトリーを有するＳｒ²⁺とＢａ²⁺も浸透性であるが；カチオン直径が有意に増加すると平衡キャビティが歪められ、結合が弱くなると、我々は予想する。このことは実験的選択性順序Ｃａ²⁺＝Ｓｒ²⁺＞Ｂａ²⁺及びコンダクタンス順序Ｂａ²⁺＞Ｓｒ²⁺＝Ｃａ²⁺と適合する。Ｍｇ²⁺の小さいサイズ、異なる配位ジオメトリー及び遅い水置換速度(slow rate of water exchange )のために、Ｍｇ²⁺の排除が予想される［“ＭｅｔａｌＩｏｎｓｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ ”，Ｓｉｇｅｌ，Ｈ．とＳｉｇｅｌ，Ａ．編集，２６：１〜１３（１９９０）におけるＭａｒｔｉｎ，Ｒ．Ｂ．，ＢｉｏｉｎｏｒｇａｎｉｃｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＭａｇｎｅｓｉｕｍ．］。チャンネル面においてｐｏｌｙＰｉに緊密に結合するが、Ｌａ³⁺のようにサイズによって又はＣｄ²⁺若しくはＣｏ²⁺のように配位ジオメトリーによって侵入(entering)を阻害されるイオンは、浸透性カチオンの侵入をブロックする。Ｍｎ²⁺のような浸透性ブロッカーはＣａ²⁺よりも緊密に結合して、チャンネルを通ってより緩慢に移動して、Ｃａ²⁺電流を抑制する。この複合体は、その組成と構造との単純さにも拘わらず、真核Ｃａ²⁺チャンネルの特徴の多くを有するので、これらの精巧な系におけるイオン輸送の基礎をなす構造特徴と分子メカニズムとを解明するためのモデルとして役立つ。実施例１１この実施例は、大腸菌から単離され、リン脂質二重層に組み入れられた精製ＰＨＢと、この二重層を囲む水溶液に加えられた合成ポリリン酸カルシウムとから製造されたカルシウムチャンネルを示す。大腸菌ＤＨ５αをコンピテントにして、細胞ペレットを洗浄し、実施例２におけるようにプロテイナーゼＫによって処理した。クロロホルム中のＰＨＢをデカン中の１−パルミトイル，２−オレオイルホスファチジルコリンに加えた（脂質４０μｇに対してＰＨＢ１０ｎｇ）。クロロホルムを蒸発させ、１０ｍＭＴｒｉｓＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中の１００ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＭｇＣｌ₂の２浸漬水溶液の間に、ＰＨＢ脂質溶液によって二重層を形成した。実施例１に述べたように、ポリリン酸カルシウムを製造し、浸漬水溶液に加えた。内側に６０ｍＶの電圧を印加した。結果は、電位依存性であるシングルチャンネル活性であった。水溶液中のこの濃度でのＰＨＢ単独はこれらの条件下でチャンネルを有さない。ＣａＣｌ₂と共に溶液に電圧を印加した後に、チャンネルが形成される。上記記載が本発明の例示に過ぎないこと、及び本発明が以下の請求の範囲によってのみ限定されることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＢ３２Ｂ 9/00 9349−4ＦＢ３２Ｂ 9/00 ＺＧ０１Ｎ 27/26 0275−2ＪＧ０１Ｎ 27/26 Ｚ 27/333 0275−2Ｊ 27/30 ３３１Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．膜の第１面と第２面との間にチャンネルを有する、安定な二重層膜又は多重層膜であって、（ａ）膜の各側で２つの水性領域を分離する脂質二重層と；（ｂ）（１）ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）と（２）ポリホスフェートとの実質的に純粋な混合物であって、ＰＨＢとポリホスフェートとが膜を横切るチャンネルを形成する分子量を有する混合物とを含む膜。２．脂質二重層がリン脂質、１−パルミトイル，２−オレオイルホスファチジルコリンによって製造される、請求項１記載の膜。３．ＰＨＢが約１０００〜３０，０００の分子量を有する、請求項１記載の膜。４．（ａ）対（ｂ）の重量比が約１０００：１から１００，０００：１までの範囲内であり、（１）対（２）の比が約１：１から１０：１までの範囲内である、請求項１記載の膜。５．プレートを通るアパーチャーの中で支持される、請求項１記載の膜。６．アパーチャーが約５０〜３００μｍ²の横断面積を有する、請求項５記載の膜。７．ポリホスフェートが金属のポリリン酸塩であり、金属がリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム及びマンガンから成る群から選択される、請求項１記載の膜。８．リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム及びマンガンから成る群から選択される金属イオンがチャンネルを通って輸送されることができる、請求項１記載の膜。９．二重層膜がリポソームとして約４０〜１２０Åの厚さを有する、請求項１記載の膜。 10．約５０〜１０００μｍ²の横断面積を有し、二重層膜が約４０〜１２０Å の厚さを有する、プレートを通るアパーチャーの中で支持される、請求項１記載の膜。 11．チャンネルを通して炭素を輸送する方法であって、（ａ）膜の第１面と第２面との間にチャンネルを有する、安定な二重層膜又は多重層膜であって、膜の各側で２つの水性領域を分離する脂質二重層と；（１）ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）と（２）ポリホスフェートとの実質的に純粋な混合物であって、ＰＨＢとポリホスフェートとが膜を横切るチャンネルを形成する分子量を有する混合物とを含む膜を形成する工程と；（ｂ）チャンネルを通るカチオンの輸送手段を用意する工程とを含む前記方法。 12．元素又は分子がイオンであり、輸送手段が膜の両側の間の電位差又は濃度差である、請求項１１記載の方法。 13．リン脂質が１−パルミトイル，２−オレオイルホスファチジルコリンである、請求項１１記載の方法。 14．ＰＨＢが約１０００〜３０，０００の分子量を有する、請求項１１記載の方法。 15．リン脂質対ＰＨＢとポリホスフェートとの混合物の比が約１０００：１から１００，０００：１までの範囲内であり、（１）対（２）の比が約１：１から１０：１までの範囲内である、請求項１１記載の方法。 16．プレートを通るアパーチャーの中で支持される、請求項１１記載の方法。 17．アパーチャーが約５０〜５００μｍ²の横断面積を有する、請求項１１記載の方法。 18．ポリホスフェートが金属のポリリン酸塩であり、金属がリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム及びマンガンから成る群から選択される、請求項１１記載の方法。 19．リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム及びマンガンから成る群から選択される金属イオンが輸送手段によってチャンネルを通って輸送される、請求項１１記載の方法。 20．二重層膜がリポソームとして約４０〜１２０μｍの厚さを有する、請求項１１記載の方法。 21．約５０〜５００μｍ²の横断面積を有する、プレートを通るアパーチャーの中で支持され、二重層膜が約４０〜１２０μＭの厚さを有する、請求項１１記載の方法。 22．カルシウムチャンネルブロッキング化合物の分析方法であって、（ａ）膜の第１面と第２面との間にチャンネルを有する、安定な二重層膜又は多重層膜であって、膜の各側で２つの水性領域を分離する脂質二重層と；（１）実質的に純粋なポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）と（２）ポリホスフェートとの混合物であって、ＰＨＢとポリホスフェートとが膜を横切るチャンネルを形成する分子量を有する混合物とを含む膜を形成する工程と；（ｂ）膜の片側又は両側にカルシウムチャンネルブロッカー化合物とカルシウムイオンとを供給する工程と；（ｃ）チャンネルを通るカルシウムイオンの輸送手段を用意する工程とを含み、カルシウムチャンネルブロッキング化合物が膜を通るチャンネルをブロックする前記方法。 23．輸送手段が膜の両側の間の電位差又は濃度差である、請求項２２記載の方法。 24．リン脂質二重層がリン脂質、１−パルミトイル，２−オレオイルホスファチジルコリンによって形成される、請求項２２記載の方法。 25．ＰＨＢが約１０００〜３０，０００の分子量を有する、請求項２２記載の方法。 26．リン脂質対ＰＨＢとポリホスフェートとの混合物の比が約１０００：１から１００，０００：１までの範囲内であり、（１）対（２）の比が約１：１から１０：１までの範囲内である、請求項２２記載の方法。 27．プレートを通るアパーチャーの中で支持される、請求項２２記載の方法。 28．アパーチャーが約５０〜１０００μｍ²の横断面積を有する、請求項２２記載の方法。 29．ポリホスフェートが金属のポリリン酸塩であり、金属がリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム及びマンガンから成る群から選択される、請求項２２記載の方法。 30．リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム及びマンガンから成る群から選択される金属イオンがチャンネルを通る輸送からブロックされる、請求項２２記載の方法。 31．二重層膜がリポソームとして約４０〜１２０μｍの厚さを有する、請求項２２記載の方法。 32．約５０〜５００μｍ²の横断面積を有する、プレートを通るアパーチャーの中で支持され、二重層膜が約４０〜１２０Åの厚さを有する、請求項２２記載の方法。 33．膜の第１面と第２面との間にチャンネルを有する二重層膜又は多重層膜の形成方法であって、（ａ）リン脂質を無機ポリホスフェートとポリヒドロキシブチレートとの混合物と有機溶媒中で混合して、膜形成用溶液を生成する工程と；（ｂ）ＰＨＢと無機ポリホスフェートとがリン脂質によって形成される層を通るチャンネルを形成している、２水性相の間の膜を形成する工程とを含む前記方法。 34．脂質二重層をリン脂質、１−パルミチル，２−オレオイル−ホスファチジルコリンによって形成する請求項３３記載の方法。 35．ＰＨＢが約１０００〜３０，０００の分子量を有する請求項３３記載の方法。 36．リン脂質対ＰＨＢとポリホスフェートとの混合物の比が約１０００：１から１００，０００：１までの範囲内であり、（１）対（２）の比が約１：１から１０：１までの範囲内である、請求項３３記載の方法。 37．プレートを通るアパーチャーの中で支持されることによって形成される、請求項３３記載の方法。 38．アパーチャーが約５０〜１０００μｍ²の横断面積を有する、請求項３３記載の方法。 39．ポリホスフェートが金属のポリリン酸塩であり、金属がリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム及びマンガンから成る群から選択される、請求項３３記載の方法。 40．二重層膜がリポソームとして約４０〜１２０μｍの厚さを有する、請求項３３記載の方法。 41．約５０〜１０００μｍ²の横断面積を有する、プレートを通るアパーチャーの中で支持され、二重層膜が約４０〜１２０Åの厚さを有する、請求項３３記載の方法。