DE69535689T2

DE69535689T2 - Polyhydroxybutyrate- und polyphosphatmembranen mit kanälen

Info

Publication number: DE69535689T2
Application number: DE69535689T
Authority: DE
Inventors: Rosetta N. Okemos REUSCH
Original assignee: Michigan State University MSU
Current assignee: Michigan State University MSU
Priority date: 1994-10-03
Filing date: 1995-09-26
Publication date: 2009-01-08
Anticipated expiration: 2015-09-27
Also published as: EP0731727A1; DE69535689D1; US5650330A; CA2176361A1; US5585249A; WO1996010454A1; AU683203B2; US6602398B1; EP0731727A4; AU3725395A; JP3021663B2; JPH09507166A; ATE384262T1; EP0731727B1; CA2176361C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile Doppelschicht- oder Mehrschichtmembran mit Kanälen durch die Membran, die ein Phospholipid und eine Mischung aus einem Polyhydroxybutyrat (PHB) und einem Polyphosphat enthält. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transportieren eines Ions oder Moleküls durch den Kanal in der Membran. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Untersuchen von Verbindungen, die den Kanal blockieren. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Aufnehmen der Kanäle in Membrane.
R-poly-3-hydroxybutyrate und anorganische Polyphosphate (PolyPi) sind alte und ubiquitäre Homopolymere, deren biologische Funktionen nicht gut verstanden sind. PHB, ein Kopf-Schwanz-Polymer von R-3-Hydroxybutyrat ist am besten bekannt als ein Polymer mit hohem Molekulargewicht (60.000 bis 1.000.000), das in Einschlusskörpern in vielen Prokaryoten abgelagert ist. PolyPi sind lineare Ketten von Orthophosphaten, die durch Phosphoranhydridbindungen verbunden sind, die eine freie Energie der Hydrolyse vergleichbar der des ATP aufweisen. Reusch et al. (R. N. Reusch und H. L. Sadoff., J. Bakteriol. 156, 778–788 (1983); R. N. Reusch, et al., J. Bakteriol. 168, 553–562 (1986); und R. N. Reusch., Soc. Exp. Biol. und Med. 19, 377–381 (1989)) isolierten PHB mit einem niederen Molekulargewicht (< 12.000) aus bakteriellen Plasmamembranen und aus Membranen und Organellen von Pflanzen, und schlussfolgerten, dass Membran-PHB in Escherichia coli, Azotobacter vinelandii und Bacillus subtilis mit Ca(PolyPi) komplexiert war. Die Anwesenheit dieser Komplexe in bakteriellen Membranen wird erkannt durch Beobachten der thermotropen Fluoreszenz der Membransonde N-Phenyl-1-naphthylamin; eine Dissoziation der Komplexe führt zu einem Anstieg der Fluoreszenz mit einem Peak bei ca. 56°C. Die Konzentration an PHB/PolyPi ist niedrig während des Log-Phasen Wachstums, steigt jedoch 50- bis 100-fach oder mehr an, wenn die Zellen durch physiologische oder physikochemische Mittel genetisch kompetent gemacht werden. Bei hohen Konzentrationen verursachen die Komplexe Änderungen der Plasmamembranstruktur, die durch Gefrierbruchelektronenmikroskopie beobachtbar sind (R. Reusch, et al., Can. J. Microbiol. 33, 435–444 (1987)).
Poly-β-hydroxybutyrat(PHB)- und Kalziumpolyphosphat-Komplex-Membrane wurden als biologische Komplexe aus bakteriellen Membranen extrahiert (Reusch, R. und Sadoff, H., Proc. National Acad. Science 85, 4176–4180 (1988)). Versuche, die Komplexmembrane aus Kalziumpolyphosphat und PHB in Liposomen zu rekonstituieren, führte zu begrenztem Erfolg, da diese signifikant getrennt waren, wie aus 1 dieser Referenz gesehen werden kann. Die mutmaßlichen Funktionen dieser biologischen Komplexe sind weiterhin diskutiert in FEMS Microbiology Rev. 103, 119–130 (1992).
Reusch und Sadoff schlugen eine Struktur für das PHB/Ca(PolyPi) in E. coli vor, die auf molekularer Modellierung und Computermodellierung hinsichtlich der physikalischen Eigenschaften der Polymere, der Koordinationsgeometrie des Kalziums und der Membranumgebung beruhte. Es wird angenommen, dass das amphophile PHB eine schraubenförmige Pore bildet – mit einer lipophilen Außenseite aus Methyl- und Methylengruppen und einer hydrophilen Auskleidung mit Estercarbonylsauerstoffen – die durchquert wird mit einem starreren PolyPi-Anion. Ein Kanal ist gebildet in dem Raum zwischen den zwei Polymeren, der solavatisierende Carbonylsauerstoffsäulen gleichmäßig verteilt entlang dessen äußerer Wand und negativ geladene Bindungsstellen in regelmäßigen Intervallen entlang dessen innerer Wand aufweist. Der Kanal ist unterteilt in mehrere angrenzende parallele Wege, durch die Kationen, eines hinter dem anderen, sich in der Richtung von Konzentrations- oder von Spannungsgradienten bewegen können. Da alle Kationenbindungsstellen identisch sind, sind die Potentialenergieminima auch identisch. Dieses Model eines Mehrzentren-, „Eines-nach-dem-anderen"-Kanals (multiple-site, single-file channel) ist in Übereinstimmung mit den gegenwärtigen Ansichten über Protein-Ca²⁺-Kanalstrukturen, wie von Hess und Tien und Almers und McCleskey ausgedrückt (Hess, P. und R. W. Tsien, Nature. 309, 453 (1984); und Almers, W. und McCleskey, E. W., J. Physiol. 353, 585 (1984)). Dieses Model wird als Grundlage benutzt, um zu erklären, wie die Erfinder glauben, dass die vorliegende Erfindung funktioniert; diese möchten jedoch nicht an irgendeine besondere Theorie gebunden sein.
WO93/13423 offenbart Verfahren zum Untersuchen eines Kalziumkanalblockers unter Verwendung von entwicklungsfähigen Zellen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Untersuchungsverfahren zum Bestimmen, ob die Kanäle von Kanalkomplexen in Lipiddoppelschichten oder Mehrschichten durch bestimmte Ionen oder Moleküle blockiert sind, bereitzustellen.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Untersuchen eines Kalziumkanalblockers, das umfasst:

(a) das zur Verfügung stellen einer stabilen Doppelschicht- oder Mehrschichtmembran, die einen Kanal zwischen einer ersten Seite und einer zweiten Seite der Membran aufweist, die umfasst: (a1) eine Lipiddoppelschicht, die zwei wässrige Bereiche auf jeder der Seiten der Membran trennt, (a2) eine im Wesentlichen reine Mischung aus (1) einem Polyhydroxybutyrat (PHB) mit einem Molekulargewicht zwischen 1.000 und 30.000 und (2) einem Polyphosphat, wobei das PHB und das Polyphosphat Molekulargewichte aufweisen, die einen Kanal durch die Membran bereitstellen; wobei die Doppelschicht- oder Mehrschichtmembran erhältlich ist durch (i) Mischen eines Phospholipids mit einer Mischung aus einem anorganischen Polyphosphat und einem Polyhydroxybutyrat (PHB) mit einem Molekulargewicht zwischen 1.000 und 30.000 in einem organischen Lösungsmittel unter Ultraschallbehandlung, um eine membranbildende Lösung bereitzustellen, und (ii) Bilden einer Membran zwischen zwei wässrigen Phasen, wobei das PHB und das anorganische Polyphosphat einen Kanal durch eine aus dem Phospholipid gebildete Schicht bilden,
(b) das Bereitstellen eines Kalziumkanalblockers und eines Kalziumions auf einer oder beiden Seiten der Membran; und
(c) das Bereitstellen von Transportmitteln für das Kalziumion durch den Kanal, wobei der Kalziumkanalblocker den Kanal durch die Membran blockiert.

Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen dargelegt.
Das PHB kann ökonomisch aus Prokaryoten extrahiert, mit Ultraschall behandelt und gereinigt werden, um ein Molekulargewicht zwischen 1.000 und 30.000, vorzugsweise 11.000 bis 16.000 zu ergeben. PHB tritt auch in höheren Organismen auf; eine Extraktion ist jedoch schwieriger. Das PHB kann auch chemisch durch Polymerisation unter Verwendung von bekannten Verfahren synthetisiert werden.
Salze des Polyphosphats außer Kalzium können verwendet werden, wie Strontium, Barium, Mangan, Magnesium, Lithium, Natrium, Kalium, Rubidium oder Cäsium. Solche Metalle sind in der Gruppe IA und IIA des Periodensystems.
Die Phospholipide sind vorzugsweise:

(1) 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL);
(2) E. coli Phospholipide, die hauptsächlich Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylglycerol (4:1 Mischung) mit gemischten Fettacylketten, hauptsächlich 16:0, 16:1, 18:1 (Avanti Polar Lipids) sind. Viele andere synthetische und natürliche Phospholipide können verwendet werden und andere Lipide, wie Triglyceride, Cholesterol und ähnliche können zugegeben werden. Diese sind im Phospholipidhandbuch, Marcel Dekker, Inc., New York 1–22 und 603–637 (1993) beschrieben.

Die PHB- und Polyphosphatmischung kann durch irgendein Mittel getrocknet werden, das das PHB nicht zersetzt. Ein Vakuumofen kann zum Beispiel verwendet werden. Ein Mikrowellenofen kann verwendet werden. PHB und PolyPi können in einem Mörser und Pistill gemischt werden, auf den Schmelzpunkt des PHB (ca. 175°C) erwärmt und langsam abgekühlt werden. Das bevorzugte Verhältnis von PHB zu CaPolyPi ist zwischen etwa 1:1 und 10:1 und stärker bevorzugt 2:1 PHB zu CaPolyPi in etwa 1% Phospholipid. Das Verhältnis von Phospholipid zu der Mischung ist zwischen etwa 1.000:1 und 100.000:1.
Die Membran kann in jedem Lösungsmittel gebildet werden, indem das Phospholipid, Polyphosphat und PHB gelöst werden können. Chloroform und Dichlormethan wurden erfolgreich verwendet.
Vorzugsweise wird eine Lösung von PHB in Chloroform zu trocknem pulverisiertem Ca(PPi) zugegeben, das Chloroform verdampft und die Mischung im Mikrowellenherd bis zur Trockne erhitzt (4 Minuten). Chloroform (trocken) wird zugegeben und die Mischung wird mit Ultraschall behandelt. Die Chloroformlösung wird zu dem Phospholipid in Dekan zugegeben und das Chloroform wird verdampft, um eine Doppelschicht herzustellen. Falls Liposomen hergestellt werden, wird Phospholipid zu der Chloroformlösung zugegeben. Das Chloroform wird verdampft, ein wässriger Salzpuffer zu dem trocknen Film zugegeben und die Mischung mit Ultraschall behandelt.
Das wässrige Lösungsbad für die Membran kann symmetrisch (gleiche Lösung auf beiden Seiten der Membran) oder unsymmetrisch sein. Puffer werden verwendet, um den pH einzuhalten, vorzugsweise zwischen etwa 5 und 9. Die Lösungen haben vorzugsweise eine hohe Ionenstärke und enthalten eine Menge an Magnesiumsalzen.
Die vorliegende Erfindung ist nützlich zum Untersuchen von Kalzium- oder anderen Metall-Blockern. Anorganische Blocker sind zum Beispiel Lanthan, Aluminium, Nickel, Kadmium, Kobalt und Mangan. Organische Ca²⁺-Blocker sind zum Beispiel Nifedipin, Verapamil und Diltiazem.
Die Transportmittel können ein Ionenkonzentrations- oder Spannungs-Unterschied sein. Vorzugsweise hat die Apertur für die Experimente mit der Spannungsklemme (voltage clamp) eine Querschnittsfläche zwischen 50 und 1.000 μm². Die Doppelschichtmembran hat eine Dicke zwischen etwa 40 und 120 Angström.
Gewöhnlich wird eine Doppelschichtmembran gebildet. Es wird verstanden werden, dass mehrere Schichten gebildet werden können.
Die folgenden sind nicht-beschränkende Beispiele der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt die Extraktion und Reinigung von PHB (etwa 11.000 bis 13.000 durchschnittliches MW) aus Escherichia coli und die Bildung eines Doppelschichtmembrankomplexes aus PHB und Kalziumpolyphosphat mit den Kanälen.
Die Zellen von E. coli wurden durch die Verfahren von Hanahan (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557–580 (1983)) und Reusch (Reusch, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 85, S. 4176–4180, (1988)) kompetent gemacht. PHB wurde aus dem E. coli unter Verwendung von heißem Chloroform (zwischen etwa 50°C und Rückfluss) extrahiert, gekühlt und anschließend gefiltert, um unlösliche Bestandteile zu entfernen. Das PHB wird mit fünf (5) Volumina Methanol ausgefällt. Das PHB wurde suspendiert in 10 mM Tris-Puffer (Tris(hydroxymethylaminomethan)), EDTA pH 8,0 und mit Proteinase K (200 μg/ml) bei 37°C für 2 Stunden behandelt, um Proteine zu entfernen. Das PHB wurde anschließend durch Zentrifugieren gesammelt und nacheinander mit destilliertem Wasser (3×), Methanol (2×) und Aceton (2×) gewaschen. Das PHB wurde in Chloroform gelöst und durch Zugabe von 5 × Methanol (2×) ausgefällt. Das gereinigte PHB hatte ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 11.000 bis 13.000.
Kalziumpolyphosphat (Ca(PolyPi)) wurde durch Zugeben eines molaren Überschusses von 1 M CaCl₂ zu einer wässrigen Lösung Natriumphosphatglas 45 (Sigma Chemical, St. Louis Missouri) hergestellt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt, zweimal mit einer wässrigen CaCl₂-Lösung gewaschen und durch Gefriertrocknen und Erhitzen in der Mikrowelle getrocknet. Die Probe wurde pulverisiert und anschließend wieder in der Mikrowelle erhitzt.
Eine Chloroformlösung des gereinigten PHB (in einem Bereich von 1 und 10 μg/ml) wurde zu einer kleinen Menge eines Überschusses an pulverisiertem Ca(PolyPi) (< 1 mg) zugegeben. Das Chloroform wurde mit einem trocknen Stickstoffstrom entfernt und die zurückbleibende Mischung wurde in einem Mikrowellenofen bei voller Leistung zwei Zeitspannen von zwei (2) Minuten erhitzt. Trocknes Chloroform wurde zugegeben und die Mischung bei mittlerer (30% der vollen Leistung) Leistung (30% Impulszeit) für zwei (2) Minuten unter Verwendung von einem VIBRA CELL ULTRASONICATOR (Sonics and Materials, Danbury Conn.) mit Ultraschall behandelt. Ein Teil des gefilterten Überstandes wurde zu der Lösung aus (1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (POPC)) als das Phospholipid (PL) in Dekan zugegeben. Bevorzugt waren 10 ng PHB für 40 μg PL (40.000 ng), was 0,025% ist. Ein Prozentbereich von 0,1% bis 0,001% kann verwendet werden. Das Chloroform wurde anschließend verdampft.
Die Mischung des Membrankomplexes wurde verwendet, um eine Doppelschicht über eine 250 μMeter Apertur in einer Nylon(DELRIN, Dupont, Wilmington, DE)-Küvette zu bilden, die zwei wässrige Lösungsbäder separiert, die symmetrische Lösungen von 250 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ in 10 mM Tris(Tris(hydroxymethylaminomethan)) HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinsulfonsäure) bei einem pH von 7,3 bei Raumtemperatur (20°C–24°C) enthalten.
Die gebildete Membran wurde in einer Zelle unter Verwendung der Spannungsklemmentechnik getestet. Eine Spannung wurde an einer Seite (cis) angelegt. Die Trans-Seite wurde als Erde genommen. Die angelegte Spannung war zwischen 60 mV und 120 mV. Die Spannung wurde konstant gehalten und der Strom wurde gemessen. Das System maß den Strom, der erforderlich war, um die Spannung aufrecht zu erhalten. Die Ergebnisse waren, dass es eine Einzelkanalaktivität gab, die spannungsabhängig war. Ein Kalziumion bewegte sich zu der Trans-Seite der Zelle. Die Zelle kann folglich verwendet werden, um die Wirksamkeit von Kalziumkanalblockern zu testen.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt Kalziumkanäle, die aus gereinigtem PHB hergestellt wurden, das aus E. Coli isoliert wurde und in einer chromatographischen Säule abgetrennt wurde, um ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 8.000 und 15.000 zu erhalten und anschließend mit synthetischem Kalziumpolyphosphat gemischt wurde.
E. Coli DH5α wurden kompetent gemacht und die Zellpellets wie in Beispiel 1 beschrieben gewaschen. Das PHB wurde anschließend mit heißem Chloroform extrahiert. Das PHB wurde mit dem fünffachen Volumen an Methanol ausgefällt, in Tris, EDTA-Puffer, pH 7,5 suspendiert und über Nacht mit Proteinase K (200 μg/ml) bei 37°C inkubiert. Das PHB wurde durch Zentrifugieren gesammelt und nacheinander mit destilliertem Wasser (2×), Methanol (2×) und Aceton (2×) gewaschen. Das gereinigte Polymer wurde anschließend in Chloroform aufgelöst und aus einer Lösung mit fünffachem Volumen Methanol ausgefällt. Das Polymer wurde in Chloroform wieder in Lösung gebracht, filtriert und anschließend an einer nicht-wässrigen Größenausschlusssäule (SHODEX K-803, Waters, Milford, MA) chromatographiert, und das PHB wurde durch UV-Absorption bei 245 nm detektiert. Die Absorption detektierte die Veränderung des Refraktionsindexes, der durch das Polymer als eine Funktion des Molekulargewichts bewirkt wird.
Kalziumpolyphosphat wurde durch Auflösen von Natriumpolyphosphatglas (durchschnittliche Kettenlänge 45; Sigma Chemical Col., St. Louis, Missouri) in destilliertem Wasser und Zugeben eines Überschusses an Kalziumchlorid hergestellt. Der Kalziumpolyphosphatniederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt, getrocknet und pulverisiert.
Wie in Beispiel 1 wurde eine Lösung des PHB in Chloroform (10 μg/ml) und Phospholipid in Chloroform zu einem Überschuss (ca. 1 mg) Kalziumpolyphosphat zugegeben. Das Chloroform wurde mit einem Strom von Stickstoffgas verdunstet und die Polymermischung wurde durch Erhitzen bei voller Leistung in einem Mikrowellenofen (2 × 2 Minuten) getrocknet. Trocknes Chloroform wurde zugegeben und die Mischung wurde bei geringer Leistung (30%) für 2 Minuten mit Ultraschall behandelt, währenddessen sie bei geringer Temperatur (von 4°C bis 15°C) gehalten wurde. Der Überstand wurde filtriert und zu den Phospholipiden wie in Beispiel 1 zugegeben. Die Ergebnisse unter Verwendung der Spannungsklemmentechnik waren Einzelkanalströme.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt Kalziumkanäle, die aus PHBs mit gemischtem Molekulargewicht aus Einschlusskörpern in Bakterien und synthetischem Kalziumpolyphosphat hergestellt wurden.
PHB aus Alcaligenes species wurde aus Sigma-Vertriebswegen bezogen. Das Polymer wurde gereinigt und mit Ultraschall behandelt und an einer nicht-wässrigen Größenausschlusssäule, wie in Beispiel 2 beschrieben, chromatographiert. Die Fraktion, die im selben Zeitintervall wie E. Coli PHB eluierte, wurde gesammelt und für die Herstellung von Kalziumkanälen, wie in Beispiel 2 beschrieben, verwendet. Die Ergebnisse in der Spannungsklemmenzelle waren dieselben wie in Beispiel 2.
Beispiel 4
Wie in Reusch, et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 4176–4180 (1988) beschrieben, wurden die Kanalkomplexe aus den Bakterien isoliert und verwendet, um die Doppelschicht zu bilden. Das Problem mit dieser Herangehensweise war, dass andere biologische Materialien wie Proteine und Lipopolysaccharide anwesend sind, die die Kanalcharakteristika modifizieren.
Escherichia coli wurden genetisch kompetent gemacht im wesentlichen nach dem Verfahren von Hanahan (J. Mol. Biol. 166, 557–580 (1983)), wie früher beschrieben (Reusch, et al., J. Bacteriol. 168, 553–562 (1986)). Um die Membrane zu extrahieren, wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt, nacheinander mit Methanol, Methanol:Aceton (1:1) und anschließend Aceton gewaschen, und anschließend über Nacht mit Chloroform (ca. 0,5 ml Chloroform pro 100 ml Zellen) extrahiert. Alle Lösungsmittel waren trocken und alle Verfahren wurden bei 4°C in einer trocknen Umgebung durchgeführt. Ein Teil der Chloroformlösung (zwischen 10 μl bis 200 μl) wurde zu einer Lösung von 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (POPC) in Dekan (20 μl von 40 mg/ml) zugegeben. Das Chloroform wurde mit einem Strom von trocknem Stickstoffgas entfernt und die Lipidmischung wurde verwendet, um eine Doppelschicht über eine 250 μm Apertur in einer (DELRIN)-Küvette zu malen, die zwei wässrige Lösungsbäder trennte, die symmetrische Lösungen von 250 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, in 10 mM Tris HEPES, pH 7.3 wie in Beispiel 1 enthielt. Diese Doppelschicht war wirksam für Bewertungszwecke. Die Ergebnisse unter Verwendung der Spannungsklemmentechnik waren Kanäle, die bei Spannungen zwischen 60 mV und 100 mV beobachtet wurden. Diese waren spannungsaktiviert (voltage-gated) und spannungsabhängig, obwohl dies zu diesem Zeitpunkt nicht bekannt war.
Beispiel 5
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von gereinigten Kalziumkanälen aus E. Coli unter Verwendung einer chromatographischen Säule. Es war unerwartet, dass der Kanal unter Verwendung dieses Reinigungsverfahrens konserviert werden könnte.
E. Coli DH5α wurden im wesentlichen nach dem Verfahren von Hanahan, wie früher von Reusch, et al. (1986) beschrieben, kompetent gemacht. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit (1.500 Upm) bei 4°C für 15 Minuten gesammelt. Das Zell-Pellet wurde nacheinander mit Methanol (2×), Methanol:Aceton (1:1) (2×) und Aceton (2×) gewaschen, getrocknet und anschließend über Nacht mit Chloroform extrahiert. Alle Lösungsmittel waren trocken und kalt. Alle Verfahren wurden bei geringer Temperatur in einer trocknen Atmosphäre durchgeführt. Der Extrakt wurde mit einem Spritzenfilter (0,20 μm) TEFLON (Dupont, Wilmington, Delaware) gefiltert und an einer nicht-wässrigen Größenausschlusssäule (Shodex K-803, (8 mm × 25 cm) Waters, Milford, MA) unter Verwendung von Chloroform als Eluent chromatographiert. Es zeigte sich, dass die Fraktion, die in einem Molekulargewichtsbereich von 17.000 ± 4.000 eluierte, eine Einzelkanal-Kalziumkanalaktivität aufwies, wenn sie in eine planare Lipiddoppelschicht, aus 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (POPC) wie in Beispiel 1 zusammengesetzt, aufgenommen wurde. Der Komplex wurde mittels der Spannungsklemmentechniken des Beispiels 1 untersucht. Eine Analyse dieser Fraktion zeigte, dass sie PHB, PolyPi und Kalzium, jedoch kein Protein enthielt. Dieser gereinigte Kanalextrakt wurde auch in Liposome aufgenommen, die aus dem obigen Lipid zusammengesetzt waren, und in die planare Lipiddoppelschicht wie in Beispiel 1 transferiert. Die Ergebnisse unter Verwendung der Spannungsklemmentechnik waren Einzelkanalströme, die spannungsabhängig waren.
Beispiel 6
Dieses Beispiel zeigt die Aufnahme von gereinigten extrahierten Komplexen in Liposome unter Verwendung einer Ultraschallbehandlung.
PHB/PolyPi-Komplexe wurden aus E. Coli wie in Beispiel 5 extrahiert und gereinigt. Ein Teil des Chloroformextrakts (verdünnt zwischen 1 zu 100 μl) wurde zu einer Lösung von Phospholipid in Chloroform zugegeben. Die Phospholipide waren 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (POPC) oder eine 1:1 Mischung aus Rinderhirn-Phosphatidylethanolamin (PE) und Rinderhirn-Phosphatidylserin (PS) (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL) oder eine 2:1 Mischung aus POPE und POPG (PG = Phosphatidylglycerol). Das Chloroform wurde mit einem Strom aus Stickstoff unter Bildung eines dünnen Films der Lipidmischung verdunstet. Ein Puffer (z. B. 10 mM KHepes, pH 6,4, enthaltend 10 mM CaCl₂, 45 mM MgCl₂, 100 mM KCl) wurde zugegeben und die Probe wurde in ein Ultraschallbad für 30 Minuten bei 4°C gestellt und in einer inerten Atmosphäre (Stickstoff oder Argon) gehalten. Die Phospholipid-Dispersion wurde bei 80.000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der Überstand wurde auf eine 1 × 15 cm Sepharose 4B (Pharmacia, Piscataway, NJ) aufgetragen. Fraktionen wurden gesammelt und auf die Anwesenheit eines Komplexes durch Zugeben der hydrophoben Sonde N-Phenyl-1-Naphthylamin und Beobachten der thermotropen Fluoreszenz getestet. Der Komplex führt zu einem Fluoreszenz-Peak bei ca. 56°C. Den Komplex enthaltende Fraktionen wurden zu dem wässrigen Lösungsbad (cis-Seite) des planaren Doppelschichtsystems mit Spannungsklemme, wie in Beispiel 1 beschrieben, zugegeben und die Kanalaktivität wurde beobachtet, was anzeigte, dass der Komplex aus den Liposomen in die Doppelschicht aufgenommen worden war.
Viele verschiedene Verfahren können zum Bilden von Liposomen verwendet werden und die Liposomen können unilamellar oder multilamellar, klein oder groß sein. Sie können aus vielen verschiedenen Phospholipiden und Mischungen derselben gebildet sein und können auch andere Lipide wie Cholesterol und Triglyceride einschließen. Die Techniken sind gut etabliert (siehe RRC New. Liposomes a Practical Aproach, IRL Press, Seiten 1 bis 104 (1990)). Die aus gereinigtem PHB und Ca(PolyPi) (oder einen anderen PolyPi-Salz) dargestellten Komplexe können in jegliche dieser Liposome durch einfaches Zugeben eines Teils der Chloroformlösung der Komplexe zu einer Chloroformlösung der Lipide, Verdunsten des Lösungsmittels und Bilden der Liposome aus dem zurückgebliebenen Lipidfilm aufgenommen werden. Das wässrige Medium, in dem die Liposome „aufgelöst" sind, sollte vorzugsweise von hoher Ionenstärke mit einem pH zwischen 6 und 8 sein. Es sollte vorzugsweise (ein) Salz(e) von einem oder mehreren der folgenden enthalten: Ca²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺, Mn²⁺, Mg²⁺, Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺ oder Cs⁺.
Beispiel 7
Die äußeren Membrane eines Frosches sind Oozyten und sind überzogen mit dem Komplex, der in Liposomen aufgenommen ist. Der Kanal bildet sich selbst. Dies stellt einen Kanal in den Oozyten zum Testen verschiedenartiger Chemikalien bereit.
Vergleichsbeispiel 8
Das Verfahren nach Reusch et al., Proc. National Acad. Science 85, 4176–4180 (1988) wurde mit PHB mit Ca Poly(P), wie auf Seite 4178 dieser Referenz beschrieben, wiederholt in einem Versuch, ein Liposom herzustellen. In diesem Fall waren die Komplexe instabil. Die Probleme beim Bilden von Liposomen mit stabilen Komplexen waren folglich in dieser Referenz nicht gelöst.
Beispiel 9
E. Coli wurde als eine Quelle von PHB/PolyPi-Komplexen verwendet, da diese keine cytoplasmischen PHBs mit hohem Molekulargewicht synthetisieren, die mit extrahiert werden und schwer zu trennen sind von den kleineren Membran-PHBs. E. Coli DH5α wurden durch eine Änderung des Verfahrens nach Hanahan, wie früher in Beispiel 1 beschrieben, kompetent gemacht und der Komplex wurde aus dem von Lipiden befreiten (delipidated), getrockneten Zellrückstand in Chloroform extrahiert und chromatographisch wie in Beispiel 5 gereinigt. Da der Komplex sehr labil und empfindlich gegenüber Feuchtigkeit ist, wurden alle Schritte des Isolationsverfahrens bei 4°C in einer trocknen Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Wie in Beispiel 1 wurde der gereinigte Extrakt zu einer Lösung eines synthetischen 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL) in Dekan (20 mg/ml) zugegeben und das Chloroform mit einem trocknen Stickstoffstrom entfernt. Die zurückbleibende Dekanlösung wurde verwendet, um eine Doppelschicht über eine 150–250 μm Apertur zwischen zwei wässrigen Lösungsbädern zu bilden.
Es wird angenommen, dass der Komplex zwischen den zwei linearen Homopolymeren von PHB und PolyPi symmetrisch ist, wobei das anionische PolyPi senkrecht zu der Membran orientiert ist. Die cis-Seite der Doppelschicht, die willkürlich als die Innenseite definiert ist, hatte ein variables Potential, wohingegen die trans-Seite oder Außenseite als faktische Erde gehalten wurde. Spannungen werden in der üblichen Konvention als „Innen minus Außen" berichtet.
Wenn Haltepotentiale größer als +60 mV für mehrere Minuten über eine Doppelschicht enthaltend PHB/PolyPi zwischen symmetrischen Lösungen aufrecht erhalten wurden, die aus 10 mM HEPES, pH 7,5 und 250 mM von entweder CaCl₂, SrCl₂ oder BaCl₂ bei Raumtemperatur zusammengesetzt waren, wurden sprungartige Stromschwankungen beobachtet. Ausbrüche enthaltend wohldefinierte Stromschritte dauerten von wenigen Sekunden bis einige Minuten und wechselten sich ab mit Perioden der Inaktivität von 10 Sekunden bis einige Minuten, die für 15 bis 60 Minuten fortdauerten. Ein bestimmter Zellextrakt, bei 4°C trocken gelagert, konnte verwendet werden, um Kanalaktivität für zwei Wochen zu ergeben, aber die Aktivität wurde in wenigen Minuten verloren, wenn der den Komplex enthaltende Extrakt Raumluft ausgesetzt wurde. Die Stromschwankungen bei +100 mV waren ca. 1 pA mit Ca²⁺ und Sr²⁺, und Ba²⁺. Mg²⁺ war durchdringend in der Abwesenheit von Ca²⁺, aber Ca²⁺ selektiert nachhaltig gegenüber Mg²⁺, wobei jedoch geringe Konzentrationen an Mg²⁺ den Kanal stabilisierten. Die Fähigkeit von Sr²⁺ und Ba²⁺, Ca²⁺ zu ersetzen und die Selektivität gegenüber der Nicht-Durchlässigkeit (impermeance) von Mg²⁺ sind charakteristisch für Ca²⁺-Kanäle (Tsien, et al., Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16, 265 (1987)).
Einzelkanal-Strom-Spannungsbeziehungen für die durchdringenden Kationen in symmetrischen Lösungen waren linear von 40 mV bis 120 mV. Unter 40 mV waren die Einzelkanalströme zu klein und kurz, um gemessen zu werden, und bei Potentialen über +100 mV erhöhte sich das Arbeitsstromrauschen (open current noise) zusehends. Die Einzelkanalleitfähigkeiten waren ca. 10 pS für Ca²⁺, Sr²⁺ und Ba²⁺. Diese Leitfähigkeiten änderten sich nicht signifikant, wenn die Konzentrationen der Trägerkationen auf 100 mM reduziert wurden, was anzeigte, dass die Trägerstellen in dem Kanal im Hinblick auf das Trägerkation gesättigt waren und dass die relativen Leitfähigkeiten die relativen Raten des Kationentransports widerspiegeln. Die Kanalöffnungszeiten wurden beeinflusst sowohl durch die Spannung als auch die Natur des Kations, das den Strom trug. Wenn sich die Spannung dem Umkehrpotential näherte (0 für die symmetrischen Lösungen), nahmen die Öffnungszeiten für jedes der durchdingenden Kationen substanziell ab. In Abwesenheit von Ca²⁺ waren monovalente Kationen durchdringend.
Der Kanal war selektiv für divalente Kationen gegenüber monovalenten Kationen. Die Selektivität des Kanals ist gezeigt, wenn eine 250 mM SrCl₂-Lösung auf der trans-Seite durch eine isotonische Lösung aus 8 mM SrCl₂ und 270 mM KCl ersetzt wurde. Das Umkehrpotential von –37 mV war im Wesentlichen das Gleiche wie das Gleichgewichtspotential, das aus der Nernst-Gleichung berechnet wurde, wohingegen das für Cl^– +9 mV und das für K⁺ nominell unendlich war.
In vielen Zelltypen sind die Ca²⁺-Ströme durch eine Vielfalt von Übergangsmetallen blockiert, mutmaßlich da sie mit Ca²⁺ um Bindungsstellen in dem Kanal konkurrieren. Für Lanthan, Kobalt und Kadmium wurde herausgefunden, dass sie den Kanalkomplex nicht durchdringen. Beide reduzierten den Einzelkanalstrom in einer konzentrationsabhängigen Weise, wobei die Reihenfolge der Wirksamkeit La³⁺ > Co > Cd ist.
Der Kanalextrakt wurde weiterhin an einer nicht-wässrigen Größenausschlusssäule (Shodex K803) chromatographiert und die eluierten Fraktionen auf ihre Einzelkanalstromaktivität in nicht-symmetrischen Lösungen geprüft, wobei cis 20 mM BaCl₂ in 10 mM Hepes, pH 7,3, 60 mM RbCl war und trans 5 mM MgCl₂, 60 mM RbCl, 10 mM Hepes, pH 7,3 bei –1.009 mV war. Die Fraktion mit Kanalaktivität eluierte in einem relativ scharfen Peak in einem Molekulargewichtsbereich, der als 17.000 ± 4.000 nach den Standards von Polyisoprenen (Polysciences, Warrington, PA) und synthetischen PHB (Seebach, ETH, Zürich) definiert war. Die Fraktion mit Kanalaktivität enthielt PHB und PolyPi, jedoch weder Protein noch Nukleotide. Die Einzelkanalkonduktanz des gereinigten Komplexes war unverändert, wobei sie jedoch unbeständiger war, was nahelegt, dass (eine) stabilisierende Substanz(en) durch die Chromatographie entfernt wurde(n).
Beispiel 10
Die Kanalzusammensetzung wurde bestätigt durch in vitro Herstellung von PHB/Ca(PolyPi) aus gereinigtem PHB, das aus kompetenten E. Coli DH5α isoliert wurde, und Ca(PolyPi), das aus CaCl₂ und Natriumphosphatglas wie in Beispiel 1 hergestellt wurde. Trocknes pulverisiertes Ca(PolyPi) (100 μg) wurde zu einer Lösung von PHB in Chloroform (10 μg/ml) zugegeben und die Mischung wurde mit Ultraschall behandelt. Die gefilterte Lösung wurde zu Lipiden zugegeben und eine Doppelschicht wurde gebildet wie in Beispiel 9 beschrieben. Es wird erwartet, dass dieser Kanal die gleichen Charakteristika aufweisen wird wie die aus E. Coli extrahierten Kanäle.
Unter Bezugnahme auf die Beispiele können die wässrigen Lösungsbäder für die Membrane symmetrisch (gleiche Zusammensetzung auf beiden Seiten der Membran) oder unsymmetrisch (verschiedene Zusammensetzungen) sein. Die Lösung(en) kann (können) Salze von Kalzium, Strontium, Barium, Mangan, Magnesium, Lithium, Natrium, Kalium, Rubidium und Cäsium (Periodensystem, Gruppen IA und IIA) enthalten. Vorzugsweise kann Magnesium in der Lösung bereitgestellt werden und kann durch den Kanal passieren. Die Lösung(en) kann (können) Puffer enthalten, um den pH konstant zu halten, vorzugsweise zwischen 5 und 9, um die Membran instand zu halten. Die Lösungen weisen gewöhnlich eine hohe Ionenstärke (hohe Konzentration an Ionen) auf.
Der PHB/PolyPi-Kanalkomplex kann als ein einzelnes Molekül eines Ionen-leitenden Polymerelektrolyten angesehen werden, der quer durch die Membran positioniert ist (MacCallum, J. R. und Vincent, C. A., Polymer Electrolyte Reviews, Elsevier Applied Science, N. Y., S. 23–37 (1987)). PHB teilt die molekularen Charakteristika, die Salz-solvatisierende Polymere gemein haben. Dessen Estercarbonylsauerstoffe haben eine ausreichende Elektronendonorkraft, um schwache koordinative Bindungen mit Kationen zu bilden und die zwischen- und innerkettige Entfernung zwischen Carbonylsauerstoffen in der vorgeschlagenen Struktur erlaubt vielfache Bindungen zwischen der Polymerkette und dem Kation. Zusätzlich ist das Polymer oberhalb seiner Glastemperatur (ca. 0°C) unter physiologischen Bedingungen, so dass eine Bindungsrotation und segmentweise Bewegungen der Polymerkette bei der Überführung von Kationen von Stelle zu Stelle helfen können. Die Rückgratstruktur von PHB ist identisch zu der des Polyesters, Poly-β-propiolakton, die von Watanabe, et al. (Wanatabe, et al., Macromolecules 17, 2908–2912 (1984)) berichtet wurde, um ionenleitende Komplexe mit Lithiumperchlorat und Eisenchlorid zu bilden. Die von dieser Klasse von Polymeren solvatisierten Salze sind allgemein zusammengesetzt aus Kationen mit hohen Solvatationsenergien und großen Anionen mit diffuser Ladung. Ca²⁺ und PolyPi teilen diese Charakteristika – die Hydratationsenergie von Kalzium ist –397 kcal/mol und jede PolyPi-Monomereinheit teilt seine einzelne negative Ladung, die zwischen zwei Sauerstoffen verteilt ist.
Selektivität wird erzielt durch Ausnutzung der individuellen und kombinierten molekularen Eigenschaften von zwei Polymeren, um zwischen Kationen nach Ionengröße, Bindungsenergie, Hydratationsenergie und Koordinationsgeometrie zu unterscheiden. Die negativ geladenen Phosphorylreste von PolyPi ziehen Kationen zur Öffnung des Kanals und die Flexibilität der PolyPi-Kette und der Abstand zwischen benachbarten negativen Ladungen begünstigt die Bindung (sequestration) von divalenten Kationen in Gegenwart großer Konzentrationen von monovalenten Kationen (Corbridge, D. E. C., Stud. Inorg. Chem. 6: 170–178 (1985)). PHB stellt einen zweiten Selektivitätsfilter bereit durch ein bevorzugtes Solvati sieren von Kationen mit Koordinationsgeometrien, die mit der räumlichen Anordnung von Estercarbonylsauerstoffen übereinstimmen. Gemeinsam definieren die Sauerstoffliganden von PHB und PolyPi eine Gleichgewichtskavität, die die optimale Kationengröße bestimmen wird.
Der vorstehende Mechanismus der Ionenpermeation ist in Übereinstimmung mit der Selektivitätsanordnung und der Einzelkanalkonduktanz des Kanals. Falls angenommen wird, dass die Ligandengeometrie optimal für Ca²⁺ ist, dann würden Sr²⁺ und Ba²⁺, die ähnliche Koordinationsgeometrien aufweisen, auch durchdringen; wir würden jedoch erwarten, dass ein signifikantes Ansteigen des Kationendurchmessers die Gleichgewichtskavität deformieren würde und die Bindung schwächen würde. Dies ist vereinbar mit der experimentellen Selektivitätsanordnung Ca²⁺ = Sr²⁺ > Ba²⁺ und der Konduktanzanordnung Ba²⁺ > Sr²⁺ = Ca²⁺. Ein Ausschluss von Mg²⁺ wird infolge dessen kleiner Größe, der unterschiedlichen Koordinationsgeometrie und der langsamen Wasseraustauschrate erwartet (Martin, R. B., Bioinorganic chemistry of magnesium. In „Metal Ions in Biological Systems", Sigel, H. und Sigel, A., Herausgeber 26: 1–13 (1990)). Ionen, die fest an PolyPi auf der Kanalstirnfläche binden, jedoch infolge ihrer Größe, wie La³⁺, oder infolge der Koordinationsgeometrie, wie Cd²⁺ oder Co²⁺, am Eindringen gehindert werden, blockieren den Eintritt von durchdringenden Kationen. Durchdringende Blocker wie Mn²⁺ binden fester als Ca²⁺ und bewegen sich langsamer durch den Kanal, wobei sie den Ca²⁺-Strom inhibieren.
Trotz der Einfachheit seiner Zusammensetzung und Struktur, zeigt der Komplex viele der Charakteristika von eukariotischen Ca²⁺-Kanälen und dient folglich als Modell, um die strukturellen Merkmale und molekularen Mechanismen aufzuklären, die dem Ionentransport in diesen komplizierteren Systemen zugrunde liegen.
Beispiel 11
Dieses Beispiel zeigt Kalziumkanäle, die aus gereinigtem PHB hergestellt wurden, das aus E. Coli isoliert wurde, und in eine Doppelschicht aus Phospholipid und synthetischem Kalziumpolyphosphat aufgenommen wurden, das zu der wässrigen Lösung zugegeben wurde, die die Doppelschicht umgibt.
E. Coli DH5α wurden kompetent gemacht und das Zellpellet gewaschen und mit Proteinase K wie in Beispiel 2 behandelt. Das PHB in Chloroform wurde zu 1-Palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin in Dekan (10 ng PHB zu 40 μg Lipid) zugegeben. Das Chloroform wurde verdampft und eine Doppelschicht wurde gebildet mit der PHB-Lipidlösung zwischen zwei wässrigen Lösungsbädern aus 100 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ in 10 mM Tris HEPES, pH 7,4. Kalziumpolyphosphat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und zu dem wässrigen Lösungsbad zugegeben. Eine Spannung von 60 mV wurde an der Innenseite angelegt. Das Ergebnis war eine Einzelkanalaktivität, die spannungsabhängig war. Das PHB alleine hatte bei dieser Konzentration in der wässrigen Lösung keine Kanäle unter diesen Bedingungen. Nach der Anlegung der Spannung an die Lösung mit CaCl₂ wurden die Kanäle gebildet.

Claims

Verfahren zum Untersuchen eines Kalziumkanalblockers, das umfasst: (a) das zur Verfügung stellen einer stabilen Doppelschicht- oder Mehrschichtmembran, die einen Kanal zwischen einer ersten Seite und einer zweiten Seite der Membran aufweist, die umfasst: (a1) eine Lipiddoppelschicht, die zwei wässrige Bereiche auf jeder der Seiten der Membran trennt, (a2) eine im Wesentlichen reine Mischung aus (1) einem Polyhydroxybutyrat (PHB) mit einem Molekulargewicht zwischen 1.000 und 30.000 und (2) einem Polyphosphat, wobei das PHB und das Polyphosphat Molekulargewichte aufweisen, die einen Kanal durch die Membran bereitstellen; wobei die Doppelschicht- oder Mehrschichtmembran erhältlich ist durch (i) Mischen eines Phospholipids mit einer Mischung aus einem anorganischen Polyphosphat und einem Polyhydroxybutyrat (PHB) mit einem Molekulargewicht zwischen 1.000 und 30.000 in einem organischen Lösungsmittel unter Ultraschallbehandlung, um eine membranbildende Lösung bereitzustellen, und (ii) Bilden einer Membran zwischen zwei wässrigen Phasen, wobei das PHB und das anorganische Polyphosphat einen Kanal durch eine aus dem Phospholipid gebildete Schicht bilden, (b) das Bereitstellen eines Kalziumkanalblockers und eines Kalziumions auf einer oder beiden Seiten der Membran; und (c) das Bereitstellen von Transportmitteln für das Kalziumion durch den Kanal, wobei der Kalziumkanalblocker den Kanal durch die Membran blockiert.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Transportmittel ein elektrisches Potential oder eine Konzentrationsdifferenz zwischen den Seiten der Membran ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lipiddoppelschicht mit dem Phospholipid, 1-Palmityl, 2-Oleoyl-phosphatidylcholin hergestellt ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis von Phospholipid zu der Mischung aus PHB und dem Polyphosphat zwischen 1.000 zu 1 und 100.000 zu 1 ist und das Verhältnis von (1) zu (2) zwischen 1 zu 1 und 10 zu 1 ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei dieses in einer Apertur durch eine Platte gestützt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Apertur eine Querschnittsfläche von zwischen 50 und 1.000 μm² aufweist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polyphosphat Metallpolyphosphat ist und das Metall ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Lithium, Natrium, Kalium, Rubidium, Cäsium, Calcium, Strontium, Barium und Mangan.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Transport durch den Kanal für ein Metallion, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lithium, Natrium, Kalium, Rubidium, Cäsium, Calcium, Strontium, Barium und Mangan, blockiert ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Doppelschichtmembran eine Dicke zwischen 40 und 120 μm als Liposom aufweist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, welches in einer Apertur durch eine Platte mit einer Querschnittsfläche zwischen 50 und 500 μm² gestützt wird, wobei die Doppelschichtmembran eine Dicke zwischen 40 und 120 Angström aufweist.