JP3021663B2 - チャンネル付きポリヒドロキシブチレート及びポリホスフェート膜 - Google Patents
チャンネル付きポリヒドロキシブチレート及びポリホスフェート膜Info
- Publication number
- JP3021663B2 JP3021663B2 JP8511952A JP51195296A JP3021663B2 JP 3021663 B2 JP3021663 B2 JP 3021663B2 JP 8511952 A JP8511952 A JP 8511952A JP 51195296 A JP51195296 A JP 51195296A JP 3021663 B2 JP3021663 B2 JP 3021663B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- membrane
- channel
- phb
- bilayer
- polyphosphate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
- Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
- Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
- Y10T428/2984—Microcapsule with fluid core [includes liposome]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 （１） 発明の分野 本発明は、膜を通してのチャンネルを有し、リン脂質
及び、ポリヒドロキシブチレート（PHB）とポリホスフ
ェートとの混合物を含む、安定な二重層膜又は多重層膜
に関する。特に、本発明は膜中のチャンネルを通してイ
オン又は分子を輸送する方法に関する。さらに、本発明
はチャンネルをブロックする化合物を分析する方法に関
する。最後に、本発明は膜にチャンネルを組み込む方法
に関する。
及び、ポリヒドロキシブチレート（PHB）とポリホスフ
ェートとの混合物を含む、安定な二重層膜又は多重層膜
に関する。特に、本発明は膜中のチャンネルを通してイ
オン又は分子を輸送する方法に関する。さらに、本発明
はチャンネルをブロックする化合物を分析する方法に関
する。最後に、本発明は膜にチャンネルを組み込む方法
に関する。
（２） 関連技術の説明 Ｒ−ポリ−３−ヒドロキシブチレートと無機ポリホス
フェート（PolyPi）とは古くから、いたるところにある
ホモポリマーであるが、それらの生物学的役割はあまり
よく知られていない。PHB、Ｒ−３−ヒドロキシブチレ
ートの頭−尾結合ポリマーは多くの原核生物中の封入体
内に沈積した高分子量（60,000〜1,000,000）ポリマー
として最も良く知られている。PolyPiはATPに匹敵す
る、加水分解の自由エネルギーを有する、ホスホ−アン
ヒドリド（phospho−anhydride）結合によって結合した
直鎖オルトホスフェートである。Reusch等［R.N.Reusch
とH.L.Sadoff,J.Bacteriol.156,778〜788（1983）;R.N.
Reusch等,J.Bacteriol.168,553〜562（1986）；及びR.
N.Reusch,Soc Exp.Biol.and Med.19,377〜381（198
9）］は、細菌の形質膜から及び植物の膜と細胞小器官
とから低分子量（＜12,000）を有するPHBを単離し、大
腸菌（Escherichia coli）、Azotobacter vinelandi
i、及びBacillus subtilis中の膜PHBがCa（polyPi）に
よって複合体化されると結論した。細菌膜中のこれらの
複合体の存在は、膜プローブ、Ｎ−フェニル−１−ナフ
チルアミンのサーモトロピック蛍光（thermotropic flu
orescence）を観察することによって検出され；これら
の複合体の解離は蛍光を増加させ、約56℃においてピー
クを示す。PHB/polyPiの濃度は対数増殖期中は低いが、
生理学的手段によって又は生理化学的手段によってのい
ずれにせよ、細胞を遺伝学的にコンピテント（competen
t）にした場合には、50倍〜100倍以上に上昇する。高濃
度において、これらの複合体は凍結割断電子顕微鏡検査
によって観察可能な、形質膜構造の変化を惹起する［R.
Reusch等,Can.J.Microbiol.33,435〜444（1987）］。
フェート（PolyPi）とは古くから、いたるところにある
ホモポリマーであるが、それらの生物学的役割はあまり
よく知られていない。PHB、Ｒ−３−ヒドロキシブチレ
ートの頭−尾結合ポリマーは多くの原核生物中の封入体
内に沈積した高分子量（60,000〜1,000,000）ポリマー
として最も良く知られている。PolyPiはATPに匹敵す
る、加水分解の自由エネルギーを有する、ホスホ−アン
ヒドリド（phospho−anhydride）結合によって結合した
直鎖オルトホスフェートである。Reusch等［R.N.Reusch
とH.L.Sadoff,J.Bacteriol.156,778〜788（1983）;R.N.
Reusch等,J.Bacteriol.168,553〜562（1986）；及びR.
N.Reusch,Soc Exp.Biol.and Med.19,377〜381（198
9）］は、細菌の形質膜から及び植物の膜と細胞小器官
とから低分子量（＜12,000）を有するPHBを単離し、大
腸菌（Escherichia coli）、Azotobacter vinelandi
i、及びBacillus subtilis中の膜PHBがCa（polyPi）に
よって複合体化されると結論した。細菌膜中のこれらの
複合体の存在は、膜プローブ、Ｎ−フェニル−１−ナフ
チルアミンのサーモトロピック蛍光（thermotropic flu
orescence）を観察することによって検出され；これら
の複合体の解離は蛍光を増加させ、約56℃においてピー
クを示す。PHB/polyPiの濃度は対数増殖期中は低いが、
生理学的手段によって又は生理化学的手段によってのい
ずれにせよ、細胞を遺伝学的にコンピテント（competen
t）にした場合には、50倍〜100倍以上に上昇する。高濃
度において、これらの複合体は凍結割断電子顕微鏡検査
によって観察可能な、形質膜構造の変化を惹起する［R.
Reusch等,Can.J.Microbiol.33,435〜444（1987）］。
ポリ−β−ヒドロキシブチレート（PHB）とポリリン
酸カルシウムとの複合体膜は生物学的複合体として、細
菌膜から抽出されている［Reusch,R.とSadoff,H.,Proc.
National Acad.Science85,4176〜4180（1988）］。こ
れらの複合体膜をリポソームにおいてポリリン酸カルシ
ウムとPHBとから再構成しようとする試みは、この参考
文献の図１に見ることができるように、これらの複合体
膜が有意に解離したので、限られた成功を経験したにす
ぎない。これらの生物学的複合体の推定される機能はFE
MS Microbiology Rev.103,119〜130（1992）において
さらに考察されている。
酸カルシウムとの複合体膜は生物学的複合体として、細
菌膜から抽出されている［Reusch,R.とSadoff,H.,Proc.
National Acad.Science85,4176〜4180（1988）］。こ
れらの複合体膜をリポソームにおいてポリリン酸カルシ
ウムとPHBとから再構成しようとする試みは、この参考
文献の図１に見ることができるように、これらの複合体
膜が有意に解離したので、限られた成功を経験したにす
ぎない。これらの生物学的複合体の推定される機能はFE
MS Microbiology Rev.103,119〜130（1992）において
さらに考察されている。
ReuschとSadoffは、ポリマーの物理的性質と、カルシ
ウムの配位ジオメトリー（coordination geometry）
と、膜環境とに関する分子のコンピューターモデル化に
基づいて、大腸菌におけるPHB/Ca（polyPi）の構造を提
案している。これは、両親媒性（amphophilic）PHBがヘ
リカル孔（メチル基及びメチレン基の親油性外部と、エ
ステルカルボニル酸素の親水性ライニングとを有する）
を形成し、この孔をより硬質なpolyPiアニオンが通り抜
ける（traversed）ことを仮定している。これらの２種
ポリマーの間のスペースに、その外壁に沿って均一な間
隔をおいて溶媒和カルボニル酸素カラムを有し、その内
壁に沿って規則的な間隔をおいて、負に帯電した結合部
位を有するチャンネルが形成される。このチャンネルは
幾つかの隣接平行レーンに再分割され（subdivided）、
これらのレーンを通ってカチオンが一列縦隊で（insing
le−file）、濃度勾配若しくは電圧勾配の方向に移動す
ることができる。全てのカチオン結合部位は同じであ
り、最小ポテンシャルエネルギー（potential energy m
inima）も同じである。多重部位の一列縦隊チャンネル
のこのモデルは、Hess、Tien、Almers及びMcCleskeyが
表現している、タンパク質Ca2+チャンネル構造に関する
現在の見解と一致する［Hess,P.とTsien,R.W.,Nature.3
09,453（1984）；及びAlmers,W.とMcCleskey,E.W.,J.Ph
ysiol.353,585（1984）］。本発明者が考えている、本
発明がどのように機能するかを説明するための根拠とし
て、このモデルを用いるが、本発明者は何らかの特定の
理論に縛られることを望む訳ではない。
ウムの配位ジオメトリー（coordination geometry）
と、膜環境とに関する分子のコンピューターモデル化に
基づいて、大腸菌におけるPHB/Ca（polyPi）の構造を提
案している。これは、両親媒性（amphophilic）PHBがヘ
リカル孔（メチル基及びメチレン基の親油性外部と、エ
ステルカルボニル酸素の親水性ライニングとを有する）
を形成し、この孔をより硬質なpolyPiアニオンが通り抜
ける（traversed）ことを仮定している。これらの２種
ポリマーの間のスペースに、その外壁に沿って均一な間
隔をおいて溶媒和カルボニル酸素カラムを有し、その内
壁に沿って規則的な間隔をおいて、負に帯電した結合部
位を有するチャンネルが形成される。このチャンネルは
幾つかの隣接平行レーンに再分割され（subdivided）、
これらのレーンを通ってカチオンが一列縦隊で（insing
le−file）、濃度勾配若しくは電圧勾配の方向に移動す
ることができる。全てのカチオン結合部位は同じであ
り、最小ポテンシャルエネルギー（potential energy m
inima）も同じである。多重部位の一列縦隊チャンネル
のこのモデルは、Hess、Tien、Almers及びMcCleskeyが
表現している、タンパク質Ca2+チャンネル構造に関する
現在の見解と一致する［Hess,P.とTsien,R.W.,Nature.3
09,453（1984）；及びAlmers,W.とMcCleskey,E.W.,J.Ph
ysiol.353,585（1984）］。本発明者が考えている、本
発明がどのように機能するかを説明するための根拠とし
て、このモデルを用いるが、本発明者は何らかの特定の
理論に縛られることを望む訳ではない。
目的 それ故、脂質二重層又は多重層としてイオンチャンネ
ル複合体を提供することが、本発明の目的である。簡単
でかつ経済的である、二重層状イオンチャンネル複合体
の形成方法を提供することが、本発明の他の目的であ
る。さらにまた、チャンネルが特定のイオン又は分子に
よってブロックされるか否かを判定するための分析方法
を提供することが本発明の目的である。これらの目的及
び他の目的は下記説明を参照することによってますます
明らかになると思われる。
ル複合体を提供することが、本発明の目的である。簡単
でかつ経済的である、二重層状イオンチャンネル複合体
の形成方法を提供することが、本発明の他の目的であ
る。さらにまた、チャンネルが特定のイオン又は分子に
よってブロックされるか否かを判定するための分析方法
を提供することが本発明の目的である。これらの目的及
び他の目的は下記説明を参照することによってますます
明らかになると思われる。
好ましい実施態様の説明 本発明は、膜の第１面と第２面との間にチャンネルを
有する、安定な二重層膜又は多重層膜であって、膜の各
側で２つの水性領域を分離する二重層（又は複数個の二
重層）と、（１）ポリヒドロキシブチレート（PHB）と
（２）ポリホスフェートとの実質的な純粋な混合物（PH
Bとポリホスフェートとは膜を横切るチャンネルを形成
する分子量を有する）とを含む前記膜に関する。
有する、安定な二重層膜又は多重層膜であって、膜の各
側で２つの水性領域を分離する二重層（又は複数個の二
重層）と、（１）ポリヒドロキシブチレート（PHB）と
（２）ポリホスフェートとの実質的な純粋な混合物（PH
Bとポリホスフェートとは膜を横切るチャンネルを形成
する分子量を有する）とを含む前記膜に関する。
さらに、本発明はチャンネルを通してカチオンを輸送
する方法であって、膜の第１面と第２面との間にチャン
ネルを有する、安定な二重層膜又は多重層膜であり、膜
の各側で２つの水性領域を分離する脂質二重層と、
（１）ポリヒドロキシブチレート（PHB）と（２）ポリ
ホスフェートとの実質的に純粋な混合物（PHBとポリホ
スフェートとは膜を横切るチャンネルを形成する分子量
を有する）とを含む前記膜を形成する工程と；このチャ
ンネルを通してのカチオンの輸送手段を用意する工程と
を含む前記方法に関する。
する方法であって、膜の第１面と第２面との間にチャン
ネルを有する、安定な二重層膜又は多重層膜であり、膜
の各側で２つの水性領域を分離する脂質二重層と、
（１）ポリヒドロキシブチレート（PHB）と（２）ポリ
ホスフェートとの実質的に純粋な混合物（PHBとポリホ
スフェートとは膜を横切るチャンネルを形成する分子量
を有する）とを含む前記膜を形成する工程と；このチャ
ンネルを通してのカチオンの輸送手段を用意する工程と
を含む前記方法に関する。
さらにまた、本発明はカルシウムチャンネルブロッキ
ング化合物の分析方法であって、膜の第１面と第２面と
の間にチャンネルを有する、安定な二重層膜又は多重層
膜であり、膜の各側で２つの水性領域を分離する脂質二
重層と；（１）実質的に純粋なポリヒドロキシブチレー
ト（PHB）と（２）ポリホスフェートとの混合物（PHBと
ポリホスフェートとは膜を横切るチャンネルを形成する
分子量を有する）とを含む前記膜を形成する工程と；膜
の片面若しくは両面にカルシウムチャンネルブロッカー
化合物とカルシウムイオンとを供給する工程と；このチ
ャンネルを通してのカチオンの輸送手段を用意する工程
とを含み、カルシウムチャンネルブロッキング化合物が
膜を通るチャンネルをブロックする前記方法に関する。
ング化合物の分析方法であって、膜の第１面と第２面と
の間にチャンネルを有する、安定な二重層膜又は多重層
膜であり、膜の各側で２つの水性領域を分離する脂質二
重層と；（１）実質的に純粋なポリヒドロキシブチレー
ト（PHB）と（２）ポリホスフェートとの混合物（PHBと
ポリホスフェートとは膜を横切るチャンネルを形成する
分子量を有する）とを含む前記膜を形成する工程と；膜
の片面若しくは両面にカルシウムチャンネルブロッカー
化合物とカルシウムイオンとを供給する工程と；このチ
ャンネルを通してのカチオンの輸送手段を用意する工程
とを含み、カルシウムチャンネルブロッキング化合物が
膜を通るチャンネルをブロックする前記方法に関する。
最後に、本発明は膜の第１面と第２面との間にチャン
ネルを有する二重層膜又は多重層膜の形成方法であっ
て、有機溶媒中でリン脂質を無機ポリホスフェートとポ
リヒドロキシブチレート（PHB）との混合物と混合し
て、膜形成用溶液を形成する工程と;PHBと無機ポリホス
フェートとがリン脂質によって形成される二重層を通る
チャンネルを形成している、２水性相の間の膜を形成す
る工程とを含む前記方法に関する。
ネルを有する二重層膜又は多重層膜の形成方法であっ
て、有機溶媒中でリン脂質を無機ポリホスフェートとポ
リヒドロキシブチレート（PHB）との混合物と混合し
て、膜形成用溶液を形成する工程と;PHBと無機ポリホス
フェートとがリン脂質によって形成される二重層を通る
チャンネルを形成している、２水性相の間の膜を形成す
る工程とを含む前記方法に関する。
PHBを原核生物から経済的に抽出して、音波処理し、
精製して、1,000〜30,000、好ましくは11,000〜16,000
の分子量にすることができる。PHBは高等生物において
も生ずるが、抽出は一層困難である。PHBはまた、周知
のプロセスを用いる重合によって化学的に合成すること
もできる。
精製して、1,000〜30,000、好ましくは11,000〜16,000
の分子量にすることができる。PHBは高等生物において
も生ずるが、抽出は一層困難である。PHBはまた、周知
のプロセスを用いる重合によって化学的に合成すること
もできる。
例えば、ストロンチウム、バリウム、マンガン、マグ
ネシウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウ
ム又はセシウムのような、カルシウム以外のポリリン酸
塩も使用可能である。このような金属は周期律表の第I
A続と第II A族に含まれる。
ネシウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウ
ム又はセシウムのような、カルシウム以外のポリリン酸
塩も使用可能である。このような金属は周期律表の第I
A続と第II A族に含まれる。
リン脂質は好ましくは、 （１） １−パルミトイル−２−オレオイルホスファチ
ジルコリン（Avanti Polar Lipids,アラバマ州，バー
ミンガム）；及び （２） 主として16:0、16:1、18:1の混合脂肪アシル鎖
を有する、主としてホスファチジルエタノールアミンと
ホスファチジルグリセロール（4:1混合物）である大腸
菌リン脂質（Avanti Polar Lipids）である。他の多
くの合成及び天然リン脂質が使用可能であり、例えばト
リグリセリド、コレステロール等のような、他の脂質を
加えることができる。これらはPhospholipid Handbook
（Marcel Dekker社，ニューヨーク）１−22及び603〜6
37（1993）に記載されている。
ジルコリン（Avanti Polar Lipids,アラバマ州，バー
ミンガム）；及び （２） 主として16:0、16:1、18:1の混合脂肪アシル鎖
を有する、主としてホスファチジルエタノールアミンと
ホスファチジルグリセロール（4:1混合物）である大腸
菌リン脂質（Avanti Polar Lipids）である。他の多
くの合成及び天然リン脂質が使用可能であり、例えばト
リグリセリド、コレステロール等のような、他の脂質を
加えることができる。これらはPhospholipid Handbook
（Marcel Dekker社，ニューヨーク）１−22及び603〜6
37（1993）に記載されている。
PHBを分解しない任意の手段によって、PHBとポリホス
フェートとの混合物を乾燥させることができる。例え
ば、真空炉を用いることができる。マイクロ波炉を用い
ることもできる。PHBとpolyPiとを乳鉢と乳棒とによっ
て混合し、PHBの融点（約175℃）まで加熱して、徐々に
冷却することができる。PHB対CaPolyPiの好ましい比は
約1:1から10:1までの範囲内であり、最も好ましくは、
約１％のリン脂質中で2:1（PHB:CaPolyPi）である。リ
ン脂質対混合物の比は約1000:1から100,000:1までの範
囲内である。
フェートとの混合物を乾燥させることができる。例え
ば、真空炉を用いることができる。マイクロ波炉を用い
ることもできる。PHBとpolyPiとを乳鉢と乳棒とによっ
て混合し、PHBの融点（約175℃）まで加熱して、徐々に
冷却することができる。PHB対CaPolyPiの好ましい比は
約1:1から10:1までの範囲内であり、最も好ましくは、
約１％のリン脂質中で2:1（PHB:CaPolyPi）である。リ
ン脂質対混合物の比は約1000:1から100,000:1までの範
囲内である。
リン脂質、ポリホスフェート及びPHBが溶解すること
ができる任意の溶媒中で、膜を形成することができる。
クロロホルム及びジクロロメタンが上首尾に用いられて
いる。音波処理以外の混合方法を用いることができる。
音波処理が好ましい。
ができる任意の溶媒中で、膜を形成することができる。
クロロホルム及びジクロロメタンが上首尾に用いられて
いる。音波処理以外の混合方法を用いることができる。
音波処理が好ましい。
クロロホルム中のPHBの溶液を乾燥した微粉砕Ca（PP
i）に加え、クロロホルムを蒸発させ、混合物を乾燥す
るまで（４分間）マイクロ波処理することが好ましい。
クロロホルム（乾燥）を加え、混合物を音波処理する。
クロロホルム溶液をデカン中のリン脂質に加え、クロロ
ホルムを蒸発させて、二重層を形成する。リポソームを
形成する場合には、クロロホルム溶液にリン脂質を加え
る。クロロホルムを蒸発させ、水性塩緩衝液を乾燥フィ
ルムに加えて、混合物を音波処理する。
i）に加え、クロロホルムを蒸発させ、混合物を乾燥す
るまで（４分間）マイクロ波処理することが好ましい。
クロロホルム（乾燥）を加え、混合物を音波処理する。
クロロホルム溶液をデカン中のリン脂質に加え、クロロ
ホルムを蒸発させて、二重層を形成する。リポソームを
形成する場合には、クロロホルム溶液にリン脂質を加え
る。クロロホルムを蒸発させ、水性塩緩衝液を乾燥フィ
ルムに加えて、混合物を音波処理する。
膜のための浸漬（bathing）水溶液は対称的（膜の両
側で同じ溶液）でも非対称的（asymmetric）でもよい。
緩衝液を用いて、pHを好ましくは約５から９までの範囲
に維持する。溶液は好ましくは高いイオン強度を有し、
或る量のマグネシウム塩を含む。
側で同じ溶液）でも非対称的（asymmetric）でもよい。
緩衝液を用いて、pHを好ましくは約５から９までの範囲
に維持する。溶液は好ましくは高いイオン強度を有し、
或る量のマグネシウム塩を含む。
本発明はカルシウム又はその他の金属のブロッキング
化合物を分析するために有用である。無機ブロッカー
（blocker）化合物は、例えば、ランタン、アルミニウ
ム、ニッケル、カドミウム、コバルト及びマンガンであ
る。有機Ca2+ブロッカーは、例えば、ニフェジピン、ベ
ラパミル及びジルチアゼムである。
化合物を分析するために有用である。無機ブロッカー
（blocker）化合物は、例えば、ランタン、アルミニウ
ム、ニッケル、カドミウム、コバルト及びマンガンであ
る。有機Ca2+ブロッカーは、例えば、ニフェジピン、ベ
ラパミル及びジルチアゼムである。
輸送手段はイオン濃度又は電圧の差でよい。電圧クラ
ンプによる実験において、本発明の膜は、プレート（pl
ate）を通るアパーチャー（aperture）の中で支持され
ていてもよく、アパーチャーの横断面積は、50〜1000μ
m2、好ましくは50〜500μm2、さらに好ましくは50〜300
μm2である。二重層膜は約40〜120Åの厚さを有する。
ンプによる実験において、本発明の膜は、プレート（pl
ate）を通るアパーチャー（aperture）の中で支持され
ていてもよく、アパーチャーの横断面積は、50〜1000μ
m2、好ましくは50〜500μm2、さらに好ましくは50〜300
μm2である。二重層膜は約40〜120Åの厚さを有する。
通常、二重層膜が形成される。多重層膜も形成されう
ることは理解されるであろう。
ることは理解されるであろう。
下記は本発明の非限定的な実施例である。
実施例１ この実施例は大腸菌からのPHB（平均分子量約11,000
〜13,000）の抽出及び精製と、チャンネルを有する、PH
Bとポリリン酸カルシウムとの二重層膜複合体の形成と
を示す。
〜13,000）の抽出及び精製と、チャンネルを有する、PH
Bとポリリン酸カルシウムとの二重層膜複合体の形成と
を示す。
大腸菌の細胞を、Hanahanの方法［Hanahan,D.,J.Mol.
Biol.166,557〜580（1983）］及びReuschの方法［Reusc
h等,Proc.Natl.Acad.Sci.85,4176〜4180（1988）］によ
ってコンピテント細胞にした。PHBを大腸菌から熱クロ
ロホルム（約50℃から還流するまで）を用いて抽出し、
冷却し、次に濾過して、不溶物を除去した。PHBを５倍
量のメタノールによって沈殿させた。このPHBを10mM T
ris緩衝液（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタ
ン））、EDTA（pH8.0）中に懸濁させ、37℃のプロテイ
ナーゼＫ（200μg/ml）によって２時間処理して、タン
パク質を除去した。次に、PHBを遠心分離によって回収
し、蒸留水（3x）、メタノール（2x）及びアセトン（2
x）によって連続的に洗浄した。PHBをクロロホルムに溶
解し、５倍量のメタノールによって沈殿させた（2x）。
精製PHBは約11,000〜13,000の平均分子量を有した。
Biol.166,557〜580（1983）］及びReuschの方法［Reusc
h等,Proc.Natl.Acad.Sci.85,4176〜4180（1988）］によ
ってコンピテント細胞にした。PHBを大腸菌から熱クロ
ロホルム（約50℃から還流するまで）を用いて抽出し、
冷却し、次に濾過して、不溶物を除去した。PHBを５倍
量のメタノールによって沈殿させた。このPHBを10mM T
ris緩衝液（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタ
ン））、EDTA（pH8.0）中に懸濁させ、37℃のプロテイ
ナーゼＫ（200μg/ml）によって２時間処理して、タン
パク質を除去した。次に、PHBを遠心分離によって回収
し、蒸留水（3x）、メタノール（2x）及びアセトン（2
x）によって連続的に洗浄した。PHBをクロロホルムに溶
解し、５倍量のメタノールによって沈殿させた（2x）。
精製PHBは約11,000〜13,000の平均分子量を有した。
リン酸ナトリウムガラス45（Sigma Chemical,ミズリ
ー州，セントルイス）の水溶液にリン酸ナトリウムガラ
スのリンイオンに対して過剰の1MCaCl2を加えることに
よって、ポリリン酸カルシウム（Ca（polyPi））を製造
した。沈殿物を遠心分離によって回収し、CaCl2水溶液
によって２回洗浄し、凍結乾燥によって乾燥させ、マイ
クロ波処理した。サンプルを微粉砕し、再びマイクロ波
処理した。
ー州，セントルイス）の水溶液にリン酸ナトリウムガラ
スのリンイオンに対して過剰の1MCaCl2を加えることに
よって、ポリリン酸カルシウム（Ca（polyPi））を製造
した。沈殿物を遠心分離によって回収し、CaCl2水溶液
によって２回洗浄し、凍結乾燥によって乾燥させ、マイ
クロ波処理した。サンプルを微粉砕し、再びマイクロ波
処理した。
精製PHBのクロロホルム溶液（１〜10μg/mlの範囲）
を、該PHBに対して過剰な微粉砕Ca（polyPi）の少量
（＜1mg）に加えた。乾燥窒素流によってクロロホルム
を除去し、残留混合物を完全出力のマイクロ波炉におい
て２分間ずつの２期間にわたって加熱した。乾燥クロロ
ホルムを加えて、混合物を中出力（完全出力の30％）
（30％パルス時間）において２分間、VIBRA CELL ULT
RASONICATOR（Sonics and Materials,コネチカット
州，ダンバリー）を用いて音波処理した。濾過した上清
の一部をデカン中のリン脂質（PL）としての（１−パル
ミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（POP
C））の溶液に加えた。0.025％であるPL40μｇ（40,000
ng）に対してPHB 10ngが好ましかった。0.1％〜0.001
％の％範囲が使用可能である。次に、クロロホルムを蒸
発させた。膜複合体の混合物を用いて、室温（20〜24
℃）においてpH7.3の10mM Tris（トリス（ヒドロキシ
メチルアミノメタン））HEPES（４−（２−ヒドロキシ
エチル）−１−ピペラジンスルホン酸）中の250mM CaC
l2、1mM MgCl2の対照溶液を含む浸漬水溶液を分離す
る、ナイロン（DELRIN,DuPont,デラウェア州，ウィルミ
ントン）キュベット中の250μｍアパーチャーを横切る
二重層を形成した。
を、該PHBに対して過剰な微粉砕Ca（polyPi）の少量
（＜1mg）に加えた。乾燥窒素流によってクロロホルム
を除去し、残留混合物を完全出力のマイクロ波炉におい
て２分間ずつの２期間にわたって加熱した。乾燥クロロ
ホルムを加えて、混合物を中出力（完全出力の30％）
（30％パルス時間）において２分間、VIBRA CELL ULT
RASONICATOR（Sonics and Materials,コネチカット
州，ダンバリー）を用いて音波処理した。濾過した上清
の一部をデカン中のリン脂質（PL）としての（１−パル
ミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（POP
C））の溶液に加えた。0.025％であるPL40μｇ（40,000
ng）に対してPHB 10ngが好ましかった。0.1％〜0.001
％の％範囲が使用可能である。次に、クロロホルムを蒸
発させた。膜複合体の混合物を用いて、室温（20〜24
℃）においてpH7.3の10mM Tris（トリス（ヒドロキシ
メチルアミノメタン））HEPES（４−（２−ヒドロキシ
エチル）−１−ピペラジンスルホン酸）中の250mM CaC
l2、1mM MgCl2の対照溶液を含む浸漬水溶液を分離す
る、ナイロン（DELRIN,DuPont,デラウェア州，ウィルミ
ントン）キュベット中の250μｍアパーチャーを横切る
二重層を形成した。
形成された膜を電圧クランプ方法を用いて、セル（ce
ll）中で試験した。片側（シス）に電圧を印加した。ト
ランス側はアース（ground）として用いた。印加した電
圧は60mV〜120mVであった。電圧を一定に維持し、電流
を測定した。この系は電圧を維持するために必要な電流
を測定した。結果は、電位依存性であるシングルチャン
ネル活性が存在することであった。カルシウムイオンは
セルのトランス側に移動した。セルをこのように用いて
カルシウムチャンネルブロッカーの効果を試験すること
ができる。
ll）中で試験した。片側（シス）に電圧を印加した。ト
ランス側はアース（ground）として用いた。印加した電
圧は60mV〜120mVであった。電圧を一定に維持し、電流
を測定した。この系は電圧を維持するために必要な電流
を測定した。結果は、電位依存性であるシングルチャン
ネル活性が存在することであった。カルシウムイオンは
セルのトランス側に移動した。セルをこのように用いて
カルシウムチャンネルブロッカーの効果を試験すること
ができる。
実施例２ この実施例は、大腸菌から単離し、8,000〜15,000の
平均分子量を得るようにクロマトグラフィーカラム中で
分離した後に、合成ポリリン酸カルシウムと混合した、
精製PHBからのカルシウムチャンネルの製造を示す。
平均分子量を得るようにクロマトグラフィーカラム中で
分離した後に、合成ポリリン酸カルシウムと混合した、
精製PHBからのカルシウムチャンネルの製造を示す。
大腸菌DH5αをコンピテント細胞にして、細胞ペレッ
トを実施例１に述べたように洗浄した。次に、PHBを熱
クロロホルムによって抽出した。PHBを５倍量のメタノ
ールによって沈殿させ、Tris、EDTA緩衝液（pH7.5）中
に懸濁させ、37℃においてプロテイナーゼＫ（200μg/m
l）と共に一晩インキュベートした。PHBを遠心分離によ
って回収し、蒸留水（2x）、メタノール（2x）及びアセ
トン（2x）によって連続的に洗浄した。精製したポリマ
ーをクロロホルム中に溶解し、５倍量のメタノールによ
って溶液から沈殿させた。ポリマーをクロロホルム中に
再溶解し、濾過し、次に非水性サイズ排除カラム（SHOD
EX Ｋ−803,Waters,マサチュセッツ州，ミルフォー
ド）上でクロマトグラフィーし、PHBを245nmにおけるUV
吸収によって検出した。この吸収は、ポリマーによって
生じる、分子量の関数としての屈折率の変化を検出し
た。
トを実施例１に述べたように洗浄した。次に、PHBを熱
クロロホルムによって抽出した。PHBを５倍量のメタノ
ールによって沈殿させ、Tris、EDTA緩衝液（pH7.5）中
に懸濁させ、37℃においてプロテイナーゼＫ（200μg/m
l）と共に一晩インキュベートした。PHBを遠心分離によ
って回収し、蒸留水（2x）、メタノール（2x）及びアセ
トン（2x）によって連続的に洗浄した。精製したポリマ
ーをクロロホルム中に溶解し、５倍量のメタノールによ
って溶液から沈殿させた。ポリマーをクロロホルム中に
再溶解し、濾過し、次に非水性サイズ排除カラム（SHOD
EX Ｋ−803,Waters,マサチュセッツ州，ミルフォー
ド）上でクロマトグラフィーし、PHBを245nmにおけるUV
吸収によって検出した。この吸収は、ポリマーによって
生じる、分子量の関数としての屈折率の変化を検出し
た。
ポリリン酸ナトリウムガラス（平均鎖長さ45;Sigma
Chemical,ミズリー州，セントルイス）を蒸留水に溶解
し、過剰な塩化カルシウムを加えることによって、ポリ
リン酸カルシウムを製造した。ポリリン酸カルシウム沈
殿物を遠心分離によって回収し、乾燥させ、微粉砕し
た。
Chemical,ミズリー州，セントルイス）を蒸留水に溶解
し、過剰な塩化カルシウムを加えることによって、ポリ
リン酸カルシウムを製造した。ポリリン酸カルシウム沈
殿物を遠心分離によって回収し、乾燥させ、微粉砕し
た。
実施例１におけるように、クロロホルム中のPHB（10
μg/ml）とクロロホルム中のリン脂質との溶液を過剰な
ポリリン酸カルシウム（約1mg）に加えた。窒素ガス流
によってクロロホルムを蒸発し、ポリマー混合物をマイ
クロ波炉において完全出力で加熱する（2x2分間）こと
によって乾燥させた。乾燥クロロホルムを加えて、低温
（４℃〜15℃）を維持しながら、混合物を低出力（30
％）において２分間、音波処理した。上清を濾過し、実
施例１におけるようにリン脂質に加えた。電圧クランプ
方法を用いた結果はシングルチャンネル電流であった。
μg/ml）とクロロホルム中のリン脂質との溶液を過剰な
ポリリン酸カルシウム（約1mg）に加えた。窒素ガス流
によってクロロホルムを蒸発し、ポリマー混合物をマイ
クロ波炉において完全出力で加熱する（2x2分間）こと
によって乾燥させた。乾燥クロロホルムを加えて、低温
（４℃〜15℃）を維持しながら、混合物を低出力（30
％）において２分間、音波処理した。上清を濾過し、実
施例１におけるようにリン脂質に加えた。電圧クランプ
方法を用いた結果はシングルチャンネル電流であった。
実施例３ この実施例は細菌中の封入体からの混合分子量PHBと
合成ポリリン酸カルシウムとからのカルシウムチャンネ
ル製造を示す。
合成ポリリン酸カルシウムとからのカルシウムチャンネ
ル製造を示す。
アルカリゲネス（Alcaligenes）種からのPHBはSigma
channelsから購入した。ポリマーを精製し、音波処理
し、非水性サイズ排除カラム上で実施例２に述べたよう
にクロマトグラフィーした。大腸菌PHBと同じ時間間隔
に溶出する画分を回収し、実施例２に述べたようにカル
シウムチャンネルの製造に用いた。電圧クランプセルに
おける結果は実施例２と同じであった。
channelsから購入した。ポリマーを精製し、音波処理
し、非水性サイズ排除カラム上で実施例２に述べたよう
にクロマトグラフィーした。大腸菌PHBと同じ時間間隔
に溶出する画分を回収し、実施例２に述べたようにカル
シウムチャンネルの製造に用いた。電圧クランプセルに
おける結果は実施例２と同じであった。
実施例４ Reusch等のProc.Natl.Acad.Sci.85,4176〜4180（198
8）に記載されるように、チャンネル複合体を細菌から
単離し、二重層の形成に用いた。このアプローチに関す
る問題は、PHBとポリフォスフェートの複合体からなる
という特徴を有するチャンネルを修飾する、例えばタン
パク質及びリポ多糖のような、他の生物学的物質が存在
することであった。
8）に記載されるように、チャンネル複合体を細菌から
単離し、二重層の形成に用いた。このアプローチに関す
る問題は、PHBとポリフォスフェートの複合体からなる
という特徴を有するチャンネルを修飾する、例えばタン
パク質及びリポ多糖のような、他の生物学的物質が存在
することであった。
既述されたように［Reusch等,J.Bacteriol.168,553〜
562（1986）］、本質的に、Hanahanの方法［J.Mol.Bio
l.166,557〜580（1983）］によって、大腸菌を遺伝的に
コンピテント細胞にした。膜を抽出するために、細胞を
遠心分離によって回収し、メタノール、メタノール：ア
セトン（1:1）、次にアセトンによって連続的に洗浄
し、次にクロロホルム（細胞100mlにつき約0.5mlによっ
て一晩抽出した。全ての溶剤は乾燥しており、全ての操
作は乾燥環境下で４℃において実施した。クロロホルム
溶液の一部（10μｌ〜200μｌ）を、デカン中の１−パ
ルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（PO
PC）の溶液（40mg/mlを20μｌ）に加えた。クロロホル
ムを乾燥窒素ガス流によって除去し、脂質混合物を用い
て、実施例１におけるように10mM Tris HEPES（pH7.
3）中の250mM CaCl2、1mM MgCl2の対称溶液を含む、
２つの浸漬水溶液を分離する、二重層を（DELRIN）キュ
ベット中の250μｍアパーチャーを横切って塗布した。
この二重層は評価の目的のために有効であった。電圧ク
ランプ方法を用いた結果は60mV〜100mVの電圧において
チャンネルが観察されたことであった。これらは電位−
ゲート制御され（voltage−gated）、電位依存性であっ
たが、このことはこの当時は知られていなかった。
562（1986）］、本質的に、Hanahanの方法［J.Mol.Bio
l.166,557〜580（1983）］によって、大腸菌を遺伝的に
コンピテント細胞にした。膜を抽出するために、細胞を
遠心分離によって回収し、メタノール、メタノール：ア
セトン（1:1）、次にアセトンによって連続的に洗浄
し、次にクロロホルム（細胞100mlにつき約0.5mlによっ
て一晩抽出した。全ての溶剤は乾燥しており、全ての操
作は乾燥環境下で４℃において実施した。クロロホルム
溶液の一部（10μｌ〜200μｌ）を、デカン中の１−パ
ルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（PO
PC）の溶液（40mg/mlを20μｌ）に加えた。クロロホル
ムを乾燥窒素ガス流によって除去し、脂質混合物を用い
て、実施例１におけるように10mM Tris HEPES（pH7.
3）中の250mM CaCl2、1mM MgCl2の対称溶液を含む、
２つの浸漬水溶液を分離する、二重層を（DELRIN）キュ
ベット中の250μｍアパーチャーを横切って塗布した。
この二重層は評価の目的のために有効であった。電圧ク
ランプ方法を用いた結果は60mV〜100mVの電圧において
チャンネルが観察されたことであった。これらは電位−
ゲート制御され（voltage−gated）、電位依存性であっ
たが、このことはこの当時は知られていなかった。
実施例５ この実施例は、クロマトグラフィーカラムを用いた、
大腸菌からの精製カルシウムチャンネルの製造を示す。
この精製方法を用いて、チャンネルを保存することがで
きたことは意外であった。
大腸菌からの精製カルシウムチャンネルの製造を示す。
この精製方法を用いて、チャンネルを保存することがで
きたことは意外であった。
大腸菌DH5αを本質的にReusch等（1986）によって既
述されたように、Hanahanの方法によってコンピテント
細胞にした。細胞を４℃において低速度（1500rpm）で
の遠心分離によって15分間回収した。細胞ペレットをメ
タノール（2x）、メタノール：アセトン（1:1）（2
x）、次にアセトン（2x）によって連続的に洗浄し、乾
燥させ、次にクロロホルムによって一晩抽出した。全て
の溶剤は乾燥しており、かつ低温であった。全ての操作
は乾燥環境下で低温において実施した。抽出物をTEFLON
（DuPont,デラウェア州，ウイルミントン）シリンジフ
ィルター（0.20μｍ）によって濾過して、非水性サイズ
排除カラム（Shodex Ｋ−803,（8mmx25cm）,Waters,マ
サチュセッツ州、ミルフォード）上で溶離剤としてクロ
ロホルムを用いてクロマトグラフィーした。17,000±4,
000の分子量範囲で溶出した画分が、実施例１における
ように、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチ
ジルコリン（POPC）から成る平面状脂質二重層に組み入
れたときに、シングルチャンネルのカルシウムチャンネ
ル活性を有することが判明した。この複合体を実施例１
の電圧クランプ方法によって試験した。この画分の分析
は、この画分がPHB、polyPi及びカルシウムを含むが、
タンパク質を含まないことを示した。この精製チャンネ
ル抽出物を上記脂質から成るリポソームにも組み入れ
て、チャンネルを有するリポソームを形成し、実施例１
におけるように、このリポソームを平面状脂質二重層中
に移し入れて、チャンネルを有する脂質二重層を形成し
た。電圧クランプ方法を用いた結果は、電位依存性であ
るシングルチャンネル電流であった。
述されたように、Hanahanの方法によってコンピテント
細胞にした。細胞を４℃において低速度（1500rpm）で
の遠心分離によって15分間回収した。細胞ペレットをメ
タノール（2x）、メタノール：アセトン（1:1）（2
x）、次にアセトン（2x）によって連続的に洗浄し、乾
燥させ、次にクロロホルムによって一晩抽出した。全て
の溶剤は乾燥しており、かつ低温であった。全ての操作
は乾燥環境下で低温において実施した。抽出物をTEFLON
（DuPont,デラウェア州，ウイルミントン）シリンジフ
ィルター（0.20μｍ）によって濾過して、非水性サイズ
排除カラム（Shodex Ｋ−803,（8mmx25cm）,Waters,マ
サチュセッツ州、ミルフォード）上で溶離剤としてクロ
ロホルムを用いてクロマトグラフィーした。17,000±4,
000の分子量範囲で溶出した画分が、実施例１における
ように、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチ
ジルコリン（POPC）から成る平面状脂質二重層に組み入
れたときに、シングルチャンネルのカルシウムチャンネ
ル活性を有することが判明した。この複合体を実施例１
の電圧クランプ方法によって試験した。この画分の分析
は、この画分がPHB、polyPi及びカルシウムを含むが、
タンパク質を含まないことを示した。この精製チャンネ
ル抽出物を上記脂質から成るリポソームにも組み入れ
て、チャンネルを有するリポソームを形成し、実施例１
におけるように、このリポソームを平面状脂質二重層中
に移し入れて、チャンネルを有する脂質二重層を形成し
た。電圧クランプ方法を用いた結果は、電位依存性であ
るシングルチャンネル電流であった。
実施例６ この実施例は、音波処理を用いた、精製抽出複合体の
リポソーム中への組み入れを示す。
リポソーム中への組み入れを示す。
PHB/polyPi複合体を、実施例５におけるように、大腸
菌から抽出し、精製した。クロロホルム抽出物の一部
（１〜100μｌを希釈）をクロロホルム中のリン脂質の
溶液に加えた。リン脂質は１−パルミトイル−２−オレ
オイルホスファチジルコリン（POPC）、又はウシ脳ホス
ファチジルエタノールアミン（PE）とウシ脳ホスファチ
ジルセリン（PS）との1:1混合物（Avanti Polar Lipi
ds,アラバマ州，バーミンガム）、又はPOPEとPOPG（PG
＝ホスファチジルグリセロール）との2:1混合物であっ
た。窒素流によってクロロホルムを蒸発させて、脂質混
合物の薄フィルムを形成した。緩衝液（例えば、10mM C
aCl2、45mM MgCl2、100mM KClを含む10mM KHepes、p
H6.4）を加えて、サンプルを音波処理浴（sonication b
ath）に４℃において30分間入れ、不活性雰囲気（窒素
又はアルゴン）中に保持した。リン脂質分散液を80,000
gにおいて30分間、４℃で遠心分離し、上清を1x15cm S
epharose4B（Pharmacia,ニュージャージー州，ピスカタ
ウェイ）に加えた。画分を回収し、疎水性プローブ、Ｎ
−フェニル−１−ナフチルアミンを加え、サーモトロピ
ック蛍光を観察することによって複合体の存在に関して
試験した。この複合体は約56℃において蛍光ピークを生
じる。複合体を含む画分を実施例１に述べた電圧クラン
プ平面状二重層系の浸漬水溶液（シス側）に加えたとこ
ろ、チャンネル活性が観察され、このことはリポソーム
からの複合体が二重層に組み入れられていることを実証
した。
菌から抽出し、精製した。クロロホルム抽出物の一部
（１〜100μｌを希釈）をクロロホルム中のリン脂質の
溶液に加えた。リン脂質は１−パルミトイル−２−オレ
オイルホスファチジルコリン（POPC）、又はウシ脳ホス
ファチジルエタノールアミン（PE）とウシ脳ホスファチ
ジルセリン（PS）との1:1混合物（Avanti Polar Lipi
ds,アラバマ州，バーミンガム）、又はPOPEとPOPG（PG
＝ホスファチジルグリセロール）との2:1混合物であっ
た。窒素流によってクロロホルムを蒸発させて、脂質混
合物の薄フィルムを形成した。緩衝液（例えば、10mM C
aCl2、45mM MgCl2、100mM KClを含む10mM KHepes、p
H6.4）を加えて、サンプルを音波処理浴（sonication b
ath）に４℃において30分間入れ、不活性雰囲気（窒素
又はアルゴン）中に保持した。リン脂質分散液を80,000
gにおいて30分間、４℃で遠心分離し、上清を1x15cm S
epharose4B（Pharmacia,ニュージャージー州，ピスカタ
ウェイ）に加えた。画分を回収し、疎水性プローブ、Ｎ
−フェニル−１−ナフチルアミンを加え、サーモトロピ
ック蛍光を観察することによって複合体の存在に関して
試験した。この複合体は約56℃において蛍光ピークを生
じる。複合体を含む画分を実施例１に述べた電圧クラン
プ平面状二重層系の浸漬水溶液（シス側）に加えたとこ
ろ、チャンネル活性が観察され、このことはリポソーム
からの複合体が二重層に組み入れられていることを実証
した。
リポソームを形成するには、多様な方法が使用可能で
あり、リポソームは単層状又は多層状、小さい又は大き
いのいずれにでもなりうる。これらは多様なリン脂質及
びそれらの混合物から形成することができ、例えばコレ
ステロール及びトリグセリドのような他の脂質を含むこ
ともできる。これらの技術は充分に確立されている［RR
C New Liposomes ａ Practical Approach,IRL Pr
ess,1〜104頁（1990）を参照のこと］。精製PHBとCa（p
olyPi）（又は他のpolyPi塩）とから構成される複合体
は、単に、これらの複合体のクロロホルム溶液の一部を
脂質のクロロホルム溶液に加え、溶媒を蒸発させ、残留
脂質フィルムからリポソームを形成することによって、
これらのリポソームのいずれかに組み入れることができ
る。リポソームが“溶解する”水性媒質は好ましくは、
６〜８のpHを有する高イオン強度のものであるべきであ
る。この水性媒質は好ましくは下記イオン:Ca2+,Sr2+、
Ba2+、Mn2+、Mg2+、Li+、Na+、K+、Rb+又はCs+の１種以
上の塩を含むべきである。
あり、リポソームは単層状又は多層状、小さい又は大き
いのいずれにでもなりうる。これらは多様なリン脂質及
びそれらの混合物から形成することができ、例えばコレ
ステロール及びトリグセリドのような他の脂質を含むこ
ともできる。これらの技術は充分に確立されている［RR
C New Liposomes ａ Practical Approach,IRL Pr
ess,1〜104頁（1990）を参照のこと］。精製PHBとCa（p
olyPi）（又は他のpolyPi塩）とから構成される複合体
は、単に、これらの複合体のクロロホルム溶液の一部を
脂質のクロロホルム溶液に加え、溶媒を蒸発させ、残留
脂質フィルムからリポソームを形成することによって、
これらのリポソームのいずれかに組み入れることができ
る。リポソームが“溶解する”水性媒質は好ましくは、
６〜８のpHを有する高イオン強度のものであるべきであ
る。この水性媒質は好ましくは下記イオン:Ca2+,Sr2+、
Ba2+、Mn2+、Mg2+、Li+、Na+、K+、Rb+又はCs+の１種以
上の塩を含むべきである。
実施例７ カエルの外側膜は、脂質二重層に対応する卵母細胞で
あり、これらをリポソーム中に組み入れた複合体によっ
て被覆する。チャンネルは自然に（by itself）形成さ
れる。これは種々な化学薬品を試験するための、卵母細
胞中へのチャンネルを提供する。
あり、これらをリポソーム中に組み入れた複合体によっ
て被覆する。チャンネルは自然に（by itself）形成さ
れる。これは種々な化学薬品を試験するための、卵母細
胞中へのチャンネルを提供する。
比較例８ リポソームの製造を試みて、Reusch等の方法（Proc.N
ational Acad.Science 85,4176〜4180（1988））を、
この参考文献の4178頁に記載されるように、PHBとCa p
oly（Ｐ）とを用いて繰り返した。この場合に、複合体
は不安定であった。したがって、安定な複合体によって
リポソームを形成するという問題はこの参考文献におい
ては解決されなかった。
ational Acad.Science 85,4176〜4180（1988））を、
この参考文献の4178頁に記載されるように、PHBとCa p
oly（Ｐ）とを用いて繰り返した。この場合に、複合体
は不安定であった。したがって、安定な複合体によって
リポソームを形成するという問題はこの参考文献におい
ては解決されなかった。
実施例９ 大腸菌は小さい膜PHBと同時抽出され（coextract）、
小さい膜PHBから分離することが困難である高分子量の
細胞質PHBを合成しないので、大腸菌をPHB/polyPi複合
体の供給源として用いた。実施例１に既述したようなHa
nahan方法の変形によって大腸菌DH5αをコンピテントに
し、複合体を脱脂質した乾燥細胞残渣から複合体をクロ
ロホルム中に抽出し、実施例５におけるように、クロマ
トグラフィーによって精製した。この複合体は非常に不
安定であり、水分に敏感であり、単離操作の全ての工程
を乾燥窒素雰囲気下で４℃において実施した。実施例１
におけるように、精製した抽出物をデカン中の合成１−
パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン
（Avanti Polar Lipids,アラバマ州，バーミンガム）
（20mg/ml）の溶液に加え、クロロホルムを乾燥窒素流
によって除去した。残留デカン溶液を用いて、２つの浸
漬水溶液の間の150〜250μｍアパーチャーを横切る二重
層を形成した。
小さい膜PHBから分離することが困難である高分子量の
細胞質PHBを合成しないので、大腸菌をPHB/polyPi複合
体の供給源として用いた。実施例１に既述したようなHa
nahan方法の変形によって大腸菌DH5αをコンピテントに
し、複合体を脱脂質した乾燥細胞残渣から複合体をクロ
ロホルム中に抽出し、実施例５におけるように、クロマ
トグラフィーによって精製した。この複合体は非常に不
安定であり、水分に敏感であり、単離操作の全ての工程
を乾燥窒素雰囲気下で４℃において実施した。実施例１
におけるように、精製した抽出物をデカン中の合成１−
パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン
（Avanti Polar Lipids,アラバマ州，バーミンガム）
（20mg/ml）の溶液に加え、クロロホルムを乾燥窒素流
によって除去した。残留デカン溶液を用いて、２つの浸
漬水溶液の間の150〜250μｍアパーチャーを横切る二重
層を形成した。
PHBとpolyPiとの２種類の線状ホモポリマーの複合体
は対称的であり、アニオンpolyPiが膜に対して垂直に配
向する。二重層のシス側（任意に、内側と定義される）
は可変な電位であり、トランス側（又は外側）は実際の
アースに維持した。電圧は内側マイナス外側の通常の慣
例で報告する。
は対称的であり、アニオンpolyPiが膜に対して垂直に配
向する。二重層のシス側（任意に、内側と定義される）
は可変な電位であり、トランス側（又は外側）は実際の
アースに維持した。電圧は内側マイナス外側の通常の慣
例で報告する。
10mM HEPES（pH7.5）と、CaCl2、SrCl2又はBaCl2の
いずれかの250mMとから成る対称的溶液の間のPHB/polyP
i含有二重層を横切って、＋60mVより大きい維持電位（h
olding potential）を室温において数分間維持するとき
に、段階的な電流変動が観察された。10秒間〜数分間の
不活性期間と交互に数秒間〜数分間持続する明確な（we
ll−defined）電流段階を含むバースト（burst）が15〜
60分間、継続した。４℃において乾燥状態に保持され
た、一定細胞抽出物を用いて、２週間のチャンネル活性
を生じることができたが、複合体含有抽出物を室の空気
に暴露させた場合には、活性は数分間で失われた。C
a2+、Sr2+及びBa2+によると、＋100mVにおける電流変動
は約1pAであった。Mg2+はCa2+の不存在下では浸透した
が、Ca2+はMg2+に対して強度に選択されるが、低濃度の
Mg2+はチャンネルを安定化した。Sr2+及びBa2+がCa2+に
置換しうることと、Mg2+の不浸透に対する選択性とがCa
2+チャンネルの特徴である［Tsien等,Ann.Rev.Biophys.
Biophys.Chem.16,265（1987）］。
いずれかの250mMとから成る対称的溶液の間のPHB/polyP
i含有二重層を横切って、＋60mVより大きい維持電位（h
olding potential）を室温において数分間維持するとき
に、段階的な電流変動が観察された。10秒間〜数分間の
不活性期間と交互に数秒間〜数分間持続する明確な（we
ll−defined）電流段階を含むバースト（burst）が15〜
60分間、継続した。４℃において乾燥状態に保持され
た、一定細胞抽出物を用いて、２週間のチャンネル活性
を生じることができたが、複合体含有抽出物を室の空気
に暴露させた場合には、活性は数分間で失われた。C
a2+、Sr2+及びBa2+によると、＋100mVにおける電流変動
は約1pAであった。Mg2+はCa2+の不存在下では浸透した
が、Ca2+はMg2+に対して強度に選択されるが、低濃度の
Mg2+はチャンネルを安定化した。Sr2+及びBa2+がCa2+に
置換しうることと、Mg2+の不浸透に対する選択性とがCa
2+チャンネルの特徴である［Tsien等,Ann.Rev.Biophys.
Biophys.Chem.16,265（1987）］。
対称的溶液中の浸透カチオンに関するシングルチャン
ネル電流−電圧関係は40mVから120mVまで直線的であっ
た。40mV未満では、シングルチャンネル電流はあまりに
小さくかつ短くて、測定できず、＋100mVを越える電位
では、開放チャンネルの電流ノイズがかなり増加した。
シングルチャンネルコンダクタンスはCa2+、Sr2+及びBa
2+では約10pSであった。これらのコンダクタンスは、キ
ャリヤーカチオンの濃度が100mMに低下したときに有意
に変化せず、このことはチャンネル内のキャリヤー部位
がキャリヤーカチオンに関して飽和されていること及び
相対的コンダクタンスがカチオン輸送の相対的速度を反
映することを実証する。チャンネル開放時間は電流を運
搬するカチオンの電圧と性質の両方によって影響され
た。電圧が逆電位（reversal potential）（対称的溶液
に関しては零）に近づくと、各浸透カチオンに関して開
放時間は実質的に減少した。Ca2+の不存在下では、一価
カチオンが浸透性であった。
ネル電流−電圧関係は40mVから120mVまで直線的であっ
た。40mV未満では、シングルチャンネル電流はあまりに
小さくかつ短くて、測定できず、＋100mVを越える電位
では、開放チャンネルの電流ノイズがかなり増加した。
シングルチャンネルコンダクタンスはCa2+、Sr2+及びBa
2+では約10pSであった。これらのコンダクタンスは、キ
ャリヤーカチオンの濃度が100mMに低下したときに有意
に変化せず、このことはチャンネル内のキャリヤー部位
がキャリヤーカチオンに関して飽和されていること及び
相対的コンダクタンスがカチオン輸送の相対的速度を反
映することを実証する。チャンネル開放時間は電流を運
搬するカチオンの電圧と性質の両方によって影響され
た。電圧が逆電位（reversal potential）（対称的溶液
に関しては零）に近づくと、各浸透カチオンに関して開
放時間は実質的に減少した。Ca2+の不存在下では、一価
カチオンが浸透性であった。
チャンネルは一価カチオンに比べて二価カチオンに対
して選択的であった。トランス側で250mM SrCl2溶液を
8mM SrCl2と270mM KClとの等張性溶液によって置換し
た場合に、チャンネルの選択性が判明する。−37mVの逆
電位はNernst式から算出される平衡電位と本質的に同じ
であるが、Cl-に関する逆電位は＋9mVであり、K+に関す
る逆電位は公称的に無限であった。
して選択的であった。トランス側で250mM SrCl2溶液を
8mM SrCl2と270mM KClとの等張性溶液によって置換し
た場合に、チャンネルの選択性が判明する。−37mVの逆
電位はNernst式から算出される平衡電位と本質的に同じ
であるが、Cl-に関する逆電位は＋9mVであり、K+に関す
る逆電位は公称的に無限であった。
多くの種類の細胞において、Ca2+電流は種々な遷移金
属によってブロックされるが、この理由はこれらの遷移
金属がチャンネル内の結合部位をCa2+と共に満たす（co
mplete with Ca2+）からであると推定される。ランタ
ン、コバルト及びカドミウムはチャンネル複合体におい
て不浸透であることが判明した。La3+＞Co＞Cdの効率
（effectiveness）の順序で、両方がシングルチャンネ
ル電流を濃度依存的に減少させた。
属によってブロックされるが、この理由はこれらの遷移
金属がチャンネル内の結合部位をCa2+と共に満たす（co
mplete with Ca2+）からであると推定される。ランタ
ン、コバルト及びカドミウムはチャンネル複合体におい
て不浸透であることが判明した。La3+＞Co＞Cdの効率
（effectiveness）の順序で、両方がシングルチャンネ
ル電流を濃度依存的に減少させた。
チャンネル抽出物をさらに非水性サイズ排除カラム
（Shodex K803）上でクロマトグラフィーして、溶離画
分を非対称的溶液中でシングルチャンネル電流活性に関
して試験した、シスは10mM Hepes（pH7.3）中の20mM
BaCl2、60mM RbClであり、トランスは−1009mVにおい
て5mM MgCl2、60mM RbCl、10mM Hepes（pH7.3）であ
った。チャンネル活性を有する画分は、ポリイソプレン
（Polysciences,ペンシルヴェニア州，ワーリントン）
と合成PHB（Seebach,ETH,チューリッヒ）との標準によ
って17,000±4,000と定義された分子量範囲内において
相対的にシャープなピークで溶出した。チャンネル活性
を有する画分はPHBとpolyPiとを含有したが、タンパク
質もヌクレオチドも含有しなかった。精製複合体のシン
グルチャンネルのコンダクタンスは無変化であったが、
比較的不安定であり、このことは安定化物質（stabiliz
ing substance）がクロマトグラフィーによって除去さ
れたことを示唆する。
（Shodex K803）上でクロマトグラフィーして、溶離画
分を非対称的溶液中でシングルチャンネル電流活性に関
して試験した、シスは10mM Hepes（pH7.3）中の20mM
BaCl2、60mM RbClであり、トランスは−1009mVにおい
て5mM MgCl2、60mM RbCl、10mM Hepes（pH7.3）であ
った。チャンネル活性を有する画分は、ポリイソプレン
（Polysciences,ペンシルヴェニア州，ワーリントン）
と合成PHB（Seebach,ETH,チューリッヒ）との標準によ
って17,000±4,000と定義された分子量範囲内において
相対的にシャープなピークで溶出した。チャンネル活性
を有する画分はPHBとpolyPiとを含有したが、タンパク
質もヌクレオチドも含有しなかった。精製複合体のシン
グルチャンネルのコンダクタンスは無変化であったが、
比較的不安定であり、このことは安定化物質（stabiliz
ing substance）がクロマトグラフィーによって除去さ
れたことを示唆する。
実施例10 コンピテント細胞である大腸菌DH5αから単離した精
製PHBと、実施例１におけるようにCaCl2とリン酸ナトリ
ウムガラスとから製造したCa（polyPi）とから、インビ
トロでPHB/Ca（polyPi）を製造することによって、チャ
ンネル組成物を確立した。乾燥した微粉砕Ca（polyPi）
（100μｇをクロロホルム中のPHB溶液（10μg/ml）に加
え、混合物を超音波処理した。濾過した溶液を脂質に加
え、実施例９に述べたように、二重層を形成した。この
チャンネルが大腸菌から抽出したチャンネルと同じ特徴
を有することが予想される。
製PHBと、実施例１におけるようにCaCl2とリン酸ナトリ
ウムガラスとから製造したCa（polyPi）とから、インビ
トロでPHB/Ca（polyPi）を製造することによって、チャ
ンネル組成物を確立した。乾燥した微粉砕Ca（polyPi）
（100μｇをクロロホルム中のPHB溶液（10μg/ml）に加
え、混合物を超音波処理した。濾過した溶液を脂質に加
え、実施例９に述べたように、二重層を形成した。この
チャンネルが大腸菌から抽出したチャンネルと同じ特徴
を有することが予想される。
実施例に関して、膜の浸漬水溶液は対称的（膜の両側
において同じ組成）又は非対称的（異なる組成）のいず
れでもよい。溶液はカルシウム、ストロンチウム、バリ
ウム、マンガン、マグネシウム、リチウム、ナトリウ
ム、カリウム、ルビジウム及びセシウム（周期律表第I
A族と第II A族）の塩を含むことができる。好ましく
は、マグネシウムを溶液中に供給して、チャンネルを通
過させることができる。溶液はpHを好ましくは５〜９に
維持して、膜を保持するために緩衝剤を含むことができ
る。溶液は通常、高イオン強度（高いイオン濃度）を有
する。
において同じ組成）又は非対称的（異なる組成）のいず
れでもよい。溶液はカルシウム、ストロンチウム、バリ
ウム、マンガン、マグネシウム、リチウム、ナトリウ
ム、カリウム、ルビジウム及びセシウム（周期律表第I
A族と第II A族）の塩を含むことができる。好ましく
は、マグネシウムを溶液中に供給して、チャンネルを通
過させることができる。溶液はpHを好ましくは５〜９に
維持して、膜を保持するために緩衝剤を含むことができ
る。溶液は通常、高イオン強度（高いイオン濃度）を有
する。
PHB/PolyPiチャンネル複合体は膜全体に配置されるイ
オン伝導性ポリマー電解質の単分子として見なすことが
できる［MacCallum,J.R.とVincent,C.A.,Polymer Elec
trolyte Reviews,Elsevier Applied Science,ニュー
ヨーク,23〜37頁（1987）］。PHBは塩溶媒和ポリマーに
共通した分子特徴を共有する。そのエステルカルボニル
酸素はカチオンと弱い配位結合を形成するために充分な
電子ドナー力を有し、提案された構造におけるカルボニ
ル酸素間の鎖間（interchain）及び鎖内（intrachain）
距離はポリマー鎖とカチオンとの間の多重結合を可能に
する。さらに、ポリマーは生理的条件下でそのガラス温
度（約０℃）を越えているので、ポリマー鎖の回転運動
とセグメント運動（segmental motion）の両方がカチオ
ンの部位から部位への移動を助成する。PHBのバックボ
ーン構造は、Watanabe等［Watanabe等,Macromolecules,
17,2908〜2912（1984）］によって、過塩素酸リチウム
及び塩化鉄と共にイオン伝導性複合体を形成すると報告
されているポリエステル、ポリ−β−プロピオラクトン
のバックボーン構造と同じである。この種のポリマーに
よって溶媒和される塩は一般に、高い溶媒和エネルギー
を有するカチオンと、拡散電荷（diffuse charge）を有
する大きいアニオンとから一般に構成される。Ca2+とpo
lyPiとはこれらの特徴を共有し（カルシウムの水和エネ
ルギーは−397kcal/molである）、各polyPiモノマー単
位は２個の酸素の間に分配されたその単一負電荷を共有
する。
オン伝導性ポリマー電解質の単分子として見なすことが
できる［MacCallum,J.R.とVincent,C.A.,Polymer Elec
trolyte Reviews,Elsevier Applied Science,ニュー
ヨーク,23〜37頁（1987）］。PHBは塩溶媒和ポリマーに
共通した分子特徴を共有する。そのエステルカルボニル
酸素はカチオンと弱い配位結合を形成するために充分な
電子ドナー力を有し、提案された構造におけるカルボニ
ル酸素間の鎖間（interchain）及び鎖内（intrachain）
距離はポリマー鎖とカチオンとの間の多重結合を可能に
する。さらに、ポリマーは生理的条件下でそのガラス温
度（約０℃）を越えているので、ポリマー鎖の回転運動
とセグメント運動（segmental motion）の両方がカチオ
ンの部位から部位への移動を助成する。PHBのバックボ
ーン構造は、Watanabe等［Watanabe等,Macromolecules,
17,2908〜2912（1984）］によって、過塩素酸リチウム
及び塩化鉄と共にイオン伝導性複合体を形成すると報告
されているポリエステル、ポリ−β−プロピオラクトン
のバックボーン構造と同じである。この種のポリマーに
よって溶媒和される塩は一般に、高い溶媒和エネルギー
を有するカチオンと、拡散電荷（diffuse charge）を有
する大きいアニオンとから一般に構成される。Ca2+とpo
lyPiとはこれらの特徴を共有し（カルシウムの水和エネ
ルギーは−397kcal/molである）、各polyPiモノマー単
位は２個の酸素の間に分配されたその単一負電荷を共有
する。
２種類のポリマーの個々の及び組合せた分子性質を利
用して、イオンの大きさ、結合エネルギー、水和エネル
ギー及び配位ジオメトリーによってカチオンを識別する
ことによって、選択性が得られる。polyPiの負に荷電し
たホスホリル残基はカチオンをチャンネルの口（mout
h）に引き付け、polyPi鎖のフレキシビリティと、隣接
負電荷の間の距離とが、大きい濃度の一価カチオンの存
在下での二価カチオンの封鎖（sequestration）を容易
にする［Corbridge,D.E.C.,Stud.Inorg.Chem.6:170〜17
8（1985）］。PHBはエステルカルボニル酸素の空間配置
に適合する配位ジオメトリーを有するカチオンを優先的
に溶媒和することによって、第２選択性フィルターを形
成する。PHBとpolyPiとの酸素リガンドは、共同で、最
適カチオンサイズを決定する平衡キャビティ（equilibr
ium cavity）を画定する。
用して、イオンの大きさ、結合エネルギー、水和エネル
ギー及び配位ジオメトリーによってカチオンを識別する
ことによって、選択性が得られる。polyPiの負に荷電し
たホスホリル残基はカチオンをチャンネルの口（mout
h）に引き付け、polyPi鎖のフレキシビリティと、隣接
負電荷の間の距離とが、大きい濃度の一価カチオンの存
在下での二価カチオンの封鎖（sequestration）を容易
にする［Corbridge,D.E.C.,Stud.Inorg.Chem.6:170〜17
8（1985）］。PHBはエステルカルボニル酸素の空間配置
に適合する配位ジオメトリーを有するカチオンを優先的
に溶媒和することによって、第２選択性フィルターを形
成する。PHBとpolyPiとの酸素リガンドは、共同で、最
適カチオンサイズを決定する平衡キャビティ（equilibr
ium cavity）を画定する。
上記イオン浸透メカニズムはチャンネルの選択性順序
及びシングルチャンネルコンダクタンスと矛盾しない。
リガンドジオメトリーがCa2+に最適であると推定される
ならば、同じ配位ジオメトリーを有するSr2+とBa2+も浸
透性であるが；カチオン直径が有意に増加すると平衡キ
ャビティが歪められ、結合が弱くなると、我々は予想す
る。このことは実験的選択性順序Ca2+＝Sr2+＞Ba2+及び
コンダクタンス順序Ba2+＞Sr2+＝Ca2+と適合する。Mg2+
の小さいサイズ、異なる配位ジオメトリー及び遅い水置
換速度（slow rate of water exchange）のために、Mg
2+の排除が予想される［“Metal Ions in Biologica
l Systems",Sigel,H.とSigel,A.編集,26:1〜13（199
0）におけるMartin,R.B.,Bioinorganic chemistry of
Magnesium.］。チャンネル面においてpolyPiに緊密に
結合するが、La3+のようにサイズによって又はCd2+若し
くはCo2+のように配位ジオメトリーによって侵入（ente
ring）を阻害されるイオンは、浸透性カチオンの侵入を
ブロックする。Mn2+のような浸透性ブロッカーはCa2+よ
りも緊密に結合して、チャンネルを通ってより緩慢に移
動して、Ca2+電流を抑制する。
及びシングルチャンネルコンダクタンスと矛盾しない。
リガンドジオメトリーがCa2+に最適であると推定される
ならば、同じ配位ジオメトリーを有するSr2+とBa2+も浸
透性であるが；カチオン直径が有意に増加すると平衡キ
ャビティが歪められ、結合が弱くなると、我々は予想す
る。このことは実験的選択性順序Ca2+＝Sr2+＞Ba2+及び
コンダクタンス順序Ba2+＞Sr2+＝Ca2+と適合する。Mg2+
の小さいサイズ、異なる配位ジオメトリー及び遅い水置
換速度（slow rate of water exchange）のために、Mg
2+の排除が予想される［“Metal Ions in Biologica
l Systems",Sigel,H.とSigel,A.編集,26:1〜13（199
0）におけるMartin,R.B.,Bioinorganic chemistry of
Magnesium.］。チャンネル面においてpolyPiに緊密に
結合するが、La3+のようにサイズによって又はCd2+若し
くはCo2+のように配位ジオメトリーによって侵入（ente
ring）を阻害されるイオンは、浸透性カチオンの侵入を
ブロックする。Mn2+のような浸透性ブロッカーはCa2+よ
りも緊密に結合して、チャンネルを通ってより緩慢に移
動して、Ca2+電流を抑制する。
この複合体は、その組成と構造との単純さにも拘わら
ず、真核Ca2+チャンネルの特徴の多くを有するので、こ
れらの精巧な系におけるイオン輸送の基礎をなす構造特
徴と分子メカニズムとを解明するためのモデルとして役
立つ。
ず、真核Ca2+チャンネルの特徴の多くを有するので、こ
れらの精巧な系におけるイオン輸送の基礎をなす構造特
徴と分子メカニズムとを解明するためのモデルとして役
立つ。
実施例11 この実施例は、大腸菌から単離され、リン脂質二重層
に組み入れられた精製PHBと、この二重層を囲む水溶液
に加えられた合成ポリリン酸カルシウムとから製造され
たカルシウムチャンネルを示す。
に組み入れられた精製PHBと、この二重層を囲む水溶液
に加えられた合成ポリリン酸カルシウムとから製造され
たカルシウムチャンネルを示す。
大腸菌DH5αをコンピテント細胞にして、細胞ペレッ
トを洗浄し、実施例２におけるようにプロテイナーゼＫ
によって処理した。クロロホルム中のPHBをデカン中の
１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリ
ンに加えた（脂質40μｇに対してPHB 10ng）。クロロ
ホルムを蒸発させ、10mM Tris HEPES（pH7.4）中の10
0mM CaCl2、1mM MgCl2の２浸漬水溶液の間に、PHB脂
質溶液によって二重層を形成した。実施例１に述べたよ
うに、ポリリン酸カルシウムを製造し、浸漬水溶液に加
えた。内側に60mVの電圧を印加した。結果は、電位依存
性であるシングルチャンネル活性であった。水溶液中の
この濃度でのPHB単独はこれらの条件下でチャンネルを
有さない。CaCl2と共に溶液に電圧を印加した後に、チ
ャンネルが形成される。
トを洗浄し、実施例２におけるようにプロテイナーゼＫ
によって処理した。クロロホルム中のPHBをデカン中の
１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリ
ンに加えた（脂質40μｇに対してPHB 10ng）。クロロ
ホルムを蒸発させ、10mM Tris HEPES（pH7.4）中の10
0mM CaCl2、1mM MgCl2の２浸漬水溶液の間に、PHB脂
質溶液によって二重層を形成した。実施例１に述べたよ
うに、ポリリン酸カルシウムを製造し、浸漬水溶液に加
えた。内側に60mVの電圧を印加した。結果は、電位依存
性であるシングルチャンネル活性であった。水溶液中の
この濃度でのPHB単独はこれらの条件下でチャンネルを
有さない。CaCl2と共に溶液に電圧を印加した後に、チ
ャンネルが形成される。
上記記載が本発明の例示に過ぎないこと、及び本発明
が以下の請求の範囲によってのみ限定されることが意図
される。
が以下の請求の範囲によってのみ限定されることが意図
される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) B01D 61/00 B01D 69/02 B01D 69/00 500 A61K 9/127 A01N 25/28
Claims (13)
- 【請求項１】膜の第１面と第２面との間にチャンネルを
有する、安定な二重層膜又は多重層膜であって、 （ａ）膜の各側で２つの水性領域を分離する脂質二重層
膜；と （ｂ）（１）ポリヒドロキシブチレート（PHB）と
（２）ポリホスフェートとの実質的に純粋な混合物であ
って、PHBとポリホスフェートとが膜を横切るチャンネ
ルを形成する分子量を有し、膜は、同じ溶液が２つの水
性領域に存在する時に、Ca2+、Sr2+及びBa2+について40
mVと120mVとの間でシングルチャンネル電流−電圧関係
比を発揮する、PHBとポリホスフェートとの混合物；と
を 含む膜。 - 【請求項２】二重層膜が、リン脂質である１−パルミト
イル−２−オレオイルホスファチジルコリンである、請
求項１記載の膜。 - 【請求項３】PHBが約1000〜30,000の分子量を有する、
請求項１記載の膜。 - 【請求項４】約50〜1000μm2の横断面積を有する、プレ
ートを通るアパーチャーの中で支持され、二重層膜が約
40〜120Åの厚さを有する、請求項１記載の膜。 - 【請求項５】請求項１記載の膜を用いて、チャンネルを
通るカチオンの輸送手段によって、チャンネルを通して
カチオンを輸送する方法。 - 【請求項６】脂質二重層膜が、リン脂質である１−パル
ミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリンによっ
て形成される、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】約50〜1000μm2の横断面積を有する、プレ
ートを通るアパーチャーの中で支持され、二重層膜が約
40〜120Åの厚さを有する、請求項５記載の方法。 - 【請求項８】請求項１記載の膜を用いた、カルシウムチ
ャンネルブロッキング化合物の分析方法であって、該膜
の片側又は両側にカルシウムチャンネルブロッキング化
合物とカルシウムイオンとを供給し、チャンネルを通る
カルシウムイオンの輸送手段を用いて、カルシウムチャ
ンネルブロッキング化合物が膜を通るチャンネルをブロ
ックすることを分析する方法。 - 【請求項９】脂質二重層膜が、リン脂質である１−パル
ミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリンによっ
て形成される、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】約50〜1000μm2の横断面積を有する、プ
レートを通るアパーチャーの中で支持され、二重層膜が
約40〜120Åの厚さを有する、請求項８記載の方法。 - 【請求項１１】膜の第１面と第２面との間にチャンネル
を有する二重層膜又は多重層膜の形成方法であって、 （ａ）リン脂質を、無機ポリホスフェートとポリヒドロ
キシブチレート（PHB）との混合物であって無機ポリホ
スフェートとPHBとがリン脂質を横切るチャンネルを形
成する分子量を有する混合物と、有機溶媒中で混合し
て、膜形成用溶液を生成する工程；と （ｂ）無機ポリホスフェートとPHBとがリン脂質を横切
るチャンネルを形成している、水性領域に分離する膜で
あって二水性相の間の膜のそれぞれ側における一つの膜
を形成する工程であって、膜は、同じ溶液が２つの水性
領域に存在する時に、Ca2+、Sr2+及びBa2+について40mV
と120mVとの間でシングルチャンネル電流−電圧関係比
を発揮する、膜である、工程；とを 含む方法。 - 【請求項１２】リン脂質が、１−パルミトイル−２−オ
レオイルホスファチジルコリンである、請求項11記載の
方法。 - 【請求項１３】約50〜1000μm2の横断面積を有する、プ
レートを通るアパーチャーの中で支持され、二重層膜が
約40〜120Åの厚さを有する、請求項11記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/317,204 US5585249A (en) | 1994-10-03 | 1994-10-03 | Polyhydroxybutyrate and polyphosphate membranes with channels |
| US317,204 | 1994-10-03 | ||
| PCT/US1995/012256 WO1996010454A1 (en) | 1994-10-03 | 1995-09-26 | Polyhydroxybutyrate and polyphosphate membranes with channels |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09507166A JPH09507166A (ja) | 1997-07-22 |
| JP3021663B2 true JP3021663B2 (ja) | 2000-03-15 |
Family
ID=23232586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8511952A Expired - Fee Related JP3021663B2 (ja) | 1994-10-03 | 1995-09-26 | チャンネル付きポリヒドロキシブチレート及びポリホスフェート膜 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5585249A (ja) |
| EP (1) | EP0731727B1 (ja) |
| JP (1) | JP3021663B2 (ja) |
| AT (1) | ATE384262T1 (ja) |
| AU (1) | AU683203B2 (ja) |
| CA (1) | CA2176361C (ja) |
| DE (1) | DE69535689T2 (ja) |
| WO (1) | WO1996010454A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5585249A (en) * | 1994-10-03 | 1996-12-17 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Polyhydroxybutyrate and polyphosphate membranes with channels |
| JP3369421B2 (ja) * | 1996-12-18 | 2003-01-20 | 理化学研究所 | ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）からなるフィルム |
| DE19755966B4 (de) * | 1997-12-16 | 2004-08-05 | Urs J. Dr. Hänggi | Verwendung von Formulierungen von wasserfesten, biologisch abbaubaren Polymeren aus nachwachsenden Rohstoffen mit erhöhter Bindungsaffinität zur Herstellung von Trägern für Analysensysteme und Testsysteme aus diesen Formulierungen |
| GB9812783D0 (en) | 1998-06-12 | 1998-08-12 | Cenes Ltd | High throuoghput screen |
| DE102008043751B4 (de) * | 2008-11-14 | 2013-09-26 | Leibniz-Institut Für Festkörper- Und Werkstoffforschung Dresden E.V. | Verfahren zur Herstellung von großen Vesikeln aus selbstorganisierenden, membranbildenden Molekülen |
| EP2338536B1 (de) | 2009-12-21 | 2015-08-05 | Biotronik VI Patent AG | Biokorrodierbare Implantate mit funktionalisierter Beschichtung |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4336334A (en) * | 1979-02-21 | 1982-06-22 | Imperial Chemical Industries Limited | Microbiological process for the production of poly(β-hydroxybutyric acid) |
| US4661442A (en) * | 1984-06-20 | 1987-04-28 | Irt Corporation | Producing lipid-protein membranes for chemical detection |
| US4784737A (en) * | 1986-04-18 | 1988-11-15 | The United States Department Of Energy | Electromicroinjection of particles into living cells |
| US4750100A (en) * | 1986-06-06 | 1988-06-07 | Bio-Rad Laboratories | Transfection high voltage controller |
| US4891324A (en) * | 1987-01-07 | 1990-01-02 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Particle with luminescer for assays |
| US5328847A (en) * | 1990-02-20 | 1994-07-12 | Case George D | Thin membrane sensor with biochemical switch |
| US5670113A (en) * | 1991-12-20 | 1997-09-23 | Sibia Neurosciences, Inc. | Automated analysis equipment and assay method for detecting cell surface protein and/or cytoplasmic receptor function using same |
| US5260002A (en) * | 1991-12-23 | 1993-11-09 | Vanderbilt University | Method and apparatus for producing uniform polymeric spheres |
| JP3099049B2 (ja) * | 1992-07-29 | 2000-10-16 | 農林水産省果樹試験場長 | 電気的細胞融合及び電気的核酸導入のための大量処理用電極 |
| US5585249A (en) * | 1994-10-03 | 1996-12-17 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Polyhydroxybutyrate and polyphosphate membranes with channels |
| US5512295A (en) * | 1994-11-10 | 1996-04-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery |
-
1994
- 1994-10-03 US US08/317,204 patent/US5585249A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-09-26 CA CA002176361A patent/CA2176361C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-26 AU AU37253/95A patent/AU683203B2/en not_active Ceased
- 1995-09-26 AT AT95935114T patent/ATE384262T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-09-26 JP JP8511952A patent/JP3021663B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-26 WO PCT/US1995/012256 patent/WO1996010454A1/en active IP Right Grant
- 1995-09-26 DE DE69535689T patent/DE69535689T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-26 EP EP95935114A patent/EP0731727B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-13 US US08/614,690 patent/US5650330A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-13 US US08/615,713 patent/US6602398B1/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１９８８）ｐ．４１７６−４１８０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1996010454A1 (en) | 1996-04-11 |
| US6602398B1 (en) | 2003-08-05 |
| US5585249A (en) | 1996-12-17 |
| AU3725395A (en) | 1996-04-26 |
| DE69535689T2 (de) | 2009-01-08 |
| US5650330A (en) | 1997-07-22 |
| EP0731727A1 (en) | 1996-09-18 |
| DE69535689D1 (de) | 2008-03-06 |
| CA2176361A1 (en) | 1996-04-11 |
| EP0731727A4 (en) | 2005-10-12 |
| JPH09507166A (ja) | 1997-07-22 |
| AU683203B2 (en) | 1997-10-30 |
| ATE384262T1 (de) | 2008-02-15 |
| EP0731727B1 (en) | 2008-01-16 |
| CA2176361C (en) | 2001-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rostovtseva et al. | VDAC channels mediate and gate the flow of ATP: implications for the regulation of mitochondrial function | |
| Brandolin et al. | Kinetic, binding and ultrastructural properties of the beef heart adenine nucleotide carrier protein after incorporation into phospholipid vesicles | |
| US20220401558A1 (en) | Nanotube trans-membrane channels mimicking biological porins | |
| Eisenberg et al. | Adsorption of monovalent cations to bilayer membranes containing negative phospholipids | |
| Lehtonen et al. | Poly (ethylene glycol)-induced and temperature-dependent phase separation in fluid binary phospholipid membranes | |
| Batenburg et al. | Melittin induces HII phase formation in cardiolipin model membranes | |
| Imai et al. | Effect of polymyxin B on liposomal membranes derived from Escherichia coli lipids | |
| Düzgüneş et al. | [1] Fusion assays monitoring intermixing of aqueous contents | |
| Benz et al. | Outer‐membrane protein PhoE from Escherichia coli forms anion‐selective pores in lipid‐bilayer membranes | |
| Kimelberg et al. | Interactions of cytochrome c with phospholipid membranes: Binding of cytochrome c to phospholipid liquid crystals | |
| JP3021663B2 (ja) | チャンネル付きポリヒドロキシブチレート及びポリホスフェート膜 | |
| Peterson et al. | Voltage-dependent, monomeric channel activity of colicin E1 in artificial membrane vesicles | |
| Montal | Lipid-polypeptide interactions in bilayer lipid membranes | |
| Hautala et al. | Anionic liposomes in capillary electrophoresis: Effect of calcium on 1-palmitoyl-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine/phosphatidylserine-coating in silica capillaries | |
| Komatsu et al. | Ethanol-enhanced permeation of phosphatidylcholine/phosphatidylethanolamine mixed liposomal membranes due to ethanol-induced lateral phase separation | |
| Lentz et al. | Phase behavior of mixed phosphatidylglycerol/phosphatidylcholine multilamellar and unilamellar vesicles | |
| Renkes et al. | Fatty Acid‐Oligo (ethylene glycol) Ester Forms Ion Channels in Lipid Membranes | |
| JP2017083210A (ja) | 気体状の被検試料中に含まれる標的物質の検出方法及び装置 | |
| Yamasaki et al. | Adsorption behavior of lanthanide ions on nonbiological phospholipid membranes: a model study using liposome | |
| Tantawi et al. | Electrophysiology of Phosphatidylserine Bilayer Membranes Using Electrochemical Impedance Spectroscopy | |
| Suwalsky et al. | The anticancer drug cytarabine does not interact with the human erythrocyte membrane | |
| Zawada | Vesicles with a double bilayer | |
| Kang et al. | Multiplexed Molecular Counters using a High-Voltage Transmembrane Pore Platform | |
| Bafna et al. | Effect of Electroosmosis on Antibiotic Translocation through Outer Membrane Porin Ompf | |
| Yu et al. | Stable Hybrid Polymer-Lipid Membrane for High Voltage Biological Nanopore Experiments |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |