DE69920222T2

DE69920222T2 - Kalziumphosphatbeschichtete vesikel

Info

Publication number: DE69920222T2
Application number: DE69920222T
Authority: DE
Inventors: Jan Tadeusz Parks Road CZERNUSZKA; David Bryan Christchurch HADDOW
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 1998-06-26
Filing date: 1999-06-25
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2019-06-26
Also published as: DE69920222D1; WO2000000177A1; EP1089711B1; JP2002519316A; GB9813906D0; EP1089711A1; ES2229716T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Beschichtungsmaterialien, die Calciumphosphat umfassen, Verfahren für ihre Herstellung als auch ihre Verwendung in Beschichtungen. Die Erfindung betrifft insbesondere Bläschen oder hydrophobe Tröpfchen, die eine Außenschicht umfassen, welche Calciumphosphat enthält, deren Herstellung und Verwendung beispielsweise in der Beschichtung von Implantaten und der Arzneimitteldarreichung.
Von porösen monolithischen Keramiken auf der Basis von Hydroxyapatit (HA) wurde gezeigt, dass sie bei der Osteokonduktion von Knochen bei Implantierung in einen Knochendefekt hilfreich sind. Allerdings sind sie zu brüchig, um bei strukturellen Anwendungen einsetzbar zu sein.
Eine Art und Weise, dieses Problem zu überwinden, besteht in der Beschichtung eines metallischen Implantats mit HA. Das HA liefert das Knochenbindungsvermögen, wohingegen das Metall die strukturelle Unterstützung bietet. Ungünstigerweise erfordern viele herkömmliche Methoden zur Herstellung von Beschichtungen erhöhte Temperaturen, die zu unerwünschten Wirkungen wie einem Abbau des HA zu verschiedenen Calciumphosphat-Phasen in Abhängigkeit von der Stöchiometrie der Ausgangspulver und der Abkühlrate bei der Beschichtungserzeugung führen [R. LeGEROS, Clinical Materials, 14 (1993) 65]. Implantatmaterialien können mit Hydroxyapatit plasmabesprüht werden, bevor sie der biologischen Umgebung ausgesetzt werden. Allerdings hat sich bei der Verwendung plasmabesprühter Beschichtungen [K. de GROOT, J. Biomed. Mat. Res. 21 (1987) 1375] gezeigt, dass die hohen Verarbeitungstemperaturen für die Nachteile verantwortlich sind, die sich mit diesen Beschichtungen ergeben haben. Zu den Nachteilen zählen beispielsweise variable Zusammensetzungen, das Fehlen einer Kontrolle über die Mikrostruktur und das Abbröckeln und Delaminieren der Beschichtung vom Substrat. Letzere beide Wirkungen entstehen auch aufgrund der relativen Dicke der Beschichtung, was zu schlechten mechanischen Eigenschaften im Dickenquerschnitt der Beschichtung führt. Außerdem bieten plasmabesprühte Beschichtungen nichts von der Porosität, die zur Ermöglichung des Einwachsens des Knochens erforderlich ist. Außerdem machen sie kostspielige Verarbeitungsgeräte erforderlich. Um einen breiteren Bereich von Substraten als die herkömmlicherweise verwendeten Metallen einzusetzen, wäre die Anwendbarkeit einer Beschichtungsmethode wünschenswert, die keine erhöhten Verarbeitungstemperaturen erfordert. Dies würde die Verwendung von Mate rialien zulassen, die traditionellerweise als biologisch träge erachtet wurden, die aber über die erforderliche Festigkeit und Zähigkeit verfügen, um als Implantatmaterialien zu dienen. Es existieren mehrere solcher Methoden, wobei dazu ein biomimetischer Prozess zählt [T. KOKUBO, in "Bone-Binding Biomaterials" (Reed Healthcare Communications, Niederlande, 1992) 102] und die elektrophoretische Ablagerug [M. SHIRKANZADEH, M. AZADEGAN, V. STACK und S. SCHREYER, Materials Letters, 18 (1994) 211]. Diese Methoden sind allerdings Substrat-spezifisch, wobei im Falle des biomimetischen Prozesses der zur Züchtung des Apatits erforderliche Zeitraum beträchtlich ist.
Es ist außerdem von Vorteil, einen gewissen Grad an Porosität in die Beschichtungen einzubauen, um das Einwachsen von Knochen im Falle eines Implantats zu ermöglichen. Um dieses Einwachsen zu erreichen, muss die Porosität in einem Umfang vorliegen, der mit der Knochenregeneration kompatibel ist.
Die vorliegende Erfindung stellt Beschichtungsmaterialien bereit, die Calciumphosphat umfassen und mit denen die oben erörterten Probleme überwunden werden können. Sie können zur Beschichtung von Substraten bei niedrigen Temperaturen eingesetzt werden und bieten dabei einen hohen Grad an Kontrolle sowohl über die Beschichtungsdicke als auch den Porositätsgrad. Eine solche Niedertemperatur-Methode ermöglicht auch die Aufnahme weiterer Verbindungen in die Beschichtung, die sich bei hohen Temperaturen abbauen würden, wie z.B. wärmeempfindliche pharmazeutisch wirksame Verbindungen.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Bläschen bereit, welches umfasst:

a) eine Innenschicht, welche ein Phospholipid umfasst, und
b) eine Außenschicht, welche Calciumphosphat umfasst.

Das in der Innenschicht vorhandene Phospholipid ist ein beliebiges Phospholipid, das zum Bilden von Bläschen in einem wässrigen Gemisch, oder einem Gemisch solcher Phospholipide, fähig ist. Vorzugsweise ist das Phospholipid L-α-Phosphatidylserin. Bevorzugter ist das Phospholipid L-α-Phosphatidylcholin.
Die Außenschicht kann außerdem weitere Ionen umfassen, die zum Modifizieren der Eigenschaften des Calciumphosphats aufgenommen werden können, einschließlich Anionen wie Carbonat, Hydrogencarbonat, Hydrogenphosphat, Chlorid und Fluorid, und Kationen wie Magnesium.
Die Bläschen der vorliegenden Erfindung können pharmazeutisch wirksame Verbindungen enthalten, einschließlich Verbindungen, die das Binden der Beschichtung an existierenden Knochen unterstützen (Knochenwachstumsfaktoren), eine spezifische Knochenerkrankung oder eine an den Knochen angrenzende erkrankte Region behandeln oder Schmerz lindern. Insbesondere können die Bläschen der vorliegenden Erfindung Verbindungen zur Behandlung von Tumoren enthalten, wie z.B. ³²P- oder ⁸⁹Sr-enthaltende Verbindungen, Verbindun gen zur Linderung von durch Tumore verursachten Schmerzen, wie etwa narkotische Analgetika (die gemäß der Erfindung in geringeren Dosen verabreichbar sind, da sie an den Sitz des Tumors verabreicht werden können), Verbindungen zur Verminderung der Osteoklasten-Aktivität, wie durch Turmozellen verursacht, wie etwa Indomethacin, Prostoglandine und Interleukin-6-Hemmer, als auch solche Verbindungen, die spezifische Knochenerkrankungen wie Osteoporose behandeln, zum Beispiel Parathhormon, Vitamin-D-Derivate, Bisphosphanate, Knochen-morphogenetische Proteine und Antibiotika, oder Gemische davon.
Es wurde festgestellt, dass die Bläschen der vorliegenden Erfindung ohne weiteres erhalten werden können, indem sie in einem wässrigen Gemisch gebildet werden, das ein Phospholipid umfasst, und dann diese Bläschen kalzifiziert werden, indem sie mit einer Calcium- und Phosphationen umfassenden wässrigen Lösung zusammengebracht werden.
Die Phospholipid-Konzentration im wässrigen Gemisch sollte unter der Konzentration liegen, bei der eine Zusammenballung des Phospholipids auftreten kann. Vorzugsweise beträgt die Phospholipid-Konzentration 5 × 10^-5 bis 1 × 10^-3 g pro cm³, bevorzugter 5 × 10^-5 bis 7,5 × 10^-4 g pro cm³, und am bevozugtesten 2,5 × 10^-4 bis 5 × 10^-5 g pro cm³.
Die Bläschen können durch Rühren des wässrigen Gemischs gebildet werden, das ein wie oben beschriebenes Phospholipid umfasst. Dies kann durch Rühren erfolgen, doch vorzugsweise wird das Gemisch mit Hochfrequenz-Schallwellen bei ausreichender Frequenz und Leistung zum Erhalt einer Emulsion geschüttelt. Vorzugsweise beträgt die Beschallungsfrequenz 20 bis 30 kHz.
Die Schütteltemperatur sollte unter dem Siedepunkt des wässrigen Gemischs liegen. Sie sollte auch unterhalb der Temperatur liegen, bei der ein Abbau des Phospholipids auftreten könnte. Vorzugsweise beträgt die Schütteltemperatur unter 70°C, bevorzugter unter 50°C, und am bevorzugtesten liegt sie bei etwa Raumtemperatur.
Die Schütteldauer hängt von der Schüttelmethode und der Konzentration des wässrigen Gemischs ab. Vorzugsweise wird das Gemisch ausreichend lange geschüttelt, bis sich eine Emulsion bildet oder keine weiteren Bläschen mehr bilden, d.h. ein Konstantzustand erreicht ist. Wird das Gemisch beschallt, so beträgt die Schütteldauer für ein Gemisch mit einer Konzentration von 5 × 10^-5 g Phospholipid pro cm³ des wässrigen Gemischs allgemein 15 Minuten bis 2 Stunden, insbesondere etwa 1 Stunde. Wird ein Gemisch derselben Konzentration zum Erhalt der Bläschen gerührt, so erfolgt dies für eine Dauer von 30 Minuten bis 4 Stunden, bevorzugter 1 Stunde bis 3 Stunden, und am bevorzugtesten etwa 2 Stunden.
Ein oder mehrere Alkohole können in das wässrige Gemisch gemäß bekannter Methoden aufgenommen werden, um die Bläschengröße zu erhöhen. Der Alkohol ist typischerweise Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol. Vorzugsweise ist der Alkohol Ethanol. Die Konzentration des Alkohols liegt allgemein unter der Konzentration, bei der sich das Phospholi pid aufzulösen beginnt. Vorzugsweise beträgt die Alkohol-Konzentration nicht mehr als etwa 10 Volumen-% des wässrigen Gemischs.
Zu anderen Komponenten, die dem wässrigen Gemisch zugegeben werden können, zählen zum Beispiel oberflächenaktive Mittel und pharmazeutisch wirksame Verbindungen. Zu bevorzugten oberflächenaktiven Mitteln zählen anionische oberflächenaktive Mittel, z.B. Ester von Carboxylen, Sulfaten und Phosphaten. Die Verwendung der oberflächenaktiven Mittel kann die zur Erzeugung der Bläschen erforderliche Schütteldauer vermindern.
Ein Absetzen der Bläschen nach dem Schütteln kann z.B. durch Magnetrühren bei einer geringen Scherrate verhindert werden.
Die Kalzifikation der Bläschen kann durch Zusammenbringen der Phospholipid-Bläschen mit einer wässrigen Lösung vorgenommen werden, die Calcium- und Phosphat-(PO₄ ^3-)-Ionen umfasst. Typischerweise beträgt das Verhältnis von Calcium- zu Phosphationen 1:1 bis 2:1, vorzugsweise von 1,4:1 bis 2:1, und bevorzugter etwa 1,5:1.
Die Quelle der Calciumionen in der Lösung ist jegliche wasserlösliche organische oder anorganische Calcium-Verbindung, vorzugsweise Calciumchlorid oder Calciumnitrit, und bevorzugter Calciumnitrat.
Die Quelle der Phosphationen in der Lösung ist eine beliebige wasserlösliche Phosphatverbindung, vorzugsweise ein Orthophosphat, zum Beispiel ein Kaliumorthophosphat, insbesondere Dikaliumhydrogenorthophosphattrihydrat.
Wie oben angegeben, können andere Ionen in die Schicht aufgenommen werden, die Calciumphosphat umfasst. Zum Beispiel können Carbonat- und Hydrogenphosphat-Ionen zur Erhöhung der Resorptionsrate im Körper hinzugefügt werden, wobei Chlorid-, Fluorid- und Magnesiumionen zur Senkung der Resorptionsrate zugesetzt werden können.
Insbesondere können Carbonationen der wässrigen Lösung von Calcium- und Phosphationen zum Variieren der Kristallinität und Stöchiometrie der kalzifizierten Schicht zugesetzt werden. Die maximale Konzentration der Carbonationen wird vom pH-Wert, der Temperatur und dem Vorhandensein weiterer Ionen abhängen. Es wird jedoch verständlich sein, dass die kalzifizierte Schicht vorzugsweise eine Calciumphosphatschicht oder eine substituierte Calciumphosphatschicht ist. Die Quelle der Carbonationen besteht in jeglicher löslichen Carbonat- oder Hydrogencarbonat-Verbindung und ist vorzugsweise Kaliumhydrogencarbonat oder Natriumhydrogencarbonat.
Die Kalzifikation kann durch gleichzeitiges Zusammenbringen der Bläschen mit Calcium- und Phosphationen oder durch Einführen der Bläschen in eine Calciumlösung für beispielsweise etwa zwei Stunden vor der Zugabe der Phosphationen vorgenommen werden.
Die Dauer, für die die Bläschen mit der kalzifizierenden Lösung zusammengebracht werden, beeinflusst die Dicke der auf den Bläschen gebildeten Außenschicht. Typischerweise beträgt nach etwa einer Stunde die Dicke der Schicht etwa 10 nm. Die Dicke der Schicht (gekoppelt mit ihrer Porosität) kann die Rate beeinflussen, bei der die Bläschen im Körper zersetzt werden, und die Rate der Freisetzung jeglicher pharmazeutisch wirksamer Verbindung aus den Bläschen. Vorzugsweise beträgt die Beschichtungsdicke 5 bis 50 nm, bevorzugter etwa 5 bis 20 nm, und am bevorzugtesten etwa 10 nm.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein hydrophobes Tröpfchen bereit, welches umfasst:

a) einen hydrophoben Kern,
b) eine Innenschicht, welche ein oberflächenaktives Mittel umfasst, und
c) eine Außenschicht, welche Calciumphosphat umfasst.

Der hydrophobe Kern umfasst vorzugsweise einen festen oder flüssigen Kohlenwasserstoff oder ein Lipid. Er kann außerdem wasserunlösliche pharmazeutisch wirksame Verbindungen umfassen.
Das oberflächenaktive Mittel kann ein solches sein, das die Oberflächenspannung der nichtwässrigen Tröpfchen herabsetzen kann. Es kann außerdem eine aktive Stelle für die Calciumphosphat-Ablagerung bereitstellen. Vorzugsweise ist das oberflächenaktive Mittel ein anionisches oberflächenaktives Mittel, zum Beispiel ein Ester eines Carboxyls, Sulfats oder Phosphats.
Es wurde festgestellt, dass die hydrophoben Tröpfchen der vorliegenden Erfindung durch Bilden der hydrophoben Tröpfchen in einem wässrigen Gemisch ohne weiteres erhalten werden können, das eine hydrophobe Flüssigkeit oder Feststoff und ein oberflächenaktives Mittel umfasst. Die Tröpfchen werden dann durch Zusammenbringen mit einer wässrigen Lösung kalzifiziert, welche Calcium- und Phosphationen, und wahlweise weitere Ionen umfasst, wie oben erörtert.
Die hydrophoben Tröpfchen der vorliegenden Erfindung können durch Schütteln und anschließendes Kalzifizieren gebildet werden, wie oben beschrieben.
Die Größe der Bläschen und hydrophoben Tröpfchen der vorliegenden Erfindung beträgt allgemein 100 nm bis 10 μm, bevorzugt mindestens 300 nm, und bevorzugter mindestens 1 μm. Die Größe kann auf über 1 μm durch Zugabe eines Alkohols, zum Beispiel Ethanol, zum wässrigen Gemisch vor der Schütteln erhöht werden. Die Größe der Bläschen oder Tröpfchen kann auch durch Extrusionsprozesse, beispielsweise unter Verwendung von hypodermalen Spritzen oder porösen Membranen, kontrolliert werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein festes Substrat bereit, wobei an bestimmte Regionen dieses Substrats eine Schicht gebunden ist, die die oben beschriebenen Bläschen oder Tröpfchen umfasst, und wobei eine oder mehrere weitere Regionen keine daran gebundenen Bläschen oder Tröpfchen. Diese Substrate können in der Behandlung von Knochenerkrankungen und/oder der in vitro-Darreichung pharmazeutisch wirksamer Verbindungen Anwendung finden.
Beschichtbare Substrate können über ihre Gesamtfläche oder eine Teilfläche elektrisch leitfähig sein. Es können zum Beispiel Metalle wie z.B. Gold, Kunststoffe oder keramische Stoffe, die über ihre Gesamtfläche oder eine Teilfläche mit Metall beschichtet sind, Metalle, die teilweise mit Kunststoff beschichtet sind, oder Halbleiter sein. Vorzugsweise weisen die Substrate nicht-leitende Regionen auf ihren Oberflächen von 10 μm bis 2 mm Durchmesser auf, und bevorzugter betragen die Regionen etwa 150 μm im Durchmesser.
Die Substrate können unter Anwendung eines elektrolytischen Ablagerungsprozesses oder durch Aufbringen der Bläschen oder Tröpfchen der vorliegenden Erfindung in Form eines Pulvers beschichtet werden. Vorzugsweise werden die Substrate elektrolytisch beschichtet. Der elektrolytische Ablagerungsprozess kann in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von 5 bis 11, bevorzugt 6 bis 8, noch bevorzugter etwa 7,4, vorgenommen werden. Die Form des abgelagerten Calciumphosphats kann mit dem pH-Wert variieren. Zum Beispiel kann bei einem hohen pH-Wert das Hydroxyapatit abgelagert werden, wohingegen bei geringem pH-Wert Brushit aufgebracht werden kann.
Die Temperatur für die Ablagerung beträgt generell unter 100°C, vorzugsweise unter 70°C und noch bevorzugter etwa 50°C.
Ein Salz, wie zum Beispiel Kaliumchlorid, kann der Lösung zur Aufrechterhaltung einer Übersättigung durch eine hohe Hintergrund-lonenstärke zugesetzt werden, und kann als ein Elektrolyt wirken. Alternativ können Calcium und Phosphat während des Präzipitationsvorgangs zur Aufrechterhaltung der Übersättigung zugegeben werden.
Die Beschichtungsdicke steigt natürlich mit der Ablagerungsdauer. Zum Beispiel beträgt nach einer Ablagerungsdauer von 1 Stunde die Beschichtungsdicke etwa 2 μm. Es können vielfache Ablagerungen vorgenommen oder die Ablagerungsdauer verlängert werden, um dickere Beschichtungen, z.B. Beschichtungen von etwa 20 μm, zu erreichen.
Die Beschichtungen können aus Gemischen der Bläschen und/oder Tröpfchen der vorliegenden Erfindung gebildet werden. So können verschiedene Regionen der Substratoberfläche mit verschiedenen Arten von Bläschen oder Tröpfchen beschichtet werden. Zum Beispiel kann ein nicht-leitendes Muster auf dem Substrat vor der ersten Ablagerung aufgebracht werden. Nach der ersten Ablagerung unter Verwendung einer oder mehrerer Arten von Bläschen und/oder Tröpfchen der vorliegenden Erfindung kann das nicht-leitende Muster entfernt und eine zweite Ablagerung unter Verwendung verschiedener Bläschen und/oder Tröpfchen gemäß der Erfindung vorgenommen werden. Alternativ kann zum Beispiel ein Metallsubstrat beschichtet werden. Es kann dann einer Teilätzung oder einem lithographischen Prozess unterzogen werden und eine zweite Ablagerung in einer unterschiedlichen Lösung der Bläschen und/oder Tröpfchen vorgenommen werden. Die Verwendung einer Vielzahl von Bläschen und/oder Tröpfchen kann eine Kontrolle der Freisetzung der pharmazeutisch wirksamen Verbindungen in die Beschichtung ermöglichen. Zum Beispiel werden die in Bläschen oder Tröpfchen mit einer dünnen Beschichtung enthaltenen Verbindungen schneller freigesetzt als Verbindungen, die in Bläschen oder Tröpfchen mit einer dicken Beschichtung enthalten sind.
Die vorliegende Erfindung wird in lediglich beispielhafter Art unter Bezugnahme auf die Figuren weiter veranschaulicht, worin:
1 ein Schema des für die elektrolytische Ablagerung der Bläschen und Tröpfchen der vorliegenden Erfindung auf die Oberfläche von Substratplatten verwendeten experimentellen Apparates zeigt.
2 eine Röntgen-Diffraktionskurve der kalzifizierten Bläschen zeigt, die in einer Carbonationen-enthaltenden Kalzifikationslösung bei atmosphärischer Konzentration gebildet werden. Die Kurve zeigt die für HA diagnostischen Peaks.
3 zeigt eine schematische Darstellung der strukturellen Hierarchie und der in Ordnungen eingeteilten Porosität der Beschichtungen der vorliegenden Erfindung. Es wird zu erkennen sein, dass die Porosität der ersten Ordnung die Abstände zwischen den Ablagerungen betrifft, die Porosität der zweiten Ordnung die Porosität der Bläschen vor der Kalzifikation betrifft und die Porosität der dritten Ordnung die Porosität der Calciumphosphatschicht betrifft. Wie oben erörtert, können alle drei durch geeignete Manipulation der Verfahrensparameter variiert werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren weiter.
Beispiele
Die Beschichtungen wurden unter Verwendung eines Jeol 840 FEG SEM unter Anlegung einer Beschleunigungsspannung von 2 kV untersucht. Die Phasenbestimmung wurde auf einem Phillips PW 1710 Röntgendiffraktometer vorgenommen. Eine Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie wurde auf einem ATI Mattson Genesis Series Spektrometer in einem Wellenlängenbereich von 4000 bis 400 cm^-1 vorgenommen.
Bläschenbildung
5 oder 10 mg L-α-Phosphatidylcholin oder L-α-Phosphatidylserin (beide von Sigma, U.K.) wurden beschallt (d.h. mit Hochfrequenz-Schallwellen geschüttelt) unter Verwendung eines Kerry Ultrasonic Ltd.-Ultraschallrührers in 20 ml destilliertem Wasser für maximal eine Stunde bei Raumtemperatur, um kugelförmige Bläschen zu erhalten. Nach der Beschallung wurde das Absetzen der Bläschen durch Magnetrührer unter Anwendung einer niedrigen Scher rate verhindert. Diese Phospholipide sind für ihre hohe Affinität für eine Calciumbindung wohlbekannt.
Kalzifikation der Bläschen
Die beschallte Lösung wurde einer Calciumphosphat-(CaP)-Arbeitslösung zugegeben. Diese Arbeitslösung wurde wie folgt zubereitet: Lösungen von 1,75 mM [Ca] wurden aus einem Ca/P-Verhältnis = 5/3 unter Verwendung von Calciumnitrattetrahydrat in in analytischer Qualität, Ca(NO₃)₂·4H₂O und Dikaliumhydrogenorthophosphattrihydrat, K₂HPO₄·3H₂O (beide von Aldrich, U.K.) in destilliertem Wasser hergestellt. Carbonationen wurden unter Verwendung von Kaliumhydrogencarbonat , KHCO₃ (von Aldrich, U.K.) hinzugefügt. Die Carbonationen wurden entsprechend den folgenden Konzentrationen zugesetzt: (i) atmosphärisches CO₂ (1,445 × 10^-7 M), und (ii) physiologisches [CO₃ ^2-] (1,6 × 10^-6 M).
Ablagerung der Bläschen
Eine Platinanode und eine 304-Edelstahlkathode wurden in die wie oben beschrieben hergestellten übersättigten Lösungen eingebracht. Die Elektroden wurden an eine programmierbare Phillips PM2831-Energiequelle angeschlossen, die sowohl Gleichstrom-(CC)- als auch Gleichspannungs-(CV)-Eigenschaften aufwies. Die Calciumionen-Konzentration, der pH-Wert und die Temperatur wurden unter Verwendung eines ION85-Messers (Radiometer Ltd., Kopenhagen) überwacht, mit dem die Übersättigung gemessen wurde. Alle Experimente wurden bei 50°C, ausgehend von pH 7,4, Arbeitslösung 1,75 mM [Ca²⁺], 0,1 M KCl, bei einem Arbeitselektroden-Abstand von 2,25 cm und 2,2 V angelegter Spannung vorgenommen. Ebenso wie die Lipid/Wasser-Lösungen wurden weitere Lösungen zubereitet, die einen Alkohol (Ethanol) in einer zu beschallenden Lipidlösung enthielten. Die Kalzifikation und Ablagerung der Bläschen wurde in derselben Weise wie oben beschrieben vorgenommen. Bei der Ablagerungstemperatur von 50°C verdampft der Alkohol langsam, was zu einer erhöhten Bläschengröße führt. Da Phospholipide hochgradig löslich in Alkoholen sind, wurde das prozentuale Volumen des Alkohols in der beschallten Lösung auf 10 % (2 ml) beschränkt. Der experimentelle Aufbau ist in 1 detailliert gezeigt.
Es fand keine Veränderung in der Lösung mit steigender Temperatur von der Herstellungstemperatur der Bläschen (Umgebungstemperatur) bis zur Ablagerungstemperatur von 50°C statt. Da die Bläschen vor Einführung in ein Calcium-haltiges Medium gebildet wurden, erfolgte die gesamte Kalzifikation an der Außenfläche der Bläschen. Dies wurde durch SEM-Untersuchung der Beschichtungen bestätigt.
XRD und FT-IR der mit einer Carbonat-Konzentration gleich dem atmosphärischem Gleichgewicht hergestellten Beschichtungen ergaben, dass die Ablagerungen nahezu stöchiometrisches Hydroxyapatit bei sehr geringen Mengen an Carbonat umfassten. Diese zeigten sich in den XRD-Kurven nicht (2), doch waren dem CO₃ ^2- zuzuordnende Peaks in den FT- IR-Spektren erkennbar. Bei höheren Carbonat-Konzentrationen waren die XRD-Kurven ähnlich, doch waren die Carbonat-Bande in den FT-IR-Spektren intensiver.
Die SEM-Untersuchungen der unter Verwendung von 5 mg Phospholipid hergestellten Beschichtungen ergaben, dass die Oberflächenbedeckung typischerweise weniger als 50 % betrug. Aus 10 mg Lipidlösungen hergestellte Beschichtungen zeigten eine größere Bedeckung, so dass das Substrat unter SEM nicht sichtbar war. Phosphatidylcholin-Beschichtungen wurden zur Untersuchung unter dem Jeol FEG-SEM gewählt, da ein Vergleich von fünf dieser Beschichtungen mit solchen, die unter Verwendung von Phosphatidylserin hergestellt wurden, ergab, dass die prozentuale Bedeckung mit dem Phosphatidylcholin größer war.
Die SEM der Phosphatidylcholin-(10 mg)-Beschichtungen zeigte, dass die Bläschengröße von 300 nm für wässrige Lösungen, bis hin zu 1 μm für Alkohol enthaltende Lösungen rangierte. Es ist daher möglich, die Bläschengröße durch Wahl der Lösungseigenschaften zu variieren.
Die kalzifizierte Wanddicke wurde mit etwa 10 nm für eine den Calciumionen über einen Zeitraum von einer Stunde ausgesetzte Bläschensuspension bestimmt. Die kalzifizierte Wanddicke steigt mit der Einwirkdauer der Calciumionen.
Die Beschichtungsdicke (d.h. nach Auftreffen der Kügelchen auf das Substrat) steigt mit der Ablagerungsdauer. Durch Variieren der Ablagerungsdauer können Beschichtungen der erforderlichen Dicke erhalten werden.

Claims

Bläschen, welches umfasst: (a) eine Innenschicht, welche ein Phospholipid umfasst, und (b) eine Außenschicht, welche Calciumphosphat umfasst.
Bläschen nach Anspruch 1, wobei das Phospholipid ausgewählt ist aus L-α-Phosphatidylcholin und L-α-Phosphatidylserin.
Hydrophobes Tröpfchen, welches umfasst: (a) einen hydrophoben Kern, (b) eine Innenschicht, welche ein oberflächenaktives Mittel umfasst, und (c) eine Außenschicht, welche Calciumphosphat umfasst.
Tröpfchen nach Anspruch 3, wobei der hydrophobe Kern einen festen oder flüssigen Kohlenwasserstoff oder Lipid umfasst.
Tröpfchen nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, wobei das oberflächenaktive Mittel ein anionisches oberflächenaktives Mittel ist.
Bläschen oder Tröpfchen nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Außenschicht außerdem Ionen umfasst, ausgewählt aus Carbonat, Hydrogenphosphat, Chlorid, Fluorid oder Magnesium.
Bläschen oder Tröpfchen nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Dicke der Außenschicht 5 bis 50 nm beträgt.
Bläschen oder Tröpfchen nach Anspruch 7, wobei die Dicke der Außenschicht 5 bis 20 nm beträgt.
Bläschen oder Tröpfchen nach Anspruch 8, wobei die Dicke der Außenschicht etwa 10 nm beträgt.
Bläschen oder Tröpfchen nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Größe des Bläschens oder Tröpfchens 100 nm bis 10 μm beträgt.
Bläschen oder Tröpfchen nach Anspruch 10, wobei die Größe des Bläschens oder Tröpfchens mindestens 300 nm beträgt.
Bläschen oder Tröpfchen nach Anspruch 11, wobei die Größe des Bläschens oder Tröpfchens mindestens 1 μm beträgt.
Bläschen oder Tröpfchen nach einem der vorangehenden Ansprüche, welches außerdem eine pharmazeutisch wirksame Verbindung umfasst.
Bläschen oder Tröpfchen nach Anspruch 13, wobei die pharmazeutisch wirksame Verbindung das Binden einer Beschichtung, umfassend die Bläschen oder Tröpfchen, an Knochen unterstützt, eine spezifische Knochenerkrankung oder eine an den Knochen angrenzende erkrankte Region behandelt, oder Schmerz lindert.
Bläschen oder Tröpfchen nach Anspruch 14, wobei die pharmazeutisch wirksame Verbindung ausgewählt ist aus Parathormon, Vitamin-D-Derivaten, Biphosphanaten, morphogenetischen Knochenproteinen, Analgetika, ³²P- oder ⁸⁹Sr-haltigen Verbindungen Indomethacin, Prostaglandinen, Interleukin-6-Inhibitoren und Antibiotika.
Verfahren zum Herstellen eines Bläschens nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 6 bis 15, welches Verfahren umfasst: (a) Bilden eines Bläschens in einem wässrigen Gemisch, welches ein Phospholipid umfasst, und (b) Calcifizieren des Bläschens durch Zusammenbringen des Bläschens mit einer wässrigen Lösung, welche Calcium- und Phosphationen umfasst.
Verfahren zum Herstellen eines hydrophoben Tröpfchens nach einem der Ansprüche 3 bis 15, welches Verfahren umfasst: (a) Bilden eines hydrophoben Tröpfchens in einem wässrigen Gemisch, welches eine hydrophobe Flüssigkeit oder Feststoff und ein oberflächenaktives Mittel umfasst, und (b) Calcifizieren des Tröpfchens durch Zusammenbringen des Tröpfchens mit einer wässrigen Lösung, welche Calcium- und Phosphationen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, wobei das wässrige Gemisch außerdem einen Alkohol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Alkohol ausgewählt ist aus Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol.
Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, wobei die Konzentration des Alkohols nicht mehr als 10 Volumen-% des wässrigen Gemischs beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei das Verhältnis von Calcium- zu Phosphationen in der wässrigen Lösung von 1:1 bis 2:1 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Verhältnis von Calcium- zu Phosphationen von 1,4:1 bis 2:1 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Verhältnis von Calcium- zu Phosphationen etwa 1,5:1 beträgt.
Bläschen nach Anspruch 1, hergestellt mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 16 oder 18 bis 23.
Tröpfchen nach Anspruch 3, hergestellt mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 17 bis 23.
Festes Substrat, wobei Regionen des Substrats eine daran gebundene Schicht aufweisen, welche Bläschen oder Tröpfchen nach einem der Ansprüche 1 bis 15, 24 oder 25 umfasst, wobei eine andere Region oder Regionen keine daran gebundenen Bläschen oder Tröpfchen aufweisen.
Substrat nach Anspruch 26, welches umfasst (a) elektrisch leitende und nicht-leitende Regionen auf seiner Oberfläche, und (b) eine Schicht, welche Bläschen oder Tröpfchen auf den leitenden Regionen umfasst.
Substrat nach Anspruch 27, wobei die nicht-leitenden Regionen von 10 μm bis 2 mm groß sind.
Substrat nach Anspruch 28, wobei die nicht-leitenden Regionen etwa 150 μm groß sind.
Verfahren zum Herstellen eines Substrats nach einem der Ansprüche 26 bis 29, welches Verfahren das elektrolytische Niederschlagen der Beschichtung, welche Bläschen oder Tröpfchen umfasst, auf die leitenden Regionen des Substrats umfasst.
Substrat nach Anspruch 26, hergestellt mittels des Verfahrens nach Anspruch 30.
Substrat nach einem der Ansprüche 26 bis 29 zur Verwendung in der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Verwendung eines Substrats nach einem der Ansprüche 26 bis 29 in der Herstellung eines medizinisch geeigneten Implantats für die Behandlung von Knochenschädigungen oder bei der Darreichung von pharmazeutisch wirksamen Verbindungen.