WO1999028047A2 - Künstliche oberfläche mit vorbestimmter affinität - Google Patents
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- WO1999028047A2 WO1999028047A2 PCT/DE1998/003500 DE9803500W WO9928047A2 WO 1999028047 A2 WO1999028047 A2 WO 1999028047A2 DE 9803500 W DE9803500 W DE 9803500W WO 9928047 A2 WO9928047 A2 WO 9928047A2
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
- G01N33/5438—Electrodes
Definitions
- the present invention relates to a surface that has an affinity for certain molecules (ligands), a method for producing this surface, a detection system in which this surface is contained and the use of this surface, for example, as a receptor layer for bio or chemical sensors.
- Sensors i.e. comparatively small measuring arrangements are increasingly required to be able to carry out chemical or biochemical analyzes quickly at the scene. This means that these sensors detect both qualitatively and quantitatively certain substances. Systems must therefore be developed that meet these requirements. Because of the difficulties in detecting certain compounds in the smallest quantities, especially when masked, there is a great need for systems with which it is possible to detect or separate the smallest quantities analytically. For this purpose, intensive studies have recently been carried out in order to create surfaces which can be used in chemical, medical or biological analysis as well as in food or environmental analysis.
- US Patent No. 56 41 539 describes a method in which a receptor surface is made up of appropriately functionalized self-organizing molecular
- One solution to this problem is to provide a method for producing an artificial surface with a predetermined affinity, in which this surface is produced from monolayer-forming molecules.
- a surface is created from two or more types of molecules.
- One type of molecule (template) has a similar shape to the ligand and must have a strong adsorption capacity on the carrier material.
- the other type of molecules (structure-forming agent) must be capable of forming monomolecular layers and exceed the template in the resulting layer thickness.
- the process according to the invention is characterized in that the template and structure-forming agent are immobilized on the carrier material and produce a binding site. This process creates a surface that has an affinity for high and low molecular weight substances and that also achieves stable binding properties as well as high selectivity and specificity. In addition, stable and long-lasting receptor sites are also created, since the template acts as a molecular spacer.
- the method according to the invention for producing a surface with a predetermined affinity is characterized in that a support is coated with a support material and then immersed in a solution which contains both at least one template and at least one structure former, as a result of which the template and layer former are adsorbed in this way that as a result of the different layer thicknesses of the template and the structure former, a surface with so-called “depressions” is created (see FIG. 1).
- the carrier material is in the solution consisting of 10 ⁇ M dodecanethiol and 10 mM thiobarbituric acid in 10 vol .-% methanol at temperatures of 7 ° C to 25 ° C for 25 to 100 Hours, preferably immersed at 22 ° C for 72 hours, in order to create the artificial surface with affinity for a specific target molecule (here: barbituric acid).
- Another object of the invention is to provide a detection system which contains the surface produced by the method according to the invention, with which it is possible to detect substances, that is to say target molecules.
- the solution to this problem is to design this detection system in such a way that, via measurements of capacitance, impedance, resonance frequency, voltammetry, surface plasmon resonance, interferometry, ellipsometry or fluorescence, interactions between a binding site created by the method and one Molecule to be detected (ligands) can be detected.
- An example of a separation method is affinity chromatography.
- the surface according to the invention is used as a stationary phase.
- miniaturized systems offer a particularly suitable application, since the costs for the carrier material are minimal. If, for example, barbituric acid is to be purified after its synthesis, a column of gold powder which has been appropriately coated with thiobarbituric acid and dodecanethiol can be used.
- the structure former typically has better dielectric properties than the template because of its thickness.
- the capacity for thiobarbituric acid is three times higher than for dodecanethiol.
- a carrier used as an electrode, then the probability that an electron transfer from the electrode to substances (or in the opposite direction) coming from the electrolyte is much stronger on the electrode surface coated with template than on the electrode surface coated with structuring agent. Therefore, for the molecules that are bound in the binding sites, the rate for the electrochemical redox reaction is much higher than for other substances, and the selectivity of the binding sites then determines the selectivity of the reaction. With prochiral binding sites, this leads to enantioselective catalysis.
- the surface according to the invention can be used in an array which is formed from a plurality of these surfaces, in particular for targeted chemical reactions, one or more of these surfaces being combined with the same and / or different organic layers to form a functional unit.
- the carrier material is a metal, for example Au, Pt, Pd, a semiconductor, e.g. GaAs, Si, Ge, or any other organic or inorganic material such as e.g. Quartz, glass, polymer materials, as well as combinations of several of the materials listed here, in particular alloys or composites, in particular Au / Pd, Ag / Pd, Au / Cr.
- a metal for example Au, Pt, Pd, a semiconductor, e.g. GaAs, Si, Ge, or any other organic or inorganic material such as e.g. Quartz, glass, polymer materials, as well as combinations of several of the materials listed here, in particular alloys or composites, in particular Au / Pd, Ag / Pd, Au / Cr.
- a template is any molecule that can be immobilized on the carrier material.
- the template molecules are preferably selected from the group consisting of aromatic compounds, compounds with conjugated double bonds, in principle all compounds that are conformationally stabilized.
- the template can have a prochiral structure.
- a structure former is understood to mean any molecule that can form a monomolecular layer on the carrier material and that can generate the binding sites together with the template.
- molecules of the type XSi (R) 3 can be used, where X represents any molecular fragment.
- X and Y are preferably selected from the group consisting of functionalized and unfunctionalized alkyl radicals, R represents -OH or one and / or more identical and / or different halogens.
- R represents -OH or one and / or more identical and / or different halogens.
- binding point on the surface is created by the free surface of the template with the surrounding structure formers. These binding sites can be modified in such a way that additional electrostatic interactions are made possible between the template and the ligand.
- a ligand is a molecule that has an affinity for the binding site.
- the template is bound to the carrier material in the
- Binding site unsuitable can be referred to as a surface with predetermined affinity, because the so-called depressions at the locations of the template are suitable for binding only molecules (ligands) with a suitable shape. This means that molecules that do not have a shape specified by the template cannot be bound.
- Known methods are suitable for the detection of the binding, for example measurements of capacitance, voltammetry, quartz microbalance, impedance, interferometry, ellipsometry, fluorescence or surface plasmon resonance.
- the surface according to the invention can be used in many areas of chemical analysis.
- it is used as a stationary phase, e.g. as column material or for coating platelets for separating and purifying mixtures in affinity chromatography or electrophoresis.
- It can also be used for catalytic purposes in enantioselective catalysis, in particular for electrochemical catalysis, and when it is applied to a support which serves as an electrode.
- the surface according to the invention can be used in chemical, medical or biological analysis, as well as in food analysis and environmental analysis, in particular for the detection of sugar, drugs, drugs, metabolites or toxins.
- FIG. 1 shows the structure of an artificial surface with a predetermined affinity
- FIG. 2 shows the method of structuring surfaces that is already known from the prior art and the problems and disadvantages that arise in the process
- FIG. 3 shows a schematic illustration of the stabilization principle
- Figure 4 is a schematic representation of the selectivity of the artificial surfaces
- Figure 5 shows the affinity of an artificial surface with barbituric acid receptor function for various substances.
- FIG. 1 the creation of an artificial surface with predetermined affinity is shown schematically.
- the artificial surface is formed by adsorption of structure formers (2) and templates (3) on a carrier material (1).
- the adsorption ability of the structure former (2) and template (3) on the carrier material (1) is symbolized by the rounded position (7) of the molecules.
- the structure of this surface is shown in top view and in cross section. It becomes clear that depressions with the same shape and size as in the template molecule (3) are formed in the surface.
- the problem of lateral diffusion occurs in two-dimensional "molecular imprinting".
- FIG. 2 the surface is generated only by adsorption of structure formers (3) and ligands (4). Since the ligand (4) has no adsorption capacity on the carrier material, it is not incorporated into the surface. The result is that the structure formers can laterally diffuse on the surface.
- the shape and size of the gaps are dynamic and therefore only have a brief, targeted affinity.
- FIG. 3 again illustrates the difference from the prior art.
- the additional adsorption of a template (2) on the carrier material (1) prevents lateral diffusion of the structure formers (3) from occurring.
- binding sites of a previously defined size and shape are formed. This gives the artificial surface a predictable affinity.
- the principle of affinity is shown in FIG.
- the binding sites can only take up molecules that correspond in shape and size to the template. Slightly smaller molecules (5) can also be stored in the educational places, but show a lower affinity than the ligand (4). In contrast, molecules (6) that are slightly larger than the ligand (4) have no possibility of binding to the surface.
- FIG. 5 shows the behavior of an artificial surface with an affinity for barbituric acid.
- the changes in capacity resulting from the incorporation of molecules in the depressions of the artificial surface were determined. The greatest changes in capacity occur compared to barbituric acid. If, in addition to barbituric acid, diethyl barbituric acid is also present in the solution, the measurement result is only minimally influenced. In the presence of pyridine, much less effects are detected, and no decrease in capacity is found with diethylbarbituric acid.
- the preparation of the surface and the implementation of the measurement are described below in the examples.
- Silicon wafer pieces with a size of 3.20 mm x 10.02 mm and a thickness of 450 microns were in a common sputtering process with a gold electrode size 1.56 mm x 1.56 mm (reactive surface) and one Provide a line with a width of 10 ⁇ m and a length of 6.65 mm.
- the electrode was built up from a titanium and palladium layer (adhesion promoter, each 50 nm thick) and a covering gold layer (200 nm).
- silver wire with a copper core was soldered to the upper end of the leads.
- the wafer was checked optically for damage with a reflected light microscope before the cleaning process. The cleaning was done in several steps.
- the wafer was completely immersed in chloroform pa for 30 minutes. After drying in a stream of nitrogen, the wafer was placed in a 1: 1 (v / v) mixture of chloroform: methanol and treated in an ultrasound bath for 10 minutes. The wafer was dried and immersed in a hot 3: 1 (v / v) mixture of concentrated sulfuric acid and 30% hydrogen peroxide solution for 5 minutes. In the last two steps, care was taken that only the reactive electrode surface and a maximum of 4.50 mm of the feed line were immersed in the mixture. The electrode was thoroughly rinsed with ultrapure water (Millipore: Mili.QPlus-185; 18.2 M ⁇ cm "1 ) and dried. All glass and Teflon devices were carefully cleaned before use, as described above.
- ultrapure water Micropure water
- the artificial surface with affinity for barbiturate was produced on the gold electrode.
- the electrode was installed in the measuring cell.
- the change in the average layer thickness on the carrier material was followed capacitively.
- the surface of the layer former and template formed an insulation layer on the gold electrode. If the coated electrode was immersed in an electrolyte, the change in capacity could be followed. When a binding site interacted with another molecule, the layer thickness increased at this point and the capacity decreased. In this way it was possible to detect the binding of molecules on the artificial surface.
- the wafer was fastened in the measuring cell in such a way that the coated gold surface was immersed in 16 ml of buffer solution composed of 100 mM KC1 and 5 mM phosphate.
- An Ag / AgCl electrode was used as the reference electrode.
- a potential of 300 mV was applied to the gold electrode by means of a sine generator and the capacitance was monitored via a lock-in amplifier.
- barbituric acid led to a significant decrease in capacity.
- Pyridine produced the same, but significantly less pronounced effect.
- Diethylbarbituric acid showed no change in capacity (see Figure 5). These results show the pronounced selectivity of a surface produced in this way.
- Barbituric acid differs from template (2-thiobarbituric acid) only by exchanging a sulfur atom for an oxygen atom. Therefore, it fits most precisely in the gaps created by the template and achieves the most pronounced change in capacity.
- Pyridine as a somewhat smaller molecule, is also suitable for occupying the binding sites. However, since only slight changes in capacity are achieved, it can be seen that there is little affinity for pyridine consists. Diethyl barbiturate is a slightly larger molecule than the template and does not fit into the binding site, so no change in capacity was observed.
- the artificial surface only has an affinity for template molecules of ligands of the same shape or insignificantly smaller ligands.
- the regenerative properties of the surface were investigated for the system gold as a carrier material, 2-thiobarbituric acid as a template molecule and dodecanethiol as a structuring agent. For this purpose, several cycles of the measurements described under C) were carried out. After each cycle, the gold electrode was immersed in chloroform for one minute to remove the ligands from the binding sites. After drying in a stream of nitrogen, the measurement was carried out again. It was shown that the surfaces could be regenerated at least three times.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Oberfläche mit vorbestimmter Affinität gegenüber bestimmten Molekülen (Liganden), die gekennzeichnet ist dadurch, dass auf einem Trägermaterial eine Oberfläche aus zwei oder mehreren Arten von Molekülen erzeugt wird. Die Erfindung betrifft ausserdem ein Verfahren zur Herstellung dieser künstlichen Oberfläche, ein Nachweissystem, in dem die Oberfläche enthalten ist und die Verwendung dieser Oberfläche.
Description
Künstliche Oberfläche mit vorbestimmter Affinität
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Oberfläche, die gegenüber bestimmten Molekülen (Liganden) eine Affinität aufweist, ein Verfahren zur Herstellung dieser Oberfläche, ein Nachweissystem in dem diese Oberfläche enthalten ist und die Verwendung dieser Oberfläche beispielsweise als Rezeptorschicht für Bio- oder Chemosensoren.
Sensoren, d.h. vergleichsweise kleine Meßanordnungen, werden immer häufiger benötigt, um chemische oder biochemische Analysen rasch am Ort des Geschehens durchfuhren zu können. Dies bedeutet, daß diese Sensoren sowohl qualitativ als auch quantitativ bestimmte Substanzen zu erkennen. Es müssen also Systeme entwickelt werden, die diesen Anforderungen gerecht werden. Aufgrund der Schwierigkeiten bestimmte Verbindungen in kleinsten Mengen, insbesondere wenn diese maskiert werden, nachzuweisen, gibt es einen großen Bedarf an Systemen mit denen es möglich ist, kleinste Mengen analytisch nachzuweisen oder zu trennen. Dazu wurden in der letzten Zeit intensive Untersuchungen durchgeführt, um Oberflächen zu schaffen, die sowohl in der chemischen, medizinischen oder biologischen Analytik als auch in der Lebensmittel- oder Umweltanalytik einsetzbar sind.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von künstlichen Oberflächen bekannt, wobei eine Rezeptorbindung über funktionelle Gruppen erreicht wird.
Das US-Patent Nr. 56 41 539 beschreibt beispielsweise ein Verfahren, bei dem eine Rezeptoroberfläche aus entsprechend funktionalisierten selbstorganisierenden molekularen
Schichten gebildet wird. In diesem Fall können jedoch nur Makromoleküle detektiert werden, die eine hinreichend große Fläche aufweisen, um so genügend Wechselwirkungsstellen zu
ermöglichen. Die Wechselwirkung verschiedener fu ktioneller Gruppen ist aber nur auf wenige Systeme, insbesondere Carbonsäuren - Amine anwendbar und deshalb nur von sehr begrenztem Nutzen. Zudem bedarf es meist mehrerer solcher Wechselwirkungen, z.B. elektrostatischer Wechselwirkungen, um gezielt eine ganz bestimmte Molekülart detektieren zu können. Nachteilig an diesem System ist, daß hohe Selektivitäten nur äußerst selten erreicht werden. Darüber hinaus ist diese Methode gegenüber apolaren Substanzen und für Moleküle, die keine oder nur wenige Gruppen tragen, die zur Ausbildung elektrostatischer Wechselwirkungen befähigt sind, nicht anwendbar. Dies gilt auch für Moleküle mit mehreren verschiedenartigen elektrostatischen Wechselwirkungsmöglichkeiten, da nur „kationische" oder „anionische" Oberflächen erzeugt werden können.
Aus dem US-Patent Nr. 55 87 273 ist ein Verfahren bekannt, bei dem ein Analyt an geeigneten Positionen im Molekül mit Monomeren verknüpft wird, die anschließend mit Crosslinkern durch Polymerisation untereinander vernetzt werden. Nach dem Entfernen des Analyten erhält man ein Polymer, das als Rezeptor für den Analyten dient. Nachteilig an diesem Verfahren ist jedoch, daß die komplexen, vielstufigen Syntheseschritte mit Ausbeuteverlusten und Einbußen in der Spezifität verbunden sind. Darüber hinaus erweisen sich oftmals im Bereich der Sensorik die langen Ansprechzeiten dieser Systeme als nachteilig.
Eine weitere bereits bekannte Methode, die von Sagiv, J., Isr. Journal of Chemistry, 18 (1979) 346-353 und Kim, H.-J:, Cotton, T.M., Uphaus, R.A. Thin Solid Films, 160 (1988), 389-397 beschrieben wird, erzeugt die Bindungsstelle in selbstorganiserenden Monoschichten. Zu diesem Zweck werden ein Schichtbildner und das zu detektierende Molekül (Ligand) auf einer Oberfläche coadsorbiert. Durch Auswaschen des Liganden erhält man Lücken in der Monoschicht, die als Rezeptor dienen können. Dieses Verfahren ist in Figur 2 dargestellt. Der Nachteil an diesem Verfahren besteht allerdings darin, daß in Konkurrenz dazu die laterale Diffusion der Monoschicht auf der Oberfläche tritt, die die Form der Liganden verändert und zum baldigen Verlust der Rezeptorfähigkeit führt. Dieses System ist also nur für kurze Zeit stabil und damit für viel Anwendungen ungeeignet.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Erzeugung einer künstlichen Oberfläche mit vorbestimmter Affinität bereitzustellen und damit eine Oberfläche zu schaffen, mit der die oben genannten Nachteile vermieden werden.
Eine Lösung dieser Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Erzeugung einer künstlichen Oberfläche mit vorbestimmter Affinität zu liefern, bei dem diese Oberfläche aus monoschichtbildenden Molekülen erzeugt wird. Zu diesem Zweck wird eine Oberfläche aus zwei oder mehr Arten von Molekülen erzeugt. Die eine Art von Molekülen (Templates) besitzt eine ähnliche Form wie der Ligand und muß eine starke Adsorptionsfahigkeit auf dem Trägermaterial aufweisen. Die andere Art an Molekülen (Strukturbildner) muß zur Ausbildung monomolekularer Schichten befähigt sein und in der daraus resultierenden Schichtdicke das Template übertreffen. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß Template und Strukturbildner auf dem Trägermaterial immobilisiert werden und eine Bindungsstelle erzeugen. Durch dieses Verfahren wird eine Oberfläche geschaffen, die eine Affinität gegenüber hoch- und niedermolekularen Substanzen aufweist und mit der darüber hinaus stabile Bindungseigenschaften sowie hohe Selektivität und Spezifität erreicht werden. Außerdem werden auch stabile und langlebige Rezeptorstellen geschaffen, da das Template als molekularer Abstandshalter fungiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Oberfläche mit vorbestimmter Affinität ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Träger mit einem Trägermaterial beschichtet wird und anschließend in eine Lösung, die sowohl mindestens ein Template als auch mindestens einen Strukturbildner enthält, getaucht wird, wodurch Template und Schichtbildner derart adsorbiert werden, daß infolge der unterschiedlichen Schichtdicken von Template und Strukturbildner eine Oberfläche mit sogenannten „Vertiefungen" (vergleiche Figur 1) entsteht. Die Verfahrensbedingungen sind abhängig von dem verwendeten Trägermaterial, dem verwendeten Template und dem verwendeten Strukturbildner. Wird beispielsweise als Trägermaterial ein Goldfϊlm verwendet, auf dem als Strukturbildner Dodecanthiol und als Template Thiobarbitursäure adsorbiert werden sollen, wird das Trägermaterial in die Lösung bestehend aus 10 μM Dodecanthiol und lO mM Thiobarbitursäure in 10 vol.-% Methanol bei Temperaturen von 7 °C bis 25 °C für 25 bis 100
Stunden, vorzugsweise bei 22 °C für 72 Stunden getaucht, um die künstliche Oberfläche mit Affinität gegenüber einem bestimmten Zielmolekül (hier: Barbitursäure) zu schaffen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Nachweissystem bereitzustellen, das die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Oberfläche enthält, mit dem es möglich ist, Substanzen, also Zielmoleküle zu detektieren.
Die Lösung dieser Aufgabe besteht darin, dieses Nachweissystem derart zu gestalten, daß über Messungen der Kapazität, der Impedanz, der Resonanzfrequenz, der Voltametrie, der Oberflächenplasmonresonanz, der Interferometrie, der Ellipsometrie oder der Fluroreszenz, Wechselwirkungen zwischen einer nach dem Verfahren geschaffenen Bindungsstelle und einem nachzuweisenden Molekül (Liganden) detektiert werden können.
Mit diesem Nachweissystem ist es also möglich, die Bindung von Molekülen auf der künstlichen Oberfläche zu detektieren. Darüber hinaus ist es möglich, den Nachweis direkt im Probenmedium, z.B. Blut, Urin durchzuführen.
Zunächst wurden diese Oberflächen als Nachweissystem in der Chemosensorik eingesetzt, eine weitere Anwendung der Oberflächen mit bestimmter Affinität sind die Trennungsmethoden und Katalysen.
Ein Beispiel für eine Trennungsmethode ist die Affinitätschromatographie. In diesem Fall verwendet man die erfindungsgemäße Oberfläche als eine stationäre Phase. Für Systeme basierend auf der Gold-Thiol-Bindung bieten miniaturisierte Systeme eine besonders geeignete Anwendungsmöglichkeit, da die Kosten für das Trägermaterial minimal sind. Soll beispielsweise Barbitursäure nach deren Synthese gereinigt werden, kann eine Säule aus Gold- Pulver, das entsprechend mit Thiobarbitursäure und Dodecanthiol beschichtet wurde, verwendet werden.
Typischerweise hat der Strukturbildner wegen seiner Dicke bessere dielektrische Eigenschaften als das Template. Im Fall von Thiobarbitursäure und Dodecanthiol ist zum Beispiel die Kapazität für Thiobarbitursäure dreimal höher als für Dodecanthiol. Verwendet
man einen Träger als Elektrode, dann ist die Wahrscheinlichkeit, daß ein Elektronenübergang von der Elektrode auf Stoffe (oder in Gegenrichtung), die aus dem Elektrolyt kommen auf der mit Template beschichtenten Elektrodenfläche viel stärker, als auf der mit Strukturbildner beschichteten Elektrodenfläche. Deshalb ist für die Moleküle, die in den Bindungsplätzen gebunden sind, die Geschwindigkeit für elektrochemische Redoxreaktion viel höher, als für andere Stoffe und die Selektivität der Bindungsplätze bestimmt dann die Selektivität der Reaktion. Mit prochiralen Bindungsplätzen führt dies zu enantioselektiven Katalysen.
Darüber hinaus läßt sich die erfindungsgemäße Oberfläche in einem Array, der aus mehreren dieser Oberflächen gebildet wird, insbesondere für gezielte chemische Reaktionen einsetzen, wobei eine oder mehrere dieser Oberflächen mit gleichen und/oder verschiedenen organischen Schichten zu einer funktioneilen Einheit kombiniert ist/sind.
Als Trägermaterial kann jede feste Substanz verwendet werden, vorzugsweise ist das Trägermaterial ein Metall, beispielsweise Au, Pt, Pd, ein Halbleiter, z.B. GaAs, Si, Ge, oder jedes andere organische oder anorganische Material wie z.B. Quarz, Glas, Polymerstoffe, sowie Kombinationen aus mehreren der hier aufgeführten Materialien, insbesondere Legierungen oder Verbundstoffe, insbesondere Au/Pd, Ag/Pd, Au/Cr.
Es konnte gezeigt werden, daß sich für das erfindungsgemäße Verfahren prinzipiell alle Moleküle verwenden lassen, wenn sie sich entweder der Gruppe der Strukturbildner oder der Gruppe der Templates, zuordnen lassen. Eine weitere Voraussetzung ist, daß das Template auf dem Trägermaterial immobilisiert. Außerdem müssen die Strukturbildner in der Lage sein, auf dem Trägermaterial Monoschichten zu bilden. Darüber hinaus ist es von Vorteil, wenn die Dicke der resultierenden Monoschicht des Strukturbildners die Schichtdicke der adsorbierten Templates übertrifft.
Unter einem Template versteht man jedes Molekül, das auf dem Trägermaterial immobilisisert werden kann. Die Template-Moleküle werden bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus aromatischen Verbindungen, Verbindungen mit konjugierten Doppelbindungen, im Prinzip allen Verbindungen, die konformationsstabilisiert sind. Darüber hinaus kann das Template eine prochirale Struktur aufweisen.
Unter einem Strukturbildner versteht man jedes Molekül, das eine monomolekulare Schicht auf dem Trägermaterial bilden kann und zusammen mit dem Template die Bindungsstellen erzeugen kann. Im allgemeinen werden als Strukturbildner Moleküle der Form HS-X, S=X oder X-S-S-Y verwendet, wobei X und Y beliebige Molekülfragmente darstellen. Darüber hinaus können Moleküle des Typs XSi(R)3 verwendet werden, wobei X jedes beliebige Molekülfragment darstellt. X und Y werden vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus funktionalisierten und unfunktionalisierten Alkylresten ausgewählt, R steht für -OH oder ein und/oder mehrere identische und/oder verschiedene Halogene. Für die Auswahl des geeigneten Strukturbildners ist es wichtig, daß dieser zusammen mit dem Template eine Bindungsstelle bildet.
Die Bindungsstelle auf der Oberfläche wird durch die freie Oberfläche des Templates mit den umgebenden Strukturbildnern erzeugt. Diese Bindungsstellen können derart modifiziert sein, daß zwischen dem Template und dem Liganden zusätzliche elektrostatische Wechselwirkungen ermöglicht werden. Unter einem Liganden versteht man ein Molekül, daß eine Affinität zur Bindungsstelle aufweist.
Gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Oberflächen konnte gezeigt werden, daß mit dieser neuen Oberfläche stabile Bindungsstellen erzeugt werden. Durch die
Beschichtung des Trägermaterials mit den Strukturbildnern und Templates wird eine
Oberfläche aus den monoschichtbildenden Molekülen erzeugt, die Einlagerungen des
Template-Moleküls enthält. Die Bindung des Templates auf dem Trägermaterial erfolgt im
Gegensatz zu dem oben beschriebenen Verfahrens des zweidimensionalen „Molecular Imprintings" irreversibel. Außerdem wurde bei diesem Verfahren des „Molcular Imprintings" versucht, durch Zugabe von Liganden zu den Schichtbildnern die Form der Monoschicht zu beeinflussen. Es werden zwar zunächst ähnliche Oberflächen wie mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren erhalten, jedoch entsteht infolge der fehlenden Adsorption zwischen Ligand und
Trägermaterial ein richtiges Loch in der Monoschicht. Durch die mögliche laterale Diffusion in der Monoschicht behalten diese Lücken, im Gegensatz zu den Bindungsstellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, nicht ihre vorgegebene Form und sind als
Bindungsstelle ungeeignet.
Das System der vorliegenden Erfindung kann als Oberfläche mit vorbestimmter Affinität bezeichnet werden, denn die sogenannten Vertiefungen an den Stellen des Templates sind dazu geeignet, nur Moleküle (Liganden) mit passender Form zu binden. Dies bedeutet, das Moleküle, die nicht eine durch das Template vorgegebene Form aufweisen, nicht gebunden werden können.
Zum Nachweis der Bindung eignen sich bekannte Methoden, beispielsweise Messungen der Kapazität, Voltametrie, Quarzmikrowaage, Impedanz, Interferometrie, Ellipsometrie, Fluoreszenz oder Oberflächenplasmonresonanz.
Die erfindungsgemäße Oberfläche läßt sich in vielen Bereichen der chemischen Analyse einsetzten. Insbesondere findet sie Anwendung als stationäre Phase, z.B. als Säulenmaterial oder zur Beschichtung von Plättchen zur Trennung und Reinigung von Gemischen in der Affinitätschromatographie oder der Elektrophorese. Sie kann auch für katalytische Zwecke in der enantioselektiven Katalyse, insbesondere für elektrochemische Katalysen eingesetzt werden, wobei sie, wenn sie auf einem Träger aufgebracht ist, der als Elektrode dient. Außerdem kann die erfindungsgemäße Oberfläche, je nach Affinität ihrer Oberfläche in der chemischen, medizinischen oder biologischen Analytik sowie der Lebensmittelanalytik und der Umweltanalytik eingesetzt werden, insbesondere zur Detektion von Zucker, Drogen, Medikamenten, Metaboliten oder Toxinen.
Das System der vorliegenden Erfindungen wird nun mit Hilfe der beigefügten Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:
Figur 1 den Aufbau einer künstlichen Oberfläche mit vorbestimmter Affinität,
Figur 2 die aus dem Stand der Technik bereits bekannte Methode, Oberflächen zu strukturieren und die dabei auftretenden Probleme und Nachteile,
Figur 3 eine schematische Darstellung des Stabilisierungsprinzips,
Figur 4 eine schematische Darstellung der Selektivität der künstlichen Oberflächen, und
Figur 5 die Affinität einer künstlichen Oberfläche mit Barbitursäure-Rezeptorfunktion gegenüber verschiedenen Substanzen.
Alle Moleküle, die in den Figuren 1 bis 5 dargestellt sind, werden zur besseren Verdeutlichung mittels einfacher geometrischer Körper symbolisiert. Rückschlüsse auf Molekülarten, Molekülgrößen oder Bindungswinkel können deshalb nicht gezogen werden. Diese Art der Darstellung dient nur zur Verdeutlichung des erfindungsgemäßen Prinzips.
Die Abbildungen werden nun im einzelnen erläutert.
In Figur 1 wird schematisch die Erzeugung einer künstlichen Oberfläche mit vorbestimmter Affinität dargestellt. Durch Adsorption von Strukturbildnern (2) und Templates (3) auf einem Trägermaterial (1) wird die künstliche Oberfläche gebildet. Die Adsoφtionsfähigkeit von Strukturbildner (2) und Template (3) auf dem Trägermaterial (1) wird durch die abgerundete Position (7) der Moleküle symbolisiert. Der Aufbau dieser Oberfläche ist in der Draufsicht und im Querschnitt dargestellt. Es wird dabei deutlich, daß in der Oberfläche Vertiefungen mit identischer Form und Größe wie bei dem Template-Molekül (3) entstehen.
Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung tritt bei dem zweidimensionalen "Molecular Imprinting" das Problem der lateralen Diffusion auf. Dieses Problem ist in Figur 2 gezeigt, um die Vorteile der erfindungsgemäßen Oberflächenstruktur im Gegensatz zum Stand der Technik zu verdeutlichen. Im Stand der Technik wird die Oberfläche nur durch Adsoφtion von Strukturbildnern (3) und Liganden (4) erzeugt. Da der Ligand (4) keine Adsoφtionsfähigkeit auf dem Trägermaterial besitzt, wird er nicht in die Oberfläche mit eingebaut. Die Folge ist, daß die Strukturbildner auf der Oberfläche lateral diffundieren können. Die Form und Größe der Lücken sind also dynamisch und besitzen deshalb nur kurz gezielte Affinität.
Die Darstellung in Figur 3 verdeutlicht noch einmal den Unterschied zum Stand der Technik. Durch die zusätzliche Adsoφtion eines Templates (2) auf dem Trägermaterial (1) wird
verhindert, daß eine laterale Diffusion der Strukturbildner (3) auftreten kann. An Stelle der Löcher in der Schicht des Strukturbildners (3) bilden sich Bindunsgplätze von vorher definierter Größe und Form. Der künstlichen Oberfläche wird dadurch eine planbare Affinität verliehen.
In Figur 4 wird das Prinzip der Affinität gezeigt. Die Bindungsplätze können nur Moleküle aufnehmen, die in Form und Größe dem Template entsprechen. Geringfügig kleinere Moleküle (5) können sich zwar auch in den Bildungsplätzen einlagern, zeigen aber im Vergleich zum Liganden (4) eine geringere Affinität. Bei Molekülen (6), die geringfügig größer als der Ligand (4) sind, besteht dagegen keine Möglichkeit, an der Oberfläche zu binden.
Figur 5 zeigt das Verhalten einer künstlichen Oberfläche mit einer Affinität gegenüber Barbitursäure. Hierzu wurden die Kapazitätsänderungen, die aus einer Einlagerung von Molekülen in den Vertiefungen der künstlichen Oberfläche resultieren, ermittelt. Gegenüber Barbitursäure treten die größten Änderungen der Kapazität auf. Wenn zusätzlich zu Barbitursäure auch Diethylbarbitursäure in der Lösung vorhanden ist, wird das Meßergebnis nur minimal beeinflußt. Bei Anwesenheit von Pyridin werden sehr viel geringere Effekte nachgewiesen, bei Diethylbarbitursäure wird keine Kapazitätsabnahme festgestellt. Die Herstellung der Oberfläche und die Durchführung der Messung sind weiter unten bei den Beispielen beschrieben.
Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen klar, daß mit der erfindungsgemäßen Oberfläche mit vorbestimmter Affinität eine Oberfläche geschaffen wurde, mit der alle Nachteile, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, überwunden werden und die sich durch eine hohe Selektivität und Spezifität, stabile und langlebige Rezeptorenstellen, stabilen Bindungen zwischen Trägermaterial, Strukturbildner und Template auszeichnet.
Im folgenden Beispiel wird nun ein Verfahren zur Herstellung einer Oberfläche mit Affinität gegenüber Barbitursäure beschrieben.
Beispiel
A) Vorbereitung der Elektrode
Silizium- Wafer- Stückchen mit einer Größe von 3,20 mm x 10,02 mm und einer Stärke von 450 μm wurden in einem allgemein üblichen Sputteφrozeß mit einer Goldelektrode der Größe 1,56 mm x 1,56 mm (reaktive Oberfläche) und einer Zuleitung von 10 μm Breite und 6,65 mm Länge versehen. Die Elektrode wurde aus einer Titan- und Palladiumschicht (Haftvermittler, jeweils 50 nm dick) und einer deckenden Goldschicht (200 nm) aufgebaut. Als Kontaktstelle für das Meßsystem wurden am oberen Ende der Zuleitungen aus Silberdraht mit Kupferkern angelötet. Die Wafeφlättchen wurden vor dem Reinigungsprozeß optisch mit einem Auflichtmikroskop auf Beschädigungen übeφriift. Die Reinigung erfolgte in mehreren Schritten. Zuerst wurde der Wafer 30 Minuten vollständig in Chloroform p.a. getaucht. Nach dem Trocknen im Stickstoffstrom wurde der Wafer in eine 1 :1 (v/v) Mischung aus Chloroform:Methanol gegeben und 10 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Der Wafer wurde getrocknet und für 5 Minuten in eine heiße 3:1 (v/v) Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure und 30 %iger Wasserstoffperoxidlösung getaucht. Bei den letzten beiden Schritten wurde darauf geachtet, daß nur die reaktive Elektrodenfläche und maximal 4,50 mm der Zuleitung in die Mischung eintauchten. Die Elektrode wurde gründlich mit Reinstwasser (Millipore: Mili.QPlus-185; 18,2 MΩ cm"1) gespült und getrocknet. Alle Glas- und Teflongeräte wurden vor ihrer Verwendung entsprechend der vorangegangenen Beschreibung sorgfältig gereinigt.
B) Beschichtung der Elektrode
Zur Beschichtung wurde eine methanolhaltige (10 Vol.-%ige) aus 2-Thiobarbitursäure (1 mM) und Dodecanthiol (10 μM) verwendet. Dodecanthiol wurde vorher mittels Destillation gereinigt, alle übrigen Chemikalien wurden ohne weitere Reinigung verwendet. durch 70stündiges Eintauchen des Wafers bei Raumtemperatur in die ungerührte Beschichtungslösung wurde die künstliche Oberfläche mit Affinität gegenüber Barbiturat auf der Goldelektrode erzeugt. Zum Entfernen überschüssiger, auf der Oberfläche haftender
Moleküle wurde die Elektrode zwei Minuten mit Chloroform gespült. Nach dem Trocknen im Stickstoffstrom und mehrmaligem Waschen mit Reinstwasser wurde die Elektrode in die Meßzelle eingebaut.
C) Verwendung als Chemosensor
Um die Affinität zu übeφrüfen, wurde kapazitiv die Änderung der mittleren Schichtdicke auf dem Trägermaterial verfolgt. Die Oberfläche aus Schichtbildner und Template bildete auf der Goldelektrode eine Isolationsschicht. Wurde die beschichtete Elektrode in einen Elektrolyten getaucht, konnte die Änderung der Kapazität verfolgt werden. Wenn eine Bindungsstelle mit einem anderen Molekül in Wechselwirkung trat, nahm an dieser Stelle die Schichtdicke zu und die Kapazität ab. Auf diese Weise war es möglich, die Bindung von Molekülen auf der künstlichen Oberfläche zu detektieren.
Die Affinität der künstlichen Oberfläche wurde gegenüber Barbitursäure, Diethylbarbitursäure und Pyridin übeφriift.
Der Wafer wurde derart in der Meßzelle befestigt, daß die beschichtete Goldoberfläche in 16 ml Pufferlösung aus 100 mM KC1 und 5 mM Phosphat getaucht wurde. Als Referenzelektrode wurde eine Ag/AgCl-Elektrode verwendet. Mittels eines Sinus-Generators wurde ein Potential von 300 mV an die Goldelektrode angelegt und über einen Lock-in- Verstärker die Kapazität verfolgt.
Die Zugabe von Barbitursäure führte zu einer deutlichen Kapazitätsabnahme. Pyridin erzeugte den gleichen, aber deutlich schwächer ausgeprägten Effekt. Diethylbarbitursäure zeigte keine Änderung in der Kapazität (vergleiche Figur 5). Diese Ergebnisse zeigen die ausgeprägte Selektivität einer derart erzeugten Oberfläche. Barbitursäure unterscheidet sich vom Template (2-Thiobarbitursäure) nur durch einen Austausch eines Schwefelatoms gegen ein Sauerstoffatom. Daher paßt es am exaktesten in die vom Template erzeugten Lücken und erzielt die ausgeprägteste Änderung in der Kapazität. Pyridin, als ein etwas kleineres Molekül, ist ebenfalls geeignet die Bindungsstellen zu besetzen. Da aber nur geringer Änderungen der Kapazität erzielt werden, ist festzustellen, daß nur eine geringe Affinität gegenüber Pyridin
besteht. Diethylbarbiturat stellt im Vergleich zum Template ein etwas größeres Molekül dar und paßt nicht in die Bindungsstelle, folglich war auch keine Änderung der Kapazität zu beobachten.
Es konnte gezeigt werden, daß die künstliche Oberfläche nur eine Affinität gegenüber Template-Molekülen formgleicher Liganden oder unwesentlich kleineren Liganden besitzt.
D) Regeneration der Oberfläche
Die regenerativen Eigenschaften der Oberfläche wurden für das System Gold als Trägermaterial, 2-Thiobarbitursäure als Template-Molekül und Dodecanthiol als Strukturbildner untersucht. Es wurden dazu mehrere Zyklen der unter C) beschriebenen Messungen durchgeführt. Nach jedem Zyklus wurde die Goldelektrode für eine Minute in Chloroform getaucht, um die Liganden wieder von den Bindungsstellen zu entfernen. Nach dem Trocknen im Stickstoffstrom erfolgte die erneute Vermessung. Es zeigte sich, daß die Oberflächen mindestens dreimal regeneriert werden konnten.
Claims
1. Oberfläche mit vorbestimmter Affinität, dadurch gekennzeichnet, daß auf einem Trägermaterial Bindungsstellen aus zwei oder mehreren Arten von Molekülen erzeugt werden.
2. Oberfläche nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eine Art an Molekülen mindestens ein Template und die andere Art an Molekülen mindestens ein Strukturbildner ist.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche derart auf einem Trägermaterial gebildet wird, daß mindestens ein Template und mindestens ein Strukturbildner adsorbiert werden, wobei der Strukturbildner eine monomolekulare Schicht ausbildet und mit dem Template eine Bindungsstelle bildet.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial eine feste Substanz ist.
5. Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Au, Pt, Pd, einem
Halbleiter, bestehend aus GaAs, Si, Ge, einem organischen oder anorganischen Material bestehend aus Quarz, Glas, Polymerstoffe, sowie Kombinationen aus mehreren der genannten Materialien, insbesondere Legierungen oder Verbundstoffe, wie Au/Pd, Ag/Pd, Au Cr.
6. Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Template auf dem Trägermaterial immobilisiert ist.
7. Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Strukturbildner eine Verbindung der Form HS-X, S=X, X-S-S-Y oder XSi(R)3 ist, wobei X und Y beliebige Molekülfragmente darstellen, insbesondere funktionalisierte oder unfunktionalisierte Alkylreste und R für -OH oder ein und/oder mehrere identische und/oder verschiedene Halogene steht.
8. Verfahren zur Herstellung einer Oberfläche mit vorbestimmter Affinität dadurch gekennzeichnet, daß ein Träger mit Trägermaterial beschichtet wird und anschließend in eine Lösung, die mindestens ein Template und mindestens einen Strukturbildner enthält, getaucht wird, wodurch Template und Schichtbildner auf der Trägeroberfläche adsorbiert und/oder immobilisiert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Strukturbildner zusammen mit dem Template-Moleküle eine Bindungsstelle bildet.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial eine feste Substanz ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Trägermaterial ein Metall, ausgewählt aus der Gruppe Au, Pt, Pd, ein Halbleiter, ausgewählt aus der Gruppe GaAs, Si, Ge, ein organisches oder anorganisches Material ausgewählt aus der Gruppe Quarz, Glas, Polymerstoffe, sowie eine Kombination aus mehreren der hier genannten Materialien, insbesondere Legierungen oder Verbundstoffe, wie Au/Pd, Ag/Pd, Au Cr ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Template auf dem Trägermaterial immobilisiert ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Strukturbildner eine Verbindung der Form HS-X, S=X, X-S-S-Y oder XSi(R)3 ist, wobei X und Y beliebige Molekülfragmente darstellen, vorzugsweise funktionalisierte
und/oder unfunktionalisierte Alkylreste und R für -OH oder ein und/oder mehrere identische und/oder verschiedene Halogene steht.
14. Nachweissystem umfassend die Oberfläche mit vorherbestimmter Affinität nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Oberfläche auf einem Träger aufgebracht ist, diese Anordnung wird in eine Zelle, in der sich eine Lösung mit der nachzuweisenden Substanz befindet, getaucht und die nachzuweisende Substanz tritt mit der aus dem Template und dem Strukturbildner gebildeten Bindungsstelle in Wechselwirkung, wobei sich die Schichtdicke auf der Oberfläche ändert und diese Änderung detektiert wird.
15. Nachweisssystem nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Änderung der Schichtdicke durch die Änderung der Kapazität, der Resonanzfrequenz, der Impedanz, der Voltametrie, der Oberflächenplasmonresonanz, der Interferometrie, der Ellipsometrie oder der Fluoreszenz nachgewiesen wird.
16. Verwendung der Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Auftrennung und/oder Reinigung von Gemischen als stationäre Phase in der Chromatographie oder Elektrophorese.
17. Verwendung der Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 7 für katalytische Zwecke zur enatioselektiven Katalyse, vorzugsweise für elektrochemische Katalysen.
18. Verwendung der Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als Elektrode für elektrochemische Katalysen und/oder elektrochemische Analysen.
19. Verwendung der Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in der chemischen, der medizinischen, biologischen Analytik, in der Lebensmittelanalytik, der Umweltanalytik.
20. Verwendung der Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als Rezeptorschicht in der Chemo- und Biosensorik.
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