DE102007005472B4

DE102007005472B4 - Verfahren und Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte

Info

Publication number: DE102007005472B4
Application number: DE102007005472A
Authority: DE
Inventors: Kenji Kawasaki Arinaga; Ulrich Rant; Erika Pringsheim; Jelena Knezevic
Original assignee: Technische Universitaet Muenchen; Fujitsu Ltd
Current assignee: Technische Universitaet Muenchen; Fujitsu Ltd
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2007-01-30
Publication date: 2011-06-09
Anticipated expiration: 2027-01-31
Also published as: JP4833679B2; JP2007202451A; US20080003666A1; DE102007005472A1; US8568966B2

Abstract

Ein Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte, enthaltend:
Ausbilden eines aus Molekülen zusammengesetzten molekularen Films auf einem leitfähigen Substrat,
wobei das Molekül einen Bereich enthält, der an wenigstens einen Teil des leitfähigen Substrats und einen Fluoreszenzfarbstoff zu binden vermag, gekennzeichnet durch
Einstellen einer molekularen Dichte des molekularen Films durch Anlegen eines elektrischen Potentials an das leitfähige Substrat mit Überwachung der molekularen Dichte auf dem leitenden Substrat unter Verwendung einer Fluoreszenzintensität, die durch den Fluoreszenzfarbstoff erzeugt wird, als Indikator, um so Moleküle zu desorbieren und die molekulare Dichte des molekularen Films zu reduzieren.

Description

QUERVERWEIS AUF DAMIT IM ZUSAMMENHANG STEHENDE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung basiert auf und nimmt die Vorteile der Priorität der früheren, am 31. Januar 2006 angemeldeten Japanischen Patentanmeldung Nr. 2006-023715 in Anspruch, deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme inkorporiert wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte, der für Biochips, wie beispielsweise einen DNA-Chip, verwendet wird.
Beschreibung des Stands der Technik
Nanotechnologie ist kürzlich ein Schlüsselwort geworden, das bei vielen Menschen große Aufmerksamkeit erregt hat, teilweise aufgrund des Einflusses einer Nanotechnologieinitiative, die in den Vereinigten Staaten im Jahr 2000 vorgeschlagen wurde.
In der Nanotechnologie ist Nanobiotechnologie, ein interdisziplinärer Bereich zwischen Halbleitermikrobearbeitungstechnologie (Halbleiter-Nanotechnologie) und Biotechnologie, ein neues Feld, das starke Lösungen für herkömmliche Probleme hervorbringen kann, und auf diesem Feld wird aktiv Forschung und Entwicklung betrieben.
In der Nanobiotechnologie erregen Biochips, die durch DNA-Chips (oder DNA-Microarrays) repräsentiert sind, Aufmerksamkeit als ein wirksames Mittel auf dem Gebiet wie zum Beispiel klinische Diagnose und Arzneimitteltherapie. Der Biochip enthält ein aus Gläsern, Silicium, Kunststoffen, Metall, etc. gemachtes Substrat, auf dem eine große Anzahl an verschiedenen Testsubstanzen aus Biomakromolekülen, wie zum Beispiel DNA und Protein, mit einer hohen Dichte aufgebracht und angeordnet ist. Derartige Biochips können Untersuchung von Nucleinsäuren und Proteinen vereinfachen und sind besonders effektiv für genetische Analyse. (Siehe ”Electrochemical DNA sensors” T. G. Drummond et al., Nature Biotech., 2003, Band 21, Nr. 10, 1192–1199, und ”SURVEY AND SUMMARY From DNA biosensors to gene chips” J. Wang, Nucleic Acids Research, 2000, Band 28, Nr. 16, 3011–3016).
In den vergangenen Jahren wurde auch Vorrichtungen mit der Bezeichnung ”MEMS” oder ”μTAS” Aufmerksamkeit geschenkt, die die Nachweisempfindlichkeit und die Zeitdauer für den Nachweis im Vergleich zu den herkömmlichen Vorrichtungen stark verbessert haben. Derartige Vorrichtungen werden teilweise hergestellt durch Befestigen von Molekülen, die an funktionelle Moleküle gebunden sind, an ein festes Substrat, um eine funktionelle Oberfläche auszubilden (Nachweiselement), wobei Mikro-Materialbearbeitungstechnologie und Mikro-Nachweistechnologie integriert sind und Techniken zum Nachweisen von sehr kleinen Analyten verwendet werden. Der Ausdruck ”MEMS” ist die Abkürzung von Micro Electro Mechanical Systems (Elektromechanische Mikrosysteme), das heißt, eine Technologie zum Herstellen von mikroskopisch kleinen Gegenständen auf Grundlage von Halbleiterverarbeitungstechnologie, oder mikroskopisch kleinen, präzisen Vorrichtungen, die unter Verwenden der Technologie hergestellt werden. Im Allgemeinen ist es ein System, bei dem eine Mehrzahl an funktionellen Komponenten, wie zum Beispiel mechanische, optische und hydrodynamische Komponenten integriert und miniaturisiert sind. Der Ausdruck ”μTAS” ist eine Abkürzung von Micro Total Analysis System (Mikro-Gesamtanalysesystem) und ist ein chemisches Analysesystem, bei dem Mikropumpen, Mikroventile, Sensoren etc. miniaturisiert, akkumuliert und integriert sind. Im Allgemeinen weisen diese Vorrichtungen eine funktionelle Oberfläche auf, in der funktionelle Moleküle, die eine spezielle Funktion aufweisen, oder Moleküle, die an die funktionellen Moleküle gebunden sind, immobilisiert sind oder an ein Substrat über ein Schwefelatom auf eine selbstordnende Weise gebunden sind. Bei diesen Vorrichtungen wird Reaktion bei der funktionellen Oberfläche elektrisch oder optisch ausgewertet, und es ist zusätzlich möglich durch Anlegen eines externen elektrischen Signals unter Verwenden des Substrats, auf dem Moleküle immobilisiert sind, als eine Elektrode, die Reaktion bei der funktionellen Oberfläche zu fördern oder das Signal zu verstärken, das aus der Reaktion resultiert (Siehe ”Dynamic Electrical Switching of DNA Layers an a Metal Surface” U. Rant et al., Nano Lett., 2004, Band 4, Nr. 12, 2441–2445, und ”Electrostatic surface plasmon resonance: Direct electric field-induced hybridization and denaturation in monolayer nucleic acid films und label-free discrimination of base mismatches” R. J. Heaton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, Band 98, Nr. 7, 3701–3704).
Bei solchen Vorrichtungen ist Immobilisierung der funktionellen Moleküle auf einem Substrat (Elektrode) eine wichtige elementare Technologie. Bei einer solchen Technologie hat eine Technik zum Ausbilden einer selbstgeordneten Monoschicht (SAM), bei der eine selbstgeordnete Monoschicht auf dem Substrat (Elektrode) über ein Schwefelatom ausgebildet ist, viele Vorteile, da die Technik es ermöglicht, dass die funktionellen Moleküle auf dem Substrat (Elektrode) mit geringen Kosten und mit Leichtigkeit immobilisiert oder gebunden werden. Daher ist die Technik besonders effektiv zum Ausbilden einer dichten Monoschicht.
Wenn die funktionellen Moleküle auf dem Substrat (Elektrode) jedoch als eine dichte Monoschicht immobilisiert oder gebunden werden, gibt es das folgende Problem. Genauer ausgedrückt, wenn zum Beispiel eine Bindung zwischen dem funktionellen Molekül und einem Zielmolekül beobachtet wird, oder wenn das immobilisierte oder gebundene Molekül an ein größeres Zielmolekül gebunden ist, verursacht räumliche Behinderung zwischen benachbarten funktionellen Molekülen ein größeres Problem.
Zum Beispiel in dem Fall eines DNA-Chips, bei dem eine Ziel-DNA als das Zielmolekül dient und eine zu der Ziel-DNA komplementäre DNA als das funktionelle Molekül dient, sinken Hybridisierungseffizienzen in Abhängigkeit von der Zunahme der Dichte der immobilisierten oder gebundenen komplementären DNA (Siehe ”The effect of surface probe density an DNA hybridization” A. W. Peterson et al., Nucleic Acids Research, 2001, Band 29, Nr. 24, 5163–5168). Mit der Zunahme der Dichte des immobilisierten oder gebundenen funktionellen Moleküls (komplementäre DNA), nimmt räumliche Behinderung zwischen den funktionellen Molekülen (komplementäre DNAs) zu, was zu der Abnahme des Raums führt, der für Hybridisierung benötigt wird, und das Phänomen der Abnahme der Hybridisierungseffizienz verursacht. Daher ist es bei dem DNA-Chip erforderlich, die Dichte der komplementären DNA (funktionelles Molekül) als eine Sonde, die auf einem Substrat (Elektrode) immobilisiert oder gebunden ist, auf einen gewünschten Grad zu steuern.
Früher wurde die Dichte des auf einem Substrat (Elektrode) immobilisierten oder gebundenen funktionellen Moleküls zum Beispiel auf durch die folgenden bekannten Verfahren gesteuert: (1) ein Verfahren unter Verwendung von Zeit als einen Indikator, bei dem die Dichte durch Berücksichtigen der Diffusionszeit der funktionellen Moleküle auf dem Substrat (Elektrode) gesteuert wird; und (2) ein Verfahren, das verwendet wird, wenn das funktionelle Molekül ein geladenes Molekül ist, bei dem die Dichte durch Verwenden der Abschirmwirkung des Gegenions (Debye-Abschirmwirkung) gesteuert wird. Durch diese Verfahren wurde die selbstgeordnete Monoschicht als ein Film ausgebildet, in dem funktionelle Moleküle in einem gewissen Grad dispergiert sind.
Um die Dichte der immobilisierten oder gebundenen funktionellen Moleküle relativ niedrig zu machen, müssen beide Verfahren jedoch unter sehr strengen Bedingungen durchgeführt werden, da in dem Fall des Verfahrens (1) Diffusion der funktionellen Moleküle proportional zu der Quadratwurzel der Zeit ist, und in dem Fall des Verfahrens (2) die Abschirmwirkung proportional zu der Quadratwurzel der Konzentration des Gegenions ist (Siehe ”In Situ Kinetics of Self-Assembly by Surface Plasmon Resonance Spectroscopy” K. A. Peterlinz et al., Langmuir, 1996, Band 12, Nr. 20, 4731–4740, und ”Characterization of DNA Probes Immobilized an Gold Surfaces” T. M. Herne et al., J. Am. Chem. Soc., 1997, Band 119, No. 38, 8916–8920, und ”Effective Size Determining Method of Molecule, Method for Bonding Molecule to Substrate, and Molecule Detection Device”, Japanische Patentanmeldung 2006-58094 ).
Somit besteht gegenwärtig der Wunsch nach der Entwicklung einer Technik, die die Dichte des Films an funktionellen Molekülen (z. B. DNA-Moleküle), der für Biochips, wie zum Beispiel einem DNA-Chip verwendet wird, effizient und leicht auf einen gewünschten Grad einstellen kann.
Zum technologischen Hintergrund der Erfindung werden die US 5 635 047 A , die WO 2004/005582 A2 und die US 6 514 762 B1 genannt. Diese Druckschriften legen weder einzeln noch in Kombination betrachtet das kennzeichnende Merkmal des Anspruchs 1 nahe.
Im Hinblick auf die oben erwähnte gegenwärtige Situation wurde die vorliegende Erfindung gemacht, und es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die bisherigen Probleme zu lösen und die folgenden Ziele zu erreichen. Genauer ausgedrückt ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Technik zur Verfügung zu stellen, die die molekulare Dichte des Films funktioneller Moleküle (z. B. DNA-Moleküle), der für Biochips, wie zum Beispiel einen DNA-Chip, verwendet wird, effizient und leicht auf einen gewünschten Grad einstellen kann, mit anderen Worten, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte, der für Biochips, wie zum Beispiel einen DNA-Chip, geeignet ist, zur Verfügung zu stellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte und eine Vorrichtung zur Herstellung eines solchen Films ist durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche 1 bzw. 8 gelöst.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte wird bei dem Ausbilden eines molekularen Films ein molekularer Film auf einem leitfähigen Substrat ausgebildet, der aus Molekülen zusammengesetzt ist, wobei das Molekül einen Bereich einschließt, der sich wenigstens an einen Teil des leitfähigen Substrats zu binden vermag. Bei der Einstellung der Dichte wird eine molekulare Dichte des molekularen Films eingestellt durch Desorbieren eines Teils der Moleküle, die den molekularen Film bilden, von dem leitfähigen Substrat. Der auf diese Weise hergestellte molekulare Film weist eine verringerte molekulare Dichte auf, die im Vergleich mit dem beim Ausbilden des molekularen Films ausgebildeten molekularen Films durch die Desorption von Molekülen von dem molekularen Film auf einen gewünschten Bereich eingestellt ist. Folglich werden, wenn dieser molekulare Film für eine Vielfalt an Messungen, Analysen, etc. verwendet wird, die Bewegung und Funktion der individuellen Moleküle des molekularen Films ausreichend gezeigt, und es können die Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit (orig.: ”quantitative ability”) des molekularen Films beachtlich verbessert werden, was es ermöglicht, dass Messung, Analyse etc. mit großer Genauigkeit stabil wiederholt werden können.
Die Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte schließt eine Dichteeinstelleinheit ein, die so konfiguriert ist, dass sie einen Teil der Moleküle, die einen molekularen Film bilden, von einem leitfähigen Substrat desorbieren, um dadurch eine molekulare Dichte des molekularen Films einzustellen, wobei der molekulare Film auf dem leitfähigen Substrat ausgebildet ist und das Molekül einen Bereich enthält, der sich wenigstens an einen Teil des leitfähigen Substrats zu binden vermag.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte desorbiert die Dichteeinstelleinheit einen Teil der Moleküle, die einen molekularen Film bilden, von einem leitfähigen Substrat, um dadurch eine molekulare Dichte des molekularen Films einzustellen, wobei der molekulare Film auf dem leitfähigen Substrat ausgebildet ist und das Molekül einen Bereich enthält, der sich wenigstens an einen Teil des leitfähigen Substrats zu binden vermag. Der auf diese Weise erzeugte molekulare Film weist eine verringerte molekulare Dichte auf, die im Vergleich zu dem molekularen Film vor der Einstellung der molekularen Dichte durch die Dichteeinstelleinheit aufgrund der Desorption von Molekülen von dem molekularen Film auf einen erwünschten Bereich eingestellt ist. Folglich werden, wenn dieser molekulare Film für eine Vielfalt an Messungen, Analysen, etc. verwendet wird, die Bewegung und Funktion der individuellen Moleküle des molekularen Films ausreichend gezeigt, und es können die Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit (orig.: ”quantitative ability”) des molekularen Films beachtlich verbessert werden, was es ermöglicht, dass Messung, Analyse etc. mit großer Genauigkeit stabil wiederholt werden können.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Graph, der eine Beziehung zwischen dem an einem leitfähigen Substrat oder einer Elektrodenschicht (Elektrode) angelegten elektrischen Potential (V) und dem Desorptionsgrad (%) des von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht desorbierten Moleküls zeigt.
2 ist ein Graph, der eine Echtzeitveränderung bei der molekularen Dichte (Moleküle/cm²) der Moleküle auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht zeigt, wenn ein spezielles Desorptionspotential angelegt ist.
3 ist eine schematische Darstellung zum Beschreiben eines Beispiels der Vorrichtung, wobei die Moleküle (DNAs), die einen Fluoreszenzfarbstoff (Fluoreszenzmarkierung) in einem Molekül davon enthalten, auf einer Goldelektrode (das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht) immobilisiert oder gebunden sind, die Moleküle durch eine Lichtleitfaser (Faser für einfallendes Licht) mit Licht einer Wellenlänge bestrahlt werden, bei der der Fluoreszenzfarbstoff zum Emittieren von Licht angeregt werden kann, und eine Lichtleitfaser (Licht empfangende Faser) zur Verfügung gestellt ist, die die Emission durch den Fluoreszenzfarbstoff (Fluoreszenzmarkierung) feststellt.
4 ist ein Graph, der einen Messwert der Beziehung zwischen der molekularen Dichte (Moleküle/cm²) der Moleküle (DNAs) auf einer Goldelektrode und die durch den an das Molekül (DNA) gebundenen Fluoreszenzfarbstoff (Fluoreszenzmarkierung) erzeugte Fluoreszenzintensität (willkürliche Einheit) zeigt, wobei ein elektrisches Potential von –0,2 V an der Goldelektrode (dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht) angelegt ist, durch das das negativ geladene Molekül (DNA) ausgedehnt ist.
5 ist ein Graph, der einen Desorptionsgrad (%) des Moleküls (DNA) in dem Fall zeigt, bei dem die auf einer Goldelektrode (dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht) über ein Schwefelatom (S) immobilisierten oder gebundenen Moleküle (DNAs) durch Anlegen eines Reduktionspotentials an die Goldelektrode desorbiert werden.
6 ist ein Graph, der ein Ergebnis des Experiments zeigt, bei dem die molekulare Dichte des molekularen Films aus DNAs mit einer anfänglichen molekularen Dichte of 1 × 10¹² cm^–2 auf 2 × 10¹¹ cm^–2 verringert wurde.
7 ist ein Graph, der zeigt, dass, während die Fluoreszenz durch einen Fluoreszenzfarbstoff eines Moleküls, das den Fluoreszenzfarbstoff (Fluoreszenzmarkierung) enthält, überwacht wurde, drei Mal ein elektrisches Potential (Reduktionspotential) von –0,6 V an eine Goldelektrode (das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht) angelegt wurde, und die molekulare Dichte des molekularen Films der auf der Goldelektrode immobilisierten oder gebundenen Moleküle schrittweise verringert wird.
8 ist ein Graph, der ein Ergebnis des Experiments zeigt, wobei unter Verwendung der Erfindung die Desorption von DNA, deren Bindung an eine Goldelektrode durch Reduktion gespalten wurde, durch Zugabe von MCH erleichtert wurde.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
(Verfahren und Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte)
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte enthält einen Schritt zum Ausbilden eines molekularen Films und einen Dichteeinstellschritt, und kann ferner, sofern erforderlich, weitere in geeigneter Weise ausgewählte Schritte enthalten.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte enthält eine Dichteeinstelleinheit und kann ferner, sofern erforderlich, weitere in geeigneter Weise ausgewählte Einheiten enthalten, zum Beispiel eine Einheit zum Ausbilden eines molekularen Films.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte kann in geeigneter Weise unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte durchgeführt werden. Während das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nachfolgend erläutert wird, wird auch die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte durch die Erläuterung detailliert beschrieben.
– Schritt zum Ausbilden eines molekularen Films und Einheit zum Ausbilden eines molekularen Films –
Der Schritt zum Ausbilden eines molekularen Films ist ein Schritt, bei dem ein aus Molekülen zusammengesetzter molekularer Film auf einem leitfähigen Substrat ausgebildet wird, wobei das Molekül einen Bereich enthält, der an wenigstens einen Teil des leitfähigen Substrats zu binden vermag. Der Schritt zum Ausbilden eines molekularen Films kann in geeigneter Weise durch die Einheit zum Ausbilden eines molekularen Films der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte ausgeführt werden.
Die Einheit zum Ausbilden eines molekularen Films ist eine Einheit, die so konfiguriert ist, dass sie einen aus Molekülen zusammengesetzten molekularen Film auf einem leitfähigen Substrat ausbildet, wobei das Molekül einen Bereich enthält, der an wenigstens einen Teil des leitfähigen Substrats zu binden vermag.
– Leitfähiges Substrat –
Das leitfähige Substrat ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Seine Struktur kann zum Beispiel eine einschichtige Struktur oder eine mehrschichtige Struktur sein. Das leitfähige Substrat kann gänzlich aus einem leitfähigen Material gebildet sein, oder das leitfähige Substrat kann so aufgebaut sein, dass eine aus einem leitfähigen Material gemachte Elektrodenschicht auf einem isolierenden Substrat zur Verfügung gestellt ist.
Die Form, Struktur, Größe, Oberflächenbeschaffenheit, Anzahl und dergleichen des leitfähigen Substrats, isolierenden Substrats, oder der Elektrodenschicht sind nicht besonders beschränkt und können in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Beispiel der Form schließen eine flache Plattenform, Kreisform und Ellipsenform ein. Die Größe ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung festgelegt sein. Beispiele der Oberflächenbeschaffenheit schließen eine glatte Oberfläche und eine raue Oberfläche ein. Diese können allein oder in Kombination verwendet werden.
Beispiel von geeignetem Material für das isolierende Substrat schließen Quarzglas, Silicium, Siliciumoxid, Siliciumnitrid und Saphir ein. Diese können allein oder in Kombination verwendet werden.
Das Material für das leitfähige Material oder die Elektrodenschicht ist nicht besonders beschränkt, solange es leitfähig ist; Beispiele davon schließen Metalle, Legierungen, leitfähige Harze und Kohlenstoffverbindungen ein. Beispiele des Metalls schließen Gold, Platin, Silber, Kupfer und Zink ein. Beispiele der Legierung schließen Legierungen von zwei oder mehr unterschiedlichen Metallen ein, die oben beispielhaft als die Metalle genannt sind. Beispiele des leitfähigen Harzes schließen Polyacetylen, Polythiophen, Polypyrrol, Polyphenylen, Polyphenylenvinylen und Polyanilin ein. Beispiele der Kohlenstoffverbindung schließen leitfähigen Kohlenstoff und leitfähigen Diamanten ein. Diese können allein oder in Kombination verwendet werden.
Wenn die Elektrodenschicht auf dem isolierenden Substrat zur Verfügung gestellt ist, kann zum Verbessern der Adhäsion zwischen der Elektrodenschicht und dem isolierenden Substrat eine Haftschicht dazwischen ausgebildet sein.
Das Material, die Form, Struktur, Dicke, Größe und dergleichen der Haftschicht sind nicht besonders beschränkt und können in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Beispiele des Materials schließen Chrom und Titan ein. Die Struktur ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Sie kann eine einschichtige Struktur oder kann eine mehrschichtige Struktur sein.
Die Größe, Form und dergleichen der Elektrodenschicht kann in geeigneter Weise auf einen gewünschten Grad durch Beschichten der Oberfläche mit einem isolierenden Film eingestellt werden, um nur einen Teil der Elektrodenschicht freiliegend zu machen. Die Anzahl der Elektrodenschicht ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Sie kann eine sein oder kann zwei oder mehr sein.
Das Material, Form, Struktur, Dicke, Größe und dergleichen des isolierenden Films sind nicht besonders beschränkt und können in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung aus jenen aus dem Stand der Technik bekannten ausgewählt sein.
Beispiele an geeignetem Material schließen amorphes Glas, Oxide oder Nitride, wie zum Beispiel nicht-dotiertes oder dotiertes SiO₂ oder SiN_x und hochmolekulare Verbindungen, wie zum Beispiel Polyimid und Photoresist ein. Beispiele des Photoresistmaterials schließen g-Linieresiste, i-Linieresiste, KrF-Resiste, ArF-Resiste, F₂-Resiste und Elektronenstrahlresiste ein.
Um ein elektrisches Potential an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht (Arbeitselektrode) anzulegen, ist bei der Erfindung bevorzugt eine Gegenelektrode, Bezugselektrode oder dergleichen zur Verfügung gestellt, die von jenen Arbeitselektroden verschieden sind. Eine solche Elektrode kann eine oder können zwei oder mehr sein. Die Gegenelektrode ist so angeordnet, dass sie dem leitfähigen Substrat oder der Elektrode (Arbeitselektrode) gegenüber angeordnet ist und ist eine Elektrode zum Anlegen eines elektrischen Potentials an diese. Die Bezugselektrode ist eine Elektrode zum Einstellen des elektrischen Potentials zwischen dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht (Arbeitselektrode). Einstellen des elektrischen Potentials unter Verwenden der Bezugselektrode ist als ein Dreielektrodenverfahren bekannt.
Wenn zwei oder mehr von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht (Arbeitselektrode) zur Verfügung gestellt sind, macht es willkürliches und mit einer unterschiedlichen zeitlichen Festlegung durchgeführtes Anlegen oder Variieren des elektrischen Potentials an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht (Arbeitselektrode) möglich, die auf jeder Arbeitselektrodenschicht immobilisierten oder gebundenen Moleküle bei einer unterschiedlichen zeitlichen Festlegung zu desorbieren.
– Molekül –
Das Molekül ist nicht besonders beschränkt, so lange es einen Bereich enthält, der an wenigstens einen Teil des leitfähigen Substrats oder der Elektrodenschicht zu binden vermag und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein.
Das Binden an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein; Beispiele davon schließen elektrische Bindung, chemische Bindung und Adsorption ein. Die chemische Bindung ist bevorzugt, da die Desorption von einigen der Moleküle, die einen molekularen Film bilden, von dem in dem Dichteeinstellschritt aus den Molekülen ausgebildeten molekularen Film leicht gesteuert werden kann. Von den chemischen Bindungen sind Schwefelatom-enthaltende (S = Schwefel) Bindungen im Hinblick auf Steuerung der Spaltung, etc. bevorzugt, und insbesondere am meisten bevorzugt ist Binden von einem Molekül, das eine Thiolbindung (-SH-), Disulfidbindung (-S-S-) oder dergleichen enthält, mit dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht. Wenn ein Molekül, das die Thiolbindung (-SH-) oder Disulfidbindung (-S-S-) enthält, an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht gebunden ist, führt das Anlegen eines spezifischen elektrischen Potentials an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht zu der Spaltung der Bindung zwischen dem Schwefelatom (S) und dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht, was die Desorption von einigen der Moleküle, die den molekularen Film bilden, von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht verursacht. Wenn der molekulare Film ein dichter Film an Molekülen ist, wird als ein Ergebnis die molekulare Dichte des molekularen Films durch die Desorption von einigen der Moleküle verringert und auf einen gewünschten Grad eingestellt.
Das Molekül kann ohne Einschränkung irgendeine Form aufweisen und die Form kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein; Beispiele davon schließen linear, körnig, plattenförmig und eine Kombination von zwei oder mehr von diesen ein. Von diesen sind linear oder dergleichen bevorzugt.
Das Molekül kann ohne Einschränkung irgendein Molekül sein und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Zum Beispiel sind in Bezug auf Anwendung bei der Behandlung, Diagnose, etc. von Krankheit Biomoleküle und dergleichen geeignet. In beiden Fällen, bei denen das Molekül ein Biomolekül oder ein anderes Molekül ist, werden in dem Dichteeinstellschritt einige der Moleküle, die den molekularen Film bilden, desorbiert, um die molekulare Dichte des molekularen Films auf einen gewünschten Grad einzustellen. Wenn der resultierende molekulare Film als ein Sensor, etc. verwendet wird, ist es bevorzugt, dass das Verhalten der Moleküle, die den molekularen Film bilden, elektrisch gesteuert werden kann. Um einen solchen molekularen Film zu erzielen sind die Moleküle, die den molekularen Film bilden, bevorzugt in der Lage, mit dem leitfähigen Substrat elektrisch zu interagieren. Geeignete Beispiele von einem solchen Molekül schließen geladene Moleküle ein. Beispiele des geladenen Moleküls schließen ionische Polymere ein. Beispiele des ionischen Polymers schließen kationische Polymere und anionische Polymere ein. Beispiele eines geeigneten kationischen Polymers (positiv geladenes ionisches Polymer) schließen Guanidin-DNAs und Polyamine ein. Beispiele eines geeigneten anionischen Polymers (negativ geladenes ionisches Polymer) schließen Polynucleotide und Polyphosphorsäuren ein. Diese sind bevorzugt, da die Interaktion (z. B. Binden) mit dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht leicht gesteuert werden kann, da in dem Molekül bei einem spezifischen Intervall negative Ladung vorhanden ist. Diese Moleküle können allein oder in Kombination verwendet werden.
Bei der Erfindung sind Polynucleotide, die die Thiolbindung (-SH-) oder Disulfidbindung (-S-S-) in einem Teil des Moleküls enthalten, bevorzugt, und DNAs, RNAs und Komplexe von diesen und Proteine, die die Thiolbindung (-SH-) oder Disulfidbindung (-S-S-) an ihren Enden enthalten, sind am meisten bevorzugt. Die DNA und RNA kann einsträngig oder doppelsträngig sein.
Die Größe oder Länge des Moleküls ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung festgelegt sein. Wenn das Molekül das Polynucleotid ist, besteht es bevorzugt aus wenigstens 6 Basen.
Das Molekül enthält bevorzugt einen Zieleinfangteil, der ein Ziel in Bezug auf Verwendung des molekularen Films, der aus den Molekülen gebildet ist, für Diagnose, Analyse, etc. einzufangen vermag. Spezielle Beispiele des Zieleinfangteils schließen Antikörper, Antigene, Enzyme und Coenzyme für das Ziel ein. Die Anzahl des Zieleinfangteils pro Molekül des Einfangmittels ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Seine Anzahl kann ein oder zwei oder mehr sein. Die Position des Zieleinfangteils in dem Einfangmittel ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Wenn der Interaktionsteil linear ist, ist seine Position zum Beispiel sein Ende oder dergleichen. Wenn der Interaktionsteil ein Polynucleotid ist, kann die Position das 3'-Ende oder kann das 5'-Ende sein.
Das Ziel ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein; Beispiele davon schließen organische Moleküle ein. Beispiele des organischen Moleküls schließen Proteine, Plasmaproteine, Tumormarker, Apoproteine, Viren, Autoantikörper, Gerinnungs- oder fibrinolytische Faktoren, Hormone, Medikamente im Blut, Nucleinsäuren, HLA-Antigene, Lipoproteine, Glycoproteine, Polypeptide, Fette, Polysaccharide und Lipopolysaccharide ein.
Zusätzlich enthält das Molekül bevorzugt einen lichtemittierenden Teil, der bei Bestrahlung mit Licht Licht zu emittieren vermag, wenn das Molekül von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht desorbiert ist, oder der bei Bestrahlung mit Licht Licht zu emittieren vermag, während das Molekül auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht immobilisiert oder gebunden ist. Dies ist vorteilhaft, da Diagnose, etc. mit den Augen oder optischen Detektoren durchgeführt werden kann. Beispiele des optischen Detektors schließen Photomultiplier, Photodioden, Phototransistoren und Fluoreszenzmikroskope ein.
Die Anzahl des lichtemittierenden Teils pro Molekül ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein; sie beträgt wenigstens eins und kann zwei oder größer sein. Die Position des lichtemittierenden Teils in dem Molekül ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Wenn der Bereich, der zu interagieren vermag, linear ist, ist die Position zum Beispiel sein Ende oder dergleichen. Wenn der Bereich, der zu interagieren vermag, ein Polynucleotid ist, kann die Position das 3'-Ende oder kann das 5'-Ende sein.
Der lichtemittierende Teil ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein; geeignete Beispiele davon schließen Fluoreszenzfarbstoffe, Metalle und Halbleiternanokügelchen ein.
Wenn die Elektrode für Adsorption und Desorption aus Metall gemacht ist, wie zum Beispiel eine Metallelektrode, sind Fluoreszenzfarbstoffe, die in geeignetster Weise als der lichtemittierende Teil verwendet werden können, so, dass sie während einer Interaktion mit dem Metall kein Licht emittieren (zum Beispiel während sich das Molekül nahe bei dem Metall befindet) selbst wenn sie mit Licht bestrahlt werden, das eine Wellenlänge aufweist, bei der der Fluoreszenzfarbstoff Licht zu absorbieren vermag, dass sie aber, wenn keine Interaktion mit dem Metall gegeben ist (zum Beispiel, wenn das Molekül von dem Metall entfernt ist), bei Bestrahlung mit Licht, das eine Wellenlänge aufweist, bei der der Fluoreszenzfarbstoff Licht zu absorbieren vermag, Licht unter Verwenden der Lichtenergie emittieren können. Der Fluoreszenzfarbstoff ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise aus den im Stand der Technik bekannten in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Beispiele eines geeigneten Fluoreszenzfarbstoffs schließen durch die folgende Strukturformel 1 ausgedrückte Verbindungen ein. Strukturformel 1
Das Verfahren zum Synthetisieren des Moleküls ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Zum Beispiel kann das Molekül durch irgendein Verfahren synthetisiert werden, wie zum Beispiel ein chemisches Syntheseverfahren und ein fermentatives Herstellungsverfahren. Das Molekül kann entweder ein synthetisiertes oder ein kommerziell erhältliches sein.
Als das Molekül, das in dem auszubildenden molekularen Film unter Verwendendes Moleküls enthalten ist, kann nur eine Art von Molekül verwendet werden oder es können zwei oder mehr Arten von Molekülen verwendet werden. Wenn zwei oder mehr Arten von Molekülen verwendet werden, können unterschiedliche Arten von Molekülen statistisch verteilt in einer dispergierten Art vorhanden sein, oder können in einem getrennten Bereich vorhanden sein.
– Molekularer Film –
Der molekulare Film ist aus den Molekülen ausgebildet und kann eine Monoschicht oder eine Mehrfachschicht der Monoschichten sein. Damit er seine Funktion leicht durchführen kann und zu dem Zweck einer leichten Steuerung seiner Funktion ist bei der Erfindung der molekulare Film bevorzugt eine Monoschicht.
Der molekulare Film kann auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht ohne Beschränkung durch irgendein Verfahren ausgebildet werden und das Verfahren kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Beispiele davon schließen die Langmuir Blodgett Technik (LG-Technik), Rotationsbeschichtungsverfahren und Tauchverfahren ein. Von diesen sind die in ”Formation and Structure of Self-Assembled Monolayers” A. Ulman, Chem. Rev., 1996, Band 96, Nr. 4, 1533–1554” beschriebenen Verfahren am meisten bevorzugt. Wenn der molekulare Film durch diese Ausbildungsverfahren ausgebildet wird, sind die Moleküle bevorzugt in einer Flüssigkeit dispergiert oder gelöst. In diesem Fall ist die Flüssigkeit nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Beispiele davon schließen Flüssigkeiten ein, die Wasser, Alkohol oder ein oberflächenaktives Mittel enthalten. In dem molekularen Film, der auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht mittels dieser Ausbildungsverfahren ausgebildet wird, ist ein Teil des Moleküls an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht über eine chemische Bindung gebunden und ist das Molekül auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht immobilisiert. Wenn das Molekül die Thiolbindung (-SH-) oder Disulfidbindung (-S-S-) enthält, wird leicht eine Bindung zwischen der Stelle der Thiolbindung (-SH-) oder Disulfidbindung (-S-S-) und dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht ausgebildet. In diesem Fall sind die Moleküle, die den molekularen Film bilden, auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht über das in dem Molekül vorhandenen Schwefelatom (S) der Thiolbindung (-SH-) oder Disulfidbindung (-S-S-) durch eine chemische Bindung immobilisiert. Somit ist der bei dem Schritt zum Ausbilden eines molekularen Films ausgebildete molekulare Film typischer Weise eine selbstordnende Monoschicht (SAM) der Moleküle und ist dicht gepackt.
Wenn der molekulare Film ein dichter Film ist, reduziert die Verwendung des molekularen Films zur Analyse, Diagnose, etc. zum Beispiel die Beweglichkeit eines jeden Moleküls, das den molekularen Film bildet, was Probleme verursacht, wie zum Beispiel Verringerung der Empfindlichkeit.
Daher wird bei der Erfindung der molekulare Film, der in dem Schritt zum Ausbilden eines molekularen Films ausgebildet wird, dem nachfolgenden Dichteeinstellschritt unterzogen, durch den die Moleküle, die den molekularen Film bilden, von dem molekularen Film desorbiert werden, um die molekulare Dichte des molekularen Films auf einen erwünschten Grad einzustellen.
– Dichteeinstellschritt und Dichteeinstelleinheit –
Der Dichteeinstellschritt ist ein Schritt, bei dem ein Teil der Moleküle, die den molekularen Film bilden, von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht desorbiert werden, um dadurch eine molekulare Dichte des molekularen Films einzustellen. Der Dichteeinstellschritt kann in geeigneter Weise durch die Dichteeinstelleinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte ausgeführt werden.
Die Dichteeinstelleinheit ist eine Einheit, die konfiguriert ist, um einen Teil der Moleküle, die einen molekularen Film bilden, von einem leitfähigen Substrat zu desorbieren, um dadurch eine molekulare Dichte des molekularen Films einzustellen, wobei der molekulare Film auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht ausgebildet ist und das Molekül einen Bereich enthält, der wenigstens an einen Teil des leitfähigen Substrats oder der Elektrodenschicht zu binden vermag.
Die molekulare Dichte des molekularen Films kann in geeigneter Weise durch Anlegen eines elektrischen Potentials an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht eingestellt werden. Wenn das Molekül, das den molekularen Film bildet, zum Beispiel die Bindung zwischen einem Schwefelatom (S) und dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht in einem seines/ihres Teils davon enthält, führt das Anlegen eines elektrischen Potentials an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht zu der Spaltung der Bindungsstelle, was die Desorption der Moleküle von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht verursacht. Die Bindung zwischen dem Schwefelatom (S) und dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht ist eine oxidative Bindung und das Anlegen eines speziellen Reduktionspotentials kann zur reduktiven Desorption der Bindung führen (Siehe ”Fine structure in the voltammetric desorption curves of alkanethiolate monolayers chemisorbed at gold” C. J. Zhong et al., J. Electroanal. Chem., 1997, Band 425, 147–153., und ”Studies of the Electrochemical Removal and Efficient Reformation of a Monolayer of Hexadecanethiol Self-Assembled at an Au(111) Single Crystal in Aqueous Solutions” D. F. Yang et al., Langmuir, 1997, Band 13, Nr. 2, 243–249.). Als ein Ergebnis davon wird die molekulare Dichte des molekularen Films verringert, wird die räumliche Behinderung zwischen den Molekülen in dem molekularen Film verkleinert, und wird die Beweglichkeit eines jeden Moleküls verbessert. Wenn somit der molekulare Film für Analyse, Diagnose, etc., verwendet wird, ist zum Beispiel die Empfindlichkeit der Analyse, Messung, etc. verbessert.
Das an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht anzulegende elektrische Potential ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von dem Material, der Form, Größe und Anzahl des leitfähigen Substrats oder der Elektrodenschicht, dem Typ des Moleküls, dem Typ der Bindung des Moleküls an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht, die Größe des Moleküls und dergleichen ausgewählt sein. Wenn das elektrische Potential nicht zweckmäßig ist, ist die Menge an von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht desorbierten Molekül nicht ausreichend, wodurch die molekulare Dichte des molekularen Films nicht auf einen gewünschten Grad reduziert werden kann; oder die molekulare Dichte des molekularen Films kann zu niedrig werden, was zur Verringerung der Empfindlichkeit von Analyse, Messung, etc. führt, wenn der molekulare Film für Analyse, Messung, etc. verwendet wird.
Bei dem Dichteeinstellschritt kann das an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht anzulegende elektrische Potential in geeigneter Weise auf Grundlage des in Abhängigkeit von der Anwendung in geeigneter Weise ausgewählten Indikators gesteuert werden.
Ein solcher Indikator ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein; zum Beispiel sind (1) ein vorher erzeugtes Beziehungsdiagramm zwischen Desorptionsgrad (%) und angelegter Spannung (V), wobei der Desorptionsgrad (%) eine Menge des Moleküls ist, die von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht pro Zeiteinheit während des Anlegens eines elektrischen Potentials desorbiert, und (2) ein Signal, das in direkter Beziehung zu der molekularen Dichte auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht steht, am besten geeignet.
Wenn der oben erwähnte Indikator (1) verwendet wird, kann der Dichteeinstellschritt wie folgt durchgeführt werden. Genauer ausgedrückt wird ein elektrisches Potential an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht angelegt, wobei die Größe des an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht angelegten elektrischen Potentials und die angewandte Zeitdauer auf Grundlage des Beziehungsdiagramms eingestellt wird, wodurch die Moleküle von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht desorbiert werden, um die molekulare Dichte (Moleküle/cm²) des molekularen Films zu verringern.
Wenn der oben erwähnte Indikator (2) verwendet wird, kann der Dichteeinstellschritt wie folgt durchgeführt werden. Genauer ausgedrückt wird, während die molekulare Dichte (Moleküle/cm²) des Moleküls auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht in Echtzeit überwacht wird, oder während in Echtzeit ein Signal überwacht wird, das in direkter Beziehung zu der molekularen Dichte des Moleküls auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht steht, ein elektrisches Potential an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht angelegt, um die Moleküle zu desorbieren und dadurch die molekulare Dichte (Moleküle/cm²) des molekularen Films zu verringern. Das Signal ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Wenn das Molekül zum Beispiel den Fluoreszenzfarbstoff in einem Molekül davon enthält, sind durch den Fluoreszenzfarbstoff erzeugte Fluoreszenzintensität (willkürliche Einheit: a. u.) und dergleichen geeignet.
In dieser Beschreibung kann die molekulare Dichte ”Moleküle/cm²” als ”cm^–2” beschrieben sein.
Der Dichteeinstellschritt verringert (stellt ein) die molekulare Dichte des molekularen Films, und die resultierende molekulare Dichte ist in Abhängigkeit von der Anwendung des molekularen Films, dem Typ und der Größe des Moleküls, das den molekularen Film bildet, und dergleichen, unterschiedlich.
Wenn die molekulare Dichte im Vergleich zu jener eines dichten Films nicht auf einen geeigneten Grad verringert ist, kann die Empfindlichkeit oder dergleichen von Analyse, Messung, etc. nicht zufriedenstellend sein, wenn der molekulare Film für eine Vielfalt an Analysen oder Messungen verwendet wird.
Der Desorptionsgrad (%) des Moleküls des molekularen Films in dem Dichteeinstellschritt ist nicht besonders beschränkt und variiert in Abhängigkeit von dem Typ, etc. des Moleküls.
Das an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht in dem Dichteeinstellschritt anzulegende Potential ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von dem Typ, etc. des Moleküls ausgewählt sein. Zum Beispiel kann das elektrische Potential ein Oxidationspotential (positives elektrisches Potential) oder ein Reduktionspotential (negatives elektrisches Potential) sein. Wenn das Molekül an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht über die Bindung zwischen einem Schwefelatom (S) und dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht gebunden ist, kann in geeigneter Weise Reduktionspotential als das elektrische Potential angewandt werden.
Wie oben beschrieben ist, kann das in dem Dichteeinstellschritt an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht anzulegende elektrische Potential in geeigneter Weise auf Grundlage des oben erwähnten Indikators (1) oder (2) gesteuert werden. Nachfolgend werden spezielle Beispiele der Steuerung des an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht anzulegenden elektrischen Potentials beschrieben.
Wenn das elektrische Potential auf Grundlage des oben erwähnten Indikators (1) gesteuert wird, wird vorher der Desorptionsgrad (Prozentsatz an desorbierter Menge in Bezug auf die Zeitdauer des angelegten elektrischen Potentials) bei einem speziellen elektrischen Potential gemessen, um ein Beziehungsdiagramm zwischen elektrischem Potential und desorbierter Menge (1) zu erhalten. Dann wird ein spezifisches elektrisches Potential an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht angelegt und es werden das elektrische Potential und die Zeitdauer auf Grundlage des Beziehungsdiagramms eingestellt, was es ermöglicht, die Menge an desorbiertem Molekül, das auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht immobilisiert oder gebunden ist, auf einen erwünschten Grad zu steuern.
Wenn das elektrische Potential auf Grundlage des oben erwähnten Indikators (2) gesteuert wird, während die befestigte Menge (oder molekulare Dichte) des auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht immobilisierten oder gebundenen Moleküls überwacht wird, wird ein spezielles elektrisches Potential angelegt (zum Beispiel wird ein Reduktionspotential angelegt, wenn das Molekül an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht über eine Bindung zwischen einem Schwefelatom (S) und dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht gebunden ist). Echtzeitbeobachtung der Veränderung bei der befestigten Menge (molekularer Dichte) des Moleküls mit der Zeitdauer (zum Beispiel 2) ermöglicht es, die molekulare Dichte, die Menge des auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht immobilisierten oder gebundenen Moleküls, auf einen erwünschten Grad zu steuern. Wenn das elektrische Potential auf Grundlage des oben erwähnten Indikators (2) gesteuert wird, ist es nicht erforderlich, vorher das Beziehungsdiagramm wie bei dem oben erwähnten (1) zu erzeugen.
In dem Fall, bei dem das elektrische Potential auf Grundlage des oben erwähnten Indikators (2) gesteuert wird, wird die molekulare Dichte des molekularen Films direkt überwacht, oder wird das Signal überwacht, das in direkter Beziehung zu der molekularen Dichte steht. Wenn das Signal überwacht wird, das in direkter Beziehung zu der molekularen Dichte steht, wird dies zum Beispiel wie folgt ausgeführt. Genauer ausgedrückt, wenn das auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht immobilisierte oder gebundene Molekül den Fluoreszenzfarbstoff in einem Molekül davon als ein Signal enthält, das in direkter Beziehung zu der molekular Dichte steht, wird die Fluoreszenzintensität (a. u.) auf Grundlage des Fluoreszenzfarbstoffs überwacht. Durch ein solches Überwachen kann die molekulare Dichte, die Menge des auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht immobilisierten oder gebundenen Moleküls, auf einen erwünschten Grad gesteuert werden. Genauer ausgedrückt wird zuerst, wie in 3 gezeigt ist, das Molekül (Sonden-DNA 8), das den Fluoreszenzfarbstoff (Fluoreszenzmarkierung 7) in einem Molekül davon enthält, auf das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht (Goldelektrode 3; Au = Gold) durch die Bindung zwischen dem Schwefelatom (S) und dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht immobilisiert oder gebunden, d. h. durch eine an dem Ende der Sonden-DNA 8 befindliche Schwefelatom-Gold-Bindung (S-Au) 6, um den molekularen Film der Moleküle auszubilden. Wenn das gleiche elektrische Potential (negative Ladung) wie die Ladung (negative Ladung) des Moleküls (z. B. DNA) an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht (Goldelektrode 3) und seine/ihre Gegenelektrode 4 mit der Stromversorgung 5 angelegt wird, bewegt sich das Molekül von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht aufgrund von elektrostatischer Abstoßung weg. Da ein Ende des Moleküls auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht durch die S-Au-Bindung immobilisiert oder gebunden ist, verbleibt das Molekül auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht wie wenn es stehen würde. Wenn das Molekül durch eine Lichtleitfaser, etc. mit Licht mit einer Wellenlänge bestrahlt wird, bei der der Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszenz emittiert, emittiert der Fluoreszenzfarbstoff in Abhängigkeit von der Position des Moleküls unterschiedlich Licht. In dem Fall, bei dem das Molekül nahe bei dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht angeordnet ist, ist Emission durch den Fluoreszenzfarbstoff aufgrund Auslöschwirkung schwach, Übertragung eines Teils der Anregungsenergie zu dem Zeitpunkt, wenn der Fluoreszenzfarbstoff durch Absorbieren von Lichtenergie des eingestrahlten Lichts angeregt wird, auf das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht. In dem Fall, bei dem sich das Molekül entfernt von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht befindet, ist andererseits die Auslöschwirkung verringert, und es wird mehr in dem Fluoreszenzfarbstoff erzeugte Anregungsenergie für Emission verwendet. Als ein Ergebnis emittiert der Fluoreszenzfarbstoff stark Licht. Dann wird diese Fluoreszenz bei einem Fluoreszenzbeobachtungsbereich 9 beobachtet, bei dem sich Bestrahlungslicht zu dem Molekül durch eine Faser für einfallendes Licht 1, und ein Licht empfangender Bereich einer Licht empfangenden Faser 2, die Fluoreszenz von der Fluoreszenzmarkierung 7 empfängt, kreuzen. Diese optische Nachweistechnik wurde in der Literatur (siehe ”Dynamic Electric Switching of DNA Layers an a Metal Surface” U. Rant et al., Nano Lett., 2004, Band 4, Nr. 12, 2441–2445) und dem Patent (siehe ”Analyte evaluating device, and method for evaluating analyte” US-Patentanmeldung US 2005/0069932 A1) beschrieben.
Eine derartige durch den Fluoreszenzfarbstoff in dem Molekül erzeugte Fluoreszenzintensität (a. u.) wird als das Signal überwacht und es wird ein Reduktionspotential an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht angelegt. Dies führt zu der Spaltung der Stelle der Thiolbindung oder Disulfidbindung in dem Molekül, das auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht immobilisiert oder gebunden ist, desorbiert die Moleküle. Wie in 4 gesehen werden kann, verringert sich mit der allmählichen Verringerung der Dichte des Moleküls (Moleküle/cm²) auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht die Fluoreszenzintensität (a. u.). Durch Stoppen des Anlegens des Reduktionspotentials an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht zu dem Zeitpunkt, bei dem die Fluoreszenzintensität den Wert gezeigt hat, der einer erwünschten molekularen Dichte entspricht, kann ein molekularer Film mit einer erwünschten molekularen Dichte erhalten werden.
– Weiterer Schritt und weitere Einheit –
Der weitere Schritt ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein; Beispiele davon schließen einen nachfolgend beschriebenen Zufuhrschritt ein. Der weitere Schritt kann in geeigneter Weise durch die weitere Einheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte ausgeführt werden, zum Beispiel durch die nachfolgende Zufuhreinheit.
Der Zufuhrschritt ist ein Schritt, bei dem ein Schwefelatom-enthaltendes Molekül, das kleiner ist als ein desorbiertes Molekül, zu dem Platz zugeführt wird, der auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht durch die Desorption der Moleküle von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht erzeugt wurde, um das Binden des Schwefelatom-enthaltenden Moleküls an den Platz zu ermöglichen. Der Zufuhrschritt kann in geeigneter Weise durch die Zufuhreinheit der Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte ausgeführt werden.
Die Zufuhreinheit ist eine Einheit, die zum Zuführen eines Schwefelatom-enthaltenden Moleküls, das kleiner ist als das desorbierte Molekül, zu dem Platz konfiguriert ist, der auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht durch die Desorption der Moleküle von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht erzeugt wurde, um Binden des Schwefelatom-enthaltenden Moleküls an den Platz zu ermöglichen.
Wenn bei dem Dichteeinstellschritt das von dem molekularen Film desorbierte Molekül ein relativ großes Molekül ist, wie zum Beispiel Polymer, typischerweise DNA oder Protein, ist Diffusion in die Lösung langsam. Selbst wenn die Bindung zwischen dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht und einem Schwefelatom durch die Reduktion gespalten ist, ist es somit sehr gut möglich, dass ein solches Molekül wegen langsamer Diffusion von der Oberfläche des leitfähigen Substrats oder Elektrode auf der Oberfläche des leitfähigen Substrats oder der Elektrodenschicht verbleibt und auf diesen readsorbiert. (Siehe ”Studies of the Electrochemical Removal and Efficient Reformation of a Monolayer of Hexadecanethiol Self-Assembled at an Au(111) Single Crystal in Aqueous Solutions” D. F. Yang et al., Langmuir, 1997, Band 13, Nr. 2, 243–249.). In einem solchen Fall wird durch rasches Schützen des losgemachten Teils unter Verwenden von Molekülen mit einer größeren Diffusionsgeschwindigkeit als das desorbierte Molekül die Readsorption (das Wiederbefestigen) des desorbierten Moleküls auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht verhindert und wird die Desorption der Moleküle erleichtert. Somit wird es möglich, den desorbierten Teil elektrisch oder physikalisch zu schützen.
Das Schwefelatom-enthaltende Molekül ist nicht besonders beschränkt, so lange es wenigstens ein Schwefelatom enthält, und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein. Zum Beispiel sind in ”Characterization of DNA Probes Immobilized on Gold Surfaces” T. M. Herne et al., J. Am. Chem. Soc., 1997, Band 119, Nr. 38, 8916–8920., und ”Quantitative Measurements and Modeling of Kinetics in Nucleic Acid Monolayer Films Using SPR Spectroscopy” R. Georgiadis et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, Band 122, Nr. 13, 3166–3173, beschriebene Moleküle und dergleichen geeignet. Von diesen sind Thiolverbindungen, die eine Thiolbindung (-SH-) enthalten, Disulfidverbindungen, die eine Disulfidbindung (-S-S-) enthalten, und dergleichen geeignet, und Mercaptohexanol (HO(CH₂)₆SH:MCH) und dergleichen sind am besten geeignet. Da diese Verbindungen die Thiolbindung (-SH-) oder Disulfidbindung (-S-S-) in ihrem Molekül enthalten, können sie leicht an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht binden. Da diese Verbindungen darüber hinaus eine kleinere Molekülmasse aufweisen, als das oben erwähnte Molekül, und exzellente Beweglichkeit (Mobilität) aufweisen, etc., binden sie sich nach der Desorption der Moleküle rascher an den Platz auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht als sich das desorbierte Molekül an den Platz wieder befestigt. Somit sind solche Verbindungen von Vorteil, da Readsorption des desorbierten Moleküls auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht in geeigneter Weise verhindert werden kann und die Erzeugung von einem elektrischen oder physikalischen Defekt bei dem Platz effektiv verhindert werden kann. Die Schwefelatom-enthaltenden Moleküle können allein oder in Kombination verwendet werden.
Die Molekülmasse des Schwefelatom-enthaltenden Moleküls ist nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Molekülmasse oder dergleichen des Moleküls ausgewählt sein. Sie ist bevorzugt kleiner als die Molekülmasse des Moleküls, noch bevorzugter zwei Mal kleiner oder noch kleiner als jene des Moleküls. Genauer ausgedrückt ist sie bevorzugt drei Mal kleiner oder noch kleiner als jene des Moleküls, da sie bessere molekulare Mobilität als beim Molekül zur Verfügung stellt.
Bei dem Zufuhrschritt kann das Schwefelatom-enthaltende Molekül in geeigneter Weise zu dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht bei oder vor der Spaltung zwischen dem Molekül und dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht zugeführt werden. Alternativ dazu kann das Schwefelatom-enthaltende Molekül in geeigneter Weise dem leitfähigen Substrat nach der Spaltung zwischen den Molekülen und dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht zugeführt werden.
Bei dem Zufuhrschritt ist die Menge des dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht zuzuführenden Schwefelatom-enthaltenden Moleküls nicht besonders beschränkt und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von dem Typ des leitfähigen Substrats oder der Elektrodenschicht, dem Typ oder der Dichte des Moleküls, etc. ausgewählt sein.
– Anwendung des Molekularen Films mit einer eingestellten Dichte –
Der durch das erfindungsgemäße Verfahren oder die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte hergestellte molekulare Film weist eine auf einen erwünschten Grad eingestellte oder verringerte molekulare Dichte auf. Somit kann der molekulare Film in geeigneter Weise für eine Vielfalt an Vorrichtungen oder Verfahren für Analyse oder Messvorrichtungen oder Messverfahren als ein Sensor, etc., verwendet werden, insbesondere als ein Biosensor, wie zum Beispiel DNA-Chip. Der molekulare Film ist auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht ausgebildet, und jene, die den molekularen Film auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht enthalten, können zum Beispiel als eine Vorrichtung, wie zum Beispiel als Biosensor, verwendet werden. Somit kann die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach dem Ausbilden des molekularen Films ohne weitere Bearbeitung als eine Vorrichtung, ein Analysator, eine Messvorrichtung, etc. einschließlich einem Biosensor verwendet werden.
Der erfindungsgemäß hergestellte molekulare Film mit einer eingestellten Dichte kann zum Beispiel wie folgt verwendet werden. Genauer ausgedrückt kann Anlegen eines elektrischen Potentials an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht, auf dem/der der molekulare Film ausgebildet ist, oder Variieren des angelegten elektrischen Potentials die auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht adsorbierten Moleküle von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht desorbieren. Zum Beispiel ermöglicht Variieren des elektrischen Potentials des leitfähigen Substrats oder der Elektrodenschicht, an das/die ein positives elektrisches Potential angelegt ist, zu einem negativen elektrischen Potential, oder Variieren des elektrischen Potentials des leitfähigen Substrats oder der Elektrodenschicht, an das/die ein Reduktionspotential (negatives elektrisches Potential) angelegt ist, zu einem positiven elektrischen Potential, die Desorption der Moleküle. Wenn zum Beispiel das Molekül ein Polynucleotid (DNA) ist, das die Thiolbindung (-SH-) oder Disulfidbindung (-S-S-) an seinem Ende enthält, ist das Polynucleotid an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht über das Schwefelatom (S) der Thiolbindung oder Disulfidbindung gebunden. Da das Polynucleotid selbst negativ geladen ist, werden durch Anlegen eines positiven elektrischen Potentials an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht die Polynucleotidmoleküle aufgrund elektrostatischer Anziehung zu dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht hingezogen. Im Gegensatz dazu werden, wenn ein negatives elektrisches Potential an das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht angelegt wird, die Polynucleotidmoleküle um die Bindung zwischen dem Schwefelatom (S) und dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht herum bewegt und bleiben aufgrund von elektrostatischer Abstoßung von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht von dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht entfernt. Somit ermöglicht ein wie oben beschriebenes Anlegen eines erwünschten elektrischen Potentials an den molekularen Film, jedes Molekül anzuziehen, das den molekularen Film auf dem leitfähigen Substrat oder der Elektrodenschicht bildet, oder jedes Molekül davon wegzubewegen, wodurch ein gewünschtes Steuern in Abhängigkeit von dem Typ, Zweck, etc. von Analyse oder Messung möglich gemacht wird.
Wenn unter Verwenden des durch das erfindungsgemäße Verfahren, oder die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte hergestellten molekularen Films Analyse, Messung oder dergleichen durchgeführt wird, wird der molekulare Film typischerweise durch Eintauchen in eine wässrige Lösung verwendet.
Die wässrige Lösung ist nicht besonders beschränkt, so lange sie eine Lösung ist, und kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Anwendung ausgewählt sein; Beispiele davon schließen Wasser, Elektrolyt und gepufferte Salzlösung ein. Diese können allein oder in Kombination verwendet werden.
Wenn Analyse, Messung oder dergleichen unter Verwenden des molekularen Films durchgeführt wird, können Lösungen eines nicht-wässrigen Elektrolyten anstelle der wässrigen Lösung verwendet werden, durch die wasserunlösliche Substanzen analysiert oder gemessen werden können. In diesem Fall schließen Beispiele eines geeigneten nicht-wässrigen Elektrolyten organische Lösemittel ein; genauer ausgedrückt sind zum Beispiel Acetonitril, Benzonitril und Tetrahydrofuran geeignet.
Beispiele der Erfindung werden nachfolgend erläutert, aber diese dürfen nicht so verstanden werden, dass sie die Erfindung beschränken.
Beispiele
– Schritt zum Ausbilden eines molekularen Films (Einheit) –
Unter Verwendung einer einsträngigen DNA als dem Molekül, das eine Thiolgruppe an einem Ende und einen fluoreszierenden Cyaninfarbstoff (Cy3) als den Fluoreszenzfarbstoff (Fluoreszenzmarkierung) an dem anderen Ende (24-Basen Sonden-DNA: ss-24mer-Sonden-DNA) aufweist, wurde ein molekularer Film (dichter Film) durch Selbstordnung der DNAs wie folgt ausgebildet. Genauer ausgedrückt wurden die DNAs entsprechend dem in ”Formation and Structure of Self-Assembled Monolayers” A. Ulman, Chem. Rev., 1996, Band 96, Nr. 4, 1533–1554, beschriebenen Verfahren auf einer Goldelektrode (2 mm ϕ) als das leitfähige Substrat oder die Elektrodenschicht über ein Schwefelatom immobilisiert oder gebunden, um einen molekularen Film (dichten Film) der DNAs auf der Goldelektrode auszubilden.
Um den Dichteeinstellschritt durch Einstellen (Verringern) der molekularen Dichte der DNA, die den molekularen Film bildet, unter Verwenden einer durch den Fluoreszenzfarbstoff (Fluoreszenzmarkierung) als einen Indikator erzeugten Fluoreszenzintensität durchzuführen, wurden, wie in 3 gezeigt ist, eine Faser für einfallendes Licht 1 und eine Licht empfangende Faser 2 so angeordnet, dass ein elektrisches (Reduktionspotential) Potential an die Goldelektrode 3 und ihre Gegenelektrode 4 durch die Stromversorgung 5 durch eine Zuleitung angelegt werden kann. Die Faser für einfallendes Licht 1 beleuchtet DNAs (Sonden-DNAs) 8, die auf der Goldelektrode 3 immobilisiert oder gebunden sind, und die Licht empfangende Faser 2 empfängt die Fluoreszenz von der Fluoreszenzmarkierung 7 der DNAs 8.
– Dichteeinstellschritt (Einheit) –
Wenn ein elektrisches Potential von –0,2 V bezogen auf die Gegenelektrode 4 mit der Stromversorgung 5 angelegt wird, so dass ein negatives elektrisches Potential, die gleiche Polarität wie die Ladung der DNA 8 (negative Ladung), an die Goldelektrode 3 angelegt wird, befindet sich die DNA 8 aufgrund der elektrostatischen Abstoßung entfernt von der Goldelektrode 3. Da ein Ende der DNA 8 durch eine Thiolbindung 6 auf der Goldelektrode 3 immobilisiert oder gebunden ist, bleibt die DNA 8 auf der Goldelektrode 3, wie wenn sie stehen würde. Dann wird die DNA 8 durch die Faser für einfallendes Licht 1 mit Licht einer Wellenlänge bestrahlt, bei der der Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszenz durch Absorption emittiert. Indem Fall, bei dem sich die DNA 8 nahe bei der Goldelektrode 3 befindet, ist Emission durch den Fluoreszenzfarbstoff verringert oder findet aufgrund von Auslöschwirkung nicht statt, Transfer eines Teils der Anregungsenergie zu dem Zeitpunkt, an dem die Fluoreszenzmarkierung 7 durch Absorbieren von Lichtenergie von einfallendem Licht angeregt wird, zu der Goldelektrode. In dem Fall, bei dem sich die DNA 8 von der Goldelektrode 3 entfernt befindet, ist die Auslöschwirkung verringert, und es wird mehr in der Fluoreszenzmarkierung 7 erzeugte Anregungsenergie für Emission verwendet. Als ein Ergebnis ist die Emission durch die Fluoreszenzmarkierung 7 erhöht. Dann wird diese Fluoreszenz bei dem Fluoreszenzbeobachtungsbereich 9 beobachtet, bei dem sich Bestrahlungslicht zu der DNA 8 durch die Faser für einfallendes Licht 1 und ein Licht empfangender Bereich der Licht empfangenden Faser 2, die Fluoreszenz von der Fluoreszenzmarkierung 7 der DNA 8 empfängt, kreuzen.
Wenn ein relativ großes Reduktionspotential von –0,6 V bis –0,8 V weiter an die Goldelektrode 3 angelegt wird, wird die Thiolbindung 6 der DNA 8 durch das Reduktionspotential gespalten, was zu der Abnahme der molekularen Dichte (Moleküle/cm²) führt. Anfänglich betrug die molekulare Dichte der DNAs 8 etwa 1,2 × 10¹² (Moleküle/cm²). Durch die reduktive Desorption aufgrund des Anlegens des Reduktionspotentials, wurden DNAs 8 allmählich von der Goldelektrode 3 desorbiert, was zu einer verringerten molekularen Dichte von etwa 8 × 10¹⁰ (Moleküle/cm²) führte. Die Beziehung zwischen der durch die Fluoreszenzmarkierung 7 erzeugten Fluoreszenzintensität (a. u.) und der molekularen Dichte (Moleküle/cm²) der DNAs 8 auf der Goldelektrode 3 wurde gemessen, die in dem Graph von 4 gezeigt ist. Während der Messung der Fluoreszenzintensität wurde ein negatives elektrisches Potential von –0,2 V angelegt, man brachte die DNA 8 zum Stehen und es wurde der Abstand zwischen der Goldelektrode 3 und der Fluoreszenzmarkierung 7 konstant gehalten. Der Grund dafür ist, die Veränderung von Fluoreszenzintensität aufgrund von Auslöschwirkung zu vermeiden. Genauer ausgedrückt, da ein Teil der Anregungsenergie auf die Elektrode (Auslöschwirkung) übertragen wird, führt eine Veränderung des Abstands zwischen der Fluoreszenzmarkierung 7 und der Goldelektrode 3 zu einer Veränderung der Fluoreszenzintensität.
Als Nächstes wurde eine Mehrzahl an Elektroden mit molekularen Filmen aus DNAs 8 mit einer anfänglichen molekularen Dichte von etwa 1 × 10¹² (Moleküle/cm²) hergestellt und es wurden unterschiedliche elektrische Potentiale von –0,3 V bis –0,9 V angelegt, und es wurde der Desorptionsgrad von DNA 8 bei jedem elektrischen Potential gemessen. Wie in 5 gezeigt ist, wurde eine große Veränderung (0% bis 100%) beim Desorptionsgrad (%) von DNA 8 zwischen –0,4 V und –0,7 V festgestellt.
Aus den Ergebnissen von 5 wurde festgestellt, dass ein Desorptionsgrad von 80% bei –0,6 V erhalten wurde. Somit wurden durch Anlegen eines Reduktionspotentials von –0,6 V an die Goldelektrode 3 die DNAs 8 allmählich von der Goldelektrode 3 desorbiert, wie in 6 gezeigt ist, und es wurde die molekulare Dichte von DNAs 8 von anfänglich 1 × 10¹² (Moleküle/cm²) auf 2 × 10¹¹ (Moleküle/cm²) verringert (eingestellt).
In dem in 6 gezeigten Graphen sind der anfängliche Zeitraum (0 bis etwa 60 Sekunden), die folgenden Zeiträume (etwa 60 Sekunden bis etwa 360 Sekunden) und (etwa 360 Sekunden bis etwa 500 Sekunden) als ”A”, ”B” bzw. ”C” bezeichnet. Die Fluoreszenzintensität (a. u.) in ”A” beruht auf der Fluoreszenzmarkierung 7 der DNAs 8 (molekularer Film) mit einer anfänglichen molekularen Dichte. Die Fluoreszenzintensität (a. u,) in ”C” beruht auf der Fluoreszenzmarkierung 7 der DNAs 8 mit einer verringerten molekularen Dichte nach der Desorption von DNAs 8 durch das Anlegen eines Reduktionspotentials an die Goldelektrode 3. Die Fluoreszenz in ”B” beruht auf der Fluoreszenzmarkierung 7 der DNAs 8 unmittelbar nach der Desorption von der Goldelektrode 3 bei Anlegen eines Reduktionspotentials an die Goldelektrode 3. Da die Auslöschwirkung vollständig eliminiert ist, wurde vorübergehend eine große Fluoreszenz beobachtet. Aus den Ergebnissen von 5 wurde die molekulare Dichte nach der Desorption von der Goldelektrode 3 durch das Anlegen eines Reduktionspotentials (negatives elektrisches Potential) von –0,6 V an die Goldelektrode 3 für 5 Minuten, das heißt die molekulare Dichte, die die Fluoreszenzintensität in ”C” des Graphen von 6 ergibt, als 2 × 10¹¹ cm^–2 berechnet. Es wurde bestätigt, dass dieser Wert gut mit dem experimentellen Wert unter Verwenden des in ”Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized an Gold” A. B. Steel et al., Anal. Chem., 1998, Band 70, Nr. 22, 4670–4677 beschriebenen elektrochemischen Verfahrens übereinstimmt.
Durch den oben beschriebenen Dichteeinstellschritt wurde die molekulare Dichte des molekularen Films von DNAs 8 mit einer relativ dichten molekularen Dichte leicht auf einen gewünschten Grad eingestellt (verringert).
Als nächstes wurde, während Fluoreszenz durch die Fluoreszenzmarkierung 7 der DNA 8 in Echtzeit überwacht wurde, drei Mal für jeweils 30 Sekunden ein Reduktionspotential (negatives elektrisches Potential) von –0,6 V an die Goldelektrode 3 angelegt, wodurch die molekulare Dichte des molekularen Films von an die Goldelektrode 3 immobilisierten oder gebundenen DNAs 8 stufenweise verringert (eingestellt) wurde. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. In 7 sind der anfängliche Zeitraum (0 bis etwa 70 Sekunden), die folgenden Zeiträume (etwa 70 Sekunden bis etwa 120 Sekunden), (etwa 120 Sekunden bis etwa 330 Sekunden), (etwa 330 Sekunden bis etwa 370 Sekunden), (etwa 370 Sekunden bis etwa 540 Sekunden), (etwa 540 Sekunden bis etwa 580 Sekunden), und (etwa 580 Sekunden bis etwa 700 Sekunden), als ”D”, ”E”, ”F”, ”G”, ”H”, ”I” bzw. ”J” bezeichnet. Ausgehend von der Fluoreszenzintensität (a. u.) in ”D”, die der anfänglichen molekularen Dichte entspricht, erreichte die Fluoreszenzintensität (a. u.) durch die allmähliche Desorption von DNAs 8 von der Goldelektrode 3 über ”F” und ”H” die Fluoreszenzintensität (a. u.) in ”J”, die der molekularen Enddichte entspricht. Jeder Peak von ”E”, ”G” und ”I” bedeutet vorübergehende Fluoreszenz durch Desorbieren von DNAs 8. Aus dem Graphen von 4, der eine Beziehung zwischen Fluoreszenzintensität (a. u.) und Oberflächendichte (molekulare Dichte) zeigt, wurde die molekulare Dichte, die die Fluoreszenzintensität bei ”J” ergibt, die der molekularen Enddichte entspricht, als 4 × 10¹¹ cm^–2 geschätzt. Es wurde bestätigt, dass dieser Wert gut mit dem experimentellen Wert unter Verwenden des oben erwähnten elektrochemischen Verfahrens übereinstimmt.
– Zufuhrschritt (Einheit) –
Als nächstes wurden DNAs 8 von der Goldelektrode 3 von einer anfänglichen molekularen Dichte von 2,2 × 10¹¹ cm^–2 bis zu einer molekularen Enddichte von 1,5 × 10¹¹ cm^–2 desorbiert. Während der Desorption, wurde Mercaptohexanol (HO(CH₂)₆SH:MCH) als das Schwefelatom-enthaltende Molekül, das ein kleineres Molekül als die DNA 8 ist, zu dem Platz auf der Goldelektrode 3 zugeführt, von dem die DNAs 8 desorbierten, was das Binden des MCH an den Platz ermöglichte. Wie es in 8 gezeigt ist, wurde als ein Ergebnis unmittelbar nach der Zugabe des MCH (”Y” in 8) ein Fluoreszenzpeak aufgrund der Desorption von DNAs 8 beobachtet (”X” in 8; Signal aufgrund der Desorption von DNAs, die durch die Zugabe des MCH erleichtert wurde). Es wurde auch bestätigt, dass die Wirkung der Erleichterung der Desorption durch ein relativ kleines Thiolmolekül (das MCH) wirksam ist, wenn die DNAs 8 von der Goldelektrode 3 durch wiederholtes Anlegen eines elektrischen Potentials zur Desorption desorbiert werden.
Die vorliegende Erfindung kann herkömmliche Probleme lösen und kann eine Technik zur Verfügung stellen, die die molekulare Dichte des Film funktioneller Moleküle (z. B. DNA-Moleküle), der für Biochips verwendet wird, wie zum Beispiel DNA-Chip, effizient und leicht auf einen erwünschten Grad einstellen kann, sie kann mit anderen Worten ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte zur Verfügung stellen, der für Biochips, wie zum Beispiel DNA-Chip geeignet ist.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren oder die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte kann ein molekularer Film, dessen molekulare Dichte auf einen erwünschten Grad eingestellt (verringert) ist, erhalten werden, und in dem resultierenden molekularen Film sind die Beweglichkeit eines jeden Moleküls, das den molekularen Film bildet, und dergleichen nicht inhibiert und sind günstig. Somit kann der molekulare Film in geeigneter Weise für eine Vielfalt an Diagnosen, Analysen, Messungen, Nachweis und dergleichen für z. B. verschiedene Erkrankungen verwendet werden. Wenn das Molekül den Zieleinfangteil enthält, kann auch Diagnose, Analyse, Messung, Nachweis, etc. von verschiedenen nützlichen Molekülen, wie zum Beispiel Protein, durchgeführt werden, und darüber hinaus kann durch zur Verfügung stellen des lichtemittierenden Teils auch quantitative Bestimmung des nützlichen Moleküls durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren oder die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte ist extrem nützlich in dem Bereich der Nanobiotechnologie, und der molekulare Film, der durch die Erfindung erhalten wird und der eine auf einen erwünschten Grad eingestellte molekulare Dichte aufweist, trägt in bemerkenswerter Weise zu der Verbesserung von Leistungsfähigkeit, Zuverlässigkeit, Empfindlichkeit (orig.: ”quantitative ability”) und Reproduzierbarkeit von Vorrichtung, etc. bei.

Claims

Ein Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte, enthaltend: Ausbilden eines aus Molekülen zusammengesetzten molekularen Films auf einem leitfähigen Substrat, wobei das Molekül einen Bereich enthält, der an wenigstens einen Teil des leitfähigen Substrats und einen Fluoreszenzfarbstoff zu binden vermag, gekennzeichnet durch Einstellen einer molekularen Dichte des molekularen Films durch Anlegen eines elektrischen Potentials an das leitfähige Substrat mit Überwachung der molekularen Dichte auf dem leitenden Substrat unter Verwendung einer Fluoreszenzintensität, die durch den Fluoreszenzfarbstoff erzeugt wird, als Indikator, um so Moleküle zu desorbieren und die molekulare Dichte des molekularen Films zu reduzieren.
Das Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach Anspruch 1, wobei das Einstellen einer molekularen Dichte so durchgeführt wird, dass unter Überwachen der molekularen Dichte auf dem leitfähigen Substrat in Echtzeit, oder unter Überwachen eines Signals in Echtzeit, das mit der molekularen Dichte auf dem leitfähigen Substrat direkt in Beziehung steht, ein elektrisches Potential an das leitfähige Substrat angelegt wird, um Moleküle zu desorbieren und dadurch die molekulare Dichte des molekularen Films zu verringern.
Das Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Molekül ein Schwefelatom in einem Teil davon enthält und an das leitfähige Substrat über das Schwefelatom zu binden vermag.
Das Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das elektrische Potential Reduktionspotential ist.
Das Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter enthaltend Zuführen eines Schwefelatom-enthaltenden Moleküls, das kleiner ist als das desorbierte Molekül, zu einem durch die Desorption der Moleküle von dem leitfähigen Substrat erzeugten Platz auf dem leitfähigen Substrat, um dem Schwefelatom-enthaltenden Molekül zu ermöglichen, sich an den Platz zu binden.
Das Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach Anspruch 5, wobei bei dem Zuführen das Schwefelatom-enthaltende Molekül dem leitfähigen Substrat bei oder vor der Desorption der Moleküle von dem leitfähigen Substrat zugeführt wird.
Das Verfahren zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach Anspruch 5, wobei bei dem Zuführen das Schwefelatom-enthaltende Molekül dem leitfähigen Substrat nach Anlegen eines elektrischen Potentials für die Desorption der Moleküle von dem leitfähigen Substrat zugeführt wird.
Eine Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte, die eine Dichteeinstelleinheit enthält, die konfiguriert ist, um Moleküle zu desorbieren und eine molekulare Dichte des molekularen Films zu reduzieren, durch Aufbringen eines elektrischen Potentials auf ein leitendes Substrat während die molekulare Dichte des leitfähigen Substrats überwacht wird unter Verwendung einer Fluoreszenzintensität, die von einem Fluoreszenzfarbstoff erzeugt wird, als Indikator, um dadurch die molekulare Dichte des molekularen Films einzustellen, wobei der molekulare Film auf dem leitfähigen Substrat ausgebildet ist und das Molekül einen Bereich enthält, der an wenigstens einen Teil des leitfähigen Substrats und des Fluoreszenzfarbstoffes zu binden vermag.
Die Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach Anspruch 8, wobei die Dichteeinstelleinheit die Moleküle desorbiert und die molekulare Dichte des molekularen Films durch Anlegen eines elektrischen Potentials an das leitfähige, Substrat verringert, während die molekulare Dichte auf dem leitfähigen Substrat in Echtzeit überwacht wird, oder während ein Signal in Echtzeit überwacht wird, das in direkter Beziehung zu der molekularen Dichte auf dem leitfähigen Substrat steht.
Die Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach einem der Ansprüche 8 bis 9, wobei das Molekül ein Schwefelatom in einem Teil davon enthält und an das leitfähige Substrat über das Schwefelatom zu binden vermag.
Die Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das elektrische Potential Reduktionspotential ist.
Die Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach einem der Ansprüche 8 bis 11, weiter enthaltend eine Zufuhreinheit, die konfiguriert ist um ein Schwefelatom-enthaltendes Molekül, das kleiner ist als das desorbierte Molekül, zu einem Platz zuzuführen, der auf dem leitfähigen Substrat durch die Desorption der Moleküle von dem leitfähigen Substrat erzeugt wurde, um dem Schwefelatom-enthaltenden Molekül zu ermöglichen, an den Platz zu binden.
Die Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach Anspruch 12, wobei die Zufuhreinheit das Schwefelatom-enthaltende Molekül zu dem leitfähigen Substrat bei oder vor der Desorption der Moleküle von dem leitfähigen Substrat zuführt.
Die Vorrichtung zum Herstellen eines molekularen Films mit einer eingestellten Dichte nach Anspruch 12, wobei die Zufuhreinheit das Schwefelatom-enthaltende Molekül zu dem leitfähigen Substrat nach Anlegen eines elektrischen Potentials für die Desorption der Moleküle von dem leitfähigen Substrat zuführt.