WO2004033614A1 - 分子放出装置及び分子放出方法 - Google Patents

分子放出装置及び分子放出方法 Download PDF

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WO2004033614A1
WO2004033614A1 PCT/JP2003/007651 JP0307651W WO2004033614A1 WO 2004033614 A1 WO2004033614 A1 WO 2004033614A1 JP 0307651 W JP0307651 W JP 0307651W WO 2004033614 A1 WO2004033614 A1 WO 2004033614A1
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WO
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molecule
electrode
release device
conductive member
molecules
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Application number
PCT/JP2003/007651
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tsuyoshi Fujihara
Shozo Fujita
Shunsaku Takeishi
Kenji Arinaga
Yoshitaka Yamaguchi
Tatsuya Usuki
Urlich Rant
Karin Buchholz
Marc Tornow
Original Assignee
Fujitsu Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Fujitsu Limited filed Critical Fujitsu Limited
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime

Definitions

  • the present invention is capable of efficiently releasing or transferring various useful molecules such as DNA to a target such as a cell, and can be applied to gene therapy and the like, and is a safe molecule release device and a method for releasing molecules.
  • a target such as a cell
  • the present invention is capable of efficiently releasing or transferring various useful molecules such as DNA to a target such as a cell, and can be applied to gene therapy and the like, and is a safe molecule release device and a method for releasing molecules.
  • the gene therapy can be applied to lifestyle-related diseases (diabetes, etc.), which were not previously included in the category. It is expected to be applied to the treatment of various diseases.
  • Gene transfer is essential in the gene therapy, but a safe and efficient gene transfer method has not been established so far.
  • an 18-year-old adolescent who received gene therapy at the University of Pennsylvania in the United States was overdose of the adenovirus vector used to transfer the gene four days later. Reported death.
  • the gene transfer method using the non-viral vector for example, a vesicle liposome method, a gene gun method, and a microinjection method are known.
  • the vesicle ribosome method has been used as a non-viral vector in that the antigenicity is low (immunity is unlikely to occur), the gene size that can be transferred is large, and the transfer efficiency is high. ing.
  • this method has a problem that the injected gene is not incorporated into the genome, and the expression is transient, and the expression is particularly low in non-dividing cells.
  • the gene gun method is a technique for physically and forcibly introducing a gene into a cell as if by a gun (see Patent Documents 1 and 2).
  • a gun since the gene or the fine particles are injected into the cell like a gun, there is a problem that the cell is damaged, safety is not sufficient, and energy cost is increased.
  • DNA is released from a substrate by binding DNA to a gold electrode via a thiol group and applying a negative potential to the gold electrode (for example, see Non-Patent Document 1). ).
  • a large amount of energy that degrades the thiol group is required, and there are problems in cost, safety, and the like.
  • the microinjection method is considered as the most reliable method for introducing a gene into cells.
  • the DNA solution is directly injected into the cells using a hollow needle that is thicker than the cell size, the damage to the cells is large, and the cells need to be fixed and are fragile.
  • rPIC rec omb inant Pre-Integration Composite
  • rPIC method recombinant preintegration complex method in which the complex is introduced into a target cell by a microchromator or the like
  • the gene can be incorporated into the genome of the target cell without depending on the species of the target cell.
  • expression is sustained (for example, see Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • the non-viral vector there is a problem in that it is not safe to use the method, and there is an anxiety in terms of safety, and it takes time and cost to prepare the complex (rPIC).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Document 1
  • Patent Document 2
  • the present invention solves the conventional problems, and enables various useful molecules, such as DNA, to be efficiently released or transferred into cells or the like without damaging the target, such as gene therapy. It is an object of the present invention to provide a safe molecule release device and a safe molecule release method. Disclosure of the invention
  • the molecule releasing device of the present invention is a molecule that releases molecules from a conductive member to which a potential is applied by changing the potential to break the interaction and release the molecule from the conductive member. It has a discharging means.
  • the molecular release means electrically connects the electrically conductive member to which a potential is applied. The acting molecules are released from the conductive member when the potential is changed and the interaction is released. At this time, if a target to which the molecule is to be transferred is arranged near the conductive member, the released molecule is transferred to a cell or the like as the target.
  • the molecule release method of the present invention is characterized in that molecules electrically attracted to two or more conductive members are released from the conductive members at different timings by an electric repulsive force.
  • the potential is changed (applied voltage) at different timings to the two or more conductive members, so that the molecules are released at different timings by electric repulsion, and cells And so on.
  • FIG. 1A and FIG. 1B are schematic explanatory views showing an example of the principle of releasing molecules in the molecule releasing device of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic explanatory view showing an example of a state where molecules are electrically attracted to an electrode in the molecule release device of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic explanatory view showing an example of a state in which the molecules shown in FIG. 2 are released from the electrodes by an electric repulsion.
  • FIG. 4A, FIG. 4B and FIG. 4C are schematic illustrations for explaining an example of a process of releasing a molecule from an electrode and transferring the molecule into a cell.
  • FIG. 5 is a schematic explanatory diagram showing an example of the relationship between the voltage applied to the electrode and the release of DNA molecules (those having weak interaction with the electrode).
  • FIG. 6 is a schematic explanatory diagram showing an example of the relationship between the voltage applied to the electrode and the release of DNA molecules (excluding those having weak interactions with the electrode).
  • FIG. 7 is a schematic explanatory diagram showing an example of a relationship between a voltage applied to an electrode and release of a complex of a DNA molecule and a protein.
  • FIG. 8 is a schematic explanatory diagram showing an example of a sword-like electrode substrate in which a number of needle-like electrodes are arranged.
  • FIG. 9 is a schematic explanatory diagram showing an example of a state where normal human dendritic cells are cultured in a monolayer.
  • FIG. 10 is a schematic explanatory view showing an example of a state in which one needle electrode is punctured into a cell.
  • FIG. 11 is an enlarged schematic explanatory view showing an example of a state in which DNA molecules have been transferred into the cells shown in FIG.
  • FIG. 12 is a schematic explanatory view showing an example of a state in which two needle-like electrodes are punctured in a cell.
  • FIG. 13 is an enlarged schematic explanatory view showing an example of a state where DNA molecules have been transferred into the cells shown in FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the molecule releasing device of the present invention has a molecule releasing means, and further has other means such as a monitoring means appropriately selected as needed.
  • the molecule releasing means has a function of releasing molecules that are electrically interacting with the conductive member to which a potential is applied by changing the potential and releasing the interaction from the conductive member.
  • the conductive member is not particularly limited as long as it shows conductivity, and for example, an electrode is suitably mentioned, and its shape, structure, size, surface texture, number, material, etc. are determined according to the purpose. Can be selected appropriately.
  • the electrode may be referred to as a molecule emission electrode.
  • the shape examples include a plate shape, a needle shape, a rod shape, and a spherical shape.
  • One of these shapes may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • needle-shaped (needle-shaped electrodes) are preferred when the molecule is directly released or transferred into cells or the like to which the molecule is to be transferred in gene therapy or the like.
  • the structure may be formed of a single member, for example, or may be formed of two or more members. In the former case, the member needs to be conductive. In the latter case, at least one member only needs to be conductive, and examples thereof include a structure in which a layer (conductive layer) made of the above material is provided on a base.
  • the substrate is not particularly limited, and its structure, size, and the like can be appropriately selected.
  • Examples of the shape include a plate, a needle, a rod, and a sphere.
  • the material is preferably conductive, insulating, or the like, and examples of the insulating material include quartz glass, silicon, and silicon oxide.
  • the width or diameter is about 500 ⁇ m or less, preferably 300 m or less, and in the case of a fine chip. Is preferably 100 m or less.
  • the electrode is a needle electrode, it is preferable that the diameter is 0.2 ⁇ or less and the length is 3 ⁇ m or more in consideration of applications such as gene therapy.
  • the number may be, for example, one or two or more. The number is preferably 2 or more from the viewpoint of the molecule release efficiency and the like.
  • the materials, shapes, structures, sizes, surface properties, and the like of the electrodes may be the same or different from each other.
  • the arrangement of the two or more electrodes is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the electrodes may be arranged arbitrarily or may be arranged in line. In the latter case, the distance between the electrodes can be constant.
  • the interval between the two or more electrodes examples include, for example, the size of cells (about ⁇ ⁇ ) when cells are cultured in a monolayer on a plate, the interval between cells to which the molecule is to be transferred, and the like.
  • the molecule is transferred (introduced) to the cells cultured in a monolayer on the plate, it is preferably about 1 to 5 jum.
  • the control of the two or more electrodes may be performed at the same timing as each other or at different timings.
  • the two or more electrodes may hold the same or different molecules as the molecules, respectively. In the latter case, a plurality of species such as the gene as the molecule can be efficiently released or transferred into the cell or the like to which the molecule is to be transferred.
  • the two or more electrodes are the needle electrodes, it is preferable that the two or more needle electrodes are erected on a substrate.
  • a sword-shaped electrode substrate can be obtained. Wear.
  • the sword-shaped electrode substrate for example, in gene therapy or the like, as a target to which the molecule is transferred, the molecule is efficiently released or transferred (introduced) into cells or the like cultured in a monolayer on a plate. ).
  • the needle electrode is removed from the target site in the living body while removing the fiber scope.
  • the material include metal, conductive resin, and conductive carbon. These may be used alone or in combination of two or more. In the latter case, for example, the metal may be coated on the conductive resin or the conductive carbon. .
  • Examples of the metal include metals such as gold, platinum, silver, copper, and zinc, and alloys thereof.
  • Examples of the conductive resin include polyacetylene, polythiophene, polypyrrole, poly p-phenylene, polyphenylenevinylene, and polyaryne.
  • Examples of the conductive carbon include carbon nanotubes and carbon nanohorns.
  • Examples of the carbon nanotubes include single-walled carbon nanotubes (SWNT) and multi-walled carbon nanotubes (MWNT). Specific examples of the single-walled carbon nanotubes include an arm-chair carbon nanotube, Zigzag-type carbon nanotubes, chiral-type carbon nanotubes, and the like.
  • the electrode when the electrode is a needle electrode, at least one selected from a metal having a nanopillar structure, a needle-like conductive plastic, and a carbon nanotube is preferable.
  • the nano pillar structure means a structure in which a plurality of small pillars having a size on the order of nanometers are protruded.
  • the metal having the nanopillar structure can be formed by etching the metal.
  • the site where the molecule is held by the interaction in the conductive member is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, when the conductive member is the plate-shaped electrode, When the plate surface or the like is the needle-like electrode, at least a pointed portion thereof is preferably used.
  • the conductive member is the needle-shaped electrode
  • the molecule is electrically sucked and held at the tip of the needle-shaped electrode, and the needle-shaped electrode is inserted into a cell or the like to which the molecule is to be transferred. If the molecule is released from the needle-shaped electrode while the electrode is punctured, it is advantageous in that the molecule can be efficiently released or transferred (introduced) into the cell or the like.
  • the arrangement of the conductive member is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. In terms of the efficiency of release or transfer of the molecule into the object, for example, the molecule is transferred. It is preferable to dispose it near the target, and when the conductive member is the needle-like electrode, it is preferable to puncture the target to which the molecule is to be transferred.
  • the conductive member is disposed in a conductive medium. Is preferred.
  • the conductive medium is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include a liquid, a solid, and a mixture thereof.
  • Examples of the liquid include: Examples thereof include water, an ionic solution, and a solution containing an electrolyte. From the viewpoint of gene therapy or the like, the above-mentioned cells are preferably used. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the target to which the molecule is to be transferred is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. Examples of the target include cells and microcapsules.
  • the cells are not particularly limited, and include animal cells, plant cells, microorganisms, and the like. Among them, animal cells such as humans are preferable in that the cells can be cultured in a monolayer on a plate, and the transfer of the molecules is efficient and easy.
  • the molecule releasing means may have a second electrode. If the second electrode is provided, the second electrode forms a pair of electrodes together with the conductive member (electrode), and forms an electric circuit with the conductive member (electrode). By appropriately changing (applying a voltage) the potential between the second electrode and the conductive member (electrode), the molecules are electrically transferred from the conductive member (electrode). It can be released or aspirated.
  • the conductive member For example, when a positive potential is applied to the conductive member (electrode) and the molecule is attracted to the conductive member (electrode) by an electric interaction, the conductive member (electrode) is applied. When a negative potential is applied to () and the potential is changed (voltage is applied), the molecule can be released from the conductive member (electrode) by an electric repulsive force.
  • the shape, structure, size, material, and the like of the second electrode are not particularly limited, and can be appropriately selected from known electrodes according to purposes. Among them, the needle-like electrode having the needle-like shape is preferable.
  • the number of the second electrodes is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. Usually, the number is equal to or less than the number of the conductive members (electrodes) and is as small as possible. More preferably, for example, when the conductive member (electrode) is erected on the base and there are two or more bases, it is preferable that each base is one. In this case, it is preferable that the conductive member (electrode) and the second electrode in each base are arranged so as to face each other, and at this time, the second electrode is erected on the base.
  • the second electrode may be arranged in the center of the base such that the second electrode is surrounded by the conductive member (electrode), or the second electrode may be arranged at regular intervals.
  • the arranged rows and the rows in which the conductive members are arranged at equal intervals may be alternately arranged.
  • the molecule releasing means may have a third electrode in addition to the second electrode. No. In this case, the control is performed by a so-called three-electrode method, and the potential (reference potential) between the conductive member (emission electrode) and the second electrode is easily set as compared with the two-electrode method without using the third electrode. This is advantageous in that it can be controlled to The third electrode can be used, for example, as an electrode for measuring or observing the reference potential.
  • the shape, structure, size, material, and the like of the third electrode are not particularly limited, and can be appropriately selected from known electrodes according to the purpose. What was described is mentioned.
  • the number of the third electrodes is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. Generally, the smaller the number, the more preferable it is.
  • the conductive member (electrode) is disposed on the base. When two or more substrates are erected, it is preferable that the number is one for each substrate. In this case, it is preferable that the conductive member (electrode) and the third electrode in each base are arranged so as to face each other, and the third electrode may be erected on the base. A third electrode may be located at the center of the substrate.
  • the molecule releasing means may have a power source.
  • the power source is connected to the conductive member (electrode) and the second electrode, an electric circuit can be formed together with the conductive member (electrode) and the second electrode to form an electric field.
  • the potential of the conductive member (electrode) can be arbitrarily changed (voltage applied).
  • the electric field is not particularly limited, and may be a DC electric field or an AC electric field.
  • the shape and the like of the molecule are not particularly limited as long as they include at least a region capable of electrically interacting with the conductive member, and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the shape includes, for example, a linear shape, a granular shape, a plate shape, a combination of two or more of them, and among them, a linear shape is preferable.
  • region where the electric interaction for example, a region having electric polarity and the like are preferably exemplified.
  • the shape of the region is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a linear shape, a granular shape, a plate shape, and a combination of two or more of these. And the like.
  • the size of the region is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the strength of the interaction and the like.
  • the molecule is securely held on the conductive member and is efficiently released. From the viewpoint, larger is preferable, and it may be the entire region of the molecule.
  • the number of the regions may be one or two or more per one of the molecules.
  • the electric interaction force for example, bonding force
  • the conductive member in each region may be the same or different.
  • a part of the region may have a portion having a different electric interaction force (for example, a bonding force) with the conductive member.
  • a group such as (CH 2 ) 3 SS (CH 2 ) 3 OH can be introduced into the 3, terminus of the polynucleotide.
  • the SS portion is more strongly bonded to the conductive member (eg, a metal electrode or the like) than other portions.
  • the molecule (a molecule into which the group is not introduced) that can be released from the conductive member at a low voltage (even when the change in the potential is small) and a high voltage from the conductive member (the The above-mentioned molecules that cannot be released (the molecules into which the gas is introduced) can be formed.
  • the former is used 1 ", the molecules can be released from the conductive member (electrode) at a low cost, and if the latter is used, the molecule can be released without being influenced by environmental conditions and the like. Molecules can be released from the conductive member.
  • the molecule is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • an ionic polymer or the like is preferable in that it can electrically interact with the conductive member (such as bonding).
  • biomolecules are more preferable from the viewpoint of application to treatment of diseases and the like.
  • the ionic polymer is preferably selected from a positive ion polymer and a negative ion polymer.
  • Examples of the positive ion polymer include: Preferable examples include anidin DNA and polyamine.
  • the negative ion polymer include polynucleotide and polyphosphate. These are preferable in that the negative charges are present at regular intervals in the molecule, so that the interaction (bonding, etc.) with the conductive member is easily controlled. Considering the application to gene therapy, etc., polynucleotides Is particularly preferred.
  • Examples of the polynucleotide include a gene, a gene complex (complex of a gene and a protein), and the like.
  • Examples of the gene include a cancer-related gene, a gene associated with a genetic disease, a virus gene, a bacterial gene, and a gene exhibiting a polymorphism called a disease risk factor.
  • cancer-related gene examples include k_ras gene, N-ras gene, p53 gene (lung cancer, esophageal cancer, liver cancer), BRCA1 gene, BRCA2 gene, src gene, ros gene, GM-CSF gene (kidney cancer) , Prostate cancer), thymidine kinase gene (prostate cancer), anticancer drug resistance gene MDR1 (breast cancer), APC gene and the like.
  • genes related to the genetic diseases include various congenital metabolic disorders, for example, phenylketonuria, alkaptonuria, cystinuria, Huntington's chorea, Down syndrome, Duchenne muscular dystrophy, blood Hemophilia, severe combined immunodeficiency, familial hypercholesterolemia, and the like.
  • Examples of the viral gene and the bacterial gene include hepatitis C virus, hepatitis B virus, influenza virus, measles virus, HIV virus, mycoplasma, rickettsia, streptococcus, salmonella, and the like.
  • Examples of the polymorphic genes include genes having different nucleotide sequences depending on individuals that are not necessarily directly related to the cause of disease or the like, for example, PS1 (priserinin 1) gene, PS 2 (priserinin 2) gene, Examples include the APP (beta-amyloid protein kinase) gene, lipoprotein gene, HLA (Human Leukocyte Antigen), genes related to blood types, genes related to the onset of hypertension, diabetes, and the like.
  • a recombinant virus infects cells and enters the nucleus.
  • a complex with a protein such as an enzyme such as integrase that is formed immediately before integration into the genome (recombinant Pre-Integration Composite (rPIC)).
  • rPIC recombinant Pre-Integration Composite
  • the DNA and RNA may be single-stranded or double-stranded.
  • the method for producing the polynucleotide is not particularly limited and may be appropriately selected from known methods according to the purpose. For example, a method using a DNA synthesizer (DNA automatic synthesizer) or a method prepared in advance A method in which monomer blocks are arranged and annealed to the oligonucleotide sequence that has been set and then annealed, and a DNA or RNA ligase is allowed to act on the oligonucleotide to bind the oligonucleotides.
  • the length thereof is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. In this respect, it is preferable that the length be at least 6 bases. In general, the shorter the length of the polynucleotide, the lower the peak voltage required for release from the conductive member (the smaller the change in potential is sufficient).
  • the type of the molecule used is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.One type may be used, or two or more types may be used. It is possible to release or transfer a plurality of types of the molecules into cells or the like to which the cells are transferred.
  • the molecule may have a label from the viewpoint of facilitating the determination of the release from the conductive member.
  • Examples of the label include a radioisotope, a chemiluminescent substance, a fluorescent substance, an enzyme, an antibody, and the like.
  • radioisotope examples include 32 P, 33 P, 35 S, and the like.
  • chemiluminescent substance examples include atalydi-dimethyl ester, luminol, isorluminol, and derivatives thereof.
  • fluorescent substance examples include fluorescent dyes such as fluorescein series, rhodamine series, eosin series, and NBD series, green fluorescent protein (GFP), europium (Eu), terbium (Tb), and samarium (Sm).
  • fluorescent dyes such as fluorescein series, rhodamine series, eosin series, and NBD series, green fluorescent protein (GFP), europium (Eu), terbium (Tb), and samarium (Sm).
  • GFP green fluorescent protein
  • Eu europium
  • Tb terbium
  • Sm samarium
  • Rare earth chelates such as, tetramethinolenrhodamine, Texas red, 4-methinolenverifelone, 7-amino 4 monomethyl coumarin, Cy 3, Cy 5, and the like.
  • enzymes examples include peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, ⁇ -galactosidase, luciferase, and the like.
  • Examples of the others include biotin, ligands, specific nucleic acids, proteins, haptens, and the like.
  • biotin avidin or streptavidin specifically binds to this
  • hapten an antibody specifically binds to this
  • the label is a ligand.
  • the label is a specific nucleic acid, protein, hapten, or the like
  • a nucleic acid, a nucleic acid-binding protein, a protein having an affinity for a specific protein, or the like can be combined. is there.
  • the molecule releasing means the molecules that are electrically interacting with the conductive member to which a potential is applied are released from the conductive member by changing the potential and releasing the interaction. There is no particular limitation as long as it is possible, and it can be appropriately selected according to the purpose.
  • a potential for example, a positive potential
  • the potential (positive potential) and the applied potential are applied to the conductive member that has electrically attracted and held the molecule.
  • a reverse potential eg, a negative potential
  • the molecules can be easily and efficiently released from the conductive member by an electric repulsion.
  • the polynucleotide is a negatively-charged negative ion polymer, so that a positive potential is applied to a metal electrode or the like as the conductive member.
  • the polynucleotide is attracted and held on the metal electrode by an electric interaction (Coulomb attraction).
  • the polynucleotide is released from the metal electrode due to an electric repulsion between the metal electrode and the polynucleotide. Therefore, the molecules can be freely released from the conductive member at an arbitrary timing only by appropriately changing the potential applied to the conductive member.
  • the conductive member is one electrode, An electrode in which a second electrode is used as a counter electrode of the electrode and a power supply capable of applying a voltage thereto is combined, or an electrode in which the third electrode for controlling the potential between these electrodes is further provided.
  • a second electrode is used as a counter electrode of the electrode and a power supply capable of applying a voltage thereto is combined, or an electrode in which the third electrode for controlling the potential between these electrodes is further provided.
  • the voltage (change in applied potential) applied to the conductive member (electrode) is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the degree is preferably such that the cells to be transferred are not damaged or killed, and for example, 0.8 V is preferable.
  • the molecule releasing means can release (control) different molecules from the plurality of conductive members at different timings.
  • the plurality of conductive members are For example, if the molecule is placed around a cell to which the molecule is to be transferred, the cell can be treated, differentiated, and the like. Further, the molecule releasing means may operate only a part of the plurality of conductive members so that the molecule is released only from the part. In this case, the plurality of conductive members For example, by puncturing cells adjacent to each other and releasing and transferring the molecule to only a part of these cells, the action of the molecule can be examined. You can also examine the effects of
  • the other means may include, for example, a monitoring means. According to the monitoring means, a pair for transferring the molecule The state of an elephant cell or the like can be observed, and the treatment, differentiation, and the like of the cell can be performed automatically, safely, and efficiently.
  • the molecular release device of the present invention can be suitably used in various fields, and can be particularly suitably used as a device for gene therapy, a device for diagnosing a gene disease, a device for gene transfer, an analyzer for gene transfer, and the like. .
  • the molecule releasing method of the present invention includes at least a molecule releasing step of releasing molecules electrically attracted to the two or more conductive members from the conductive members at different timings by an electric repulsive force. And other steps appropriately selected.
  • the molecular release method of the present invention is the molecular release device of the present invention, wherein the number of the conductive members is two or more, and the two or more conductive members are designed to be controllable at different timings. It can be suitably carried out using
  • the molecule releasing step independently controls each of the two or more conductive members (electrodes), and specifically changes the potential applied to each conductive member (electrode) independently (for example, This can be performed by changing the potential to a potential opposite to the applied potential) (by applying a voltage).
  • the molecules that have been electrically attracted to the conductive member are released from the conductive member by an electric repulsion.
  • a cell or the like into which the molecule is to be transferred is arranged in the vicinity of the conductive member.
  • the needle electrode is used as the conductive member, the needle electrode is used. By puncturing the cell or the like, the molecule can be efficiently released or transferred into the cell.
  • the molecular release method of the present invention can be suitably used in various fields, and can be particularly suitably used for gene therapy, diagnosis of genetic diseases, gene introduction, detailed observation by gene introduction, and the like.
  • a DNA molecule 10 serving as the molecule as the conductive member that attracts and holds the DNA molecule 10 by electrical interaction.
  • the metal electrode 1 and the second electrode are connected to a power supply (not shown). It is placed in a state of being immersed in a conductive liquid.
  • the metal electrode 1, the second electrode, and the power supply are the molecule releasing means.
  • a needle-like electrode 101 as the conductive member for attracting and holding DNA molecules (not shown) by electric interaction and a second electrode 102 are arranged in a row so as to face each other. It is provided with a sword-shaped electrode substrate 100 that is arranged and arranged every other time (arrangement interval: 5 ⁇ ).
  • the needle electrode 101 and the second electrode 102 are connected to a power supply (not shown), and are arranged so as to be immersed in a conductive liquid.
  • the needle electrode 101, the second electrode 102, and the power supply are the molecule release means.
  • the power supply as the molecule releasing means is operated and a positive potential is applied to the needle electrode 101, a negatively charged DNA molecule is applied with a positive potential by the power supply, The positively charged needle electrode 101 is attracted and held by electrical interaction (Coulomb attraction).
  • cells 201 to which the molecules were to be transferred were monolayer cultured on a flat plate (culture plate) 200, and a confluent monolayer culture layer was obtained in advance.
  • the cell spacing in the monolayer culture layer is 10 ⁇ or more, and at least two needle electrodes can be punctured per cell in calculation.
  • the needle-shaped electrode 101 and the second electrode 102 in which DNA is electrically sucked and held at the tip are arranged in every other row so as to face each other.
  • the tips of the aligned and arranged sword-shaped electrode substrates 100 are punctured into the cells 201 in the monolayer culture layer.
  • the power supply is operated to slightly apply a potential (negative potential) opposite to the previously applied positive potential to the needle electrode 101 (a slight voltage (180 mV)). To be applied). Since each needle electrode 101 in the sword-shaped electrode substrate 100 is electrically controllably connected to an active matrix (a passive matrix is also possible), the needle electrode 1 at an arbitrary position can be controlled.
  • the negatively charged DNA molecule is released from the negatively charged needle electrode 101 by an electric interaction (Coulomb repulsion), and is transferred into the cell 201.
  • the molecule can be transferred into the cell 201 by applying only a small voltage. Therefore, the desired DNA molecules and the like can be efficiently transferred into the cells 201 at any timing without damaging the cells 201.
  • FIGS. 12 and 13 a total of two needle-like electrodes 101 and a second electrode 102 are punctured in one cell 201, and a voltage is applied between these electrodes. You may let it.
  • the potential to be applied can be controlled within a desired range, and the potential difference (applied voltage) can be controlled so that the cell 201 is not overloaded with a large potential (do not apply a large voltage).
  • the death of the cell 201 can be suppressed.
  • the molecule was reacted with a polished circular metal electrode 1 having a diameter of 7 mm (gold electrode in this example) at room temperature for 24 hours. Then, the metal electrode 1 and the second electrode opposed to the metal electrode 1 are arranged in an electrolytic solution, a DC electric field is applied between the two electrodes, and a positive potential is applied to the metal electrode 1 (gold electrode). did. Then, the negatively charged molecule was attracted to and held by the positively charged metal electrode 1 (gold electrode) by electric interaction (Coulomb attraction). At this time, the number of the molecules electrically attracted to the metal electrode 1 (gold electrode) is as follows: J. Am. Chem. Soc. 19999, 121, 11081—10821. It was calculated according the literature reference 1. was 8 X 1 0 10 atoms.
  • a carbon nanotube having a diameter of 0.2 ⁇ m and a length of 3 ⁇ m coated with gold was needle-shaped.
  • the needle-shaped electrode 101 as the conductive member and the second electrode 102 are arranged and arranged in every other row so as to face each other (arrangement interval: 5 / zm).
  • a pinholder-shaped electrode substrate 1 00 each electrically controllable allowed to stand on the substrate where the electrical wiring is provided (500 ⁇ ⁇ ⁇ 500 ⁇ ) .
  • the needle electrode 101 and the second electrode 102 at an arbitrary position on the sword-like electrode substrate 100 can change the potential to a desired degree at a desired timing (a voltage can be applied). I have.
  • a fluorescent (Cy3) labeled DNA 400-mer 400 bases was prepared by PCR using a fluorescent (Cy3) label primer. This was designated as the molecule.
  • the fluorescent (Cy 3) -labeled DNA as the molecule is reacted with the sword-shaped electrode substrate 100 as the conductive member at room temperature for 24 hours, and a needle-shaped electrode 101 (gold electrode) is formed.
  • the needle electrode 101 (gold electrode) and the second electrode 102 are connected to each other.
  • a DC electric field was applied in between, and a positive potential was applied to the needle electrode 101 (gold electrode).
  • the negatively charged molecule was attracted and held at the tip of the positively charged needle electrode 101 (gold electrode) by an electric interaction (Coulomb attraction).
  • cells 201 of commercially available normal human dendritic cells (manufactured by Takara Bio) as a target to which the molecule is to be transferred are placed on a plate (culture plate) 200 using a lymphocyte proliferation kit (manufactured by Takara Bio).
  • Monolayer culture was performed, and the culture solution was removed to prepare a confluent monolayer culture layer as shown in FIG.
  • the needle-shaped electrode 101 and the second electrode 102 in which the DNA is electrically sucked and held at the point of the tip are arranged in every other row.
  • electrode The tip of the substrate 100 is attached to the cells 201 in the monolayer culture layer, that is, a total of the needle electrode 101 and the second electrode 102 per cell 201 in the monolayer culture layer.
  • the book was punctured.
  • the power supply was operated to apply a voltage of -0.8 V to the needle electrode 101 with respect to the third electrode (AgZAgC1) for 30 seconds.
  • the needle electrodes 101 of the sword-like electrode substrate 100 are electrically connected to the active matrix so as to be electrically controllable, the needle electrodes 101 at an arbitrary position can be set at a desired timing. And a desired voltage can be applied. Then, the negatively charged DNA molecule was released from the negatively charged needle electrode 101 by electric interaction (Coulomb repulsion) and was transferred into the cell 201.
  • the needle electrode 101 of the sword-like electrode substrate 100 was extracted from the monolayer culture layer, and the monolayer culture layer in the range of 200 ⁇ m ⁇ 200 m was measured using a microplate reader. For, the presence or absence of fluorescence emission derived from Cy 3 was measured. As a result, the above-mentioned fluorescence was confirmed in all the cells in the range of 200 ⁇ (2.0 ⁇ m). This confirmed that the molecule was transferred to all cells with high efficiency.
  • the conventional problems can be solved, and various useful molecules such as DNA can be efficiently released or transferred into cells or the like without damaging the target.
  • a safe molecule release device and a safe molecule release method can be provided.

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Abstract

　本発明は、ＤＮＡ等の各種有用分子を効率的に、細胞等の対象への放出乃至移入可能であり、遺伝子治療等に応用することができ、安全な分子放出装置及び分子放出方法を提供することを目的とする。本発明の分子放出装置は、電位が印加された導電性部材に電気的に相互作用している分子を、該電位を変化させることによりその相互作用を解いて該導電性部材から放出させる分子放出手段を有する。導電性部材が、分子を移入させる対象の近傍に配置される又は該対象を穿刺して配置される態様、導電性部材が電極である態様、導電性部材の数が２以上である態様、電極が針状電極である態様、分子放出手段が分子を異なるタイミングで放出可能な態様、分子がイオン性ポリマーから選択される態様、等が好ましい。本発明の分子放出方法は、２以上の導電性部材に電気的に吸引されている分子を、電気的な反発力により、異なるタイミングで該導電性部材から放出させる。

Description

分子放出装置及び分子放出方法 技術分野
本発明は、 DN A等の各種有用分子を効率的に、 細胞等の対象への放出乃至移 入可能であり、 遺伝子治療等に応用することができ、 安全な分子放出装置及び分 子放出方法に関する。 明
背景技術
遺伝子治療は、 画期的な治療法であるにも拘らず、 関与する遺伝子が明らかに されている疾病が少ないこと、 安全で効率的な遺伝子導入法が確立されていない 書
こと等の理由から、 致死性の単一遺伝子病 （例えば、 重症複合型免疫不全症、 家 族性高コレステロール血症など） 、 癌、 エイズ （後天性免疫不全症候群） などに その適用が限られてきた。 1 9 95年の N I H (Na t i o n a l I n s t i t u t e s o f He a l t h) の Va r mu s らによる報告では、 これまで に実施された遺伝子治療において導入した遺伝子が原因で疾病が治癒したケース は皆無であるとされた。 しかし、 ヒ トゲノム計画により 200 3年 4月に人間の 全遺伝子情報が明らかになつたこともあり、 今後、 機能ゲノム科学や構造ゲノム 科学の進展により、 解読されたヒ トゲノム配列のどの部分がどのような機能発現 に関係しているのかが明らかにされていけば、 前記遺伝子治療は、 従来はその範 疇とされていなかった生活習慣病 （例えば、 糖尿病など） などにも適用可能とな り、 各種疾病の治療にも適用されていくものと予想される。
前記遺伝子治療においては、 遺伝子導入が必須となるが、 安全で効率の良い遺 伝子導入法は、現在までのところ確立されていない。実際、 1 9 99年 9月には、 ァメ リカのペンシルベニア大学で遺伝子治療を受けた 1 8歳の青年が 4日後に遺 伝子導入に使われたアデノウィルスベクターの規定量以上の投与が原因で、 死亡 したことが報告された。 このような状況に鑑みて、 安全かつ効率の良い、 非ウイ ルスベクターによる遺伝子導入法の確立が強く要請されている。 前記非ウィルスベクターによる遺伝子導入法としては、 例えば、 小胞リポソ一 ム法、 遺伝子銃法、 マイクロインジェクショ ン法などが知られている。
これらの方法の中でも、 前記小胞リボソーム法は、 抗原性が低く （免疫が生じ にく く） 、 導入可能な遺伝子サイズが大きく、 導入効率がよい等の点で非ウィル スベクターとして用いられてきている。 しかし、 この方法の場合、 注入された遣 伝子がゲノム内に取り込まれず、 発現が一過性であり、 特に非分裂細胞では発現 性が低いという問題がある。
前記遺伝子銃法は、 遺伝子を細胞内にあたかも銃で打ち込むようにして物理的 にかつ強制的に導入させる技術である （特許文献 1及ぴ 2参照） 。 しかし、 この 場合、遺伝子又は微粒子を銃のようにして細胞に打ち込むため、該細胞が損傷し、 安全性が十分ではなく、またエネルギーコス トがかかるという問題がある。一方、 チオール基を介して DN Aを金電極に結合させ、 該金電極に負電位を印加するこ とにより、 該 DNAを基板から放出させることが開示されている （例えば、 非特 許文献 1参照） 。 しかし、 この場合、 DNAを放出させるためには、 該チオール 基を分解させるだめの大きなエネルギーが必要であり、 コス ト面、 安全面等に問 題がある。
前記マイクロインジ-クション法は、 遺伝子を細胞に導入する最も確実な方法 として考えられている。 しかし、 この方法の場合、 細胞のサイズと比較して太い 中空針を用いて細胞に DN A溶液を直接注入しているため、 細胞に与える傷害は 大きく、 しかも、 細胞の固定が必要で、 脆弱な細胞膜を持つ体細胞の固定化は現 状では不可能であり、 注入された遺伝子がゲノム内に取り込まれず、 発現が一過 性であるという問題がある。
最近、 組換えウィルスが細胞に感染して核に入ってゲノムに組み込まれる直前 に开成される複合体 (r e c omb i n a n t P r e— I n t e g r a t i o n C omp l e x ; r P I C) を予め作製しておき、 該複合体を標的細胞にマ ィクロマ二ュピュレーター等により導入する組み換えプレインテグレーション複 合法（r P I C法）によると、 前記標的細胞の種に依存せずに遺伝子を該標的細胞 のゲノム中へ取り込み可能であり、 かつ発現が持続的に行われることが報告され ている （例えば、 非特許文献 2参照） 。 しかし、 この場合、 非ウィルスベクター による方法とはいえず安全性の点で不安があり、 また、 前記複合体 （r P I C) を作製するのに手間、 コスト等を要するという問題がある。
したがって、 前記遺伝子治療法においては、 所望の箇所に所望のタイミングで 効率よくかつ低コストで安全に遺伝子等の分子を標的細胞に導入可能な技術は未 だ提供されていないのが現状である。 特許文献 1
特開平 5— 685 75号公報
特許文献 2
特開 2000— 1 2584 1号公報
非特許文献 1
J . Wa n g e t a 1. , L a n g m u ι r , 1 5， 654 丄一り 5 45 (1 99 9)
非特許文献 2
宝ホールディングス株式会社、 「組み換えプレインテグレーション複合法 (r P I C法）を開発」 [on line] 200 1年 1 2月 1 1 日 [2003年 4月 21 曰検索] 、 インター ッ <URL ： http://www.takara.co.jp/news/2001/10 - 12/01 - 1-037. htm>
本発明は、 従来における問題を解決し、 DN A等の各種有用分子を効率的に、 細胞等の対象を損傷させることなく、 これらへの放出乃至移入可能であり、 遣伝 子治療等に応用することができ、 安全な分子放出装置及び分子放出方法を提供す ることを目的とする。 発明の開示
本発明の分子放出装置は、 電位が印加された導電性部材に電気的に相互作用し ている分子を、 該電位を変化させることによりその相互作用を解いて該導電性部 材から放出させる分子放出手段を有することを特徴とする。 該分子放出装置にお いては、 前記分子放出手段により、 電位が印加された導電性部材に電気的に相互 作用している分子が、 該電位が変化されてその相互作用が解かれ、 該導電性部材 から放出される。 このとき、 該導電性部材の近傍に、 前記分子を移入させる対象 を配置させておくと、 放出された前記分子が該対象としての細胞等内に移入され る。
本発明の分子放出方法は、 2以上の導電性部材に電気的に吸引されている分子 を、 電気的な反発力により、 異なるタイミングで該導電性部材から放出させるこ とを特徴とする。 該分子放出方法においては、 前記 2以上の導電性部材に対し、 異なるタイミングで電位を変化 （電圧を印加） させることにより、 前記分子が、 電気的な反発力により、 異なるタイミングで放出され、 細胞等の対象内に移入さ れる。 図面の簡単な説明
図 1 A及び図 1 Bは、 本発明の分子放出装置における分子が放出される原理の 一例を示す概略説明図である。
図 2は、 本発明の分子放出装置において分子が電極に電気的に吸引された状態 の一例を示す概略説明図である。
図 3は、 図 2に示す分子が電気的な反発力により電極から放出された状態の一 例を示す概略説明図である。
図 4 A、 図 4 B及び図 4 Cは、 電極から分子を放出し細胞内に該分子を移入さ せるプロセスの一例を説明するための概略説明図であ 。
図 5は、 電極への印加電圧と D N A分子 （電極との相互作用が弱いもの） の放 出との関係の一例を示す概略説明図である。
図 6は、電極への印加電圧と D N A分子（電極との相互作用が弱いものを除く） の放出との関係の一例を示す概略説明図である。
図 7は、 電極への印加電圧と、 D N A分子とタンパク質との複合体の放出との 関係の一例を示す概略説明図である。
図 8は、 針状電極を多数整列させた剣山状電極基板の一例を示す概略説明図で ある。
図 9は、正常ヒ ト樹状細胞を単層培養した状態の一例を示す概略説明図である。 図 1 0は、細胞に針状電極を 1本穿刺した状態の一例を示す概略説明図である。 図 1 1は、 図 1 0に示す細胞内へ D N A分子を移入させた状態の一例を示す拡 大概略説明図である。
図 1 2は、細胞に針状電極を 2本穿刺した状態の一例を示す概略説明図である。 図 1 3は、 図 1 2に示す細胞内へ D N A分子を移入させた状態の一例を示す拡 大概略説明図である。 発明を実施するための最良の形態
(分子放出装置）
本発明の分子放出装置は、 分子放出手段を有してなり、 更に必要に応じて適宜 選択したモニタリング手段等のその他の手段を有してなる。
前記分子放出手段は、 電位が印加された導電性部材に電気的に相互作用してい る分子を、 該電位を変化させることによりその相互作用を解いて該導電性部材か ら放出させる機能を有する。 前記導電性部材としては、導電性を示すものであれば特に制限はなく、例えば、 電極が好適に挙げられ、 その形状、 構造、 大きさ、 表面性状、 数、 材質などにつ いて目的に応じて適宜選択することができる。 なお、 以下、 該電極を分子放出電 極と称することがある。
前記形状としては、 例えば、 板状、 針状、 棒状、 球状、 などが挙げられる。 こ れらの形状は、 1種単独で使用してもよいし、 2種以上を併用してもよい。 これ らの中でも、 遺伝子治療等において、 前記分子を直接、 該分子を移入させる対象 である細胞等内に放出乃至移入させる場合には、 針状 （針状電極） が好ましい。 前記構造としては、 例えば、 単独の部材で形成されていてもよいし、 2以上の 部材で形成されていてもよい。 前者の場合には、 前記部材が導電性であることが 必要である。 後者の場合には、 少なく とも一つの部材が導電性であればよく、 例 えば、 基体上に前記材料による層 （導電層） が設けられた構造、 などが挙げられ る。 なお、 前記基体としては、 特に制限はなく、 その構造、 大きさ等について適 宜選択することができ、 その形状としては、 板状、 針状、 棒状、 球状などが挙げ られ、その材質としては導電性、絶縁性等が好ましく、該絶縁性の材質としては、 例えば、 石英ガラス、 シリ コン、 酸化ケィ素等が挙げられる。
前記大きさとしては、 例えば、 前記分子放出装置をチップ化する場合には、 幅 乃至径が、 5 0 0 μ m以下程度であり、 3 0 0 m以下が好ましく、 微細なチッ プとする場合には 1 0 0 m以下が好ましい。 なお、 前記電極が針状電極である 場合、 遺伝子治療等の用途を考慮すると、 その直径が 0 . 2 μ πι以下でありかつ 長さが 3 μ m以上であるのが好ましい。 前記数としては、 例えば、 1つであってもよいし、 2以上であってもよい。 前 記分子の放出効率等の観点からは 2以上であるのが好ましい。
前記数が 2以上である場合、 前記電極の材質、 形状、 構造、 大きさ、 表面性状 等は、 それぞれ互いに同一であってもよいし、 異なっていてもよい。
前記 2以上の前記電極の配置としては、 特に制限はなく、 目的に応じて適宜選 択することができ、任意に配置してもよいし、整列配置してもよい。後者の場合、 各電極の間隔を一定にすることができる。
前記 2以上の前記電極の間隔としては、 例えば、 平板 （プレート） に単層培養 した際の細胞の大きさ （約 Ι Ο μ πι) 等、 前記分子を移入させる対象である細胞 等の間隔等に応じて適宜選択することができ、 前記平板に単層培養した細胞に前 記分子を移入 （導入） させる場合には、 1〜 5 ju m程度が好ましい。
前記 2以上の前記電極の制御 （電位の変化、 電圧の印加） は、 それぞれ互いに 同じタイミングで行ってもよいし、 異なるタイミングで行ってもよい。
前記 2以上の前記電極には、 前記分子としてそれぞれ同一のものが保持されて いてもよいし、 異なるものが保持されていてもよい。 後者の場合、 前記分子とし ての遺伝子等の複数種を、 該分子を移入させる対象である前記細胞等内に効率的 に放出乃至移入させることができる。 前記 2以上の前記電極が前記針状電極である場合、 該 2以上の針状電極は、 基 体上に立設等させておくのが好ましい。
この場合、 前記基体として平板を選択すれば、 剣山状電極基板とすることがで きる。 該剣山状電極基板を用いると、 例えば、 遺伝子治療等において、 前記分子 を移入させる対象として、 平板 （プレート） に単層培養した細胞等内に、 前記分 子を効率的に放出乃至移入（導入）させることができる。 また、 前記基体としてフ アイ一バースコープを選択し、 該ファイバースコープの尖端に前記針状電極を設 ければ、 該フアイ一バースコープの除きながら前記針状電極を生体内の目的部位
(例えば、 癌細胞、 疾患臓器等） にまで移動させ、 そこで穿刺することができ、 遺伝子治療等に好適である点で有利である。 前記材質としては、 例えば、 金属、 導電性樹脂、 導電性カーボン、 などが挙げ られる。 これらは、 1種単独で使用してもよいし、 2種以上を併用してもよく、 後者の場合、 例えば、 前記導電性樹脂や前記導電性カーボン上に前記金属を被覆 等してもよい。
前記金属としては、 例えば、 金、 白金、 銀、銅、 亜鉛等の金属、 これらの合金、 などが挙げられる。
前記導電性樹脂としては、 例えば、 ポリアセチレン、 ポリチォフェン、 ポリピ ロール、 ポリ p—フエ-レン、 ポリフエ-レンビ-レン、 ポリア-リ ン、 などが 挙げられる。
前記導電性カーボンとしては、 例えば、 カーボンナノチューブ、 カーボンナノ ホーンなどが挙げられる。 なお、 前記カーボンナノチューブとしては、 例えば、 単層カーボンナノチューブ （S WN T ) 、 多層カーボンナノチューブ （MWN T ) などが挙げられ、 前記単層カーボンナノチューブの具体例としては、 アームチェ ァー型カーボンナノチューブ、 ジグザグ型カーボンナノチューブ、 カイラル型力 一ボンナノチューブなどが挙げられる。
これらは、 1種単独で使用してもよいし、 2種以上を併用してもよい。 これら の中でも、 前記電極を針状電極とする場合には、 ナノピラー構造の金属、 針状の 導電性プラスチック及びカーボンナノチューブから選択される少なくとも 1種が 好ましい。 なお、 前記ナノピラー構造とは、 ナノメーターオーダーの大きさから なる小柱が複数突設された構造を意味する。 該ナノピラー構造の金属は、 前記金 属に対してエッチングを行って形成することができる。 前記導電性部材において前記分子が相互作用により保持される部位としては、 特に制限はなく、 目的に応じて適宜選択することができ、 例えば、 該導電性部材 が、 前記板状電極である場合にはその板面などが、 前記針状電極である場合には 少なくともその尖端部などが好適に挙げられる。 なお、 該導電性部材が前記針状 電極の場合、 前記分子を該針状電極の尖端部に電気的に吸引し保持させておき、 前記分子を移入させる対象である細胞等内に該針状電極を穿刺した状態で該分子 を該針状電極から放出させると、該分子を該細胞等內に効率的に放出乃至移入（導 入） させることができる点で有利である。
前記導電性部材の配置としては、 特に制限はなく、 目的に応じて適宜選択する ことができるが、 該分子の前記対象内への放出乃至移入の効率の点で、 例えば、 前記分子を移入させる対象の近傍に配置するのが好ましく、 前記導電性部材が前 記針状電極である場合には、 前記分子を移入させる対象に穿刺して配置するのが 好ましい。 なお、 前記分子が前記導電性部材に電気的に吸引されており、 該分子 を前記導電性部材から電気的な反発力により放出させる場合、 該導電性部材は、 導電性媒体中に配置されるのが好ましい。 該導電性媒体としては、 特に制限はな く、 目的に応じて適宜選択することができ、 例えば、液体、 固体、 これらの混合、 などのいずれであってもよく、 前記液体としては、 例えば、 水、 イオン溶液、 電 解質を含有する溶液、 などが挙げられ、 また、 遺伝子治療等の観点からは、 前記 細胞が好適に挙げられる。 これらは、 1種単独で使用してもよいし、 2種以上を 併用してもよい。 前記分子を移入させる対象としては、 特に制限はなく、 目的に応じて適宜選択 することができるが、 例えば、 細胞、 マイクロカプセル、 などが好適に挙げられ る。 なお、 前記細胞としては、 特に制限はなく、 動物細胞、 植物細胞、 微生物、 などが挙げられる。 これらの中でも、 該細胞を平板 （プレート） 上に単層培養さ せることでき、 前記分子の移入が効率的かつ容易である点で、 ヒ ト等の動物細胞 が好ましい。また、前記対象が細胞でありかつ前記分子が遺伝子である場合には、 該遺伝子の移入効率の点で、 該細胞を表面処理しておくのが好ましい。 該表面処 理としては、 特に制限はなく、 目的に応じて公知の方法の中から適宜選択するこ とができるが、 例えば、 リン酸カルシウム処理、 などが挙げられる。 前記分子放出手段は、 第二の電極を有していてもよい。 該第二の電極を設けて おく と、 前記導電性部材 （電極） と共に該第二の電極が一対の電極を構成し、 前 記導電性部材 （電極） と共に電気回路を形成し、 電流の収支を図ることができ、 該第二の電極と前記導電性部材 （電極） との間の電位を適宜変化 （電圧を印加） させることにより、前記分子を該導電性部材（電極）から電気的に放出させたり、 吸引させたりすることができる。 例えば、 前記導電性部材 （電極） に正電位が印 加されており、 該導電性部材 （電極) に前記分子が電気的相互作用により吸引さ れている場合には、該導電性部材 （電極） に負電位を印加させ、 該電位を変化 （電 圧を印加） させると、 前記分子を電気的な反発力により該導電性部材 （電極） か ら放出させることができる。
前記第二の電極としては、 その形状、 構造、 大きさ、 材質等については特に制 限はなく、 目的に応じて公知の電極の中から適宜選択することができ、 例えば、 前記導電性部材として説明したものが挙げられ、 これらの中でも、 前記形状が針 状である針状電極が好ましい。
前記第二の電極の数としては、 特に制限はなく、 目的に応じて適宜選択するこ とができるが、 通常、 前記導電性部材 （電極） の数と同数以下であり、 可能な限 り少ない方が好ましく、 例えば、 前記導電性部材 （電極） が前記基体上に立設さ れ、 該基体が 2以上ある場合には、 各基体当 fこり 1であるのが好ましい。 この場 合、 各基体における前記導電性部材 （電極） と該第二の電極とは互いに対向して 配置されるのが好ましく、 また、 このとき、 前記第二の電極を前記基体上に立設 させてもよく、 該第二の電極を前記導電性部材 （電極） が囲むようにして該第二 の電極を該基体の中央に配置させてもよいし、 あるいは、 該第二の電極が等間隔 に配列した列と、 前記導電性部材が等間隔に配列した列とを交互に整列配置させ てもよい。 前記分子放出手段は、 前記第二の電極のほかに、 第三の電極を有していてもよ い。 この場合、 いわゆる三電極法による制御となり、 該第三の電極を用いない二 電極法に比べ、 前記導電性部材 （放出電極） 及び前記第二の電極の間における電 位（基準電位）を容易に制御することができる点で有利である。該第三の電極は、 例えば、 前記基準電位を測定乃至観測するための電極として使用することができ る。
前記第三の電極としては、 その形状、 構造、 大きさ、 材質等については特に制 限はなく、 目的に応じて公知の電極の中から適宜選択することができ、 例えば、 前記導電性部材として説明したものが挙げられる。
前記第三の電極の数としては、 特に制限はなく、 目的に応じて適宜選択するこ とができ、 一般的には少ない方が好ましく、 例えば、 前記導電性部材 （電極） が 前記基体上に立設され、 該基体が 2以上ある場合には、 各基体当たり 1であるの が好ましい。 この場合、 各基体における前記導電性部材 （電極） と該第三の電極 とは互いに対向して配置されるのが好ましく、 前記第三の電極を前記基体上に立 設させてもよく、 該第三の電極を該基体の中央に配置させてもよい。
前記分子放出手段は電源を有していてもよい。該電源を前記導電性部材（電極） 及び前記第二の電極に接続しておくと、 該導電性部材 （電極） 及び該第二の電極 と共に電気回路を形成し、 電場を形成することができ、 該導電性部材 （電極） の 電位を任意に変化 （電圧を印加） 等させることができる。 なお、 前記電場として は、 特に制限はなく、 直流電場であってもよいし、 交流電場であってもよい。 前記分子としては、 前記導電性部材と電気的な相互作用可能な領域を少なくと も含む限り、 その形状等については特に制限はなく、 目的に応じて適宜選択する ことができる。 なお、 該形状としては、 例えば、 線状、 粒状、 板状、 これらの 2 以上の組合せ、 など挙げられ、 これらの中でも、 線状などが好ましい。
前記電気的な相互作用可能な領域としては、 例えば、 電気的極性を有する領域 などが好適に挙げられる。
前記領域の形状としては、 特に制限はなく、 目的に応じて適宜選択することが でき、例えば、線状、粒状、板状、 これらの 2以上の組合せ、 など挙げられるが、 これらの中でも、 線状などが好ましい。 前記領域の大きさとしては、 特に制限はなく、 前記相互作用の強さ等に応じて 適宜選択することができるが、前記分子を前記導電性部材に対し、確実に保持し、 効率よく放出させる観点からは、 大きい方が好ましく、 前記分子の全領域であつ てもよい。
前記領域としては、 その数が前記分子 1つ当たり、 1つであってもよいし、 2 以上であってもよい。 後者の場合、 各領域における、 前記導電性部材との電気的 な相互作用力 （例えば結合力） 力 互いに同一であってもよいし、 異なっていて もよい。
前記領域において、更にその一部に前記導電性部材との電気的な相互作用力（例 えば結合力など） が異なる部位が存在していてもよい。 例えば、 前記領域が前記 ポリヌクレオチドである場合には、 該ポリヌクレオチドの 3， 末端に （C H 2 ) 3 S S ( C H 2 ) 3 O Hなどの基を導入することができ、 この場合、 該基の S S部分 は、 他の部分よりも前記導電性部材 （例えば金属電極など） に強固に結合する。 このように、 一部に前記導電性部材との電気的な相互作用力が強い部位が存在す る分子の場合、 前記導電性部材に低い電圧を印加しただけでは （該導電性部材に 印加する電位の変化が小さいと） 放出されなくなる。 その結果、 前記導電性部材 から低電圧で （前記電位の変化が小さくても） 放出可能な前記分子 （前記基が導 入されていない分子） と、 前記導電性部材から高電圧でないと （前記電位の変化 が大きくないと） 放出不能な前記分子 （前記気が導入された分子） とを形成する ことができる。 このとき、 前者を利用 1"ると、 低コストで前記分子を前記導電性 部材 （電極） から放出可能であり、 また、 後者を利用すると、 環境条件の変動等 の影響を受けることなく、 前記分子を前記導電性部材から放出可能である。
前記分子としては、 特に制限はなく、 目的に応じて適宜選択することができ、 例えば、 前記導電性部材と電気的な相互作用 （結合等） が可能である点でイオン 性ポリマーなどが好適に挙げられ、 これらの中でも、 病気の治療等への応用等の 観点からは生体分子がより好ましい。
前記イオン性ポリマーとしては、 正イオンポリマー及び負イオンポリマーから 選択されるのが好ましい。
前記正イオンポリマー （正に帯電したイオンポリマー） としては、 例えば、 グ ァニジン DNA、 ポリアミンなどが好適に挙げられる。
前記負イオンポリマー （負に帯電したイオンポリマー） としては、 例えば、 ポ リヌクレオチド、 ポリ リン酸などが好適に挙げられる。 これらは、 負電荷が分子 中に一定間隔で存在する点で前記導電性部材との相互作用 （結合等） を制御し易 い点で好ましく、 遺伝子治療等への応用等を考慮すると、 ポリヌクレオチドが特 に好ましい。
前記ポリヌクレオチドとしては、 例えば、 遺伝子、 遺伝子複合体 （遺伝子とタ ンパク質との複合体） などが挙げられる。 なお、 前記遺伝子としては、 例えば、 癌関連遺伝子、 遺伝病に関連する遺伝子、 ウイ ルス遺伝子、 細菌遺伝子、 及び病気のリスクファクターと呼ばれる多型性を示す 遺伝子、 などが挙げられる。
前記癌関連遺伝子としては、 例えば、 k_ r a s遺伝子、 N— r a s遺伝子、 p 53遺伝子 （肺癌、 食道癌、 肝癌） 、 BRCA1遺伝子、 BRCA2遺伝子、 s r c遺伝子、 r o s遺伝子、 GM— CS F遺伝子 （腎臓癌、 前立腺癌） 、 チミ ジンキナーゼ遺伝子 （前立腺癌） 、 抗癌剤耐性遺伝子 MDR 1 (乳癌） 、 APC 遺伝子などが挙げられる。
前記遺伝病に関連する遺伝子としては、 例えば、 各種先天性代謝異常症、 例え ばフェニールケ トン尿症、 アルカプトン尿症、 シスチン尿症、 ハンチントン舞踏 病、 D own症候群、 Du c h e n n e型筋ジス トロフィー、 血友病、 重症複合 型免疫不全症、 家族性高コレステロール血症、 などが挙げられる。
前記ウィルス遺伝子及び前記細菌遺伝子としては、例えば、 C型肝炎ウィルス、 B型肝炎ウィルス、 インフルエンザウイルス、 麻疹ウィルス、 H I Vウィルス、 マイコプラズマ、 リケッチア、 レンサ球菌、 サルモネラ菌、 などが挙げられる。 前記多型性を示す遺伝子としては、 病気等の原因とは必ずしも直接は関係のな い個体によって異なる塩基配列を持つ遺伝子、 例えば、 P S 1 (プリセリニン 1) 遺伝子、 P S 2 (プリセリニン 2) 遺伝子、 AP P (ベーターァミロイ ドブレ力 ーサー蛋白質） 遺伝子、 リポプロテイン遺伝子、 HLA (Huma n L e u k o c y t e An t i g e n) 、 血液型に関する遺伝子、 高血圧、 糖尿病等の発 症に関係するとされている遺伝子、 などが挙げられる。
前記遺伝子複合体としては、 例えば、 組換えウィルスが細胞に感染して核に入 つてゲノムに組み込まれる直前に形成されるィンテグラーゼのような酵素などの タンノ ク質との複合体 （r e c omb i n a n t P r e - I n t e g r a t i o n C omp l e x ; r P I C) 、 などが挙げられる。 前記 DNA及び RNA は、 一本鎖であってもよいし、 二本鎖であってもよい。
前記ポリヌクレオチドを作製する方法としては、 特に制限はなく、 公知の方法 の中から目的に応じて適宜選定することができ、 例えば、 DNAシンセサイザー (DNA自動合成機） を用いる方法、 あるいは、 予め作成しておいたオリゴヌク レオチド配列に対し、 モノマーブロックを並べてアニーリングし、 DNAライゲ ース又は R N Aライゲースを作用させて結合させる方法、 などが挙げられる。 前記ポリヌクレオチドの場合、 その長さとしては、 特に制限はなく、 目的に応 じて適宜選択することができるが、 最も短くても効果が期待できるアンチセンス 法ですら二本鎖の安定性の点で、少なく とも 6塩基であるのが好ましい。一般に、 該ポリヌクレオチドの長さが短い程、 前記導電性部材から放出させるのに必要な ピーク電圧が低くなる （電位の変化量が小さくて足りる） 。
前記分子の使用する種類としては、 特に制限はなく、 目的に応じて適宜選択す ることができ、 1種であってもよいし、 2種以上であってもよく、 後者の場合、 該分子を移入させる対象である細胞等内に複数種の該分子を放出乃至移入させる ことが可能である。
前記分子は、前記導電性部材から放出されたことの判別を容易にする観点から、 標識を有していてもよい。
前記標識としては、例えば、 放射性同位元素、化学発光物質、 蛍光物質、酵素、 抗体、 その他が挙げられる。
前記放射性同位元素としては、 例えば、 32P、 33P、 35 S、 等が挙げられる。 前記化学発光物質としては、 例えば、 アタリジ-ゥムエステル、 ルミノール、 イソルミノール又はこれらの誘導体、 等が挙げられる。
前記蛍光物質としては、 例えば、 フルォレセイン系列、 ローダミン系列、 ェォ シン系列、 NBD系列等の蛍光色素、緑色蛍光蛋白質 (GF P)、 ユーロピウム （E u) 、 テルビウム （T b) 、 サマリウム （Sm) 等の希土類キレート、 テトラメ チノレローダミン、 テキサスレッ ド、 4ーメチノレゥンベリフエロン、 7—ァミノ一 4一メチルクマリン、 C y 3、 C y 5、 等が挙げられる。
前記酵素としては、 例えば、 ペルォキシダーゼ、 アルカリホスファタ一ゼ、 グ ルコースォキシダーゼ、 β一ガラク トシダーゼ、 ルシフェラーゼ、 等が挙げられ る。
前記その他としては、 例えば、 ピオチン、 リガンド、 特定の核酸、 蛋白質、 ハ プテン、 等が挙げられる。 前記標識がビォチンである場合にはこれに特異的に結 合するアビジン又はストレブトアビジンが、 前記標識がハプテンである場合には これに特異的に結合する抗体が、 前記標識がリガンドである場合にはレセプター が、 前記標識が特定の核酸、 蛋白質、 ハプテン等である場合にはこれらと特異的 に結合する核酸、 核酸結合蛋白質、 特定の蛋白質と親和性を有する蛋白質等が、 それぞれ組合せ可能である。 前記分子放出手段としては、 電位が印加されている前記導電性部材と電気的に 相互作用している前記分子を、 該電位を変化させることによりその相互作用を解 いて該導電性部材から放出させることができる限り特に制限はなく、 目的に応じ て適宜選択することができる。
該分子放出手段によると、 例えば、 電位 （例えば正電位） が印加され、 前記分 子を電気的に吸引し保持していた前記導電性部材に対し、 印加されていた該電位 (正電位） とは逆の電位 （例えば負電位） を印加することにより、 容易にかつ効 率的に、 該分子を電気的な反発力により該導電性部材から放出させることができ る。 具体的には、 前記分子が前記ポリヌクレオチドである場合、 該ポリヌクレオ チドは負電荷に帯電した負イオンポリマーであるので、 前記導電性部材としての 金属電極等に正電位を印加しておく と、 該ポリヌクレオチドは該金属電極に電気 的相互作用 （クーロン引力） により吸引され保持される。 一方、 該金属電極に負 電位を印加すると、 該金属電極と該ポリヌクレオチドとの間における電気的な反 発力により該ポリヌクレオチドが該金属電極から放出される。 したがって、 前記 導電性部材に印加する電位を適宜変化させるだけで， 前記分子を前記導電性部材 から任意のタイミングで自在に放出させることができる。
前記分子放出手段の具体例としては、 前記導電性部材を一方の電極とし、 前記 第二の電極を該電極の対向電極とし、 これらに電圧を印加可能な電源を組合せた もの、 あるいは、 更にこれらの電極間の電位を制御するための前記第三の電極を 設けたもの、 などが好適に挙げられる。
なお、 前記分子放出手段において、 前記導電性部材（電極） に印加する電圧 （印 加した電位の変化） としては、 特に制限はなく、 目的に応じて適宜選択すること ができるが、 前記分子を移入させる対象としての細胞を損傷乃至死滅させない程 度が好ましく、 例えば、 一 0 . 8 Vが好ましい。
この電圧範囲は、 公知のエレク トロ トランスフエクシヨン等の方法に比べて、 前記細胞に負荷する電圧を十分に低く、 該細胞に損傷を与えることがない点で有 利である。 この電圧範囲は、 前記導電性部材と、 これに対抗配置させた前記第二 の電極とを、 同一の対象 （細胞） に穿刺させて配置する場合に、 特に好適に採用 することができる。 本発明においては、 前記分子放出手段が、 複数の前記導電性部材から互いに異 なる前記分子を異なるタイミングで放出 （制御） 可能であるのが好ましく、 この 場合、 該複数の前記導電性部材を、 例えば、 前記分子を移入させる細胞の周辺に 配置させておくと、 該細胞の治療、 分化等を行うことも可能である。 また、 前記 分子放出手段が、 複数の前記導電性部材の内の一部のみを作動させ、 該一部から のみ前記分子が放出されるようにしてもよく、 この場合、 複数の前記導電性部材 を、 例えば、 互いに隣接する細胞に穿刺させておき、 これらの細胞の一部のみに 前記分子を放出し移入させることにより、該分子による作用を調べることができ、 また、 該互いに隣接する細胞間の影響を調べることもできる。
これらは、 複数の前記導電性部材を、 パッシブマトリクス又はアクティブマト リクス上に配置させることにより行うことができ、 複数の前記導電性部材をパッ シブマトリタス又はアクティブマトリクス上に配置させた配線構造によると、 所 望の位置の前記導電性部材のみを任意のタイミングで制御することができる。 本発明においては、 前記その他の手段として、 例えば、 モニタリング手段、 な どを有していてもよい。 該モニタリング手段によると、 前記分子を移入させる対 象である細胞等の状態を観察することができ、 該細胞の治療、 分化等を自動的に かつ安全に効率よく行うことができる。 本発明の分子放出装置は、 各種分野において好適に使用することができ、 遺伝 子治療の装置、 遺伝子病の診断、 遺伝子導入の装置、 遺伝子導入による分析装置 等として特に好適に使用することができる。
(分子放出方法）
本発明の分子放出方法は、 2以上の前記導電性部材に電気的に吸引されている 分子を、 電気的な反発力により、 異なるタイミングで該導電性部材から放出させ る分子放出工程を少なくとも含み、 更に適宜選択したその他の工程等を含む。 本発明の分子放出方法は、 本発明の前記分子放出装置において、 前記導電性部 材の数が 2以上であり、 該 2以上の導電性部材を異なるタイミングで制御可能な 態様に設計されたものを用いて好適に実施することができる。
前記分子放出工程は、 前記 2以上の導電性部材 （電極） におけるそれぞれを独 立に制御する、 具体的には各導電性部材 （電極） に印加された電位をそれぞれ独 立に変化 （例えば、 印加されている電位と逆電位に変化） させる （電圧を印加さ せる） ことにより、 行うことができる。 該分子放出工程により、 前記導電性部材 に電気的に吸引していた前記分子が電気的な反発力により該導電性部材から放出 される。 そして、 このとき、 該導電性部材の近傍に前記分子を移入させる対象で ある細胞等を配置させておく と、 あるいは、 該導電性部材として前記針状電極を 用いる場合には該針状電極を前記細胞等に穿刺しておくと、 該細胞内に前記分子 が効率的に放出乃至移入させることができる。 本発明の分子放出方法は、 各種分野において好適に使用することができ、 遺伝 子治療、 遺伝子病の診断、 遺伝子導入、 遺伝子導入による細部観察、 等に特に好 適に使用することができる。 ここで、 本発明の分子放出装置における分子放出の原理について、 図面を参照 しながら説明する。 図 1 A及び図 1 Bに示すように、 本発明の分子放出装置の一 例としては、 前記分子としての D N A分子 1 0と電気的な相互作用によりこれを 吸引し保持する前記導電性部材としての金属電極 1を少なくとも備えてなる。 な お、金属電極 1における上方には前記第二の電極（図示せず）が設けられており、 金属電極 1 と該第二の電極とは、 電源 （図示せず） に接続されており、 導電性の 液中に浸漬された状態で配置されている。 金属電極 1、 前記第二の電極及び前記 電源が、 前記分子放出手段である。
前記分子放出手段としての前記電源を作動させておき、 金属電極 1に正電位を 印加しておくと、 図 1 A及び図 2に示すように、 負に帯電している D N A分子 1 0が、 前記電源により正電位が印加され、 正に帯電した金属電極 1に電気的な相 互作用 （クーロン引力） により吸引され保持されている。 一方、 前記電源を作動 させ、 金属電極 1に今まで印加していた正電位と逆の電位 （負電位） を僅かに印 加すると （電圧 （― 8 0 O m V ) を僅かに印加すると） 、 図 1 B及び図 3に示す ように、負に帯電している D N A分子 1 0力 S、前記電源により負電位が印加され、 負に帯電した金属電極 1から、 電気的な相互作用 （クーロン反発力） により、 放 出される。
このとき、 図 4 Aに示すように、 金属電極 1の近傍に、 前記分子を移入させる 対象として、 予め D N A分子 1 0が移入し易くなるように表面処理 （リボソーム を添加） をした細胞 2 0を配置させておく と、 図 4 Bに示すように、 金属電極 1 から放出された D N A分子 1 0は、 細胞 2 0に接近し、 図 4 Cに示すように、 細 胞 2 0内に D N A分子 1 0が移入される。 この場合、 電子銃、 マイクロインジェ クション法、 エレク トロトランスフエクションなどを使用した場合と異なり、 僅 かな電圧を印加しただけで前記分子の細胞 2 0内への移入を行うことができ、 こ のため、 細胞 2 0に損傷を与えることがなく、 前記対象である細胞内に所望の D N A分子等を所望のタイミングで移入 （導入） させることができる。 このため、 本発明の分子放出装置は、安全性に優れ、遺伝子治療等に好適に応用可能である。 次に、本発明の分子放出装置の他の例について、図面を参照しながら説明する。 図 8に示すように、 本発明の分子放出装置の他の例としては、 前記分子としての D N A分子 （図示せず） を電気的な相互作用により吸引し保持する前記導電性部 材としての針状電極 1 0 1 と、 第二の電極 1 0 2とを、 互いに対向するように一 列おきに整列配置 （配置間隔： 5 μ πι) された剣山状電極基板 1 0 0を備えてな る。 なお、 針状電極 1 0 1 と第二の電極 1 0 2とは、 電源 （図示せず） に接続さ れており、 導電性の液中に浸潰された状態で配置されている。 針状電極 1 0 1、 第二の電極 1 0 2及び前記電源が、 前記分子放出手段である。
前記分子放出手段としての前記電源を作動させておき、 針状電極 1 0 1に正電 位を印加しておく と、 負に帯電している D N A分子が、 前記電源により正電位が 印加され、 正に帯電した針状電極 1 0 1に電気的な相互作用 （クーロン引力） に より吸引されて保持されている。
図 9に示すように、 前記分子を移入させる対象としての細胞 2 0 1を平板 （培 養プレート） 2 0 0上に単層培養し、 集密状態の単層培養層を予め得ておいた。 なお、 該単層培養層における細胞間隔は 1 0 μ «ι以上であり、 計算上、 細胞 1個 当たり少なく とも 2本の針状電極を穿刺することができる。
図 1 0及び図 1 1に示すように、 D N Aが尖端部に電気的に吸引され保持され た針状電極 1 0 1と、 第二の電極 1 0 2とを互いに対向するように一列おきに整 列配置した剣山状電極基板 1 0 0の尖端を、 前記単層培養層における細胞 2 0 1 に穿刺させる。 この状態で、 前記電源を作動させて針状電極 1 0 1に今まで印加 していた正電位と逆の電位 （負電位） を僅かに印加する （電圧 （一 8 0 0 m V ) を僅かに印加する） 。 なお、 該剣山状電極基板 1 0 0における各針状電極 1 0 1 は、 アクティブマトリクス （パッシブマトリクスも可） に電気的に制御可能に接 続されているため、 任意の箇所の針状電極 1 0 1を所望のタイミングで所望の程 度に電位を変化可能 （電圧を印加可能） である。 すると、 負に帯電している D N A分子が、 電気的な相互作用 （クーロン反発力） により、 負に帯電した針状電極 1 0 1から放出され、 細胞 2 0 1内に移入される。 この場合、 電子銃、 マイクロ インジェクション法、 エレク トロ トランスフエクションなどを使用した場合と異 なり、 僅かな電圧を印加しただけで前記分子の細胞 2 0 1内への移入を行うこと ができ、 このため、 細胞 2 0 1に損傷を与えることがなく、 細胞 2 0 1内に任意 のタイミングで所望の D N A分子等を効率よく移入させることができる。 また、 図 1 2及び図 1 3に示すように、 1つの細胞 20 1内に針状電極 1 0 1 と第二電極 1 02とを計 2本の穿刺し、 これらの電極間に電圧を印加させてもよ い。 この場合、 細胞 20 1に大きな電位を負荷し過ぎないように （大きな電圧を 印加しないように） 、 印加する前記電位を所望の範囲に制御し、 該電位差 （印加 電圧） を制御することができ、 細胞 20 1が死滅等してしまうことを抑制するこ とができる点で好ましい。 以下、 本発明の実施例について説明するが、 本発明は、 これらの実施例に何ら 限定されるものではない。
(実施例 1 )
まず、 3， 末端に （CH2) 3 S S (CH2) 3OHを導入した一本鎖ポリヌクレ ォチド （ここでは 1 2塩基対） を合成した。 これを前記分子とした。
図 2に示すように、 該分子を、 ポリ ッシュした直径 7 mmの円形状の金属電極 1 (この実施例では金電極） と室温で 24時間反応させた。 そして、 金属電極 1 と、 これに対向配置させた前記第二の電極とを電解液中に配置させ、 二つの電極 間に直流電場を印加し、 金属電極 1 (金電極） に正電位を印加した。 すると、 正 に帯電した金属電極 1 (金電極） に、 負に帯電している前記分子が電気的相互作 用 （クーロン引力） により吸引され保持された。 この時、 金属電極 1 (金電極） に電気的に吸引された前記分子の数は、 J . Am. C h e m. S o c. 1 99 9， 1 2 1， 1 0803— 1 082 1の文献の記載を参考に算出したところ、 1. 8 X 1 010個であった。
そこで、 次に、 前記二つの電極間に直流電場を印加し、 金属電極 1 (金電極） に負電位 （パルスなどのモジュレーションをかけたもの） を印加した。 すると、 図 3に示すように、 クーロン反発力により金属電極 1 (金電極）から前記分子（金 属電極 1と s sを介して強固に結合していないもの） が乖離し、 放出された。 このとき、 図 5に示すように、 DNA分子 1 0 (金属基板 1との相互作用が弱 いもの） は、 比較的短時間で金属基板 1から放出された （図 5中横軸は時間 （秒） を表す） 。 また、 図 6に示すように、 DNA分子 10 (金属基板 1との相互作用 が弱いものを除いた） は、 比較的長時間で金属基板 1から放出された。 また、 図 7に示すように、 DN A分子とタンパク質との複合体は、 比較的長時間で金属基 板 1から放出された。
(実施例 2)
図 8に示すように、 前記導電性部材及び前記第二の電極として、 直径が 0. 2 μ mでありかつ長さが 3 μ mであるカーボンナノチューブの表面を金で被覆した ものを針状の金電極として用いた。 前記導電性部材としての針状電極 1 01と、 第二の電極 1 0 2とを互いに対向するように一列おきに整列配置 （配置間隔： 5 /zm) で 10， 000本、 アクティブマトリクス状に電気配線が設けられた基板 (500 ^∞Χ 500 μπι) 上に各々電気的に制御可能に立設させて剣山状電極 基板 1 00を作製した。 このため、 剣山状電極基板 1 00における任意の箇所の 針状電極 1 0 1及び第二の電極 1 02は、 所望のタイミングで所望の程度に電位 を変化可能 （電圧を印加可能） となっている。
一方、 蛍光 （C y 3) ラベルプライマーを用いて P CR法によりで蛍光 （C y 3) ラベルされた DNA400量体 （400塩基） を作製した。 これを前記分子 とした。
前記分子としての、 該蛍光 （Cy 3) ラベルされた DNAと、 前記導電性部材 としての剣山状電極基板 1 00とを室温で 24時間反応させ、針状電極 1 0 1 (金 電極） と、 該針状電極 10 1の隣に対向配置させた第二の電極 1 02とを電解液 中に配置させた状態で、 針状電極 10 1 (金電極） と第二の ¾極 1 02との間に 直流電場を印加し、 針状電極 1 0 1 (金電極） に正電位を印加した。 すると、 正 に帯電した針状電極 101 (金電極） の尖端に、 負に帯電している前記分子が電 気的相互作用 （クーロン引力） により吸引され保持された。
次に、 前記分子を移入させる対象としての、 市販の正常ヒ ト樹状細胞 （タカラ バイオ製） の細胞 20 1をリンパ球増殖キッ ト （タカラバイオ製） を用いて平板 (培養プレート） 200に単層培養し、 培養液を除き、 図 9に示したような集密 状態の単層培養層を作製した。
図 1 0及び図 1 1に示すように、 DN Aが尖端部に電気的に吸引され保持され た針状電極 1 0 1及び第二の電極 1 0 2を一列おきに整列配置させた剣山状電極 基板 1 0 0の尖端を前記単層培養層における細胞 2 0 1に、 即ち前記単層培養層 における各細胞 2 0 1当たり、針状電極 1 0 1及び第二の電極 1 0 2の計 2本を、 穿刺させた。 この状態で、 前記電源を作動させて針状電極 1 0 1に対し、 前記第 三の電極（A g Z A g C 1 )を基準として— 0 . 8 Vの電圧を 3 0秒間印加した。 なお、 該剣山状電極基板 1 0 0における各針状電極 1 0 1は、 アクティブマトリ タスに電気的に制御可能に接続されているため、 任意の箇所の針状電極 1 0 1を 所望のタイミングで所望の電圧を印加可能である。 すると、 負に帯電している D N A分子が、 電気的な相互作用 （クーロン反発力） により、 負に帯電した針状電 極 1 0 1から放出され、 細胞 2 0 1内に移入された。
その後、 前記単層培養層から剣山状電極基板 1 0 0における針状電極 1 0 1を 抜き取り、 マイクロプレートリーダーを用い、 2 0 0 μ m X 2 0 0 m範囲にお ける前記単層培養層について、 C y 3由来の蛍光発色の有無を測定した。 その結 果、 2 0 0 μ πι Χ 2 .0 0 μ m範囲內の全細胞において前記蛍光発色が確認された。 このことから、 全細胞に前記分子を高効率で移入させることが確認された。
また、 前記分子を移入させた前記単層培養層における一部の細胞を培養プレー ト 2 0 0から剥がし取り、 培養液を再注入して該単層培養層を培養した結果、 剥 がし採られた部分が、 再び細胞層に覆われていた。 このことから、 前記分子を移 入（導入）させた細胞には障害が生じていないことが確認された。 産業上の利用可能性
本発明によると、 従来における問題を解決することができ、 D N A等の各種有 用分子を効率的に、 細胞等の対象を損傷させることなく、 これらへの放出乃至移 入可能であり、 遺伝子治療等に応用することができ、 安全な分子放出装置及び分 子放出方法を提供することができる。

Claims

1 . 電位が印加された導電性部材に電気的に相互作用している分子を、 該 電位を変化させることによりその相互作用を解いて該導電性部材から放出させる 分子放出手段を有することを特徴とする分子放出装置。
2 . 分子放出手段が、 電位が印加された導電性部材に電気的に相互作用し ている分子を、 該電位と逆の電位を該導電性部材に印加することによりその相互 作用を解いて該導電性部材から青放出させる請求の範囲第 1項に記載の分子放出装 置。
3 . 導電性部材が、 分子を移入させる対象の近傍に配置される請求の範囲 第 1項から第 2項のいずれかに記載の分子放出装置。
4 . 導電性部材が、 分子を移入させる対象囲を穿刺して配置される請求の範 囲第 1項から第 2項のいずれかに記載の分子放出装置。
5 . 対象が、 細胞及びマイクロカプセルから選択される請求の範囲第 3項 から第 4項のいずれかに記載の分子放出装置。
6 . 導電性部材がファィバースコープの先端に設けられた請求の範囲第 1 項から第 5項のいずれかに記載の分子放出装置。
7 . 導電性部材が電極である請求の範囲第 1項から第 6項のいずれかに記 載の分子放出装置。
8 . 導電性部材の数が 2以上である請求の範囲第 1項から第 7項のいずれ かに記載の分子放出装置。
9 . 2以上の導電性部材がそれぞれ独立に作動が制御される請求の範囲第 8項に記載の分子放出装置。
1 0 . 電極が針状電極である請求の範囲第 7項から第 9項のいずれかに記載 の分子放出装置。
1 1 . 針状電極が、 直径が 0 . 2 / m以下でありかつ長さが 3 μ m以上であ る請求の範囲第 1 0項に記載の分子放出装置。
1 2 . 針状電極が、 金属、 導電性樹脂及び導電性カーボンから選択される少 なくとも 1種で形成された請求の範囲第 1 0項から第 1 1項のいずれかに記載の 分子放出装置。
1 3 . 針状電極の少なく とも尖端部に分子が電気的な相互作用により保持さ れる請求の範囲第 1 0項から第 1 2項のいずれかに記載の分子放出装置。
1 4 . 針状電極の数が 2以上であり、 該 2以上の針状電極に同一の分子及び 異なる分子のいずれかが電気的な相互作用により保持される請求の範囲第 1 0項 から第 1 3項のいずれかに記載の分子放出装置。
1 5 . 第二の電極を更に有する請求の範囲第 7項から第 1 4項のいずれかに 記載の分子放出装置。
1 6 . 第二の電極が針状であり、 該第二の電極及び針状電極が同一の対象中 に穿刺されて配置される請求の範囲第 1 5項に記載の分子放出装置。
1 7 . 第三の電極を更に有する請求の範囲第 7項から第 1 6項のいずれかに 記載の分子放出装置。
1 8 . 分子放出手段が、 分子を異なるタイミングで放出可能である請求の範 囲第 1項から第 1 7項のいずれかに記載の分子放出装置。
1 9 . 分子が線状である請求の範囲第 1項から第 1 8項のいずれかに記載の 分子放出装置。
2 0 . 分子が電気的極性を有する請求の範囲第 1項から第 1 9項のいずれか に記載の分子放出装置。
2 1 . 分子がイオン性ポリマーから選択される請求の範囲第 1項から第 2 0 項のいずれかに記載の分子放出装置。
2 2 . イオン性ポリマーがポリヌクレオチド及びその複合体から選択される 少なく とも 1種である請求の範囲第 2 1項に記載の分子放出装置。
2 3 . ポリヌクレオチドが少なく とも 6塩基有してなる請求の範囲第 2 2項 に記載の分子放出装置。
2 4 . 対象の状態をモニターするモニタリング手段を更に有する請求の範囲 第 3項から第 2 3項のいずれかに記載の分子放出装置。
2 5 . 2以上の導電性部材に電気的に吸引されている分子を、 電気的な反発 力により、 異なるタイミングで該導電性部材から放出させることを特徴とする分 子放出方法。
2 6 . 導電性部材が、 細胞内に穿刺されて配置される針状電極である請求の 範囲第 2 5項に記載の分子放出方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007202451A (ja) * 2006-01-31 2007-08-16 Fujitsu Ltd 密度が調整された分子膜の製造方法及び製造装置
WO2021182479A1 (ja) * 2020-03-10 2021-09-16 学校法人早稲田大学 複合ナノチューブを介した細胞内物質導入および抽出技術

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8036738B2 (en) * 2006-03-14 2011-10-11 New Jersey Institute Of Technology Iontophoretic transdermal drug delivery system based on conductive polyaniline membrane

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11290058A (ja) * 1998-04-10 1999-10-26 Unique Medical Imada:Kk 遺伝子導入用電極装置及び遺伝子導入装置

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3618601A (en) * 1969-10-16 1971-11-09 Thatcher W Richardson Iontophoresis unit
DE2739324C3 (de) * 1977-09-01 1981-09-10 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung elektrochemischer Reaktionen sowie dazu geeignete bipolare Elektroden
US6051380A (en) * 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US5849486A (en) * 1993-11-01 1998-12-15 Nanogen, Inc. Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization
JP3368603B2 (ja) * 1992-02-28 2003-01-20 オリンパス光学工業株式会社 遺伝子治療用処置具
JPH05236997A (ja) * 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
US5415629A (en) * 1993-09-15 1995-05-16 Henley; Julian L. Programmable apparatus for the transdermal delivery of drugs and method
KR0151203B1 (ko) * 1994-12-08 1998-12-01 이헌조 다중전극형 바이오센서
HUP9801679A3 (en) * 1995-03-10 2001-01-29 Meso Scale Technologies Llc Co Process and agent for multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing
US6013024A (en) * 1997-01-20 2000-01-11 Suzuki Motor Corporation Hybrid operation system
US6713291B2 (en) * 1999-01-28 2004-03-30 Alan D. King Electrodes coated with treating agent and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11290058A (ja) * 1998-04-10 1999-10-26 Unique Medical Imada:Kk 遺伝子導入用電極装置及び遺伝子導入装置

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007202451A (ja) * 2006-01-31 2007-08-16 Fujitsu Ltd 密度が調整された分子膜の製造方法及び製造装置
WO2021182479A1 (ja) * 2020-03-10 2021-09-16 学校法人早稲田大学 複合ナノチューブを介した細胞内物質導入および抽出技術

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