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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung für die
parallele Durchführung von Mikroarray-Experimenten zum
Nachweis einer spezifischen Wechselwirkung zwischen Sonden- und
Targetmolekülen mit einer Mikrotiterplatte, die mehrere
längliche Reaktionsgefäße umfasst. Ferner
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Vorrichtung
und eine Anordnung zur Durchführung und zur Analyse von
Mikroarray-Experimenten zum Nachweis einer spezifischen Wechselwirkung
zwischen Sonden- und Targetmolekülen.
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Biomedizinische
Tests basieren häufig auf dem Nachweis einer Wechselwirkung
zwischen Sondenmolekülen, die in bekannter Menge und Position auf
einen Träger aufgebracht sind, und nachzuweisenden Targetmolekülen.
Insbesondere in der DNA-Analytik sind die Sondenmoleküle
auf so genannten Mikroarrays, die auch als Biochips oder optische
Biochips bezeichnet werden, aufgebracht. Die Sondenmoleküle
sind dabei in vorgegebener Art und Weise in einer Matrix immobilisiert.
Ferner können sie in einer Matrix synthetisch erzeugt werden.
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Der
Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem Sondenmolekül
und einem Targetmolekül erfolgt dadurch, dass die Targetmoleküle
in einer Lösung mit den Sondenmolekülen in Kontakt
gebracht und unter definierten Bedingungen inkubiert werden. Infolge
der Inkubation findet zwischen den Sondenmolekülen und
den passenden Targetmolekülen eine spezifische Wechselwirkung
statt, wobei die auftretende Bindung deutlich stabiler ist als die Bindung
von Targetmolekülen an Sondenmolekülen, die für
das Targetmolekül nicht spezifisch sind. Zum Entfernen
von Targetmolekülen, die nicht spezifisch gebunden worden
sind, wird das System mit entsprechenden Lösungen gewaschen
oder erwärmt. Der Nachweis der spezifischen Wechselwirkung
zwischen einem Targetmolekül und einem Sondenmolekül
kann anschließend beispielsweise fluoreszenzoptisch erfolgen.
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Ein
Mikroarray wird üblicherweise auf einem Standardobjektträger,
der auch als Slide bezeichnet wird, aufgebracht. Die Abmessungen
eines solchen Standardobjektträgers sind 25,4 mm × 76,5
mm. Er besteht zumeist aus Glas, manchmal auch aus Kunststoff. Das
Mikroarray wird auf dem Standardobjektträger mittels einer
Drucktechnologie aufgebracht, je nach Anwendung z. B. in Form von
wenigen bis zu mehreren tausend Signalpunkten, die auch als Dots
bzw. Spots bezeichnet werden.
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Um
Analysen durchführen zu können, ist es bekannt,
einen Kunststoffrahmen auf den mit dem Mikroarray versehenen Standardobjektträger
zu kleben und das zu analysierende Reagenz mit den Targetmolekülen
mittels Pipette aufzutragen. Anschließend wird der Kunststoffrahmen
abgedeckt und der Array weiteren Analyseschritten unterworfen, bis schließlich
die optische Auswertung erfolgen kann. Des Weiteren ist es bekannt,
Hybridisierungsadapter oder spezifische Hybridisierungsautomaten
zu verwenden.
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Das
Prozessieren der Mikroarrays erfolgt bisher manuell oder mit speziellen
Geräten, die nicht auf Hochdurchsatzanwendungen ausgelegt
sind. Die Verbreitung solcher Geräte in Laboren ist sehr
gering. Außerdem sind diese Geräte relativ teuer.
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Es
besteht daher ein großer Bedarf an Vorrichtungen, die zum
einen eine einfache parallele Durchführung von auf Mikroarrays
basierenden Nachweistests ermöglichen und zum anderen auf einfache
und kostengünstige Weise bereitgestellt werden können.
Es besteht insbesondere ein Bedarf an Vorrichtungen, mit denen Tests
auf der Basis von Mikroarrays durchgeführt werden können,
welche die Verwendung von typischen im Laboralltag verwendeten Geräten
und Instrumenten erlaubt.
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Die
in der Laborpraxis vorhandenen Geräte sind insbesondere
auf das Mikrotiterplattenformat ausgelegt. Eine Mikrotiterplatte,
auch well plate genannt, ist rechteckig und besteht in der Regel
aus Kunststoff, manchmal auch aus Glas. Sie enthält eine Vielzahl
von Reaktionsgefäßen, die voneinander isolierte
Volumina, die in diesem Fall auch als Kavitäten oder Wells
bezeichnet werden, bereitstellen. Die Reaktionsgefäße
sind in einem definierten Raster in Reihen und Spalten angeordnet.
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Die
Abmessungen einer Mikrotiterplatte betragen in der Regel 128 mm × 86
mm × 15 mm (Länge × Breite × Höhe).
Innerhalb dieser Abmessungen werden eine Vielzahl von Formaten definiert,
die Reaktionsgefäße umfassen, die auf der gleichen
Grundfläche mit variabler Höhe angeordnet sind.
Typischerweise werden folgende Formate verwendet: 6 Reaktionsgefäße
(2 × 3, von 2 bis 5 ml Füllvolumen), 12 Reaktionsgefäße
(3 × 4, von 2 bis 4 ml Füllvolumen), 24 Reaktionsgefäße
(4 × 6, von 0,5 bis 3 ml Füllvolumen), 96 Reaktionsgefäße
(8 × 12, von 0,3 bis 2 ml Füllvolumen), 384 Reaktionsgefäße
(16 × 24, von 0,03 bis 0,1 ml Füllvolumen), 1536
Reaktionsgefäße (32 × 48, 0,1 ml Füllvolumen).
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Die
genauen Abmessungen einer Mikrotiterplatte sind vom American National
Standards Institute (ANSI) und der Society for Biomolecular Sciences (SBS)
festgelegt worden (ANSI/SBS 1-2004, 2-2004, 3-2004 und 4-2004).
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Die
Kavitäten in den Reaktionsgefäßen der Mikrotiterplatte
können verschieden Formen aufweisen: Es kann ein so genannter
F-Boden (Flachboden), ein so genannter C-Boden (Flachboden mit minimal
abgerundeten Ecken), ein so genannter V-Boden (konisch zulaufender
Boden) und ein so genannter U-Boden (U-förmiger Vertiefung)
gebildet sein. Die Reaktionsgefäße zeichnen sich
dadurch aus, dass sie eine längliche Form besitzen, d.
h. insbesondere, dass die Längserstreckung der Kavität
größer ist als die Quererstreckung.
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Die
Mikrotiterplatte wird für die jeweilige analytische Aufgabe
speziell beschichtet. Zur Analyse werden die zu analysierenden Medien üblicherweise mit
Pipettierrobotern in die Kavitäten der Reaktionsgefäße
gefüllt. Anschließend erfolgen diverse Prozessier-
und Auswerteschritte. Das Auslesen der Messergebnisse erfolgt ebenfalls
mit automatisierten Verfahren. Auf diese Weise können in
kurzer Zeit eine große Anzahl verschiedener Substanzen,
z. B. über 100.000 verschiedene Substanzen, auf eine gewünschte
biologische Aktivität geprüft werden.
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Mikrotiterplatten
haben sich seit vielen Jahren als Standards in der Laborpraxis etabliert.
Deshalb sind auf die Formate der Mikrotiterplatten zur Analyse von
Medien auf biologische Eigenschaften, beispielsweise zur Absorptionsmessung
in Photospektrometern oder bei der Hochdurchsatzprüfung (High-Throughput
Screening, HTS) in der Pharma- und Pflanzenschutzforschung, eine
Vielzahl von Geräten am Markt vorhanden und praktisch in
jedem Labor Standard.
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Die
eingangs erwähnten Standardobjektträger, die mit
einem Mikroarray beschichtet sind, besitzen jedoch im Vergleich
zur Mikrotiterplatte einige grundsätzliche Vorteile. Der
Aufbau des Mikroarrays auf den Standardobjektträger ist
kleiner als der Aufbau einer Mikrotiterplatte. Ferner werden geringere Mengen
an Beschichtungs- und Anlaysereagenzien verwendet. Es besteht jedoch
ein Bedarf auf dem Mikroarrayformat mehrere Analysen parallel durchführen
zu können und diese hierfür zu automatisieren. Aus
diesem Grund wurden verschiedene Ansätze vorgeschlagen,
um das Mikroarrayformat an das Mikrotiterplattenformat anzupassen
bzw. das Mikroarrayformat mit dem Mikrotiterplattenformat kompatibel zu
machen.
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Aus
der
WO 2006/082035
A1 ist ein Objektträger mit einem Mikroarray bekannt,
bei dem auf der oberen Oberfläche eine Plattform gebildet
ist, auf welcher eine Einteilung vorgesehen ist. Die Plattform ist
in dem Mikroarrayformat ausgebildet, die Einteilung in dem Mikrotiterformat.
Das Mikroarray ist auf der Plattform d. h. im Bodenbereich der Einteilung gebildet.
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Aus
der
WO 2006/051088
A2 ist eine Vorrichtung für die parallele Durchführung
von Mikroarray-Experimenten bekannt, die eine Mikrotiterplatte verwendet.
Dabei ist auf der Grundfläche, d. h. auf dem Boden des
Reaktionsgefäßes der Mikrotiterplatte jeweils
ein einzelnes Mikroarray mit auf vorbestimmten Bereichen des Mikroarrays
angeordneten Sondenmolekülen im Wesentlichen stufenlos
integriert.
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Die
vorstehend beschriebenen Vorrichtungen, bei welchen die Mikroarraytechnik
in das Mikrotiterformat integriert worden ist, weisen jedoch den Nachteil
auf, dass die Fläche, welche pro Reaktionsgefäß für
die Analyse bereitgestellt wird, sehr klein ist. Des Weiteren ist
das Aufbringen des Mikroarrays aufwändig und teuer. Wenn
für das Mikrotiterformat eine Bodenplatte mit jeweils einem
Mikroarray pro Reaktionsgefäß verwendet wird oder
der gesamte Aufbau aus einem Stück besteht, ergibt sich
ferner der Nachteil, dass die ganze Bodenplatte verworfen werden
muss, wenn ein Mikroarray fehlerhaft ist.
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung für
die parallele Durchführung von Mikroarray-Experimenten
der eingangs genannten Art bereitzustellen, die kompatibel mit gängigen Laborgeräten
für die Prozessierung von Mikrotiterplatten ist. Ferner
soll ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Vorrichtung und
eine Anordnung zur Durchführung und zur Analyse von Mikroarray-Experimenten
angegeben werden, bei welchen gängige Laborgeräte
für die Prozessierung von Mikrotiterplatten verwendet werden
können.
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Erfindungsgemäß wird
diese Aufgabe durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1,
ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 8 und eine Anordnung
mit den Merkmalen des Anspruchs 11 gelöst. Vorteilhafte
Aus- und Weiterbildungen ergeben sich aus den abhängigen
Ansprüchen.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung für die parallele
Durchführung von Mikroarray-Experimenten zum Nachweis einer
spezifischen Wechselwirkung zwischen Sonden- und Targetmolekülen
weist eine Mikrotiterplatte auf, die mehrere längliche
Reaktionsgefäße umfasst. Bei zumindest einem dieser Reaktionsgefäße
ist ein Mikroarray so angeordnet, dass sich die Normale des Mikroarrays
im Wesentlichen senkrecht zur Längsrichtung des Reaktionsgefäßes
erstreckt.
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Beim
bestimmungsgemäßen Gebrauch der Mikrotiterplatte
zeigen die Öffnungen der Reaktionsgefäße
nach oben, d. h. entgegen der Richtung der Schwerkraft. Diese Richtung
wird im Folgenden als vertikale Richtung definiert. Beim bestimmungsgemäßen
Gebrauch der Mikrotiterplatte ist die Längsrichtung der
Reaktionsgefäße parallel zur vertikalen Richtung.
Parallel zu der Längsrichtung der Reaktionsgefäße
verlaufen die Seitenwände der Reaktionsgefäße
bzw. Ebenen, welche die Seitenwand an zumindest zwei Punkten berühren.
Senkrecht zu der Längsrichtung der Reaktionsgefäße
und zu den Seitenwänden erstrecken sich die Böden
der Reaktionsgefäße. Die Normale eines Bodens
eines Reaktionsgefäßes erstreckt sich somit zumindest
am tiefsten Punkt parallel zur Längsrichtung des Reaktionsgefäßes.
Ist der Boden eines Reaktionsgefäßes nicht als F-Boden
(Flach-Boden) ausgebildet, sondern als C-Boden, V-Boden oder U-Boden,
weist der Bodenbereich Abschnitte auf, bei denen die Normale zwar nicht
parallel zur Längsrichtung des Reaktionsgefäßes
verläuft. Die Normale schließt in diesem Fall
einen Winkel mit der Längsrichtung ein, der sich jedoch wesentlich
von einen rechten Winkel (90 Grad) unterscheidet. Bei herkömmlichen
Vorrichtungen, welche eine Mikrotiterplatte verwenden und bei denen
ein Mikroarray im Bodenbereich angeordnet ist, ist die Normale des
Mikroarrays somit nicht im Wesentlichen senkrecht zur Längsrichtung
des Reaktionsgefäßes, sondern im Wesentlichen
parallel zur Längsrichtung.
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Unter
einem länglichen Reaktionsgefäß wird im
Sinne der Erfindung ein Reaktionsgefäß verstanden,
bei dem die Längserstreckung der von dem Reaktionsgefäß gebildeten
Kavität größer ist als die minimale Erstreckung
in einer Richtung senkrecht zu der Längsrichtung. Bevorzugt
ist die Längserstreckung der Kavität auch größer
als die maximale Erstreckung der Kavität in einer Richtung
senkrecht zu der Längsrichtung. Das Verhältnis
der Längserstreckung der Kavität des Reaktionsgefäßes
zu der minimalen Erstreckung in einer Richtung senkrecht zu der
Längsrichtung ist insbesondere größer
oder gleich 1,5. Dieses Verhältnis liegt beispielsweise
in einem Bereich von 2 bis 10, bevorzugt in einem Bereich von 3
bis 7. Besonders bevorzugt sind die Verhältnisse 20:6 oder
20:3.
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Unter
einer Mikrotiterplatte wird im Sinne der Erfindung eine ein- oder
zweidimensionale rasterartige Anordnung von separaten Reaktionsgefäßen
verstanden. Die Reaktionsgefäße werden häufig
auch als Wells oder Kavitäten bezeichnet. Die Reaktionsgefäße
können auf einer Platte angeordnet sein. Die rasterartige
Anordnung der Reaktionsgefä ße bei der erfindungsgemäßen
Vorrichtung kann zwar auf vielfältige Weise erfolgen. Die
Anordnung erfolgt jedoch insbesondere in den eingangs genannten
Formaten für Mikrotiterplatten, wie sie durch das American
National Standards Institute (ANSI) festgelegt wurden.
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Der
Begriff Mikrotiterplatte umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung
auch so genannte Streifen (Stripes). Unter einem solchen Streifen
wird eine eindimensionale Anordnung von z. B. 8 oder 12 separaten
Reaktionsgefäßen auf einer Platte bzw. einem Streifen
verstanden. Die Reaktionsgefäße sind in diesem
Fall nebeneinander auf einer Geraden angeordnet.
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Da
die erfindungsgemäße Vorrichtung auf dem Mikrotiterplattenformat
beruht, lässt sich diese Vorrichtung in Verbindung mit
herkömmlichen Geräten einsetzen, die für
die Handhabung von herkömmlichen Mikrotiterplatten geeignet
sind. Beispielsweise sind herkömmliche Geräte
zum Befüllen, Bewegen oder Temperieren von Mikrotiterplatten
mit Standard-Formaten mit der erfindungsgemäßen
Vorrichtung kompatibel. Außerdem können Detektoreinrichtungen
die für die Verwendung in Verbindung mit Mikrotiterplatten
geeignet sind, auch in Verbindung mit der erfindungsgemäßen
Vorrichtung einsetzen.
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Unter
einem Mikroarray, welches unter Umständen auch als Biochip,
Sonden-Array oder Bioarray bezeichnet wird, wird im Sinne der vorliegenden Erfindung
eine Anordnung von molekularen Sonden bzw. einer Substanzbibliothek
auf einen Träger verstanden, wobei die Position einer jeden
Sondenspezies separat bestimmt ist. Unter einer Substanzbibliothek
wird dabei eine Vielzahl von unterschiedlichen Sondenmolekülen
verstanden. Vorzugsweise umfasst das Mikroarray definierte Stellen
bzw. vorbestimmte Bereiche, so genannte Array-Elemente, die besonders
bevorzugt in einem bestimmten Muster angeordnet sind, wobei jedes
Array-Element üblicherweise nur eine Spezies an Sonden
beinhaltet. Die Anordnung bzw. Immobilisierung der Sondenmoleküle
auf dem Träger kann dabei durch kovalente oder nicht kovalente
Wechselwirkungen erzeugt werden. Die Sondenmoleküle befinden
sich dabei innerhalb der von einem Reaktionsgefäß als
Reaktionsraum gebildeten Kavität.
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Unter
einer Sonde bzw. einem Sondenmolekül wird im Sinne der
vorliegenden Erfindung ein Molekül verstanden, das zum
Nachweis anderer Moleküle durch ein bestimmtes, charakteristisches
Bindungsverhalten bzw. eine bestimmte Reaktivität verwendet
wird. Für die auf dem Mikroarray angeordneten Sonden kommt
jede Art von Molekül in Frage, das sich an feste Oberflächen
koppeln lässt und eine spezifische Affinität aufweist.
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Unter
einem Target bzw. einem Targetmolekül wird in Sinne der
vorliegenden Erfindung das mit einer molekularen Sonde nachzuweisende
Molekül verstanden. Bei einem Target kann es sich beispielsweise
um eine Nukleinsäure oder ein Protein handeln.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung unterscheidet sich
von herkömmlichen Vorrichtungen, welche Mikroarrays in
das Mikrotiterformat integrieren, in der Ausrichtung des Mikroarrays.
Bei bekannten Vorrichtungen ist das Mikroarray am Boden des Reaktionsgefäßes
angeordnet, wobei die Normale des Mikroarrays im Wesentlichen vertikal
ausgerichtet ist, d. h. in Längsrichtung des Reaktionsgefäßes.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung erstreckt
sich die Normale des Mikroarrays im Wesentlichen senkrecht zur Längsrichtung
des Reaktionsgefäßes, d. h. das Mikroarray erstreckt
sich insbesondere in vertikaler Richtung parallel zu den Seitenwänden.
Diese Anordnung und Ausrichtung des Mikroarrays bietet den Vorteil,
dass in einem Reaktionsgefäß eine größere Mikroarrayfläche
untergebracht werden kann als bei der waagerechten Ausrichtung des
Mikroarrays, z. B. am Boden des Reaktionsgefäßes.
Bei den herkömmlichen Mikrotiterformaten mit 96 Reaktionsgefäßen stehen
bei einer waagerechten Ausrichtung des Mikroarrays üblicherweise
nicht mehr als 5 bis 7 mm2 zur Verfügung.
Das theoretische Maximum liegt bei dem Mikrotiterplattenformat mit
96 Reaktionsgefäßen bei 9 mm2.
Ein Mikrotiterplattenformat mit mehr als 96 Reaktionsgefäßen,
wie z. B. das Format mit 384 Reaktionsgefäßen,
lässt sich bei herkömmlichen Vorrichtungen technisch
nur schwer verwirklichen, da die Fläche für das
Mikroarray in diesem Fall sehr klein wird. Durch die Erstreckung
des Mikroarrays in Längsrichtung bei der erfindungsgemäßen
Vorrichtung können die Mikroarrays in den Reaktionsgefäßen
jedoch auch dann untergebracht werden, wenn die Grundfläche
für ein Reaktionsgefäß sehr klein wird.
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Des
Weiteren können bei der erfindungsgemäßen
Vorrichtung die Mikroarrays für die einzelnen separaten
Reaktionsgefäße der Mikrotiterplatte unabhängig
voneinander verwendet werden. Bei herkömmlichen Vorrichtungen
werden in der Regel alle Reaktionsgefäße gemeinsam
in Verbindung mit einem Mikroarrayträger genutzt. Wenn
in diesem Fall weniger Proben zur Analyse anstehen, müssen
die überzähligen Reaktionsgefäße
ungenutzt bleiben.
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Gegenüber
herkömmlichen Mikroarrays, die auf Standardobjektträgern
aufgedruckt sind und für die Adapter, wie z. B. Einteilungen
wie ein Rahmensystem zur Anpassung an das Mikrotiterplattenformat
verwendet werden, ergeben sich die folgenden Vorteile: Es erfordert
einen sehr großen Aufwand, die Adapter, die aus Kostengründen
in der Regel wiederverwendet werden müssen, mit dem Objektträger
zu koppeln. Dabei ergeben sich häufig auch Probleme mit
der Dichtigkeit der von den Adaptern gebildeten Kammern zueinander.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung können
die kostengünstigen Reaktionsgefäße einer
herkömmlichen Mikrotiterplatte verwendet werden. Die Dichtigkeit
der Reaktionsgefäße zueinander ist dabei gewährleistet.
Das Bedrucken des Objektträgers mit dem Mikroarray bei
einer herkömmlichen Vorrichtung erfordert wegen der Stege, die
für die Kammern gebildet werden, spezielle Prüftechniken,
welche zu höheren Kosten führen. Außerdem
sind die Mikroarrays bei einer herkömmlichen Vorrichtung
auf den Oberflächen nicht vor Berührung geschützt.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind die
Mikroarrays aufgrund der Anordnung innerhalb des länglichen
Reaktionsgefäßes und aufgrund der Ausrichtung
in Längsrichtung des Reaktionsgefäßes
wirksam vor einer Berührung bei der Handhabung der Vorrichtung
geschützt.
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Gemäß einer
Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ist das Mikroarray auf einer Seitenwand des Reaktionsgefäßes
angeordnet. Es kann z. B. direkt auf eine Seitenwand aufgebracht werde.
Ferner kann das Mikroarray auf eine Folie aufgebracht, z. B. aufgedruckt
werden. Die mit dem Mikroarray versehende Folie wird dann auf die
Seitenwand aufgeklebt.
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Bevorzugt
ist das Mikroarray auf einem Träger angeordnet, wobei zumindest
ein Teil des Trägers eine Seitenwand eines Reaktionsgefäßes
bildet. Der Träger, auf welchem das Mikroarray angeordnet ist,
kann dabei insbesondere die Seitenwände mehrerer Reaktionsgefäße
bilden. Dabei kann es sich bei dem Träger um einen Objektträger
(Slide) handeln, wie er herkömmlicherweise für
Mikroarrays verwendet wird. Die Form des Mikroarrays kann eine beliebige
geometrische Form, wie z. B. ein Rechteck oder eine Linie sein.
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Gemäß einer
Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
sind mehrere Reaktionsgefäße von zumindest dem
Träger und einer Kammstruktur gebildet. Die Mikrotiterplatte
ist in diesem Falle insbesondere ein eindimensionales Raster, bei
dem mehrere Reaktionsgefäße nebeneinander angeordnet sind.
Bei der Mikrotiterplatte handelt es sich in diesem Fall um einen
so genannten Streifen. Die Kammstruktur bildet in diesem Fall insbesondere
die Unterteilungen oder Stege zwischen den Reaktionsgefäßen.
Auf der dem Träger gegenüberliegenden Seite kann
die Kammstruktur geschlossen sein. In diesem Fall ist ein Reaktionsgefäß von
dem Träger und den von der Kammstruktur gebildeten Stegen
und dem von der Kammstruktur gebildeten Boden begrenzt.
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Gemäß einer
anderen Ausgestaltung ist auf der dem Träger gegenüberliegenden
Seite auf der Kammstruktur eine Folie aufgebracht, so dass ein Reaktionsgefäß in
diesem Fall von dem Träger, der Folie und den von der Kammstruktur
gebildeten Stegen und dem von der Kammstruktur gebildeten Boden
begrenzt ist.
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Die
Mikrotiterplatte kann auch von mehreren solcher Streifen gebildet
sein, um die zweidimensionalen Standard-Mikrotiterplattenformate
zu bilden.
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Der
Träger und die Kammstruktur können einteilig ausgebildet
sein. Bevorzugt sind der Träger und die Kammstruktur jedoch
zweiteilig ausgebildet. Der Träger und die Kammstruktur
können in diesem Fall irreversibel oder reversibel miteinander
verbunden sein, um die Reaktionsgefäße zu bilden.
Bei dem zweiteiligen Aufbau aus dem Träger und der Kammstruktur
ergibt sich der Vorteil, dass das auf den Träger aufgebrachte
Mikroarray optisch auf etwaige Fehler untersucht werden kann, bevor
der Träger mit der Kammstruktur verbunden wird, um die
Reaktionsgefäße zu bilden.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung kann somit nicht
nur in Verbindung mit Geräten verwendet werden, die für
das Mikrotiterplattenformat geeignet sind. Bei der Vorrichtung können
auch Standardträger verwendet werden, wie sie üblicherweise
für Mikroarrays vorgesehen sind. Dies führt zu
einer sehr kostengünstigen Herstellung der erfindungsgemäßen
Vorrichtung, da herkömmliche Standardträger für
Mikroarrays verwendet werden können und die Mikroarrays
mittels Standarddrucker auf die Standardträger gedruckt
werden können. Außerdem ergibt sich der Vorteil,
dass ein Träger für ein Reaktionsgefäß oder
einen Streifen einer Mikrotiterplatte einzeln bedruckt wird, so
dass bei Fehldrucken nur der einzelne Träger verworfen
werden muss und nicht ein Träger für die vollständige
Mikrotiterplatte, die aus einer Vielzahl von Streifen besteht.
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In
der Ausgestaltung, bei welcher der Träger die Kammstruktur
reversibel miteinander verbunden sind, ist es möglich,
die Kammstruktur nach dem Prozessieren wieder abzunehmen, der Träger
kann dann mit Standardlesegeräten für die Träger
ausgelesen werden.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung
einer Vorrichtung für die parallele Durchführung
von Mikroarray-Experimenten zum Nachweis einer spezifischen Wechselwirkung
zwischen Sonden- und Targetmolekülen wird eine Mikrotiterplatte
mit mehreren länglichen Reaktionsgefäßen
gebildet. Ferner wird ein Mikroarray gebildet, bei dem auf vorbestimmten
Bereichen Sondenmoleküle angeordnet sind. Bei zumindest
einem Reaktionsgefäß wird das Mikroarray dann
so angeordnet, dass sich die Normale des Mikroarrays im Wesentlichen
senkrecht zur Längsrichtung des Reaktionsgefäßes
erstreckt.
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Das
Mikroarray kann insbesondere auf eine Seitenwand des Reaktionsgefäßes
aufgebracht werden. Dies kann beispielsweise im Druckverfahren oder
durch eine in situ Synthetisierung erfolgen.
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Ferner
kann das Mikroarray auf einen Träger aufgebracht werden.
Auch dies kann beispielsweise im Druckverfahren oder durch eine
in situ Synthetisierung erfolgen. Für das Reaktionsgefäß wird
in diesem Fall eine Kammstruktur gebildet und der Träger und
die Kammstruktur werden so miteinander verbunden, dass zumindest
ein Teil des Trägers eine Seitenwand eines Reaktionsgefäßes
bildet. Der Träger und die Kammstruktur können
beispielsweise irreversibel miteinander verbunden werden, um Reaktionsgefäße
zu bilden. Beispielsweise kann der Träger und die Kammstruktur
verklebt werden. Des Weiteren kann der Träger auch reversibel
mit der Kammstruktur verbunden werden, um Reaktionsgefäße
zu bilden. Beispielsweise kann zwischen dem Träger und
der Kammstruktur eine Klick- oder Rastverbindung hergestellt werden.
Des Weiteren gibt es auch Klebstoffe, mit denen der Träger
reversibel mit der Kammstruktur verbunden werden kann.
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Die
erfindungsgemäße Anordnung zur Durchführung
und zur Analyse von Mikroarray-Experimenten zum Nachweis einer spezifischen
Wechselwirkung zwischen Sonden- und Targetmolekülen umfasst
mehrere längliche Reaktionsgefäße, in
denen ein Mikroarray gebildet ist, bei dem auf vorbestimmten Bereichen
Sondenmoleküle angeordnet sind, wobei das Mikroarray so
in den Reaktionsgefäßen angeordnet ist, dass sich
die Normale des Mikroarrays im Wesentlichen senkrecht zur Längsrichtung
des Reaktionsgefäßes erstreckt. Ferner umfasst
die Anordnung eine Detektoreinrichtung, mit der auf vorbestimmten
Bereichen des Mikroarrays eine Wechselwirkung zwischen den auf dem
Mikroarray angeordneten Sondenmolekülen und Targetmolekülen
erfassbar ist. Bei der erfindungsgemäßen Anordnung sind
die Reaktionsgefäße insbesondere in Form einer
Mikrotiterplatte angeordnet.
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Gemäß einer
Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Anordnung
umfasst die Detektorvorrichtung eine Kamera zum optischen Auslesen
einer spezifischen Wechselwirkung, wobei eine Optik der Kamera in
die Reaktionsgefäße einfahrbar ist und mit der
Optik eine Lichtemission in einer zur Längsrichtung der
Reaktionsgefäße senkrechten Richtung erfassbar
ist. Gemäß einer anderen Ausgestaltung kann die
Kamera der Detektor vorrichtung die spezifische Wechselwirkung auch
durch eine durchsichtige Wand des Reaktionsgefäßes
hindurch detektieren. In diesem Fall muss die Optik der Kamera nicht
in die Reaktionsgefäße eingefahren werden.
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Die
Erfindung wird nun anhand eines Ausführungsbeispiels mit
Bezug zu den Zeichnungen erläutert.
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1 zeigt
eine Aufsicht auf den Träger eines Ausführungsbeispiels
der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
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2 zeigt
einen vertikalen Schnitt durch das Ausführungsbeispiel
der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
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3 zeigt
einen horizontalen Schnitt durch das Ausführungsbeispiel
der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
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4 zeigt
einen horizontalen Schnitt durch ein weiteres Ausführungsbeispiel
der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
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5 zeigt
die Abmessungen eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen
Vorrichtung in einem vertikalen Schnitt,
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6 zeigt
die Abmessungen eines weiteren Ausführungsbeispiels der
erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem vertikalen
Schnitt,
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7 zeigt
einen horizontalen Schnitt durch ein weiteres Ausführungsbeispiel
der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
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8 zeigt
eine perspektivische Ansicht des in 7 gezeigten
Ausführungsbeispiels und
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9 zeigt
eine perspektivische Ansicht einer Halterung für die erfindungsgemäße
Vorrichtung.
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Im
Folgenden wird der Aufbau und die Herstellung eines Ausführungsbeispiels
der erfindungsgemäßen Vorrichtung für
die parallele Durchführung von Mikroarray-Experimenten
zum Nachweis einer spezifischen Wechselwirkung zwischen Sonden-
und Targetmolekülen beschrieben:
Zunächst
werden auf an sich bekannte Weise mehrere Mikroarrays 4 auf
einen Standardobjektträger 1 (Slide), wie in 1 gezeigt,
aufgebracht. Die Mikroarrays 4 könnenbeispielsweise
auf die Oberfläche des Standardobjektträgers 1 aufgedruckt
werden. Dabei werden Sondenmoleküle bei definierten Positionen
auf den Träger 1 positioniert. Zwischen den Mikroarrays 4 werden
Streifen frei gelassen, bei denen keine Sondenmoleküle
angeordnet sind. Jedes Mikroarray 4 ist einem einzelnen
Reaktionsgefäß 3 zuge ordnet, wie es später
erläutert wird. Die Mikroarrays 4 verlaufen in
Richtung Y der Breite des Trägers 1. Über
die Länge X des Trägers 1 sind dabei
so viele Mikroarrays 4 angeordnet, wie Reaktionsgefäße 3 mittels
des Trägers 1 gebildet werden, wie es später erläutert
wird.
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Des
Weiteren ist eine so genannte Kammstruktur 2 vorgesehen.
In 2 ist ein vertikaler Schnitt durch die Kammstruktur 2 gezeigt.
Die 5 und 6 zeigen zwei Beispiele mit
möglichen Abmessungen der Kammstruktur 2. Von
der Kammstruktur 2 werden nebeneinander mehrere längliche Kavitäten 6 gebildet,
die nach oben und zunächst zu einer Seite hin offen sind.
Die Kavitäten 6 werden durch Stege 10 voneinander
getrennt, welche die Zinken der Kammstruktur 2 bilden.
Beim bestimmungsgemäßen Gebrauch der Kammstruktur 2 in Verbindung
mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die
Längsrichtung L vertikal ausgerichtet. Die Erstreckung
h der Kavität 6 in Längsrichtung L ist
wesentlich größer als die Erstreckung der Kavität 6 in den
zur Längsrichtung L senkrechten Richtungen. Das Verhältnis
der Erstreckung h der Kavität 6 in Längsrichtung
L zu der minimalen Erstreckung b1 der Kavität 6 in
einer Richtung senkrecht zur Längsrichtung L ist insbesondere
größer oder gleich 1,5, bevorzugt in einem Bereich
von 2 bis 10 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 3 bis
7. Bei den in den 5 und 6 gezeigten
Beispielen ist das Verhältnis h:b1 gleich 20:6 bzw. 20:3.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung wird dadurch gebildet,
dass der Träger 1 wie in 3 gezeigt
mit der Kammstruktur 2 verbunden wird, wobei die 3 einen
horizontalen Schnitt durch die Vorrichtung zeigt. Der Träger 1 wird
dabei derart seitlich an der Kammstruktur 2 befestigt,
dass sich die Breite Y des Trägers 1 in Längsrichtung
L der Kavitäten 6 erstreckt und die Kavitäten 6 über
der Länge X des Trägers 1 so angeordnet
sind, dass sich jeweils ein Mikroarray 4, welches sich
auf dem Träger 1 befindet, innerhalb einer Kavität 6 angeordnet
ist. Dabei steht die Normale N des Mikroarrays 4 senkrecht
zur Längsrichtung L der von der Kammstruktur 2 und dem
Träger 1 gebildeten Reaktionsgefäßen 3.
Der Träger 1 mit dem Mikroarray 4 bildet
somit eine vertikal ausgerichtete Seitenwand der Reaktionsgefäße 3.
Die gegenüberliegenden Seitenwände der Reaktionsgefäße 3 sowie
der Boden werden von der Kammstruktur 2 gebildet. Die von
der Kammstruktur 2 gebildeten Seitenwände der
Reaktionsgefäße 3 sind dabei hutförmig,
wobei die minimale Erstreckung der Öffnung der Reaktionsgefäße 3 in
einer zur Längsrichtung L senkrechten Richtung mit b1 bezeichnet
ist und die maximale Erstreckung der Öffnung der Reaktionsgefäße 3 in
zur Längsrichtung L senkrechten Richtung mit b2 bezeichnet
ist.
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Die
Abmessungen und Abstände der von der Kammstruktur 2 und
dem Träger 1 gebildeten Streifen mit den Reaktionsgefäßen 3 sind
so gewählt, dass sie mit dem Mikrotiterplattenformat kompatibel sind.
Der von der Kammstruktur 2 und dem Träger 1 gebildete
Streifen wird somit hier auch als Mikrotiterplatte 5 bezeichnet.
In 3 ist ein Streifen im Mikrotiterformat gezeigt,
welcher acht nebeneinander liegende Reaktionsgefäße 3 umfasst.
In 4 ist eine Anordnung gezeigt, bei der 12 solcher
Streifen nebeneinander angeordnet sind, so dass eine Mikrotiterplatte
mit 96 Reaktionsgefäßen 3 gebildet wird. Wenn
die von der Kammstruktur 2 gebildeten Kavitäten 6 näher
nebeneinander liegen, können entsprechend weitere Mikrotiterplattenformate
gebildet werden. Der Abstand der Kavitäten 6 der
Reaktionsgefäße 3 (Mitte zu Mitte Abstand
für eine Prozessierung in der Senkrechten), kann beispielsweise
9 mm, 4,5 mm oder 2,25 mm sein.
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Der
Träger 1 kann reversibel oder irreversibel mit
der Kammstruktur 2 verbunden sein. Für eine irreversible
Verbindung kann die Kammstruktur 2 beispielsweise auf den
Träger 1 aufgeklebt werden. Bei einer reversiblen
Verbindung wird zwischen der Kammstruktur 2 und dem Träger 1 eine
Klick- oder Rastverbindung hergestellt. Des Weiteren kann die reversible
Verbindung auch mittels eines speziellen Klebstoffs hergestellt
werden. In diesem Fall kann der Träger 1 nach
der Wechselwirkung der Sondenmoleküle des Mikroarrays 4 mit
Targetmolekülen, die in Lösung in die Kavitäten 6 eingefüllt
worden sind, wieder von der Kammstruktur 2 entfernt werden,
woraufhin eine optische Auswertung durchgeführt werden
kann.
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In
den 7 und 8 ist ein weiteres Beispiel
einer Kammstruktur 2 gezeigt. In diesem Fall werden Kavitäten 6 mit
einem rechteckigen Querschnitt gebildet. Hierfür weist
die Kammstruktur 2 einen Bodenbereich 13 und Stege 10 oder
Zinken auf. Die Seite 12, die dem Träger 1,
der in den 7 und 8 nicht
gezeigt ist, gegenüber liegt, kann auch, wie bei dem in 3 gezeigten
Beispiel, von der Kammstruktur 2 gebildet sein. Diese Seite 12 kann aber
auch dadurch gebildet werden, dass eine Folie auf die Stege 10 oder
Zinken der Kammstruktur 2 aufgebracht ist. In diesem Fall
ist ein Reaktionsgefäß 6 von dem Träger 1,
der Folie 12 und den von der Kammstruktur 2 gebildeten
Stegen 10 sowie dem von der Kammstruktur 2 gebildeten
Boden 13 begrenzt.
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In 9 ist
eine Halterung 7 gezeigt, in welcher die Mikrotiterplatte 5 eingesetzt
werden kann. Die in 9 gezeigte Halterung kann beispielsweise 24
Mikrotiterplatten 5 im Streifenformat aufnehmen. Hierfür
sind gegenüberliegend an den Seiten Einschnitte 8 gebildet.
Zur Ausrichtung der Streifen ist ferner ein Steg 9 vorgesehen,
welcher mit einem entsprechenden Einschnitt 11 der Mikrotiterplatte 5 wechselwirkt.
Die Abmessun gen der Halterung 7 entspricht dabei auch dem
Mikrotiterplattenformat. Die Länge der Halterung 7 ist
127,76 mm, die Breite 85,32 mm.
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Im
Folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen
Anordnung zur Durchführung und zur Analyse von Mikroarray-Experimenten zum
Nachweis einer spezifischen Wechselwirkung zwischen Sonden- und
Targetmolekülen beschrieben:
Die Anordnung umfasst
eine Mikrotiterplatte 5, wie sie vorstehend beschrieben
wurde. Bei der Mikrotiterplatte ist ein Mikroarray 4 angeordnet,
dessen Normale N sich im Wesentlichen senkrecht zur Längsrichtung
L der Reaktionsgefäße 3 der Mikrotiterplatte erstreckt.
Ferner ist eine Detektoreinrichtung vorgesehen, mit welcher auf
vorbestimmten Bereichen des Mikroarrays eine Wechselwirkung zwischen
den auf dem Mikroarray 4 angeordneten Sondenmolekülen und
Targetmolekülen erfassbar ist.
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Falls
als Mikrotiterplatte 5 ein Streifen verwendet wird, wie
er in 3 gezeigt ist, kann mit der Detektorvorrichtung
eine von dem Mikroarray 4 ausgehende Lichtemission in Richtung
der Normale N des Mikroarrays 4 durch eine in diesem Fall
transparent ausgebildete Kammstruktur 2 bzw. durch die
Folie 12 hindurch detektiert werden.
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Gemäß einer
anderen Ausgestaltung umfasst die Detektorvorrichtung eine Kamera
zum optischen Auslesen der spezifischen Wechselwirkung. Die Kamera
weist eine Optik auf, welche von oben in die Reaktionsgefäße 3 einfahrbar
ist, und mit der eine Lichtemission in einer zur Längsrichtung
L der Reaktionsgefäße 3 senkrechten Richtung,
d. h. in Richtung der Normale N des Mikroarrays 4, erfassbar
ist.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - WO 2006/082035
A1 [0015]
- - WO 2006/051088 A2 [0016]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - ANSI/SBS 1-2004,
2-2004, 3-2004 und 4-2004 [0010]