WO1995017526A1 - Verfahren und vorrichtung zur herstellung einer zellstruktur auf einer semipermeablen membran - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur herstellung einer zellstruktur auf einer semipermeablen membran Download PDF

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WO1995017526A1
WO1995017526A1 PCT/CH1994/000241 CH9400241W WO9517526A1 WO 1995017526 A1 WO1995017526 A1 WO 1995017526A1 CH 9400241 W CH9400241 W CH 9400241W WO 9517526 A1 WO9517526 A1 WO 9517526A1
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semipermeable membrane
cell
membrane
cell structure
cell growth
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PCT/CH1994/000241
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Inventor
Jiri E Prenosil
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Prenosil, Jiri, E.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for producing a cell structure on a semipermeable membrane according to the preamble of claims 1 and 8.
  • tissue technology methods and corresponding devices are required which lead to a rapidly growing tissue structure through the cultivation of keratinocytes.
  • tissue structures are used in transplantation technology on incineration stations in hospitals.
  • PS-EP 155237 a method and a device for culturing cells and microorganisms is described.
  • a cell growth chamber, a medium chamber and a product chamber are assumed, these three chambers being connected to one another via a membrane.
  • the cells within the cell culture chamber are immobilized on supports made of mesh-like tissues, these supports mechanically supporting the membranes and the frame-like edges of these supports serving as seals and at the same time as spacers.
  • the medium chamber is continuously flowed through by an oxygen-enriched nutrient solution, while the product is only withdrawn discontinuously from the cell culture chamber.
  • a disadvantage of this method is the fact that cell growth takes place in an unorganized manner, and layer growth cannot be expected.
  • the cell material is not homogeneously distributed, which leads to constipation and is particularly disruptive.
  • the insufficient oxygen supply also proves to be disadvantageous, since this can only take place through the nutrient solution.
  • the required tightness over the membrane support is very difficult to achieve.
  • Another disadvantage is that the entire system can be sterilized, since too much thermal energy is dissipated via the steel parts of the device.
  • the cultivated cells can hardly be used further in the sense of the present invention.
  • a membrane reactor for cultivating plant cells has also been described (Biotechnol. Prog. 1990 (6), 447-451).
  • This reactor essentially consists of a 2-chamber system, a cell growth chamber and a medium chamber, a gas phase flowing through the cell growth chamber and a nutrient solution flowing through the medium chamber. Both chambers are separated by a semipermeable membrane, which allows the nutrient solution to enter the cell growth chamber and at the same time serves as a carrier for an immobilized cell layer.
  • the cells of this layer of cells take in oxygen, both from the culture medium, as well as from the • located above the cell layer gas phase. On the other hand, metabolic products can be eliminated via the gas phase and the nutrient solution.
  • the disadvantage here is that the cells cannot be removed from the reactor for further use and that the membrane is rigid and cannot be moved.
  • the object of the invention is to propose a method and a device with which the production of human, viable cell layers in a 2-chamber system can be achieved as a cell structure, and which are kept ready for transplantation on a semipermeable membrane.
  • FIG. 2 embodiment of a membrane reactor with transport means in section
  • FIG. 3 embodiment of a transport container in section.
  • FIG. 1 shows the flow diagram of the method according to the invention in a schematic representation.
  • the starting point is a membrane reactor 10, such as that found in Biotechnol. Prog. 1990 (6), 447-451, for the cultivation of plant cells has been described (I).
  • This essentially consists of a cell growth chamber 1 and a medium chamber 2 and a semipermeable membrane Ml, which allows the nutrient solution to get into the cell growth chamber.
  • the membrane reactor is connected to a supply and control unit, which will not be discussed further here.
  • the semipermeable membrane Ml is then grown with human, viable cells BC (basal cells), for example according to the 'Rheinwald and Green' method (Rheinwald JG, Green H., Cell 6, 331-344 (1975) ) inoculated.
  • the cells BC are briefly referred to as cell material, which forms a confluent cell layer after a certain time.
  • the cell material generally comes from the tissue of the future transplant recipient. It is therefore an autologous transplant.
  • the membrane reactor is now operated further, further layers are formed on the first cell layer, a cell structure ML having formed after several days, which is a multilayer structure, a so-called multilayer. All hydrophilic or hydrophilized semi-permeable membranes are used as the membrane material.
  • the youngest cells are located in the lowest layer 4 adjoining the semipermeable membrane, and the oldest cells in the uppermost layer 6.
  • the thickness of the cell layer can vary can be selected over a wide range by adapting the conditions, in particular the growing season.
  • a second semipermeable membrane M2 is then attached to the resulting cell structure ML, or multilayer, with the semipermeable membrane M1, and the first semipermeable membrane M1 is then removed. This has resulted in a cell structure ML with a semipermeable membrane M2, in which the layer 6 of the oldest cells lie on the semipermeable membrane M2 and the basal cells BC look outwards (IV).
  • This cell structure is then placed sterile on the wound bed WB1 (V).
  • the layer with the youngest cells (basal cells) of the resulting cell structure ML is brought into contact with the wound bed, which has proven to be particularly advantageous.
  • the orientation of the cell layer corresponds to that of the skin.
  • step (VI) An alternative to this procedure is step (VI), in which the semipermeable membrane M1 with the resulting cell structure ML is removed from the membrane reactor and is brought directly onto the wound bed WB2 under sterile conditions.
  • the cell structure may be very thin, in the limit case consist of only one layer, so that the oldest cells are also the youngest. In this case, the cell layer orientation has not yet been developed.
  • the semipermeable membrane can be chosen practically any size and have any geometry, which was not possible with previous laboratory methods. This is of particular interest in the case of large-scale burns.
  • the process is easy to use: the semipermeable membrane with the cell structure grown on it can be designed as part of a transport container. As a result, the necessary manipulations are kept to a minimum, which proves to be very advantageous from the point of view of sterile handling that is as simple as possible.
  • the conditions are continuously adapted and optimally designed, for example by the composition of the nutrient medium or the gas phase.
  • the cell layer or the cell layers are supplied with dissolved nutrients from below and are in contact with air from above, which corresponds to the natural skin formation process.
  • the method is particularly suitable for the field of tissue transplantation, i.e. in the production of human tissues, in particular keratinocytes, in the production of an epidermis, the method surprisingly being characterized by a much lower workload than is the case with previously known methods.
  • the feeder cells i.e. the cells which contain the growth factors and / or the messenger substances (signal substances, proteins, peptides) are added to the nutrient solution and are kept in circulation without being in direct contact with the keratinocytes.
  • the semipermeable membrane to certain deformations and thereby to subject the cell layers that are formed to a certain mechanical stress. This can be done, for example, by achieving pressure differences by periodically changing the pressure conditions in the medium chamber and / or in the cell growth chamber.
  • the amplitude and frequency of the pulsations can be changed individually or in combination.
  • a window is provided in the membrane reactor through which the cells can be continuously monitored with a video system, for example with a video microscope.
  • the microscope is advantageously controlled by a computer, which enables control over the various growth stages using software for image analysis. This means that the usual results regarding the desired quality and availability can be considerably improved increase.
  • FIG. 1 The embodiment described in FIG. 1 is based on a medium chamber, a cell growth chamber and a semipermeable membrane.
  • this system can be expanded as desired, e.g. by using a membrane reactor with two or more semipermeable membranes.
  • the corresponding transport container then comprises several compartments, in each of which there is a cell structure under sterile conditions.
  • Fig. 2 shows an embodiment of a membrane reactor with transport means in section.
  • the membrane reactor consists of a base plate 1 and a cover plate 2, which can be tightly connected to the base plate.
  • the bottom plate 1 has on its underside openings for the inlet 3 and the outlet 4 of the nutrient solution, which is guided through the nutrient solution channels 5 within the membrane reactor.
  • the cover plate 2 has the openings for the feed 6 and the discharge 7 of the gas phase.
  • On the top of the cover plate there is a viewing window 8 and an inoculation device 9 with the cover 10.
  • a semipermeable membrane 11 which is guided from a supply roll 12 over the nutrient solution channels 5 and through the opening 13 can be deducted.
  • the pairs of transport rollers 14, 14 'and 15, 15' are arranged in such a way that the semipermeable membrane 11 is thus guided over the nutrient solution channels 5 at the correct point, and that the membrane is moved out of the membrane reactor through the opening 13 can be.
  • the pairs of transport rollers 14, 14 'and 15, 15' run essentially synchronously in pairs, which ensures gentle transport of the semipermeable membrane with the cell structure grown thereon. After the inoculation process, cell growth takes place on the semipermeable membrane 11, a cell structure 16 being formed under sterile conditions. After the cell growth process is completed, the cell structure 16 becomes semi-permeable Membrane 11 is removed from the membrane reactor by means of the transport rollers, where the former is available for further use, for example for a transplant.
  • the membrane reactor is preferably made of anodized aluminum or stainless steel. However, it can also be made from a sterilizable plastic, such as a polysulfone. The production of a cell structure can thus not only be carried out in a simple manner, but can also be repeated. As soon as a first cell structure has been carried out from the membrane reactor, the new piece of the semipermeable membrane is already lying on the nutrient solution channels again for the subsequent inoculation.
  • transport roller pairs 14, 14 'and 15, 15' described here for transporting the semipermeable membrane is only one of many possibilities.
  • a drive system can be used which consists of a roller system and, similar to a conveyor belt, with a fine, fine-mesh plastic fabric is surrounded. The latter is guided over the rollers so that a slight tension is maintained in the plastic fabric. The plastic fabric is led directly over the nutrient solution channels. The semipermeable membrane is then located above the plastic fabric and is now supplied with the nutrient solution by the close-meshed plastic fabric.
  • Another option for transporting the semipermeable membrane is to provide it with a perforated grid at the edges, as is customary with printer paper.
  • the cams of a drive roller engage in this hole pattern and ensure locomotion.
  • the drive rollers are then expediently connected to a toothed belt in order to guarantee synchronism. It is important with all possible drive types that they must be sterilizable without any problems, which influences the choice of the materials used.
  • FIG. 3 shows an exemplary embodiment of a transport container in section.
  • the membrane reactor 20 corresponds to that in FIG. 2.
  • the semipermeable membrane 11 is guided into the transport container 30 via the opening 13. This is firmly connected to the membrane reactor 20 via the O-ring seals 21, 21 'and the holding devices 22, 22'.
  • the pair of transport rollers 23, 23 ' runs synchronously with the pairs of transport rollers of the membrane reactor 20, so that the membrane is not mechanically overstressed during transfer into the transport container.
  • the transport container is closed.
  • the transport container 30 is removed from the membrane reactor 20 and is thus sterile and ready for a transplant project.

Abstract

Das beschriebene Verfahren ermöglicht eine grossflächige Zellstruktur (ML) mit beliebiger Geometrie in einem Membranreaktor (10) unter kontrolliertem Zellwachstum auf einer semipermeablen Membran (M1) herzustellen. Diese Zellstruktur wird unter sterilen Bedingungen in einfacher Weise dem Transplantatempfänger bereitgehalten, wobei der Transportbehälter als integraler Bestandteil des Membranreaktors ausgebildet ist. Damit werden die bisherigen arbeitsintensiven, manuellen Schritte weitgehend automatisiert.

Description

Beschreibung:
Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung einer ZeilStruktur auf einer semipeπαeablen Membran
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung einer Zellstruktur auf einer semipermeablen Membran gemäss dem Oberbegriff der Patentansprüche 1 und 8.
In der Gewebetechnologie sind Verfahren und entsprechende Vorrichtungen gefragt, welche über die Züchtung von Keratinozyten zu einer rasch wachsenden Gewebestruktur führen. Solche Gewebe¬ strukturen finden Anwendung in der Transplantationstechnologie auf Verbrennungsstationen in Spitälern.
_.ach der PS-EP 155237 ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen und Mikroorganismen beschrieben. Dabei wird von einer Zellzuchtkammer, einer Mediumkammer und einer Produktkammer ausgegangen, wobei diese drei Kammern gegeneinander über je eine Membran verbunden sind. Die Zellen innerhalb der Zellzuchtkammer werden an Trägern aus netzartigen Geweben immobilisiert, wobei diese Träger die Membranen mechanisch unterstützen und die rahmenartigen Ränder dieser Träger als Dichtung und gleichzeitig als Distanzkörper dienen. Die Medium¬ kammer wird von einer mit Sauerstoff angereicherten Nährlösung kontinuierlich durchströmt, während das Produkt aus der Zell¬ zuchtkammer nur diskontinuierlich abgezogen wird. Nachteilig bei diesem Verfahren ist die Tatsache, dass das Zellwachstum in einer nicht-organisierten Art und Weise erfolgt, wobei ein Schicht¬ wachstum nicht erwartet werden kann. Das Zellmaterial ist nicht homogen verteilt, was zu Verstopfungen führt und besonders störend wirkt. Ebenfalls nachteilig erweist sich die ungenügende Sauerstoffversorgung, da diese nur durch die Nährlösung erfolgen kann. Zudem ist keine visuelle Überwachungsmöglichkeit des Inokluierungsvorganges und des Zellwachstums möglich. Die erforderliche Dichtheit über den Träger der Membranen ist nur sehr schwierig zu erzielen. Ein weiterer Nachteil ist die Sterilisierbarkeit des ganzen Systems, da zuviel thermische Energie über die Stahlteile der Vorrichtung abgeführt werden. Zudem lassen sich die kultivierten Zellen im Sinne der vorliegen¬ den Erfindung kaum weiterverwenden.
Im weiteren ist in ein Membranreaktor zur Kultivierung von Pflanzenzellen beschrieben worden (Biotechnol. Prog. 1990 (6), 447-451) . Dieser Reaktor besteht im wesentlichen aus einem 2- Kammersystem, einer Zeilwachstumskammer und einer Mediumkammer, wobei die Zellwachstumskammer von einer Gasphase, die Mediumkam¬ mer von einer Nährlösung durchströmt wird. Beide Kammern werden durch eine semipermeablen Membran getrennt, welche die Nährlösung in die Zellwachstumskammer gelangen lässt und gleichzeitig als Träger einer immobilisierten Zellschicht dient. Die Zellen dieser Zellschicht nehmen Sauerstoff auf, sowohl aus dem Nährmedium, als •auch aus der über der Zellschicht befindlichen Gasphase. Über die Gasphase und über die Nährlösung können andererseits Stoffwech¬ selprodukte eliminiert werden.
Nachteilig ist dabei, dass sich die Zellen aus dem Reaktor für die Weiterverwendung nicht entnehmen lassen und dass die Membran starr ist uns sich nicht bewegen lässt.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung vorzuschlagen, womit die Herstellung von humanen, wachstumsfähigen Zellschichten in einem 2-Kammersystem als Zell¬ struktur erzielt werden kann, und diese auf einer semipermeablen Membran zur Transplantation bereitgehalten werden.
Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe mit einem Verfahren gemäss dem Wortlaut des Patentanspruches 1 und einer Vorrichtung gemäss dem Wortlaut des Patentanspruches 8 gelöst. Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen: Fig. 1 Flussdiagramm zur Darstellung des Verfahrens
Fig. 2 Ausführungsbeispiel für einen Membranreaktor mit Transportmitteln im Schnitt
Fig. 3 Ausführungsbeispiel für einen Transportbehälter im Schnitt.
Fig. 1 zeigt das Flussdiagramm des erfindungsgemässen Ver¬ fahrens in schematischer Darstellung. Ausgangspunkt ist ein Membranreaktor 10, wie er etwa in Biotechnol. Prog. 1990 (6), 447-451, zur Kultivierung von Pflanzenzellen beschrieben wurde (I) . Im wesentlichen besteht dieser aus einer Zellwachstumskammer 1 und einer Mediumkammer 2 und einer semipermeablen Membran Ml, welche die Nährlösung in die Zellwachstumskammer gelangen lässt. Der Membranreaktor ist an eine Versorgungs- und Kontrolleinheit angeschlossen, auf die hier nicht weiter eingegangen wird. Die semipermeable Membran Ml wird nun in einem weiteren Schritt (II) mit menschlichen, Wachstumsfähigen Zellen BC (Basalzellen) , z.B. nach dem 'Rheinwald und Green'-Verfahren (Rheinwald J.G., Green H., Cell 6, 331-344 (1975)) inokuliert. Die Zellen BC werden im weiteren kurz als Zellmaterial bezeichnet, welches nach einer bestimmten Zeit eine konfluente Zellschicht bildet. Das Zellmate¬ rial stammt im allgemeinen vom Gewebe des zukünftigen Transplan¬ tatempfängers. Es handelt sich also um ein autologes Transplan¬ tat. Wird der Membranreaktor nun weiter betrieben, so bilden sich weitere Schichten auf der ersten Zellschicht, wobei sich nach Tagen eine Zellstruktur ML gebildet hat, welche eine Mehrschicht¬ struktur, eine sogenannte Multilayer darstellt. Als Membranmate¬ rial finden dabei alle hydrophilen oder hydrophilisierten semi¬ permeablen Membranen Anwendung. Dabei befinden sich die jüngsten Zellen in der untersten, an die semipermeable Membran angrenzen¬ den Schicht 4, und die ältesten Zellen in der obersten Schicht 6. Je nach weiterer Verwendung kann die Dicke der Zellschicht durch eine Anpassung der Bedingungen, insbesondere der Wachs¬ tumszeit, in weiten Bereichen gewählt werden. Auf die entstandene Zellstruktur ML, bzw. Multilayer, mit der semipermeablen Membran Ml wird nun in einem Schritt (III) eine zweite semipermeable Membran M2 auf der Ml gegenüberliegenden .Seite angebracht und anschliessend die erste semipermeable Membran Ml entfernt. Dadurch ist nun eine Zellstruktur ML mit semipermeabler Membran M2 entstanden, bei welcher die Schicht 6 der ältesten Zellen auf der semipermeabler Membran M2 anliegen und die Basalzellen BC nach aussen sehen (IV) . Diese Zellstruktur wird dann steril auf das Wundbett WB1 gebracht (V) . Auf diese Weise wird die Schicht mit den jüngsten Zellen (Basalzellen) der entstandenen Zell¬ struktur ML mit dem Wundbett in Kontakt gebracht, was sich als besonders vorteilhaft erwiesen hat. Die Orientierung der Zell¬ schicht entspricht dabei derjenigen der Haut .
Eine Alternative zu diesem Vorgehen bildet der Schritt (VI), bei welchem die semipermeable Membran Ml mit der entstandenen Zellstruktur ML aus dem Membranreaktor entfernt wird, und unter sterilen Bedingungen direkt auf das Wundbett WB2 gebracht wird. Die Zellstruktur kann u.U. sehr dünn sein, im Grenzfall lediglich aus einer Schicht bestehen, sodass die ältesten Zellen gleichzei¬ tig auch die jüngsten sind. Die Zellschichtorientierung ist in diesem Fall noch nicht ausgebildet.
Das beschriebene Verfahren weist einige wichtige Vorteile auf: Die semipermeable Membran kann praktisch beliebig gross gewählt werden und eine beliebige Geometrie aufweisen, was mit bisherigen Laborverfahren nicht möglich war. Dies ist im Fall von grossflächigen Verbrennungen von besonderem Interesse. Das Verfahren ist einfach zu handhaben: Die semipermeable Membran mit der darauf gewachsenen Zellstruktur kann als Bestandteil eines Transportbehälters ausgebildet werden. Dadurch werden die notwendigen Manipulationen auf ein Minimum beschränkt, was sich aus der Sicht einer sterilen, möglichst einfachen Handhabung sehr vorteilhaft erweist. Die Bedingungen können je nach Wachstumspha- se und je nach vorgegebener Zielsetzung für das geplante Trans¬ plantationsvorhaben kontinuierlich angepasst und optimal gestal¬ tet werden, z.B. durch die Zusammensetzung des Nährmediums oder der Gasphase. Die Zellschicht, bzw. die Zellschichten, werden von unten mit gelösten Nährstoffen versorgt und sind von oben in Kontakt mit Luft, was dem natürlichen Hautbildungsvorgang ent¬ spricht.
Das Verfahren eignet sich besonders für das Gebiet der Gewebetransplantation, d.h. bei der Herstellung von humanen Geweben, insbesondere Keratinozyten, bei der Erzeugung einer Epidermis, wobei sich das Verfahren überraschenderweise durch einen viel geringeren Arbeitaufwand auszeichnet als dies mit bisherigen bekannten Verfahren der Fall ist.
Zur Erzielung eines raschen Wachstums können die Feeder- Zellen, d.h. die Zellen, welche die Wachstumsfaktoren enthalten und/oder die Botenstoffe (signal substances, proteins, peptides) der Nährlösung zugegeben werden und in Zirkulation belassen werden, ohne dass sie direkten Kontakt zu den Keratinozyten aufweisen. Zudem hat sich als besonders wirkungsvoll erwiesen, die semipermeable Membran gewissen Deformationen zu unterwerfen und dadurch die sich bildenden Zellschichten einem bestimmten mechanischen Stress auszusetzen. Dies kann beispielsweise durch die Erzielung von Druckunterschieden erfolgen, indem die Druck¬ verhältnisse in der Mediumkammer und/oder in der Zellwachstums¬ kammer periodisch geändert werden. Dabei können die Amplitude und die Frequenz der Pulsationen einzeln oder in Kombination geändert werden.
Zur Kontrolle des Zellwachstums wird ein Fenster im Membran¬ reaktor vorgesehen, durch welches die Zellen laufend mit einem Video-System, beispielsweise mit einemVideo-Mikroskop, überwacht werden können. Das Mikroskop wird vorteilhafterweise über einen Computer gesteuert, was unter Verwendung einer Software zur Bildanalyse eine Kontrolle über die verschiedenen Wachstumssta¬ dien ermöglicht. Damit lassen sich die bisher üblichen Resultate bezüglich der gewünschten Qualität und Verfügbarkeit erheblich steigern.
Die in Fig. 1 beschriebene Ausführungsform geht von einer Mediumkammer, einer Zellwachstumskammer und einer semipermeablen Membran aus. Selbstverständlich kann dieses System beliebig erweitert werden, so z.B. durch die Verwendung eines Membranreak¬ tors mit zwei oder mehr semipermeablen Membranen. Der entspre¬ chende Transportbehälter umfasst dann mehrere Kompartimente, in welchen sich je eine Zellstruktur unter sterilen Bedingungen befindet.
Fig. 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel für einen Membranreaktor mit Transportmitteln im Schnitt. Der Membranreaktor besteht aus einer Bodenplatte 1 und aus einer Deckplatte 2, welche mit der Bodenplatte dicht verbunden werden kann. Die Bodenplatte 1 weist an deren Unterseite Öffnungen für den Zulauf 3 und den Ablauf 4 der Nährlösung, welche innerhalb des Membranreaktors durch die Nährlösungskanäle 5 geführt wird. Die Deckplatte 2 weist die Öffnungen für die Zuführung 6 und die Abführung 7 der Gasphase auf. Auf der Oberseite der Deckplatte befindet sich ein Sichtfen¬ ster 8 und eine Inokulierungseinrichtung 9 mit dem Deckel 10. Im Innern des Membranreaktors befindet sich eine semipermeable Membran 11, welche ab einer Vorratsrolle 12 über die Nährlösungs¬ kanäle 5 geführt wird und durch die Öffnung 13 abgezogen werden kann. Die Transportrollenpaare 14,14' und 15,15' sind so ange¬ ordnet, dass damit die semipermeable Membran 11 sowohl an der richtigen Stelle über die Nährlösungskanäle 5 geführt werden, als auch dass die Membran durch die Öffnung 13 aus dem Membran¬ reaktor gefahren werden kann. Die Transportrollenpaare 14,14' und 15,15' laufen paarweise im wesentlichen synchron, wodurch ein schonungvoller Transport der semipermeablen Membran mit der darauf gewachsenen Zellstruktur gewährleistet ist. Auf der semipermeablen Membran 11 findet nach dem Inokulierungsvorgang das Zellwachstum statt, wobei unter sterilen Bedingungen eine Zellstruktur 16 entsteht. Nachdem der Zellwachstumsprozess abge¬ schlossen ist, wird die Zellstruktur 16 auf der semipermeablen Membran 11 mittels den Transportrollen aus dem Membranreaktor entfernt, wo erstere für eine Weiterverwendung, beispielsweise für eine Transplantation, zur Verfügung steht. Der Membranreaktor wird vorzugsweise aus eloxiertem Aluminium oder aus rostfreiem Stahl gefertigt. Er kann aber auch aus einem sterilisierbaren Kunststoff, wie etwa aus einem Polysulfon, gefertigt werden. Die Herstellung einer Zellstruktur kann so auf einfache Weise nicht nur durchgeführt, sondern auch wiederholt werden. Sobald eine erste Zellstruktur aus dem Membranreaktor ausgeführt worden ist, liegt gleichzeitig bereits für die nachfolgende Inokulation das neue Stück der semipermeablen Membran wieder auf den Nährlösungs¬ kanälen.
Die Verwendung der hier beschriebenen Transportrollenpaare 14,14' und 15,15' zum Transport der semipermeablen Membran stellt nur eine von vielen Möglichkeiten dar. So kann beispielsweise ein Antriebssystem verwendet werden, welches aus einem Rollensystem besteht und, ähnlich wie ein Förderband, mit einem feinen, engmaschigen Kunststoffgewebe umgeben ist. Dabei wird letztere über die Rollen so geführt, dass eine leichte Spannung im Kunststoffgewebe erhalten bleibt. Das Kunststoffgewebe wird direkt über die Nährlösungskanäle geführt. Über dem Kunststoffge¬ webe befindet sich dann die semipermeable Membran, welche nun durch das engmaschige Kunststoffgewebe mit der Nährlösung ver¬ sorgt wird. Eine weitere Möglichkeit zum Transport der semiper¬ meablen Membran besteht darin, dass diese an den Ränder mit einem Lochraster versehen wird, wie dies bei einem Printerpapier üblich ist. Die Nocken einer Antriebswalze greifen in diesen Lochraster und sorgen für die Fortbewegung. Die Antriebswalzen werden dann zweckmässigerweise mit einem Zahnriemen verbunden, um den Gleich¬ lauf zu garantieren. Wichtig ist bei allen möglichen Antriebs¬ arten, dass sie problemlos sterilisierbar sein müssen, was die Wahl der eingesetzten Materialien beeinflusst.
Fig. 3 zeigt ein Ausführungsbeispiel für einen Transportbe¬ hälter im Schnitt. Der Membranreaktor 20 entspricht demjenigen in Fig. 2. Über die Öffnung 13 wird die semipermeable Membran 11 in den Transportbehälter 30 geführt. Dieser ist über die O-Ring- Dichtungen 21,21' und die Haltevorrichtungen 22,22' mit dem Membranreaktor 20 fest verbunden. Das Transportrollenpaar 23,23' läuft mit den Transportrollenpaaren des Membranreaktors 20 syn¬ chron, sodass die Membran beim Transfer in den Transportbehälter mechanisch nicht überbeansprucht wird. Mittels einer Trennvor¬ richtung 24, die hier nicht näher beschrieben wird, wird nach dem Transport der semipermeablen Membran 11, welche nun die Zell¬ struktur enthält, die semipermeable Membran unter sterilen Bedingungen getrennt und mittels einer Schliessvorrichtung, welche hier ebenfalls nicht näher beschrieben wird, wird der Transportbehälter verschlossen. Nach Öffnen der Haltevorrichtun¬ gen 22,22' wird der Transportbehälter 30 vom Membranreaktor 20 entfernt und steht damit steril für ein Transplantationsvorhaben bereit.
Erfindungswesentlich ist, dass mit dem beschriebenen Verfah¬ ren eine grossflächige Zellstruktur mit beliebiger Geometrie in einem Membranreaktor unter kontrolliertem Zellwachstum auf einer semipermeablen Membran hergestellt werden kann, und diese Zell¬ struktur unter sterilen Bedingungen in einfacher Weise für den Transplantatempfänger in einem Transportbehälter bereitgehalten werden kann. Damit werden die bisherigen arbeitsintensiven, manuellen Schritte weitgehend automatisiert.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung einer Zellstruktur in einem Mem¬ branreaktor, bestehend aus mindestens einer Zellwachstumskammer
(1) und mindestens einer Mediumkammer (2), wobei die Zellwachs¬ tumskammer von einer Gasphase, die Mediumkammer von einer Nähr¬ lösung durchströmt wird, und aus mindestens einer semipermeablen Membran (Ml) , wobei diese als Träger der herzustellenden Zell¬ struktur dient, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellmaterial auf der semipermeablen Membran Ml inokuliert wird und sich eine erste Schicht bildet, dass das Zellmaterial von der unteren Seite der semipermeablen Membran durch die Nährlösung und von der oberen Seite der semipermeablen Membran durch die Gasphase versorgt wird, wodurch ein kontrolliertes Zellwachstum bewirkt wird, bei welchem mehrere weitere Schichten geordnet zur Zellstruktur (ML) wachsen, dass die Stoffwechselprodukte über die Nährlösung und über die Gasphase beseitigt werden, und dass dadurch auf der semipermeablen Membran eine Zellstruktur (ML) entsteht, welche unter sterilen Bedingungen transferiert und weiterverwendet wird.
2. Verfahren' zur Herstellung einer Zellstruktur in einem Mem¬ branreaktor, bestehend aus mindestens einer Zellwachstumskammer
(1) und mindestens einer Mediumkammer (2) , wobei die Zellwachs¬ tumskammer von einer Gasphase, die Mediumkammer von einer Nähr¬ lösung durchströmt wird, und aus einer semipermeablen Membrane (Ml), wobei diese als Träger der herzustellenden Zellstruktur dient, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellmaterial auf der semipermeablen Membran (Ml) inokuliert wird und sich eine Schicht bildet, dass das Zellmaterial von der unteren Seite der semiper¬ meablen Membran durch die Nährlösung und von der oberen Seite der semipermeablen Membran durch die Gasphase versorgt wird, wodurch ein kontrolliertes Zellwachstum bewirkt wird, dass die Stoffwech¬ selprodukte über die Nährlösung und über die Gasphase beseitigt werden, und dass dadurch auf der semipermeablen Membran eine Zellstruktur entsteht, welche unter sterilen Bedingungen trans¬ feriert und weiterverwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass an die entstandene Zellstruktur (ML) auf der gegenüberlie¬ genden Seite der ersten semipermeablen Membran (Ml) eine zweite semipermeable Membran (M2) angebracht wird und dass die Zell¬ struktur von der ersten semipermeablen Membran getrennt wird, wodurch ein Orientierungswechsel der Zellstruktur bewirkt wird.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeich¬ net, dass der Transfer der Zellstruktur (ML) in einen Transport¬ behälter (30) erfolgt.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeich¬ net, dass für das kontrollierte Zellwachstum ein Video-System, insbesondere ein Mikroskop, welches über eine Computer-Einheit gekoppelt ist, eingesetzt wird, wodurch die Kontrolle des Zell¬ wachstums kontinuierlich erfolgt.
6. Anwendung des Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung von humanen Geweben, insbesondere von Keratinozyten bei der Erzeugung einer Epidermis.
7. Anwendung des Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Gewebetransplantation.
8. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass im Membranreaktor Mittel zum Transport der semipermeablen Membran, dass Mittel zur Deformation derselben während des Zellwachstums und dass ein Transportbehälter zum Transport der Zellkultur vorgesehen sind.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel zum Transport ein Rollensystem vorgesehen ist, welches mit einem endlosen Kunststoffgewebe umgeben ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel zum Transport ein Rollensystem mit Nocken vorgesehen ist, welche in den Lochraster der semipermeablen Membran greifen.
11. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel zum Transport mindestens zwei paarweise synchron laufende Transportrollenpaare (14,14' ;15,15' ) vorgesehen sind.
12. Vorrichtung nach Ansprüchen 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Deformation der semipermeablen Membran durch Druckunter¬ schiede, durch Änderung der Amplitude und der Frequenz erfolgt.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Deformation der semipermeablen Membran periodisch erfolgt.
14. Vorrichtung nach den Ansprüchen 8 bis 13, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass der Transportbehälter (30) an den Membranreaktor (10) angekoppelt wird und dass er einen integralen Bestandteil des Membranreaktors bildet.
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